韩国猪流行性腹泻病毒：流行病学、疫苗和控制策略的最新综述

2024-03-21

疫苗引进/卖出

▲ 详细日程见文末 ▲1摘要在过去的三十年里，猪流行性腹泻病毒（PEDV）对韩国国内养猪业构成了重大的金融威胁。PEDV感染主要导致受累分娩至育肥（FTF）猪群持续流行，导致地方性猪流行性腹泻（PED），随后全年反复暴发。本综述旨在鼓励养猪生产者、兽医和研究人员之间的合作，以提供答案，以加强我们对PEDV的理解，以预防和控制地方性PED并为下一次流行病或大流行做好准备。我们发现，合作实施PED风险评估和定制的基于四支柱的控制措施对于阻断受影响畜群中的地方性PED链至关重要：前者可以识别农场风险因素，而后者旨在通过畜群免疫稳定和病毒消除来弥补或改善弱点。在地方性PED下，病毒在浆液中的长期存活。无症状感染的后备母猪（“特洛伊猪”）可以将病毒传播到产房，这是FTF猪场根除PEDV的主要挑战，并突出了在猪群及其环境中主动监测和监测病毒的必要性。本文强调了目前对分子流行病学和市售疫苗的了解，以及控制PEDV的风险评估和定制策略。这稳定群体免疫和消除病毒传播的干预措施可能是建立区域或国家PED根除计划的基石。关键词：猪流行性腹泻病毒，地方性PED，疫苗接种，风险评估，控制策略。2介绍冠状病毒（CoVs）是一大类病毒，可引起人类和动物的呼吸道和消化道疾病，从而对人类和动物健康构成重大威胁。冠状病毒是最大的单链RNA病毒，可分为四个属：冠状病毒家族中的Alpha-、Beta-、Gamma-和德尔塔冠状病毒属。迄今为止，已鉴定出七种猪冠状病毒：传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪呼吸道冠状病毒、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、嵌合猪肠道冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒。在阿尔法冠状病毒属中，猪血凝性脑脊髓炎病毒在Beta冠状病毒属中，猪德尔塔冠状病毒在德尔塔冠状病毒属中。猪冠状病毒的流行困扰着全世界的猪群，并造成了跨物种传播的潜在风险。近几十年来，猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea， PED）的病原体PEDV成为全球养猪业的严重威胁，造成重大经济损失。PEDV目前被归类为经典基因型1a（G1a），最初出现在英国，并在1970年代摧毁了许多欧洲国家的养猪业。然而，在1980至1990年代，欧洲的急性PEDV流行明显下降，此后仅报告了零星的疫情。PEDV（G1a）在1980年代初进入亚洲，损害了亚洲猪肉产业，并构成了巨大的金融威胁。与欧洲的PEDV相比，亚洲的PEDV疫情更为残酷，导致哺乳仔猪死亡率高且该病在多个亚洲国家经常转为地方病。尽管在过去四十年中，PEDV主要在亚洲猪肉生产国肆虐，但这种猪冠状病毒的威胁并未得到全球认可。然而，2013年初，随着高致病性（HP）-PEDV（分为基因型2b（G2b））在美国的突然爆发，PEDV的声誉发生了翻天覆地的变化，每年给美国生猪养殖企业造成了9-18亿美元的损失。美国出现的HP-G2b毒株传播到邻近国家，包括加拿大、墨西哥、哥伦比亚和秘鲁，并最终传播到东亚国家和欧洲，导致2013-2014年PEDV大流行。在韩国，HP-G2b PEDV于2013年底出现并席卷全国，包括济州岛，在全国范围内引起PED灾难。这篇综述的重点是韩国PEDV的现状和控制措施，结合疫苗接种、病毒和群体监测，以根除韩国流行性PED。3病因学3.1 PEDV结构和基因组PEDV属于网巢病毒目、冠状病毒科、α冠状病毒属的佩德科病毒亚属。PEDV有包膜，大致呈球形或多形性，直径为95-190 nm，包括长度为18-23nm的棒状三聚体化突起（图1A）。PEDV基因组和病毒粒子结构详见其他报道。该病毒具有约28kb 的单链正义RNA基因组，基因组末端包含5'-帽和 3'-多聚腺苷酸化尾部结构。PEDV基因组由七个典型的冠状病毒基因组成，包括开放阅读框（ORF）3，其排列顺序为5‘非翻译区（UTR）-ORF1a-ORF1b-S-ORF3-E-M-N-3’UTR（图1B）。ORF1a 和 1b 包含基因组的 5‘-近端三分之二，编码 16 种非结构蛋白（nsp）。基因组 3’近端区域中剩余的ORF编码四种典型的冠状病毒结构蛋白和一个辅助基因 ORF3。这4种结构蛋白包括3个包膜相关的150-220 kDa糖基化刺突蛋白（S）、20-30 kDa膜（M）和7 kDa包膜（E）蛋白以及58 kDa核衣壳（N）蛋白，后者包裹基因组形成长螺旋螺旋结构。图1. PEDV结构和基因组组织的示意图。（A）PEDV结构模型。PEDV病毒粒子结构如左图所示。