AIF1

学术前沿 单细胞结合空间转录组的研究思路和案例分享 ——肿瘤免疫研究领域（下） 01 引言 单细胞转录组测序是在单个细胞水平进行高通量转录组测序的一项技术，其能有效解决细胞异质性以及之前bulk RNA-seq被掩盖的种种问题。随着该技术在分辨率和通量方面的不断优化，研究者从异质性样本中分析细胞类型特异性基因调控网络的能力也相对提高，但是在细胞的空间位置水平尚有欠缺。空间转录组技术于2020年被《自然》杂志评为年度技术，可以解析时间和空间维度上单个细胞的基因表达模式，以及细胞类群的空间位置关系及生物学特征。其原理是将空间条形码寡核苷酸引物固定在载玻片上，然后将组织贴于载玻片实现组织内转录组序列的捕获与检测。随着10x Genomics的空间Visium技术的登场和不断更新加强，单细胞联合空间转录组的研究如火如荼的开展，遍布了遗传、发育、肿瘤、免疫等多个生物科研和医学热门领域。 一、研究目的 1.某肿瘤中，整体的细胞图谱、空间图谱及细胞间机制探索。 2.某肿瘤中，不同进展期（病变期）、不同亚型、特殊基因表达或原发灶与转移灶样本之间差异机制探索。 3.某肿瘤中，肿瘤对治疗方案的疗效应答中的差异机制探索。 二、样本选择 1. 某癌种中，根据其样本类型的特殊性，选择一定数量的样本，包括新鲜组织、冰冻组织或石蜡样本。 2. 某癌种中，根据原发灶和转移灶、免疫类型（浸润型、沙漠型、排斥型）、基因表达（阴/阳）或不同病理亚型的分组取样。 3. 某癌种中，根据PD1免疫药物治疗/靶向药物治疗/常规放化疗等治疗药物，新辅助、转化治疗等方案，选取应答/无应答、治疗前/治疗后的样本分组取样检测。 三、研究方法 1.主要研究方法：主要应用在发现探索阶段的方法,一般包括流式细胞技术(Facs)、单细胞组学（scRNA-seq）、空间转录组(visium HD)、多重免疫荧光染色(mIF)、探针原位杂交（Xenium）等； 2.其他辅助方法：辅助研究方法应用在机制验证方面，会根据验证模型的不同水平，比如细胞水平、动物模型、人源组织、类器官、网络数据库等等，对应各种生物检测分析方法并没有固定的思路。 四、分析思路 1.单细胞图谱：细胞类型的空间分布特征，亚群的图谱分类； 2.空间图谱绘制：细胞类型的空间分布特征，亚群的定位； 3.各个亚群细胞中的特征，寻找对比差异显著的细胞亚群，从剖析细胞/基因功能空间动态变化、空间细胞分化规律（拟时序）去分析细胞发生的机制和可能作用； 4.各类细胞亚群的相关性，通过细胞通讯、ST定位以及IHC或mIF等图像直观证明细胞亚群间特异的互动关系； 5.实验验证靶点和机制：细胞水平、类器官水平、动物模型水平做敲除干预治疗等验证。 五、文献分享 案例1 《单细胞和空间转录组分析揭示了肝转移性结直肠癌的细胞异质性》 发表期刊：Cell，影响因子：11.5 研究背景：结直肠癌(CRC)是世界上第三大最常见的恶性肿瘤，而转移性 CRC 的生存率很低。CRC转移过程是一个多步骤的过程，包含了癌细胞和基质细胞之间的交流通过分泌细胞因子、生长因子和蛋白酶来促进转移性扩散，从而重塑肿瘤微环境。TME 的细胞组成非常复杂，包括多种成纤维细胞和免疫细胞，它们在癌症逃避、转移和治疗反应中发挥着重要作用。癌症相关成纤维细胞（CAF）是许多类型恶性肿瘤（包括 CRC、乳腺癌和胰腺癌）的主要基质细胞成分。为了全面绘制结直肠癌和匹配的肝转移的细胞景观，研究人员使用scRNA-seq结合空间转录组(ST)和免疫组织化学(IHC)染色以及流式细胞术生成了高分辨率的细胞图谱。 检测技术组合：流式细胞术、单细胞转录组、空间转录组 样本类型：1. 6例CRC患者的27份样本，包括原发性结直肠癌(CC)、邻近正常结直肠粘膜(CN)、肝转移(LM)、邻近正常肝组织(LN)和外周血(PB)五种组织类型用于单细胞转录组检测。 2. 