Rznomics Co., Ltd.

Rznomics 是一家韩国公司，聚焦 RNA 创新药物的研发，基于四膜虫Ⅰ型内含子的自剪接活性，开发了两大 RNA 技术平台：第一种称为 RNA Replacement Enzyme，基于反式核酶的 RNA 编辑平台；第二种称为 STS RNA 环化平台，利用反式核酶末端对末端的自我靶向和自我剪接反应（end-to-end self-targeting and splicing reaction）高效合成 circRNA。 1 反式核酶的 RNA 编辑平台 通过两次连续的转酯反应，基于 I 型内含子的反式核酶（trans-splicing ribozyme）可利用治疗性目的 RNA 序列（末端连接 I 型内含子）替换掉原有靶标 RNA 序列（target RNA sequence）。反式核酶结构中的引导序列 IGS（5'-GN'N'N'N'N'-3'）与底物 RNA 上的靶标位点（5'-NNNNNU-3'）形成特殊的互补配对区(包含 G·U 摇摆配对)，即典型的 P1 螺旋结构，从而完成反式核酶对靶标位点的识别过程。核酶的 5’剪切位点由 P1 中的 G•U 配对界定。内含子 3’末端是一个保守的鸟苷酸ΩG，界定核酶的 3’剪接位点。位于核酶下游的目的 RNA 序列中的部分区域与引导序列 IGS 可形成部分配对，形成典型的 P10 结构。IGS 和靶标位点之间延伸的碱基配对可提升核酶反应的特异性和效率。P10 螺旋结构中接近 6~7 个碱基配对也可提升 3'剪接位点的特异性。在 I 型内含子核酶上游引入反义序列（antisense sequence），使其与底物 RNA 靶标位点下游区域（ABS）互补配对同样可提升剪接反应的特异性和效率。 核酶的反式剪接反应发生两个独立的 RNA 分子之间。在第一次转酯反应中，外源鸟苷酸结合到位于核酶催化中心内的 G-Binding site，充当亲核基团，利用 3'-OH 攻击靶标位点，发生 5'剪接位点切割，导致靶标位点 3’末端的尿苷酸暴露出 3'-OH。在第二次转酯反应中，核酶构象首先发生改变，使得位于Ⅰ型内含子 3'末端的ωG 代替外源鸟苷酸结合到核酶催化中心。接着，靶标位点 3’末端暴露出 3'-OH 的尿苷酸会攻击ωG，把底物 RNA 与目的 RNA 序列连接起来。 2    反式核酶的 RNA 环化平台 2023 年，Rznomics 公司研发团队 Seong-Wook Lee 等人在 Molecular Therapy : Nucleic Acids 发表文章：Efficient circular RNA engineering by end-to-end self-targeting and splicing reaction using Tetrahymena group I intron ribozyme，为利用四膜虫 I 型内含子产生 circRNA，他们设计开出一种 STS 环化载体，可在一个 RNA 分子内实现末端对末端的自我靶向和自我剪接以产生 circRNA。Rznomics 公司在 2022 年 10 月 12 日将 STS 环化技术申请专利：Construct of self-circularization RNA，专利号为 US11,939,580 B2。本期内容，我们将全面解析 STS 环化技术。 2.1    STS 环化载体设计 STS 自环化 RNA 载体序列设计如下：5’-IGS(引导序列)-ribozyme(核酶)–gene of interest(目的基因)-target site 3’(靶标位点)，其中，5’和 3’分别代表 RNA 载体的 5’末端和 3’末端，目的基因代表需要环化的 RNA 序列。需要注意的是，STS 自环化 RNA 载体序列根据 P1 Helix 长度和是否存在 P10 Helix 可分为2种类型： 第一种是最为复杂的初始 STS 环化载体，具备延伸的 P1 Helix+P10 Helix，同时，为了将 P1 和 P10 拉近，分别在 IGS 上游添加反义序列 AS 和 target site 的下游添加与 AS 互补的 ABS 序列。 初始 STS 环化载体设计原理 初始 STS 环化载体质粒模板序列 第二种是优化后的 STS 环化载体只具有 P1 Helix，去除掉 P10 Helix 和 AS/ABS 序列。构成 G•U 摇摆配对的 U 位于 target site 的 3’末端，而构成 G•U 摇摆配对的 G 位于位于 IGS 序列的 5’末端。 只具有 P1 Helix 的优化 STS 环化载体设计 只具有 P1 Helix 的优化 STS 环化载体质粒模板序列 2.2    体外验证 STS 环化体系 聚丙烯酰胺变性凝胶电泳 采用初始 STS 环化系统合成 circFluc(EMCV IRES)，测定不添加 GTP 直接环化（direct STS）和添加 GTP 诱导额外的环化反应对于环化效率的影响。将直接环化后的 RNA 样品用 RNasR 处理过后，在 4%聚丙烯酰胺尿素变性凝胶上，信号最为强烈的条带为 Candiate1（预测为 circRNA），此外还存在其他可清晰简单的条带（Candiate2 及 Nicked circRNA）。有意思是，在 IVT 结束后，添加 GTP 额外诱导环化反应（1st 和 2nd）产生的 RNA 样品经过 RNasR 处理过后，同样在凝胶上可见三条信号强度类似的条带。这说明无需额外的环化反应，IVT 反应过程中便可同步生成 circRNA。 RT-PCT 测序 接下来，研究需要验证迁移速度最为缓慢的 candidate 1 的确为 circRNA。将上述凝胶中的 candidate 1 回收，进行 RT-PCR。无论是否添加 RNase R，candidate 1 回收条带利用检测 circRNA 的引物均可扩增出条带，而不含核酶的线性 IVT RNA 产物均无法扩增出条带。这说明 candidate 1 毫无疑问肯定是 circRNA。将 candidate 1 RT-PCR 产物送去测序，结果证实 Luc 3’端和 IRES 5’端正确连接到一起。 Nicking Test 尽管采用 RT-PCR 证实 candidate 1 条带为 circRNA，但是无法排除 candidate 1 是一种通过分子间剪接反应形成的二聚体 circRNA。因此，采用 Nicking testing 再次进行确认。 从电泳凝胶中回收到的 candidate 1/2 与不同浓度的 Mg2+离子混合，65℃条件下加热 30min，然后，立即冰浴。当不与 Mg2+离子孵育时，凝胶电泳条带上除了 candidate 1，还存在一个较弱的 Nicked circRNA 条带(1092nt)。当 Mg2+离子浓度为 2.5mM 时，凝胶电泳条带上的 candidate 1 条带基本消失，只可看到微弱的 Nicked circRNA 条带。当 Mg2+离子浓度提升至 5mM 时，即便是 Nicked circRNA 条带也将发生水解而消失不见。