病毒粒子内的RNA基因组与核衣壳相互作用，（N）蛋白质形成长螺旋核糖核蛋白（RNP）复合物，该复合物被脂质双层包膜包围，其中嵌入刺突蛋白（S）、包膜（E）和膜蛋白（M）；括号中表示每种结构蛋白的预测分子大小。一组相应的亚基因组 mRNA （sg mRNA；2-6），通过这些 mRNA 表达经典结构蛋白或非结构ORF3蛋白，通过这些右图还描绘了共末端不连续转录策略。（B）PEDV基因组RNA的结构。顶部显示了大约28kb的5'-封端和3'-多聚腺苷酸化基因组。病毒基因组的两侧是 UTR，并且是多顺反子的，携带复制酶ORF1a 和1b，然后是编码包膜（S、E 和 M）、N 和辅助 ORF3 蛋白的基因。ORF1a和1b表达通过−1 程序性RFS 产生两种已知的多蛋白（pp1a 和 pp1ab）；这些多蛋白通过共翻译或翻译后加工成至少16种不同的非结构蛋白，命名为NSP1-16（底部）。UTR，未翻译区域；ORF，开放式阅读框；RFS，核糖体移码；A（n），多聚腺苷酸化尾部；PLP，木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶；3CLpro，主要的3C样半胱氨酸蛋白酶；RdRp：RNA依赖性RNA聚合酶；HEL，解旋酶；ExoN，3′→5′核酸外切酶；NendoU，尼多病毒尿苷酸特异性核糖核酸内切酶；2′OMT，核糖-2′-O-甲基转移酶；PEDV，猪流行性腹泻病毒。改编自Lee。3.2 PEDV基因型与其他CoV S蛋白一样，PEDVS糖蛋白（由S1和S2亚基组成）通过与细胞受体相互作用介导病毒进入和通过诱导中和抗体。基因突变，包括插入（insert，IN）和缺失（insert，DEL）以及S基因的重组，可驱动病毒致病性和组织或物种趋向性的改变。考虑到表型和基因型特征，S基因是研究PEDV遗传相关性（即基因分型）和分子流行病学的合适测序位点。因此，使用基于S基因的系统发育学，PEDV可以在基因上分为两种主要基因型和两种亚基因型：低致病性（LP）-G1（经典G1a和重组G1b）和HP-G2（局部流行性G2a和全球流行或大流行性G2b）。G1a毒株包括原型CV777和几种组织培养适应病毒，而G1b代表新型重组变异株，这些变异株首先在中国报道，然后在美国、韩国和多个欧洲国家被发现。G1b毒株起源于次要G1a病毒和主要亲本G2b病毒的自然同源重组。G2包括最近的现场分离株，分为两个亚组：G2a和G2b，前者覆盖了亚洲过去和当前的区域流行病，后者包括导致2013-2014年大流行的当代优势毒株以及目前在美洲和亚洲大陆的疫情。3.3 PEDV生命周期PEDV表现出有限的组织趋向性，与其他CoV一致，并且主要在猪小肠绒毛上皮细胞或肠上皮细胞中复制。尽管猪氨肽酶N（pAPN）长期以来一直被认为是PEDV的假定细胞受体，但目前已知情况并非如此，这表明存在参与病毒进入的真实细胞受体。此外，与细胞表面暴露的唾液酸结合通过促进病毒初始附着在细胞受体上，在PEDV感染中发挥作用。然而，PEDV的复制首先通过S蛋白与小肠绒毛状上皮细胞的未知表面受体结合，然后在内吞作用后通过pH非依赖性融合（病毒和质膜之间）或pH依赖性融合（病毒和内体膜之间）将病毒内化到靶细胞中（图3）未包被的病毒基因组释放到胞质溶胶中，通过不连续合成开始病毒mRNA生物合成和基因组复制。ORF1a和1b立即被翻译成复制酶多蛋白pp1a和pp1ab：前者通过最初的ORF1a翻译产生，而后者由ORF1b翻译表达，具体取决于C末端将pp1a延伸为pp1ab的-1核糖体移码，该移码C末端将pp1a延伸到pp1ab。这些pp1a和pp1ab通过内部病毒蛋白酶蛋白水解成熟，产生 16 种加工终产物，命名为 nsp1-16，其包括复制和转录复合物，该复合物首先使用正链基因组 RNA 参与负链RNA合成。产生全基因组和亚基因组（sg）长度的负链，并用于合成全长基因组 RNA 和3’-共末端sg mRNA。每个sg mRNA仅被翻译成由sg mRNA的 5′-most ORF编码的蛋白质。包膜S、E 和 M蛋白插入内质网（ER）并锚定在高尔基体中。N蛋白与新合成的基因组RNA相互作用，形成螺旋核糖核蛋白（RNP）复合物。子代病毒通过在内质网-高尔基体中间区室预形成的螺旋RNP出芽组装，然后通过光滑壁、含病毒粒子的囊泡与质膜的胞吐样融合释放。因此，PEDV感染会破坏目标肠细胞并损害肠上皮，导致严重的绒毛萎缩和空泡化。这些临床结果会干扰乳汁的有效消化和吸收，导致急性消化不良和吸收不良性水样腹泻，最终导致哺乳新生儿致命性脱水（图2）。图2. PEDV复制周期和发病机制概述。左图显示了病毒从初始进入（pH 依赖性或-非依赖性融合）并将病毒基因组释放到成熟病毒粒子的胞吐作用（光滑壁、含病毒粒子的囊泡与质膜融合）。右图描述了 PEDV 如何引起消化不良和吸收不良的水样腹泻，最终导致致命的脱水。RTC：复制和转录复合物；ER：内质网；ERGIC：ER-高尔基体中间室；PEDV：猪流行性腹泻病毒。改编自Lee。