6例CRC患者，包含4例CRC原发性肿瘤（C1至C4）和2例肝转移性肿瘤（L1和L2）采用空间转录组。 主要结果： 1.根据免疫和非免疫细胞群，分别展示了CRC原发肿瘤和CRC肝转移性肿瘤的单细胞转录组图基本分类，以及原发和转移的差异。 Fig.1.CRC原发及肝转移中的全球细胞景观 2.CRC原发性肿瘤和CRC源性肝转移性肿瘤的空间分布 在ST组织中鉴定出B细胞、 T细胞、 NK细胞、浆细胞、髓样细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞和内皮细胞。这些细胞簇的比例和分数在每个地区都不同。与C1、C3和C4的肿瘤旁组织相比，肿瘤组织中浆细胞的比率降低。 Fig.2.空间转录组样本的细胞鉴定 3.原发性肿瘤和肝转移性肿瘤之间肿瘤细胞的转录组异质性 亚聚类分析揭示了肿瘤细胞的不同分化谱系。在各群中鉴定出簇状细胞的分化标志基因。肿瘤细胞群的异质性表明肿瘤细胞的分化潜力。 为了进一步研究不同肿瘤细胞簇的功能通路和转录程序，进行了基因集变异分析（GSVA）和转录因子（TF）分析。结果显示，表明CA2可能是TME中的干细胞亚群。 Fig.3.原发性和转移性肿瘤细胞的转录组特征和异质性 4.TME重塑髓系细胞的组成 鉴定出三种髓系细胞：单核细胞/巨噬细胞、树突状细胞和肥大细胞。使用亚聚类分析确定了8个单核细胞/巨噬细胞簇和3个常规DC（cDC）簇，GSVA分析显示，Mac_SPP1亚群参与了与炎症反应相关的通路。拟时序显示Mac_CXCL9 和 Mac_SPP1 亚群均发生终末分化，表明它们是肿瘤激活的Mac亚群。cDC_LAMP3 亚群还表现出高水平的成本刺激分子CD40CD80和CD86 表达，它们是DC成熟的标志物。在LM中，cDC_LAMP3亚群的比例显著增加表明肿瘤细胞对TIME的重塑作用。 Fig.4.骨髓细胞的免疫景观 5.CXCL13T 细胞在肝转移性肿瘤中富集 在 T 细胞中，7个CD8 T细胞簇、5个常规CD4 T（cCD4）细胞簇和2个调节T细胞簇被识别。从细胞比例显示，无论是CD8还是CD4的T细胞，LM的CXCL13T细胞子集比例都很高。GSVA分析显示，CD8_CXCL13亚群富含T细胞增殖通路，CD4_CXCL13 亚群富含G细胞+2-M检查点通路。用流式细胞术鉴定了CD69+CD103+CD8+T细胞。CC和LM的CD69+CD103+CD8+T细胞的Ki67表达水平均高于其他CD8+T细胞。然而，来自CN和LN的不同CD8+T细胞亚群的增殖特性几乎相同。 Fig.5.CXCL13+T细胞在肝转移瘤中富集 6.CXCL13 T细胞与CRC患者的良好预后相关 在上图验证CD8_CXCL13细胞可能是肿瘤激活的亚群。进一步对CD8_CXCL13子集的特征做深入研究。与其他亚群相比，在CD8_CXCL13亚群中观察到高水平的耗竭标志物，且耗竭表型表明它们的肿瘤反应性。IHC难以检测组织中的CXCL13，因此选用CD69和CD103标记CXCL13细胞，结果显示该群T细胞比肿瘤组织中的其他CD8 T细胞更接近CK19肿瘤细胞。将基因表达综合（GEO）队列中的CRC患者分为CXCL13+高和CXCL13低组，发现CC中 CXCL13 的较高表达预示着更好的总生存期。 Fig.6. CXCL13+ T细胞的特性及预后影响 7.成纤维细胞的不同亚群存在于 CRC 的原发性和肝脏转移性肿瘤中 在CRC的TME中鉴定出8个具有不同基因表达模式的成纤维细胞簇，然后研究人员对各类成纤维细胞分别做了转录组数据比较、IHC组化、拟时序分析、以及ST分析，在CRC原发性和肝转移性肿瘤之间观察到不同的表型谱和成纤维细胞的高度可变频率，这表明在不同癌症环境中TME内的细胞异质性。 Fig.7. 原发性和转移性肿瘤中成纤维细胞的转录组特征和异质性 8.