上述现象说明 candidate 1 是单体形式，在 Mg2+离子浓度为 2.5mM 时断裂为 Nicked circRNA（1092nt），Mg2+离子浓度为 5mM 时，完全降解。 candidate 2 条带大小与完整的 precursor RNA（1847nt）类似。从电泳凝胶中回收到的 candidate 2 与与不同浓度的 Mg2+离子混合反应后再次电泳，结果发现，当 Mg2+离子浓度为 2.5mM 时，与 candidate 1 不同，candidate 2 并未产生 Nicked circRNA 条带，而是直接消失，说明 candidate 2 并非是 circRNA。 此外，研究人员将胶回收的 candidate 1 与特异性 RNase H 探针（与 circRNA 环化连接处配对）退火，经过 RNase H 处理后的样品在电泳凝胶中显示两条带，与 RNase H 未处理组相比，circRNA 条带减少，Nicked circRNA 条带增加。再次证实 IVT 反应中的 precursor RNA 不可能发生分子间的自剪接反应生成多聚体 circRNA。 2.3    细胞水平验证 STS 环化体系 研究人员将 STS 初始环化载体序列插入到以 CMV 作为启动子的质粒上，然后将该质粒转染至 293A 细胞。从转染后 12h 至 48h，细胞内 Luciferase 表达水平逐渐增加。从转染质粒 48h 后的 293A 细胞中提取总 RNA，采用 RT-PCR 和测序在分子水平证实细胞内确实生成 circFluc。 2.4    IP-RP-HPLC 纯化 circRNA 策略 为减少 circRNA 免疫原性，研究人员采用 IP-RP-HPLC 纯化 circRNA。HPLC 纯化系统为安捷伦 1290 Infinity 超高效液相色谱，分析柱为 Agilent PLRP-S 4000A。洗脱收集条件分为两种，一种用于样品的分析（Analytical）,一种用于样品的收集（Fraction collection）。 用 HPLC 分析采用试剂盒小柱子纯化得到的 IVT 粗提产物，在峰图上可明显看到一前一后，两个间隔开来的峰，而一旦 IVT 产物经过 RNase-R 处理后，在 HPLC 峰图将只会留下前面的峰，后面的峰会消失。这说明 circRNA 位于前峰，线性 RNA 位于后峰，而且，还说明即便不使用 RNase R 处理，采用 HPLC 也可将 IVT 产物中的 circRNA 分离开来。 采用 HPLC 的 Fraction collection 洗脱收集条件，分段回收样品，再用凝胶电泳检测回收到的样品。在凝胶电泳条带图中，我们可以非常清晰地看到在 Fraction 12 中存在纯度含量最高的 circRNA。 2.5    优化 STS 环化载体 AS/ABS 序列优化 在 STS 环化载体 DNA 模板上添加不同长度的反义序列/反义结合序列（AS/ABS）（50/100/150/200/250/300），研究 AS/ABS 序列长度对于 IVT 共环化反应（37℃+3h）效率的影响。 凝胶电泳显示，与 AS200 或者更长的序列相比，AS50/100/AS150 显示出更好的环化效率。另外一方面，对于 AS50/100 来说。其 IVT 产物产量显著减少。因此，就环化效率和 IVT 产量来说，在在 STS 初始环化载体在添加 AS150 是最佳选择。 间隔序列优化 IRES 和Ⅰ型内含子核酶都是高度结构化的，彼此之间可能会对各自的正确折叠造成影响，因此，在 IRES 和Ⅰ型内含子核酶之间添加 Spacer 序列是提升环化效率的常规做法。然而，对于基于 STS 环化体系来说，无论是添加 PolyA（A10/A30/A50）或者其他序列，对于环化效率和 IVT 产量来说均没有显著改变。 P1/P10/AS 元件对于 STS 环化效率影响 研究人员设计了 3 种 STS 环化载体：包含 P1+P10+AS150 的 STS 环化载体；包含 P1+P10 的 STS 环化载体；仅包含 P1 的 STS 环化载体，旨在研究 circRNA 环化载体中 P1/P10/AS 元件对于 STS 环化效率的影响。 IVT 共环化反应结束后，测定 IVT 产物含量和 circRNA 含量。结果发现，3 种 STS 环化载体的 IVT 产物产量无显著区别，然而，对于 circRNA 产量来说，P1+P10+AS 环化载体＞P1 环化载体＞P1+P10 环化载体。这个结果让人大感意外，也就是说在 STST 环化载体中，移除掉 P10 和 AS，仅仅保留 P1 也可通过 IVT 共环化反应高效产生 circRNA。 优化 P1 Helix 前面提到，在 STS 环化载体中去除掉移除掉 P10 和 AS，仅仅保留 P1 也可通过 IVT 共环化反应高效产生 circRNA。接着，研究人员想知道构成 P1 Helix 的碱基组成对于环化效率的影响。令人感到大为惊讶的是，凝胶电泳条带强度显示，富含 AU 的 P1 STS 环化载体环化效率要明显强于 P1+P10+AS/ABS 初始 STS 环化载体或者由其他碱基组成的 P1 STS 环化载体。 2.6    细胞内翻译水平 研究人员将 PIE 和 STS 环化载体生成的 circGFP RNA 转染 293A 细胞，定点检测细胞内 GFP 蛋白表达水平。结果发现，STS 环化载体生成的 circRNA 在细胞内的蛋白表达水平要明显高于 PIE 环化载体生成的 circRNA。此外，研究人员还发现经 IP-RP HPLC 纯化的 circRNA 在 A549 细胞中几乎不会触发明显的天然免疫反应。 小结 韩国 Rznomics 公司利用四膜虫 I 型内含子核酶设计了一种末端对末端自我靶向识别和自我剪接的 STS 环化载体系统，并且对其各元件进行优化，最终惊人地发现仅需 P1 Helix 便可高效生成 circRNA，此外，还发现构成 P1 Helix 的碱基富含 AU 时要比其他碱基具备更高的环化效率。当 P1 STS 环化载体仅包含 IGS，ribozyme，GOI 序列时，在 GOI 3’末端添加 U，那么生成的 circRNA 将仅由 GOI 和额外添加的 U 组成。如果将 GOI 中任何富含 AU 的区域选为 P1 Helix 中的 target site，将紧随 target site 后面的 3’-GOI 序列置于核酶ΩG 后面，那么最终生成的 circRNA 将仅仅由 GOI 组成，不包含额外的 U 碱基。总之，这种基于四膜虫 I 型内含子核酶的 STS 环化载体系统为高效生成 circRNA 提供了更多的选择性。