3.4 PEDV的传播PEDV可以感染任何年龄的猪；然而，疾病的严重程度和死亡率与受感染动物的年龄成反比。该病毒具有高度传播性，对出生后1周内的新生仔猪有致死性，发病率和死亡率高达100% 。口服的最小感染剂量（0.056 中位组织培养感染剂量感染5日龄哺乳猪所需的HP-G2b PEDV的[TCID50]/mL）远低于3周龄断奶仔猪（56 TCID 50/mL）。在断奶仔猪和育肥猪（包括后备母猪和母猪）中，在发病后第1周内，临床症状是自限性的，不如2周龄以下哺乳仔猪严重。表1总结了实验感染PEDV的不同日龄猪腹泻和粪便病毒脱落的发生和持续时间。表1.经口接种感染HP-G2b PEDV株不同日龄猪的临床体征及粪便病毒RNA脱落总结PEDV的主要传播途径是通过直接或间接接触临床或亚临床感染的猪或腹泻粪便和/或呕吐物的粪-口途径（图4）。PEDV 可以通过接触受污染的设备、车辆（运输猪或尸体、运送饲料或运输粪便）、人类（穿着受污染的工作服的农场员工或访客，包括养猪从业者或拖车司机）或野生动物（包括鸟类、流浪猫和老鼠）侵入农场。其他受污染的物资，如饲料或饲料添加剂成分（如喷雾干燥的猪血浆），可能是病毒的潜在传播源。PEDV也可以通过母猪的乳汁垂直传播给后代。在精液中也会出现PEDV脱落，这表明病毒可通过受污染的精液在猪群中传播。此外，PEDV颗粒被雾化后可通过粪鼻途径进行空气传播，这些颗粒在特定条件下对哺乳仔猪具有传染性。在PED流行之后，由于猪场管理不当（例如消毒不当和生物安全松懈），病毒可能会消退，留在分娩舍或在断奶至育肥场（WTF）持续存在（图 4）。在分娩到育肥（FTF）猪场中，如果一旦感染，PEDV可以传播到WTF设施并污染WTF设施，但存活的仔猪会转移到保育舍和生长育肥猪舍，这会产生地方性PED，其中病毒通过污染-传播-感染循环继续在受影响的猪群中传播。在PED流行时，如果新生仔猪由于多种原因（例如疫苗接种不当、母猪替代或泌乳缺陷（例如乳腺炎或无乳症））而无法从母猪那里获得足够水平的母体保护性免疫力，则在猪场内传播的常驻病毒将感染这些抗体缺失的易感仔猪，并随着大量脱落而繁殖该病毒是复发的来源，最终导致新生仔猪死亡率显著增加。PEDV的感染在断奶和生长育肥猪中没有症状；然而，病毒可以在其粪便中传播，污染猪舍并以亚临床方式复制。因此，PEDV可以通过污染-传播-感染循环，继续亚临床感染地方性猪场的生长猪和育肥猪，这增加了后备母猪在受污染猪舍驯化期间感染病毒的机会。一旦被感染，无症状的后备母猪可以充当“特洛伊猪”，它们没有临床症状，但其粪便中会携带病毒，这些病毒将成为隐性且不可战胜的携带者，将病毒传播到产房。因此，由“特洛伊猪”携带的PEDV可以传播并感染脆弱的新生仔猪，从而成为反复暴发的源头，在临床上影响被动免疫力低下或无被动免疫的哺乳猪。因此，加强后备母猪的感染监测和疫苗接种计划是控制地方性PEDV感染猪群的关键措施。图3.猪流行性腹泻病毒在流行性和地方性PED病例中的传播来源和途径。L/K/K，异源初免-加强免疫方案，包括一剂初免接种G2b口服活疫苗（L）和两剂加强剂 G2b灭活（K）疫苗。PED，猪流行性腹泻。4韩国的PEDV流行病学4.4.1 PEDV从经典G1a到G2a的基因型转变一项回顾性研究表明，早在1987年，韩国就存在PEDV[76]，尽管国内G1a PEDV的出现最早是在1992年。此后，该病毒在国内猪群中流行，因为在2007年检测的猪场中，有90%的猪场检测到PEDV传播（即断奶和育肥猪血清阳性）。然而，2010年使用国内分离株进行的一项遗传多样性研究表明，2007-2009 年期间鉴定的主要 PEDV 的分离株被归类为与G1a亚群在系统发育上关系较远的G2a菌株。与G1a原型CV777菌株相比， G2a PEDV菌株包含一个遗传特征，即S插入-缺失（S INDEL）分别在55/56、135/136和160–161位包含三方不连续的4-1-2 IN-IN-DEL。韩国在2010年之前缺乏遗传和分子流行病学数据，这意味着G2a毒株何时或如何出现尚不清楚。然而，在20世纪90年代或21世纪初，G1a PEDV 似乎是初始显性基因型，随后，从G1a到G2a的基因型的转变可能发生在2000年代中后期。这种基因型转变事件可能反映了在当时的韩国，在接种疫苗的猪场中反复发生着PEDV的情况，这引发了对自21世纪初以来上市的基于G1a国产分离株的PED疫苗的保护效力的质疑。4.2 HP-G2b PEDV的出现与演变2010-2011年，韩国PEDV疫情状况发生了巨大变化，当时全国范围内出现了灾难性的口蹄疫疫情，导致在两年内大规模扑杀了300多万头猪（占国内生猪总数的三分之一）。2010-2011年口蹄疫疫情期间，韩国PEDV的流行率很低，仅零星暴发，PEDV疫情持续到2013年底。然而，韩国并没有逃脱被在2013-2014年期间在美国暴发的HP-G2b PEDV株感染的命运，并从2013年11月开始在全国范围内爆发严重疫情。