在原发性肿瘤中富集的 F3 表达成纤维细胞亚群分泌促肿瘤因子，并与 CRC 患者的不良预后相关 为了研究富含CC和LM的不同成纤维细胞对TME 的重塑，研究人员分析了F2_MCAM和F4_F3的特征。通过差异基因富集以及F4_F3细胞与肿瘤细胞之间揭示了通过NRG1和Erb-B2受体酪氨酸激酶3 （ERBB3）通路进行串扰。在ST中发现了两类细胞 F3与NRG1的共定位并通过transwell细胞实验迁移证明。最后在预后数据中发现F3和NRG1 高表达水平的CRC患者总生存期较差。 Fig.8. F3+成纤维细胞的特性及预后影响 9. LM的TME中表达MCAM的成纤维细胞通过Notch 信号通路调节CD8_CXCL13细胞的产生 之前发现RBPJ在LM中的表达与CXCL13和ITGAE呈正相关。为了进一步了解两个亚群受到什么类型的细胞调节Notch信号，采用cellphoneDB分析，在内皮细胞中E2_DLL4亚群与CXCL13+ T细胞的相互作用最强，在成纤维细胞中F2_MCAM簇通JAG1-NOTCH1与CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亚群相互作用。由于TME中成纤维细胞的分散分布模式，推测F2_MCAM亚群有助于CXCL13+ T细胞中Notch信号的激活。此外根据LM中F2_MCAM的比例高低，发现F2_MCAM高组患者LM中CD8_CXCL13亚群的浸润评分更高，并在ST中得到了验证，使用JASPAR预测表明RBPJ可能作TF影响CXCL13的表达。 Fig.9. TME中的NOTCH信号调节CD8_CXCL13细胞的生成 10.ST组织中的细胞间相互作用网络 原发性肿瘤和肝转移性肿瘤ST中不同簇之间的细胞相互作用，表明ERBB3-NRG1相互作用在原发性肿瘤发生和转移中的潜在作用，发现在CRC原发肿瘤中富集的F3成纤维细胞可以通过产生各种促肿瘤因子（包括 NRG1）来调节发展和/或迁移，这些因子与肿瘤细胞上表达的ERBB3相互作用以发挥其促肿瘤功能。 Fig.10. ST组织中的细胞配体和受体相互作用 案例2 《空间和单细胞转录组学揭示了HNSCC中与癌症相关的成纤维细胞亚群限制了CD8+ T细胞的浸润和抗肿瘤活性》 发表期刊：Cancer Research，影响因子：12.5 样本类型：5例头颈部鳞状细胞癌HNSCC癌和癌旁组织； 技术组合：单细胞RNA转录组、空间转录组、免疫组化、免疫荧光、其他等等； 研究背景：免疫治疗可以延长一些HNSCC患者的生存期，但应答率仍然很低。阐明肿瘤微环境中cd8+t细胞浸润和功能障碍的关键机制有助于最大限度地发挥免疫治疗HNSCC的益处。CD8+T细胞与包括CAFs在内的其他类型细胞之间的相互作用决定了CD8+T细胞如何在这一动态TME中发挥作用，本研究对五对肿瘤和邻近组织的不同免疫浸润和单细胞RNA测序的HNSCC标本进行了空间转录组学分析，揭示了与cd8 + t细胞浸润限制和功能障碍相关的特定癌症相关成纤维细胞(CAF)亚群。 技术路线： 主要结果： 1. HNSCC肿瘤组织对CD8+T细胞具有招募趋化作用，CD8+T细胞存在于肿瘤基质中，且免疫排斥型的HNSCC中CD8a+被受限无法浸润到肿瘤巢中； Fig 1.CD8+T细胞在不同HNSCC肿瘤亚型中的分布 2.MHC-IhiCAFs（5亚群）是肿瘤组织中区别于癌旁组织的最主要的CAFs亚群，高表达CXCLs和MHC-I增强了CAFs与CD8+T的结合，且可通过限制CD8+T细胞的抗肿瘤能力造成预后不良； Fig 2.HNSCC肿瘤及邻近组织成纤维细胞的整体分析 3. MHC-IhiCAFs中存在LGALS9（编码galectin-9蛋白）的富集，大部分HNSCC肿瘤基质中均存在galectin-9蛋白的表达；MHC-IhiCAFs中galectin-9蛋白的表达依赖于干扰素信号； Fig3. TCF1 ~ GZMK ~ CD8 + T细胞与galectin-9的CAF细胞呈负相关 4.