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【JMC】具有增强药代动力学特性的新型两性PROTAC用于降解
ALK
蛋白
2024-06-21
·
精准药物
蛋白降解靶向嵌合体
临床结果
近日来自四川大学华西医院肿瘤中心的团队在 JMC 期刊上发表了题为Novel Amphiphilic PROTAC with Enhanced Pharmacokinetic Properties for ALK Protein Degradation的文章。文章主要介绍了新型两性PROTAC在降解
ALK
蛋白中具有增强的药代动力学特性。 图 1 尽管在抗
肿瘤
领域中PROTAC已成为药物开发领域最有前途的技术之一,但阻碍PROTAC技术进步的主要挑战包括水溶性差、生物利用度低和
肿瘤
细胞选择性不足。为了克服这些障碍,该研究介绍了一种新的亲两性PROTAC,B1-PEG,通过优化的PROTAC分子B1的PEGylation合成,以增强其特性。B1-PEG在水中自我组织成胶束,并在
肿瘤
细胞释放其活性形式,以应对
肿瘤
特异性高
GSH
环境。药代动力学分析显示,B1-PEG的优越生物利用度为84.8%,优于未经修饰的PROTAC分子B1。在H3122异种移植小鼠模型中测试时,B1-PEG显著抑制瘤体的生长,强调了其作为靶向
癌症
治疗的强大候选者的潜力。该发现为克服PROTAC药物设计中的生物利用度限制提供了一个有希望的方向。 图 2
EML4-ALK
融合基因被认为是
非小细胞肺癌(NSCLC)
最重要的驱动因素之一。目前已经开发了几种基于第二代
ALK
抑制剂的
EML4-ALK
降解剂,并证明了其蛋白质降解的潜力。然而,这些分子有溶解度或生物利用度问题,如B3和
AP-1
。为了确保
EML4-ALK
蛋白的降解能力并保持该分子的疏水性,作者开发了带有烷基链接剂的
ALK
降解剂,然后通过二硫键连接PEG分支,以产生目标两亲性PROTAC。由于两亲性PROTAC分子由亲水性末端和疏水性末端组成,因此假设两亲性PROTAC可以在水溶液中自组装成胶束颗粒,从而提高PROTAC分子的水溶性。此外,低水平的外周循环GSH保持两亲性PROTAC分子的稳定性,延长其在体内的循环时间,从而增强其PK特性(图2A)。随后,由于
肿瘤
细胞中的GSH水平高,亲两性PROTAC分子中的二硫键迅速减少和断开,从而释放活性PROTAC分子并发挥其抗
肿瘤
增殖作用。相比之下,正常细胞中较低的GSH水平使二硫键不太可能减少,从而避免了大多数有毒副作用。 图 3 通过评估多个PROTACs在几个细胞系中的抗
肿瘤
增殖活性和靶蛋白降解功效。B1-PEG被选为进一步研究
ALK
蛋白降解机制的候选分子。如图3F所示,使用0.25 uM B1-PEG治疗4小时后,
ALK
蛋白水平下降,并在24小时达到最大值。相应地,p-ALK水平持续抑制,仅在48小时后略有恢复。此外,通过用蛋白酶体抑制剂MG132或E3配体Pomalidomide预处理细胞,证明EML4-ALK蛋白被B1-PEG分子降解取决于UPS系统(图3I)。与此同时,p-ALK蛋白的水平也相应增加。然而,对于
Ceritinib
预处理组,尽管
ALK
蛋白的降解被部分抑制,但它仍然不影响其对
ALK
磷酸化的抑制。 图 4 在表征两亲性PROTAC分子B1-PEG的胶束形成能力和细胞吸收能力之前,首先研究了B1-PEG在PBS和GSH环境中的稳定性。在PBS缓冲液中孵化2小时后,B1-PEG的含量基本保持不变(图4A)。然而,在含有2.5 mM GSH浓度的PBS缓冲液中,B1-PEG分子在还原其二硫键后迅速降解,同时产生产物B1-SH和B1-SS-GSH(图4B)。随后,对两性分子B1-PEG在水溶液中形成胶束的自组装能力进行了初步表征。在透射电子显微镜下观察到由B1-PEG自组装的规则形状的球形胶束的形成(图4C)。这些证据证明B1-PEG作为两亲性PROTAC分子,具有在水溶液中自组装成胶束的能力。有趣的是,在实验过程中观察到B1-PEG分子的水溶液在被紫外线激发时表现出绿色荧光。因此,利用这一功能来研究B1-
PEG
的细胞吸收能力。用B1-PEG预处理H3122细胞,浓度为1uM,并使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)测量其发射光谱。结果表明,在405纳米的激发波长下,B1-PEG分子的最大发射波长为513纳米。随后,使用CLSM研究H3122细胞在不同浓度下对B1-PEG的细胞吸收,并对吸收机制进行了初步调查。如图4D所示,在给定浓度下,H3122细胞对B1-PEG的吸收没有表现出明显的浓度依赖性。当用内吞作用抑制剂