HP-G2b PEDV席卷了韩国大陆近50%的养猪场，4个月后（2014年3月），该病毒袭击了济州省（也称为济州岛），该省自2004年以来一直保持无PEDV状态。由于HP-G2b PEDV入侵的灾难性影响，据推测，在2013-2014年疫情期间，韩国养猪业损失超过了国内生猪数量的10%，估计有100万头仔猪。虽然HP-G2b PEDV入侵朝鲜半岛的源头尚未确定，但在2013年4月美国出现前所未有的猪源性腹泻病毒期间或之后，进口种猪或饲料是导致PEDV入侵韩国可能的传染源。然而，回顾性研究从 2012年11月和2013年5月采集的腹泻样本中独立鉴定出两株具有S INDEL遗传特征的韩国HP-G2b分离株，表明第二个基因型在2010年初从G2a转移到G2b。因此，在PEDV引入美国之前，HP-G2b PEDV就已经作为次要谱系存在于韩国，随后的有利环境可能有助于G2b毒株的处于主导地位。到目前为止，HP-G2b PEDV感染仍未得到控制，导致全国范围内全年出现各种规模的疫情，给国内养猪业带来了相当大的经济成本（图5）。此外，大量受PED影响的猪场在一两年内反复暴发疫情。这种情况表明，PEDV在农场中已经形成地方性的持续性存在，从而使疾病控制变得困难，并加剧了经济损失。G2b 继续独立进化，并经历具有特定地理聚类的遗传多样性，与HP-G2b韩国原型毒株（KNU-141112）的氨基酸（aa）同源性从96.3%到99.4%不等。特别是一些国产HP-G2b菌株（除了一个在S1/S2连接区具有200-aaΔ的分离株）在S1的N端结构域（NTD）中具有较小的IN或/和DEL，这与日本、台湾和美国报道的在S1 NTD中具有大的194-216-aaΔ的G2b变体不同。根据地理起源，国内分离株在系统发育上分为六个分离分支，包括全国（NW分支，具有1.3%-1.9%的aa变异）、庆南省和全南省（KJ分支，具有2.2%-2.9%的aa变异性）、忠清省和庆北省（CK分支，具有0.6%-1.7%的aa变异率）、济州-哈利姆省（JH分支，具有1.8%-2.6%的aa变异度），济州-大田（JD分支具有1.6%-2.7%的aa变异），并且未在地理上分类（NC分支具有0.9%-3.7%的aa变化）（图5A）。图4. 2013年至2023年（截至6月）韩国的 PED 病例数。（A）自 2013 年以来每年发生 PED 的次数。韩国九个省份（包括位于大陆西南部的济州岛）的热图（上图）显示了每年（2013 年至 2023 年 6 月）各省 PED 病例的全国分布情况，图例从红色到白色，从多到少。粗（天蓝色）箭头（下面板）代表表明G2b猪流行性腹泻病毒疫苗在国内市场的发布年份的时间表。（B）自 2013 年以来每月 PED 累计病例数。折线图显示了按月划分的累计病例数，表明季节性 PED（通常发生在每年 11 月至 3 月）转变为 PED 的全年发病率的现象。KV：灭活疫苗；LAV：减毒活疫苗；PED：猪流行性腹泻。JH和JD这两个济州分支分别在相应的地理起源地济州岛（省）的翰林和大井地区普遍存在，但在韩国大陆尚未发现。同样，大陆分支 NW、KJ 和 CK 直到 2022 年初才进入济州岛，尽管它们已经跨越了大陆的不同地理起源。2022年2月下旬至3月上旬，韩国南部和济州岛同时发生大规模暴发PEDV。遗传和系统发育分析证实了两个CK变异的出现，即CK.1（0.9%–1.1%aa变异）和CK.2 （1.1%–1.4%aa变异）分支（图6B）。进一步的时空调查表明，2021年初左右首次出现在庆南地区（朝鲜半岛东南部地区）的CK.1和CK.2分支几乎同时出现，通过不明来源传入猪群密度低的济州岛东北部地区，随后传播到猪密度高的翰林区（济州岛西北部）。从那时起，这些CK.1和CK.2分支包括与KNU-141112相比变异最小的流行毒株，现已在济州岛占据主导地位，并进一步扩大了其在整个大陆的分布。图5.基于2022年（A）和（B）之前全球鉴定的PEDV菌株的完整S基因的系统发育分析。有四种基因型，G1a（红色）、G1b（蓝色）、G2a（绿色）和G2b（紫色）。蓝色（G1b）分支上的不同颜色三角形表示在韩国发现的重组 LP-G1b PEDV 菌株。深橙色三角形表示 2018-2019 年 G1b 毒株，靛蓝色三角形表示 2017 年 G1b 毒株，绿色三角形表示 2014 年发现的韩国 G1b 原型毒株。紫色（G2b）分支上的不同颜色点表示在韩国全国范围内发现的 HP-G2b PEDV 菌株，这些菌株聚类为六个地理分离分支（2022 年之前），同时分为八个分支和两个亚分支（2022 年之后）：NW 分支（橙色）、KJ（深红色）、CK（浅绿色）、JH（天蓝色）、JD（霓虹灯）和未地理分类的 NC（紫色）分支。导致2022年大规模爆发的CK变种，即CK.1和CK.2分支，分别用红点和蓝点表示。黑点表示HP-G2b韩国原型菌株（KNU-141112）。PEDV：猪流行性腹泻病毒。