在CAFs中敲减LGALS9表达会降低CD8+T表达免疫检查点分子，同时促进干性和细胞毒性分子的表达，且动物实验证明Gal-9+CAFs促进干细胞样CD8+T细胞耗竭转化。 图4. 动物实验验证MHC I类的高表达限制了cd8+T细胞的抗肿瘤功能 案例3 《上皮细胞激活成纤维细胞促进食管癌的发展》 发表期刊：Cancer cell，影响因子：48.8 样本类型：29例ESCC患者79个多期食管病变的正常上皮、癌前病变和癌组织； 技术组合：单细胞RNA转录组、空间转录组、免疫组化、免疫荧光、其他等等； 研究背景：食管鳞状细胞癌(ESCC)的发展经历了多阶段上皮癌的形成，即从正常上皮、低级别和高级别上皮内瘤变到浸润性癌。然而，癌前病变如何发展为癌机制尚未可知。 主要结果： 1.ESCC多阶段肿瘤发生过程各种细胞类型图谱分析 Fig 1.单细胞转录组学分析揭示了ESCC多阶段肿瘤发生过程中的各种细胞类型 2.上皮细胞中ANXA1的功能失调可能是ESCC肿瘤发生中至关重要的事件； Fig 2.上皮细胞在ESCC肿瘤发生过程中逐渐抑制ANXA1表达 3.ESCC肿瘤发生过程中上皮细胞与成纤维细胞的相互作用，食管上皮细胞产生的ANXA1功能的丧失可能导致NF-CAF转化； Fig 3.上皮细胞抑制ANXA1可促进NF向CAFs转化 4.KLF4、KLF5、CEBPB和FOXA1与ANXA1的RNA水平呈正相关，细胞实验发现只有靶向KFL4的SiRNA可显著抑制ANXA1表达，KLF4调节ANXA1转录，促进NFs向myCAF的转化。 图4.在体外和体内，抑制上皮细胞ANXA1可促进myCAF的激活 参考文献： [1]Wang F, Long J, Li L, Wu ZX, Da TT, Wang XQ, Huang C, Jiang YH, Yao XQ, Ma HQ, Lian ZX, Zhao ZB, Cao J. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 2023 Jun 16;9(24):eadf5464. doi: 10.1126/sciadv.adf5464. Epub 2023 Jun 16. PMID: 37327339; PMCID: PMC10275599. [2]Li C, Guo H, Zhai P, Yan M, Liu C, Wang X, Shi C, Li J, Tong T, Zhang Z, Ma H, Zhang J. Spatial and Single-Cell Transcriptomics Reveal a Cancer-Associated Fibroblast Subset in HNSCC That Restricts Infiltration and Antitumor Activity of CD8+ T Cells. Cancer Res. 2024 Jan 16;84(2):258-275. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-23-1448. PMID: 37930937; PMCID: PMC10790129. [3]Chen Y, Zhu S, Liu T, Zhang S, Lu J, Fan W, Lin L, Xiang T, Yang J, Zhao X, Xi Y, Ma Y, Cheng G, Lin D, Wu C. Epithelial cells activate fibroblasts to promote esophageal cancer development. Cancer Cell. 2023 May 8;41(5):903-918.e8. doi: 10.1016/j.ccell.2023.03.001. Epub 2023 Mar 23. PMID: 36963399. 本文由 科研学术部 何鼎 提供