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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SEONGNAM, South Korea, Aug. 5, 2024 /PRNewswire/ -- SK pharmteco, a global contract development, manufacturing, and analytical testing organization serving both the small molecule and cell & gene therapy industry, and Rznomics Inc., a South Korea-based biopharmaceutical company specializing in the development of RNA-based gene therapeutics, have signed a memorandum of understanding (MOU) for a contract development and manufacturing partnership. When finalized, the multi-year partnership will establish a strategic collaboration between SK pharmteco and Rznomics to develop and commercialize multiple gene therapy products. SK pharmteco will provide technical expertise and resources, including the facilities and personnel, to enable a smooth transition from clinical to full-scale commercial manufacturing of Rznomics' innovative ribonucleic acid (RNA)-based biopharmaceuticals. "We are thrilled about the opportunity to partner with Rznomics on their groundbreaking initiatives," said Andy Fenny, Chief Commercial Officer of SK pharmteco. "By combining our significant expertise in gene therapy manufacturing with Rznomics' innovative RNA-based therapeutic approach, we believe this collaboration has the potential to deliver life-changing treatments to patients in need quickly." Seong-Wook Lee, President and Chief Executive Officer of Rznomics, commented: "This partnership will mark late-stage development and manufacturing of our gene therapy pipeline to prepare the path towards Phase II and later stage clinical trials and potential commercialization. We look forward to working closely with SK pharmteco." About SK pharmteco SK pharmteco is a global contract development and manufacturing organization (CDMO) with 13 offices and manufacturing facilities across the U.S., Europe, and Korea. The company partners with biopharmaceutical companies of all sizes to manufacture Active Pharmaceutical Ingredients (API) and intermediates, cell and gene therapy technologies, registered starting materials, and analytical services for the biopharmaceutical industry worldwide. SK pharmteco is a subsidiary of SK Inc. (KRX: 034730) (SK), the strategic investment company for SK Group, South Korea's second-largest conglomerate. About Rznomics Rznomics is a South Korea-based innovative RNA biopharmaceutical company, with vision to treat/conquer various human intractable diseases. Rznomics has developed and focused on several pipelines with RNA editing platform technologies of RZ-001 (Hepatocellular Carcinoma, Glioblastoma), RZ-003 (Alzheimer), RZ-004 (Retinitis Pigmentosa), RZ-005 (neurodegenerative disorder) and Circular RNA platform. For RZ-001, the lead pipeline, Rznomics has received Phase I/IIa IND approvals from the FDA for Hepatocellular Carcinoma and Glioblastoma in 2022 and 2023 each. In addition, FDA has granted Fast Track Designation for GBM in November 2023 and Orphan Drug Designation for HCC in January 2024. Early-phase trials have also commenced in Korea, upon IND approval for RZ-001 from the Ministry of Food and Drug Safety (MFDS). Rznomics has received IND approval for combination of RZ-001 and Immunotherapy from the MFDS as well, in December 2023. Contact: Keith Bowermaster, APR, CCMP Communications Consultant [email protected] Website: Jihye Yang Associate Manager [email protected] Website: SOURCE Rznomics Inc.