4.3 LP-G1b PEDV的出现与演变先前在中国和美国报道的新型重组LP-G1b PEDV株在2014年3月在韩国首次报道，随后在几个欧洲国家报道。G1b PEDV毒株起源于2010年代初作为次要亲本的G1a和作为主要亲本的G2b之间的重组事件。因此，S基因具有典型的遗传和系统发育特征：与经典的G1a CV777菌株相比，S基因大小相同，没有S INDEL，并且基于S基因或全基因组的系统发育分类（G1b或G2）不同。尽管我们不能排除G1b病毒在首次发现之前在韩国存在的可能性，但美国和韩国G1b毒株之间的密切遗传相关性表明，每个G1b和G2b祖先都可能同时从美国引入韩国。与占主导地位的HP-G2b毒株不同，近年来，LP-G1b病毒很少在大陆引起小规模的、经济损失较小的疫情。有趣的是，2017年，通过将S1的NTD从现有G1b（次要）重组到国内流行的G2b（主要）的骨架中，然后进行遗传漂移，出现了亚群间G1b变体（图5）。这项研究进一步表明，S1基因的NTD是不同PEDV基因型之间自然重组的共同靶点，从而提供了一些可能使病毒逃避宿主免疫防御的优势。4.4 未来方向（基因型转变或出现变异）在韩国，G1b和G2b毒株在过去十年中一直在传播：前者是通过宿主环境中的重组进化而来的，而后者是大多数国内暴发的原因，通过基因突变继续进化，例如S1 NTD中的IN或/和DEL。由于病毒被认为经历了一个进化过程来积累突变或/和重组，以确保病毒在该区域的适应性，因此新的基因型转变的出现或可能来自国内分支的变异的出现将是不可避免的。此外，这些情况可能比预期更早到来，造成局部或全球疫情。因此，进行主动监测和监视（MoS）对于寻找迄今尚未确定的具有独特抗原和致病特性的PEDV变异（或其他基因型）至关重要，这些变异可能通过遗传性突变（例如非沉默突变，包括IN或/和DEL）或基因转移（例如重组事件）在局部或全球范围内出现，以预测和准备下一次流行或大流行。5韩国的PEDV疫苗仔猪出生时患有丙种球蛋白缺乏症，在断奶前存在免疫缺陷，因为猪胎盘的上皮层性质导致胎儿中抗体产生不足，并阻止母体免疫球蛋白通过胎盘转移至后代。因此，新生仔猪不能及时建立保护性免疫力来对抗各种感染，只能完全依靠在生命早期通过摄入初乳和含有免疫球蛋白的乳汁以获取母体抗体，来进行疾病保护。IgG被认为是初乳和血清中最普遍的抗体，可预防全身感染，而分泌型IgA（secretular IgA，sIgA）在乳汁中占主导地位，在整个哺乳期持续存在，并在局部（黏膜）防御系统中发挥作用。另一种破坏性肠道冠状病毒TGEV的疫苗开发的早期进展为肠道疾病提供了乳源性免疫和疫苗接种策略的基本思路。从过去的TGEV疫苗研究中得出的一个关键发现是，仔猪的保护率与母乳中大量的sIgA抗体（即产乳免疫）有关，而与血清和初乳中的IgG抗体无关：sIgA在自然感染或口服接种活TGEV的母猪中产生，而IgG在用灭活TGEV非肠道免疫的母猪中产生。同样，肠外PEDV疫苗接种的母猪也会特异性免疫反应，但不能对其仔猪提供完全保护，这在小猪模型中是可重复的。此外，病毒在母猪肠道中复制的载量和程度可能有助于在产乳分泌物（即初乳和奶水）中产生充足水平的IgA和中和抗体。因此，疫苗免疫途径可能是诱导母猪粘膜免疫的关键因素。因此，被动产乳免疫仍然是保护新生乳猪免受肠道冠状病毒（包括PEDV）感染的最有前途和最有效的方案，并且依赖于肠道-哺乳动物y-sIgA轴（IgA免疫细胞从肠道运输到乳腺）。尽管对PEDV的保护主要取决于仔猪肠粘膜中是否存在sIgA抗体，但通过在接种疫苗的母猪的初乳和乳汁中保留高滴度的IgA和针对PEDV的中和抗体，可以维持疫苗的效力。因此，PEDV疫苗接种的核心策略必须包括：1）通过口服疫苗刺激最佳粘膜免疫反应，在母猪的乳汁中诱导相当水平的sIgA抗体，从而为仔猪肠道中的靶肠细胞提供局部被动保护；2）在出生时将优质的被动母乳免疫转移到哺乳仔猪；3）在整个护理期间维持新生仔猪的sIgA抗体以及中和抗体的保护水平。为了在韩国实现上述策略，自21世纪初以来，在怀孕母猪和后备母猪的PEDV疫苗接种中广泛应用了异源初免-加强免疫方案，即L/K/K，在产仔或分娩前间隔2-3周接种一剂活疫苗（初次免疫）和两剂灭活疫苗（加强免疫）。 5.1 G1a（第一代）PEDV疫苗在20世纪90年代，由于每年都会大规模发生PEDV疫情，韩国政府集中精力开发PEDV疫苗。第一种PEDV灭活疫苗是使用韩国G1a PEDV SM98-1株研制的，并于2004年在国内市场上市。随后，两个韩国G1a PEDV株SM98-1和DR-13在Vero细胞中培养，通过连续传代独立减毒：前者作为肠外减毒商业化活疫苗（LAV），而后者可口服LAV。此外，使用细胞培养减毒的日本G1a 83P-5株肠外LAV（P-5V）在韩国进口并上市。这些国产和进口的G1a疫苗在独立试验中为仔猪提供了保护，它们在全国范围内的实施后导致PEDV的流行率与往年相比有所下降。