阿尔茨海默症（Alzheimer's Disease, AD）是一种主要影响老年人的神经退行性疾病，全球病例数量不断增加。近年来，肠道菌群失衡被认为与AD的发病机制密切相关，尤其是微生物代谢物对神经炎症的调控作用。然而，目前尚不清楚肠道微生物组和大脑中的神经炎症如何相互作用，或者这些相互作用如何影响大脑功能和认知。 近日，中国中医科学院赵海誉研究团队在Alzheimers Res Ther发表了题为Intestinal endogenous metabolites affect neuroinflammation in 5×FAD mice by mediating "gut-brain" axis and the intervention with Chinese Medicine的研究论文，揭示了肠道微生物群的改变对AD进展的重要影响，特别是在神经炎症和代谢调控方面的作用。研究发现，通过调控“肠脑轴”的代谢产物，可能为AD的治疗提供新的干预靶点。 1. AD进展与肠道菌群的改变 认知缺陷表现 5×FAD小鼠（转基因小鼠，简称Tg-M）在认知功能评估中显示出明显的认知缺陷，尤其在Y迷宫和莫里斯水迷宫（Morris Water Maze, MWM）测试中，定位平台所需时间显著长于野生型小鼠（Wild-Type Mice, WT-M）。 在MWM的探查试验中，Tg-M小鼠在目标象限的停留时间、移动距离和穿越平台的次数均低于WT-M小鼠。此外，尽管通常焦虑水平较高的动物在中心区域的探索时间较短，但Tg-M小鼠在该区域的停留时间是WT-M小鼠的2.4倍，且排泄的粪便量也显著增加。 雌性5×FAD小鼠（转基因小鼠，简称Tg-F）体重较低，表现出更高的死亡率和攻击性，其在认知任务中的表现显著低于同龄的Tg-M小鼠，尤其在MWM测试中潜伏期增加。 图1. AD小鼠认知缺陷和焦虑增加 CNS神经炎症 5×FAD转基因小鼠表现出加速的认知障碍、早期的淀粉样蛋白（Aβ）沉积以及突触退化，尤其在雄性小鼠的海马和皮层区域观察到快速的Aβ斑块积累。 ELISA检测显示，Tg-M小鼠大脑中三种Aβ（Aβ38、Aβ40、Aβ42）的浓度显著高于WT-M小鼠。免疫染色结果表明，5×FAD小鼠的大脑中活化的小胶质细胞和星形胶质细胞数量增加，尤其在Aβ斑块周围，这导致神经炎症和血脑屏障功能障碍。 此外，RT-PCR和Western blot分析发现主要组织相容性复合物II类（MHC-II）和促炎细胞因子（如IL-1α、TNF-α、MCP-1）的表达增加，抑制了小胶质细胞对Aβ的清除功能。与雄性小鼠相比，雌性Tg-F小鼠表现出更严重的神经炎症，其大脑中Aβ、IBA-1和GFAP水平显著提高。 图2. Aβ升高会诱发神经炎症 外周免疫系统变化 5×FAD小鼠在外周免疫系统中表现出明显的功能失调，尤其是Th1（CD3+CD8−INFγ+）、Th2（CD3+CD8−IL4+）和Th17（CD3+CD8−IL17α+）细胞在转基因小鼠（Tg-M）脾脏中的比例显著高于野生型小鼠（WT-M），而调节性T细胞（Treg, CD4+CD25+Foxp3+）的频率则降低。 Th1细胞被认为在阿尔茨海默症（AD）中具有有害作用，其水平升高与小胶质细胞激活、炎症因子表达增加、认知功能受损和突触可塑性紊乱相关。研究发现，尽管Tg-M小鼠的Th1和Th2细胞均有所增加，但Th1/Th2比率下降，表明外周炎症加剧可能导致Th1细胞的升高和Th2细胞的过度分泌，进而引发Th1/Th2失衡。Treg细胞在AD中起到神经保护作用，其暂时耗竭会加速认知障碍并促进小胶质细胞清除Aβ沉积。 