阿米洛利
、
氯丙嗪
和基因位酮治疗细胞时,在用
阿米洛里
治疗的组中观察到荧光显著减少。这表明B1-PEG形成的胶束通过大肾小球细胞增多介导的内吞通路被细胞积极吸收。与被动运输相比,这无疑允许药物更有效地进入细胞,从而发挥其治疗效果。作者推测,这种荧光效应是由波马利度胺引起的,这一发现可能对研究具有类似结构的PROTAC分子的细胞和组织分布具有积极影响。然而,具体的机制仍然需要进一步验证。 图 5 为了研究B1-PEG的体外抗
肿瘤
机制,利用流式细胞仪进行细胞凋亡分析。21.3%的H3122细胞在接受1uM B1-PEG治疗48小时后发生凋亡,而
Ceritinib
治疗组仅观察到16.6%(图5A)。对于细胞周期分析,发现B1-PEG在较低浓度下阻止G0/
G1
相的细胞周期的能力很弱,但这种能力随着浓度的增加而显著增强(图5B)。特别是当浓度达到1μM时,化合物B1-PEG在G0/G1阶段抑制了高达84%的细胞,这与阳性对照Certinib(1μM时为82.5%)的情况相似。这些结果的原因可能是,与
ALK
抑制剂塞里替尼的“占用驱动”机制不同,B1-
PEG
作为
ALK
降解剂,可以显著降低细胞内
ALK
水平,并完全抑制其酶和非酶功能,从而导致强大的抗
肿瘤
增殖作用。 克隆形成分析评估经过B1-PEG处理的H3122细胞的致癌能力,B1-PEG以浓度依赖性的方式显著减少了克隆的数量,并且在0.5uM下完全抑制了克隆的形成。这些结果表明,B1-PEG可以有效诱导G0/G1阶段H3122细胞的细胞周期停止,从而诱导早期凋亡,并最终抑制H3122细胞的增殖和入侵。 图 6 为了进一步研究B1-PEG的体内抗
肿瘤
疗效,对大鼠的B1-PEG和B1进行了PK分析,相应结果如图6所示。通过静脉或腹腔注射给大鼠注射单剂量B1-PEG或B1,然后在不同时间采集静脉血液样本,并分析药物浓度水平。发现B1-PEG和B1在给药后都被迅速吸收,但B1-PEG的吸收率和峰值血浆浓度明显高于B1。给药4小时后,B1-PEG的血液浓度达到最大值,Cmax值为166.7微克/毫升(53.8纳摩尔/毫升),而B1的C最大值为0.3微克/毫升(0.3纳摩尔/毫升)。B1的绝对生物利用度为63.5%,而B1-PEG的绝对生物利用度已大幅提高,达到84.8%。这些结果表明,与B1相比,化合物B1-PEG具有增强的PK特性,适合进一步研究体内抗
肿瘤
活性。 图 7 基于B1-PEG和B1在PK分析中的优异结果,接下来评估了B1-PEG和B1在H3122异种移植模型中的疗效。治疗18天后,所有治疗组的
肿瘤
体积都显著减少(图7A和B)。特别是,使用B1-PEG(I.P.,75 mg/kg)治疗的小鼠的
肿瘤
体积表现出明显的回归,而B1的
肿瘤
生长抑制(TGI)率仅为71%,同一剂量的
塞里替尼
仅为88%(约25微摩尔/千克)。还进行了免疫组织化学(IHC)和WB分析,探测
肿瘤
组织中的
EML4-ALK
表达水平(图7D和E)。B1-PEG和B1治疗组的EML4-ALK蛋白都低于载体组。至于
塞里替尼
治疗组,没有观察到EML4-ALK蛋白水平的显著下降。在给药期间,治疗组的所有小鼠都存活下来并保持了稳定的体重,没有观察到明显的体重下降(图7B)。最终剂量后,对小鼠进行安乐死,并使用H&E染色收集器官进行组织病理学分析。每个治疗组的生理形态和功能都是正常的(图7F)。这些结果表明,B1-PEG具有良好的体内安全状况。 总之,与相同剂量的化合物B1和阳性对照
塞里替尼
相比,B1-PEG表现出优异的
肿瘤
生长抑制。此外,与B1相比,它表现出增强的PK特性。这一发现有望加速PROTAC药物的临床开发。然而,拉长的PEG链可能会增加药物的分子量,需要更高的剂量,过多PEG片段可能会导致不可预见的免疫原性,在后续研究中需要谨慎设计。 声明:发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要,并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断,后果自负。若有侵权,告知必删! 长按关注本公众号 粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看,请点这里↓
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机构
-
适应症
癌症
糖皮质激素可治疗的醛固酮增多症
非小细胞肺癌
靶点
ALK
EML4-ALK
AP-1
[+2]
药物
塞瑞替尼
盐酸阿米洛利
盐酸氯丙嗪
标准版
¥
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