然而，尽管在全国范围内开展了广泛疫苗接种，但PEDV可在接种疫苗的畜群中的持续存在引发了一场关于其有效性及其在现场使用的利弊问题的辩论。最后，韩国爆发的HP-G2b型PEDV结束了关于上述G1a型PEDV疫苗疗效的争论；第一代G1a疫苗现在韩国几乎没有继续使用，因为它们针对异源G2b PEDV毒株仅提供部分保护。5.2 G2b（第二代）PEDV灭活疫苗G1a PEDV疫苗的有效性不足在一定程度上是可以预料到的，因为在2013-2014年大流行后，韩国占主导地位的田间菌株与现有的G1a疫苗相比出现了基因和抗原变异。因此，G2b PEDV毒株被认为是开发下一代疫苗的种源毒株。尽管由于难以在细胞培养中获得现场分离株，G2b PEDV疫苗的研发受到阻碍，但2015年底和2017年，国内疫苗制造商独立上市了三种使用不同G2b PEDV分离株第二代灭活灭活疫苗（其中一种是美国株和另外两种是韩国株）。尽管供应了新的G2b灭活疫苗，但事实证明，当地的PEDV疫情是不可阻挡的。2018年PEDV发生率不降反增，自 2014 年以来全国官方报告的 PED 病例数最高（https://www.kahis.go.kr/ home/lkntscrinfo/selectLkntsOccrrnc.do）（图4）。这种相互矛盾的状态可能反映了同源的分娩前初免-加强免疫方案[单独接种2剂或3剂肠外G2b灭活疫苗（即K/K或K/K/K）]在实现上述核心策略（即诱导和维持保护性黏膜免疫）和降低疾病发病率（即PEDV粪便脱落）方面的局限性。在这一时期，为了弥补这种同源 K/K/（K）方案的缺点，G1a（第1代）口服或肠外LAV或口服主动感染（返饲）用于在国内实施传统的异源 L/K/K 策略。然而，由于对G1a疫苗的极度不信任，改良的异源初免-加强方案和返饲和G2b灭活疫苗（即返饲/K/K）或单独返饲被大多采用而作为控制 PED 的替代方案。虽然口服暴露于自体PEDV（即从感染PEDV的新生仔猪身上采集的粪便或切碎的肠道组织）可能有益，但由于自体病毒材料中感染性PEDV的数量无法定量且特异性不强，这可能无法诱导完全的母体产乳免疫并防止PEDV脱落。此外，在接受这种方法之前，我们应该考虑的是，如果不加以控制，这可能会成为病毒传播到附近养猪场或受影响农场的地方性PED的潜在来源，导致粪便或肠道内容物中存在的其他病毒和细菌病原体在猪群中广泛传播，加速PEDV的进化和多样化，以及PEDV变体或重组新型冠状病毒的出现，它们可以跨越物种屏障感染其他动物或人类。5.3 G2b（第二代）PEDV口服活疫苗目前对影响乳源性免疫诱导的因素（如注射剂量、疫苗株、后备母猪/母猪的年龄或胎次）以及其他变量的认知仍然有限。然而，多项研究证据强调了初次免疫的口服途径，即使用活疫苗或通过有控制的返饲来有效的启动、增强和维持母猪粘膜免疫，为后代提供局部被动免疫保护。因此，需要使用HP-G2b毒株开发新型的口服LAV，以克服G1a活疫苗的缺陷，并取代粗糙的返饲做法。通过努力的协同研发，全球首个G2b口服LAV于2020年底推出。在实验和现场条件下被证明是安全且具有免疫原性的。此外，结合G2b口服活疫苗和肠外灭活疫苗的异源分娩前G2b L/K/K免疫方案，通过完成上述PEDV疫苗接种的核心策略，为哺乳期新生仔猪提供了针对HP-G2b PEDV的完全被动乳源保护。然而，为了最大限度地提高疫苗有效性，如果疫苗接种与其他控制措施相结合，包括严格的生物安全/消毒措施、定期分子（病毒）和血清学（宿主）监测以及最佳的猪场管理和卫生管理，则分娩前口服 L/K/K 计划将是预防和/或控制 PEDV 的最有利实用工具。5.4 未来方向（快速响应和适用的疫苗平台）尽管韩国的HP-G2b毒株具有遗传多样性（包括8个可能的分支在内的2个亚分支），但其抗原性保持不变，这意味着G2b疫苗对导致近期暴发的同源显性毒株仍然有效。然而，PEDV的新基因型或变异将不可避免地出现，这些基因型或变异可以逃避G2b疫苗的保护，这可能需要更换现有的G2b疫苗。考虑到基于G2b的新型灭活疫苗（2015年底和2017年）和LAV（2020年底）在国内上市的时间表，若想快速开发针对潜在变异株的新疫苗，应克服病毒分离和减毒过程中的艰巨挑战。现在，通过使用基于反向遗传学的PEDV平台，可以克服这些障碍。该疫苗平台被证明是携带未来任何流行毒株的异源S基因的合理支柱，可以作为快速生成新疫苗的模板，并为未来的PEDV疫苗研究铺平道路。6PEDV的控制策略6.1 PEDV风险评估PEDV一旦被引入猪群，可能会在FTF猪场中持续存在，因此，该疾病的流行特性使在猪FTF生产系统中的PED控制更具挑战性。此外，由于猪的连续流动性和环境污染水平，从FTF猪群中清除PED是一项复杂的任务。因此，为了防止PEDV重复感染猪场，有必要监测PED控制策略中的四个主要措施，包括：1）生物安全；2）疫苗接种；3）快速诊断和主动监测；4）猪群管理（生产管理和卫生）。当怀疑PED流行时，应从四个主要措施开始协调控制，打破疾病在猪场的传播链。