图3. AD小鼠脾脏中免疫细胞的水平 抗生素诱导的肠道微生物组扰动影响了认知和神经炎症 抗生素（ABX）诱导的肠道微生物组扰动显著影响了5×FAD小鼠（Tg-M）的认知功能和神经炎症。16S rRNA基因扩增子测序显示，Tg-M小鼠粪便中的α微生物多样性显著增加，而PLS-DA分析揭示其肠道微生物组成发生了明显变化。ABX治疗导致Tg-M小鼠的α多样性急剧下降，并打破了肠道菌群的结构稳态，同时Aβ聚集减少，表明抗生素治疗促进了小胶质细胞的清除功能。 此外，ABX还降低了脑内MHC II类和炎症细胞因子（如IL-1α、TNF-α和MCP-1）的表达，可能重置了小胶质细胞的吞噬功能。ABX显著改善了Tg-M小鼠的认知障碍和焦虑，表现在MWM任务中的学习记忆提升和开放场测试中粪便排泄减少。这些结果表明，“肠脑轴”能够实现双向信息传递，且Tg-M小鼠的功能通路在氨基酸、碳水化合物和能量代谢等方面较WT-M小鼠更为丰富。 图4. 肠道微生物多样性的改变 2. 肠源性代谢物变化与氨基酸、碳水化合物和能量代谢的关系 短链脂肪酸（SCFAs）由肠道微生物发酵膳食纤维产生，调节能量代谢，并在微生物-肠-脑相互作用中发挥重要作用。 在Tg-M小鼠的粪便中，SCFAs产生菌的丰度显著变化，具体表现为有益菌如Erysipelotrichaceae和Bifidobacteriaceae的减少，以及Lachnospiraceae的增加。此外，Tg-M小鼠粪便中的哌啶酸（PA）水平下降，异丁酸（IBA）水平上升。纵向研究显示，Tg-M小鼠在9至11个月期间的粪便SCFAs水平快速增加，表明肠道微生物群的动态变化与SCFAs生成密切相关。 图5. AD小鼠粪便中 SCFA 的改变 3. 肠源性代谢物是肠脑轴的沟通中介 肠源性代谢物通过血液进入全身，影响大脑功能并在阿尔茨海默症等神经疾病中影响认知。使用气相色谱-串联质谱（GC-QQQ-MS）和液相色谱-串联质谱（LC-QQQ-MS）研究发现，5×FAD小鼠（Tg-M）的大脑中短链脂肪酸（SCFAs）水平与小胶质细胞激活呈正相关，且Tg-M小鼠的粪便、血清和脑组织中IBA水平高于野生型小鼠（WT-M）。 外周血中丙氨酸、色氨酸、牛磺酸等氨基酸水平显著增加，同时大脑中的丙氨酸、甲硫氨酸、GABA等浓度也显著升高。Tg-M小鼠表现出葡萄糖代谢障碍和线粒体功能障碍，PICRUSt分析预测其能量代谢出现障碍。在Tg-M小鼠中，丙酮酸水平显著升高，而柠檬酸和琥珀酸水平则显著降低，且外周和大脑中的代谢物变化趋势一致。这些结果表明，缺氧加重的线粒体功能障碍与Tg-M小鼠中脂质过氧化增加的现象相关。 图6. AD小鼠外周血和脑内源性代谢物的变化 4. 黄连解毒汤（HLJDD）通过调节肠道微生物代谢缓解AD小鼠的神经炎症 在对5个月大的雄性5×FAD小鼠进行六个月的HLJDD治疗后，研究发现其认知障碍和焦虑显著改善，表现为莫里斯水迷宫（MWM）测试中的学习和记忆能力提升，以及开放场测试中排便量减少。 HLJDD通过降低由Aβ和免疫细胞相互作用引发的炎症因子（如IL-1α和INF-γ）分泌，缓解了神经炎症。分析显示，HLJDD重塑了小鼠的肠道微生物结构，增加了SCFA产生菌的丰度，并降低了SCFAs的整体水平。HLJDD组的SCFAs水平与某些细菌群体呈负相关，而与其他细菌群体呈正相关。 此外，HLJDD还提高了粪便中胆碱水平，降低了色氨酸、GABA、牛磺酸和亮氨酸的含量，并通过调节外周免疫细胞（降低Th1和Th2细胞，增加Treg细胞）进一步改善了5×FAD小鼠的神经炎症和认知功能。 小结 总体而言，本研究探讨了肠道微生物群的改变如何影响阿尔茨海默症（AD）的进展，结果显示5×FAD小鼠在认知测试中表现出明显的缺陷，伴随脑中Aβ沉积和神经炎症的加重。 研究发现，短链脂肪酸（SCFAs）产生菌显著减少，而异丁酸等代谢物浓度升高，这些变化与神经炎症和认知功能下降密切相关。同时，外周免疫系统中的Th1细胞比例增加，调节性T细胞（Treg）比例减少，导致免疫失衡。 