SEONGNAM, South Korea, July 15, 2024 /PRNewswire/ -- Rznomics Inc., a South Korea based biopharmaceutical company specialized in the development of RNA-based gene therapeutics, announced that it has received Clinical Trial Notification (CTN) from the Australian Therapeutic Goods Administration (TGA) for the initiation of a Phase 1/2a clinical trial evaluating RZ-004, a gene therapeutic candidate for autosomal dominant Retinitis pigmentosa with rhodopsin mutation. Retinitis pigmentosa is an inherited retinal disease in which photoreceptor cells in retina degenerates and leads to blindness. Autosomal dominant Retinitis pigmentosa is caused by numerous diverse genetic defects and mutations in rhodopsin is the most common cause of autosomal Retinitis pigmentosa. More than 150 mutation sites in rhodopsin have been identified and it causes difficulty in treating rhodopsin-mediated autosomal dominant Retinitis pigmentosa. RZ-004, AAV vector encoding a rhodopsin RNA-targeting trans-splicing ribozyme along with wild type rhodopsin, specifically targets and reprograms pathogenic mutant Rhodopsin mRNA into normal Rhodopsin mRNA, thereby leading to the therapeutic effect. Since RZ-004 targets conservative upstream region of the rhodopsin mutations, all different types of mutations in each patient could be treated with one therapy. "The Clinical Trial Notification (CTN) marks an important milestone in addressing the high unmet medical need of autosomal dominant retinitis pigmentosa with rhodopsin mutation," said Dr. Seong-Wook Lee, Chief Executive Officer of Rznomics. "Rznomics is committed to developing innovative RNA-based biopharmaceuticals for the treatment of various human rare and intractable diseases, and we look forward to the initiation of the clinical trial to evaluate the safety and efficacy profile of RZ-004 for providing a potential treatment option for patients suffering from the disease." About Rznomics Inc. Rznomics is a biopharmaceutical company founded in 2017 with the vision of developing RNA-based gene therapies for cancer and incurable diseases. Rznomics' core platform technology is RNA editing technology based on an RNA replacement enzyme, known as trans-splicing ribozyme, which can specifically target and cleave disease-causing RNA and simultaneously replace the whole part of targeted downstream RNA with therapeutic RNA to selectively and regulatedly induce therapeutic gene expression in cells expressing the target RNA. The RNA replacement enzyme platform is being developed for numerous indications such as malignant diseases including hepatocellular carcinoma and glioblastoma, retinitis pigmentosa, rett syndrome, and alzheimer's disease. For more information, please visit SOURCE Rznomics Inc.