包括：1）加强生物安全措施和消毒措施；2）对猪群进行病毒和血清学检测，检查分娩猪群的免疫水平，并识别暴露于PEDV的生长猪或育肥猪；3）必要时为母猪和后备母猪接种疫苗；4）改善猪场管理。为了加强这些策略，建立了PED风险评估，以确定猪场是否开始流行并面临复发风险（或在未感染PEDV的猪场中发生），并根据猪场状况提供定制好干预措施。因此，进行猪场评估的目标是通过以下方式收集有关病毒、畜群（宿主）和猪场（环境）的信息：1）积极的生物安全监测，以了解生产者或员工遵守生物安全协议的程度；2）在疫情暴发时进行快速病毒筛查，包括基因诊断，以获取该病毒是从猪场外新引入的还是在最初爆发后在猪场内持续存在的；3）对分娩猪群进行血清学筛查，以获取有关母猪及其后代的猪群免疫力的信息；4）WTF猪群的病毒和血清学筛查，以获取病毒在猪场内传播的信息。对各个猪场进行风险评估，以评估其自身的生物安全性能、群体免疫力和病毒传播等级，具体如下：一）生物安全监测控制流行病或地方性PED的最关键措施之一是严格的生物安全，必须对农场内外追踪到的任何东西或任何人采取严格的生物安全措施，通过尽量减少与任何受病毒污染的材料或人员的接触，降低PEDV进入猪群或病毒在农场内或农场之间或地区之间传播的风险。因此，主观监测通过面对面交流来审查和评估内部和外部生物安全协议，评分范围为0-5（0=最差；5=最佳）。生物安全问卷分别由院子、员工和猪舍部分的13、7和6份清单组成。每个问题都对猪场如何完成三个部分的所有生物安全实践进行评分，每个部分的平均得分是独立计算的。二）群体免疫评估由于被动泌乳免疫是新生仔猪对抗PEDV的关键保护策略，因此确定母猪群中是否存在PEDV特异性抗体并不重要。相反，监测母猪体内PEDV特异性抗体的稳定性和数量（或滴度）对于监测母猪群体免疫水平是必要的，母猪群体免疫力可以在泌乳期间为新生仔猪提供被动保护。因此，建议使用基于 S1 的间接酶联免疫吸附试验（S1-iELISA）和/或病毒中和试验（VNT）方法评估乳汁中 IgA 和中和抗体的保护能力，以及母猪（包括低胎次和高胎次）和18-20日龄仔猪血清中的中和抗体（NAb）滴度。S1-iELSIA 测量初乳和奶水中 IgA 抗体的稳定性，而 VNT 可量化 NAb 在乳汁和血清样品中的稳定性。根据母猪初乳IgA和NAb的稳定性以及母猪和哺乳仔猪血清NAb的稳定性特征，以0-5评分量表（0 = 最差;5 = 最好）估计群体免疫水平（表2）。表2.使用0-5 评分量表系统对母猪群体免疫概况进行评分三）病毒循环（地方性PED）状况WTF群中PEDV或抗体或两者均存在，可用于确定病毒是否在农场内传播。实时定量RT-PCR（rRT-PCR）可以使用粪便（单个）和泥浆（围栏）样本检测和定量PEDV RNA 。同时，使用VNT对保育猪和生长猪进行血清学检查，以确定曾经或最近接触过PEDV的猪。病毒循环状态是根据个体粪便和围栏浆液粪便样本中是否存在PEDV和/或断奶和生长肥育猪中是否有PEDV血清转阳来评估的，评分为0-5（0=最佳；5=最差）（表3）。表3.使用0–5评分系统评估猪场PEDV循环（地方性PED）概况四）五边形轮廓系统使用从生物安全问卷中独立获得的三个部分的评估分数（0=最差；5=最佳）、群体免疫水平（0=最低；5=最好）和地方性PED（病毒循环）状态（5=最差；0=最佳），风险评估的结果可以通过五边形轮廓系统可视化，用五个参数（院子、员工和栏舍生物安全、群体免疫和病毒传播）的单独得分用于构建风险五边形的五个分支。如果猪场没有PEDV，则风险五边形图会呈现出PEDV复发或发生的风险分别为低、中和高三类，如图6所示。图6.使用风险五边形剖面图确定受 PED 影响的猪场（或无 PED 猪场的发生）中猪流行性腹泻病毒复发的潜在风险的图解示例。风险五边形系统评估了五个参数的水平：院子生物安全、员工生物安全、猪舍生物安全、母猪免疫和病毒传播（地方性感染）。每个因素的得分为 0-5，由相对于五边形总面积的阴影区域表示。第一张黄色五边形图描绘了一个标准模型，没有复发或发生 PED 的风险。绿色五边形图表示 PED 复发无风险或风险较低（秒）。蓝色五边形图表示由于不稳定的群体免疫力（第三）或病毒传播（第四）导致PED复发的中等风险。红色五边形图表示由于生物安全性差、群体免疫力不稳定和病毒传播（第五和第六）导致PED爆发的高风险。PED，猪流行性腹泻。6.2 量身定制的干预措施根据风险评估结果，通过识别可能影响猪场PEDV复发的危险因素，评估的猪群可分为非地方性（WTF 猪群中病毒阳性和/或血清阴性）和地方性（WTF 猪群中病毒阳性和/或血清阳性）受影响的猪场。主要因素可分为四类，包括母猪免疫力不稳定、生物安全性差、产房病毒污染和WTF猪舍病毒传播。一旦确认了猪场的弱点，就可以根据流行状况量身定制防控措施，以消除和改善相应的危险因素，从而在FTF农场建立稳定的群体免疫和消除PEDV。