这些结果强调了“肠脑轴”在AD进展中的关键作用，表明通过调节肠道微生物及其代谢产物可能为AD的干预提供新的治疗靶点，为未来研究与临床应用奠定了基础。 参考文献： Gu X, Fan M, Zhou Y, et al. Intestinal endogenous metabolites affect neuroinflammation in 5×FAD mice by mediating "gut-brain" axis and the intervention with Chinese Medicine. Alzheimers Res Ther. 2024;16(1):222. Published 2024 Oct 14. doi:10.1186/s13195-024-01587-5 本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！ 点击下方「阅读原文」，前往生物谷官网查询更多生物相关资讯~

*仅供医学专业人士阅读参考只要提起阿尔茨海默病的发病机制，大家的脑子里肯定会浮现“Aβ级联”假说，毕竟它是阿尔茨海默病发病机制的主流学说。然而，这一假说背后一直存在一个问题：这一病理级联究竟是如何启动？或者换句话说，究竟是什么启动了Aβ斑块的形成？我们都知道，无论是雨滴还是雪花，启动形成的必要条件中都有凝结核（尘埃或盐粒等）。那么Aβ毒蛋白形成Aβ斑块需要“凝结核”吗？如果需要的话，又会是谁呢？今天，由德国慕尼黑工业大学Mikael Simons和Stefan A. Berghoff领衔的研究团队，在著名期刊Immunity上发表一篇重磅研究论文[1]，初步解开了上述谜题。他们基于小鼠模型和人脑组织样本，发现原来小胶质细胞中聚集的APOE蛋白就是驱动Aβ斑块形成的内核，是“Aβ级联”和阿尔茨海默病病理的肇始者，它在小胶质细胞溶酶体内促进Aβ斑块的形成。▲ 论文首页截图那么Simons团队是如何抓住APOE聚集体的呢？他们的出发点其实很简单。他们注意到，包括阿尔茨海默病在内的多种中枢神经系统疾病，都存在APOE上调这一现象；还有很多研究发现，如果敲除小鼠的APOE编码基因，就会导致纤维状淀粉样斑块沉积减少。以上的种种说明，APOE在Aβ纤维化/稳定和/或压实中发挥重要作用。那干脆就从APOE入手。为了能在小鼠体内看到APOE的一举一动，Simons团队先构建了一个很特殊的模式小鼠（ApoE-Halo）。他们先把小鼠的原装APOE编码基因去掉，然后插入融合了HaloTag标签的新APOE基因。一番比较之后，他们发现给APOE加个小标签，不影响APOE蛋白的功能。随后，他们又让ApoE-Halo小鼠与阿尔茨海默病小鼠模型5xFAD小鼠杂交，如此一来就得到了5xFAD ApoE-Halo小鼠，与5xFAD小鼠相比，5xFAD ApoE-Halo小鼠在Aβ代谢方面、APOE和小胶质细胞标志物基因的表达等方面，也没有差异。接下来就可以仔细看看APOE与“Aβ级联”之间的关系了。他们首先看了看APOE的定位。荧光标记结果显示，在5xFAD ApoE-Halo小鼠的大脑中，APOE标记阳性的小胶质细胞（IBA1阳性）增多，而且APOE-Halo的定位与纤维状β折叠斑块重叠（MX04阳性）。▲ 染色结果以上结果说明，Simons团队开发的5xFAD ApoE-Halo小鼠模型，可以用于观察APOE与“Aβ级联”之间的关系。接下来，他们就开始研究5xFAD ApoE-Halo小鼠模型，他们发现这个小鼠模型大脑中的MX04阳性斑块大体可以分成三类：第一类最多，是Aβ标记和APOE标记均强阳性，在小鼠3.5个月和6个月时分别占比82.1%和62.6%；第二类随着疾病进展逐渐增加，是Aβ标记强阳/APOE标记弱阳，从小鼠3.5个月时的4.1%增加到6个月时的19.7%；第三类含量稳定，属于Aβ标记弱阳/APOE标记强阳，小鼠3个月时比例为14%，6个月大时比例为11%。重要的是，阿尔茨海默病患者脑组织样本也表现出类似的特征。▲ 斑块特征Simons团队还通过一些生化方法从斑块中提纯了APOE-Halo蛋白，发现它们形成了多聚体，呈现出一种蛇形纤维形态。如果将纯化的APOE-Halo蛋白加到小胶质细胞的培养液中，就可以检测到斑块的形成。随后，他们还在阿尔茨海默病患者的脑组织样本中证实了APOE聚集体的存在。以上结果说明，APOE确实会在5xFAD小鼠和阿尔茨海默病患者大脑中形成聚集体。▲ 5xFAD小鼠和阿尔茨海默病患者大脑中均存APOE聚集体那APOE聚集体究竟是不是Aβ斑块形成的关键因素呢？Simons团队通过成熟的注射实验，发现纯化的APOE聚集物注射到APOE编码基因被敲除的5xFAD小鼠体内，可以检测到MX04阳性的APOE聚集物，而且它们与Aβ共定位。基于以上研究结果，Simons团队认为APOE聚集物是Aβ斑块形成的辅助因子。▲ APOE聚集物是Aβ斑块形成的辅助因子接下来的问题是：人类的APOE聚集物是Aβ斑块形成的关键么？不同亚型的APOE对Aβ斑块的形成又有什么影响呢？为了回答上述问题，Simons团队又构建了两个新的小鼠模型，APOE3编码基因敲入小鼠5xFAD APOE3 KI和APOE4编码基因敲入小鼠5xFAD APOE4 KI。他们先比较了MX04阳性淀粉样斑块的数量，发现与5xFAD APOE3 KI和5xFAD小鼠相比，5xFAD APOE4 KI的MX04阳性斑块负荷更高。随后，他们又从基因型为APOE3/3和APOE4/4的阿尔茨海默病患者脑组织中，纯化了APOE3和APOE4聚集物，并分别注射到5xFAD小鼠体内，发现与对照相比，两者都能促进MX04阳性斑块的形成。这说明，APOE3和APOE4都可以在Aβ斑块形成过程中充当辅助因子。不过，后续研究表明，与APOE3相比，APOE4对Aβ斑块的影响更大。▲ APOE3和APOE4都可以在Aβ斑块形成过程中充当辅助因子在研究的最后，Simons团队探索了APOE促进Aβ斑块形成的机制。简单来说，脂质化的APOE颗粒（含胆固醇）被小胶质细胞吸收之后，会进入小胶质细胞的溶酶体内发生脱脂作用，胆固醇形成脂滴，而脱脂的APOE变得更容易聚集，形成聚集体；在小胶质细胞出现溶酶体功能障碍和促炎激活的情况下，APOE聚集体就会诱导Aβ斑块在溶酶体中形成。▲ 潜在机制示意图基于以上研究结果，Simons团队认为，在阿尔茨海默病患者体内，APOE表达的上调可能会导致小胶质细胞对脂蛋白颗粒的摄取增强，导致APOE聚集体的形成，而APOE聚集体可能为Aβ成核和/或聚集提供了一个可附着的表面，从而引发病理级联反应，最终导致Aβ斑块的形成。我们都知道，小胶质细胞其实是大脑中的免疫细胞，它在预防Aβ斑块形成和阿尔茨海默病进展的过程中发挥着重要的作用。有研究表明，小胶质细胞功能受损时，Aβ斑块的积累就会增加。不过，也有不少研究发现，清除小胶质细胞可以抑制Aβ斑块的形成。Simons和他的同事认为，这些看起来很矛盾的研究其实并不矛盾，因为它们可能研究的是不同阶段的小胶质细胞。他们认为，小胶质细胞可能同时负责Aβ斑块的生成和降解，而且这两个过程能在溶酶体内同时发生。总的来说，这一发现让我们对“Aβ级联”假说的启动有了新的认知，如果这一机制在人体内被进一步证实，将有助于阿尔茨海默病的防治。参考文献：[1].Kaji et al., Apolipoprotein E aggregation in microglia initiates Alzheimer’s disease pathology by seeding β-amyloidosis. Immunity. 2024. DOI:10.1016/j.immuni.2024.09.014本文作者丨BioTalker