其中包括：1）严格的内部和外部生物安全条件（先决条件）；2）初免-加强产前口服L/K/K疫苗接种和母猪及其后代保护性免疫的纵向监测；3）安全的清洁/消毒/消毒措施，与全进全出管理并行，如有必要，在产房中对猪群（粪便）和环境（粪便）中进行PEDV的纵向监控；4）WTF猪舍的消毒和后备母猪管理，包括感染监测和疫苗接种，结合断奶仔猪和生长育肥猪的猪群（粪便）和环境（泥浆）中的纵向PEDV监控和血清学监测。由于PEDV在环境（泥浆）中的低剂量感染和高存活率（在−20°C至4°C环境中存活28天），因此从受污染的猪舍中消除该病毒是一个重要的挑战。因此，应通过定期收集和检测WTF猪舍的泥浆样本来追踪和清除环境中的PEDV。图7展示了一个决策模型，描述了在非地方性或地方性感染的FTF农场中感染PEDV后采取定制控制措施的基本原理。图7.针对非地方性和地方性影响猪场的定制PED控制策略和措施图。在流行性PED发生时，建议受影响的猪场进行复发风险评估，以确定必须管理的猪场弱点，以控制和防止再次感染。导致FTF猪舍PED复发的主要危险因素包括：1）母猪免疫力不稳定，2）生物安全性差，3）产房中的病毒污染，4）WTF猪舍中的病毒传播。实施基于四大支柱的协同控制策略，以增强畜群免疫稳定性和/或消除病毒，以根除FTF畜群的PEDV。L（口服）/K/K，口服活疫苗（一针）和灭活灭活疫苗（两针加强针）的异源初免-加强免疫方案；AI-AO，全进全出；WTF，断奶至育肥；PED，猪流行性腹泻；FTF，从分娩到育肥。改编自Jang等。在2021-2022年期间，我们在10个有G2b PEDV爆发史的FTF农场中使用五角大楼概况系统进行了PED风险评估。所有猪场都实施了以下免疫计划之一：同源 K/K 或 K/K/K 制度（G2b 灭活单独接种疫苗）、改良的异源反馈/K/K 方案（反馈和 G2b 灭活疫苗）或单独反馈。如前所述，每隔3-4个月收集一次猪个体样本（粪便、血清和初乳）和围栏旁样本（泥浆）。粪便和泥浆样本分别从FTF站点的腹泻或非腹泻猪和粪坑中收集。从不同年龄（20日龄、40日龄、70日龄、100日龄、130日龄和160日龄）的猪中以及一胎母猪和二胎或更多胎次母猪中抽血。初乳是在初产母猪和经产母猪分娩当天采集。粪便和泥浆样本采用rRT-PCR检测PEDV RNA，而血清和初乳样本则使用VNT或/和S1-iELISA检测，如前所述。外部和内部生物安全检查表由猪场兽医进行评估。每个猪场的风险五边形系统是根据上述因素的评估分数创建的，表明所有猪场都存在中度或高风险的PEDV复发风险，因为存在生物安全性差，母猪免疫力不稳定，初乳（或血清）中IgA和/或NAb水平低，和/或WTF猪舍中的病毒传播（图9）。在风险评估之后，通过实施以下定制的控制措施，确定并改善了每个猪场的复发弱点，以控制 PEDV：1）改善内部和外部生物安全的漏洞，加强生物安全管理; 2）初免-加强分娩前口服 L/K/K 疫苗接种，然后进行纵向免疫监测，稳定了群体保护免疫力，具有高持续水平初乳和血清中的IgA和NAb; 3）加强连续消毒措施，同时对粪便和泥浆进行纵向PEDV监控，以及对断奶和生长育肥猪的血清进行平行监测，减少或消除病毒传播（图8）。图8. 2021-2022年期间，在有G2b猪流行性腹泻病毒暴发史的10个分娩到育肥猪场（猪场 A-J）实施定制控制措施之前和之后的PED风险五边形概况图示。初步风险评估（之前）表明，所有猪场的PED复发风险均为中等（蓝色）或高（红色）。第二次评估（之后）显示，所有猪场的PED复发风险均有所改善，因此被归类为中（蓝色）或低（绿色）。PED，猪流行性腹泻。7讨论本报告概述了韩国流行性PEDV持续存在的现状和控制措施。自2013-2014年PED大流行以来，HP-G2b PEDV已成为该国的主要毒株，并继续进化，在该领域创造了小规模的遗传多样性。直到最近（2022年初），国内HP-G2b菌株在基因型上被分为六个地理特异性的分支，包括大陆的三个分支和济州岛的两个分支，现在被分为八个分支，其中有两个亚支CK.1和CK.2，几乎同时出现在大陆和济州岛内。尽管直到最近，HP-G2b PEDV缺乏有效的口服疫苗仍是四大支柱控制策略中缺失的部分，但口服型G2b LAV在国内市场的推广使我们能够完成四大支柱（生物安全、疫苗接种、诊断和监控以及农场管理）。基于第二代G2b疫苗的口服 L/K/K 疫苗接种可增强并维持母猪免疫力（或群体免疫稳定）的强度和持续时间，以超过猪群或环境中的病毒载量。此外，进行持续有效的监控对于追踪新的PEDV基因型或变体是必要的，这些基因型或变体可以逃避当前疫苗的效力覆盖范围，并为它们占主导地位并导致局部或全球暴发做好准备。随着流行性PED的出现，相当多的FTF猪场可能会受到地方性的影响，从而增加了全年复发的可能性，并为病毒传播到邻近农场甚至更远的农场提供了传播源。在受影响的FTF猪舍中，WTF猪舍中的病毒可以作为病毒循环和再感染的孵化器，因此，必须进行净化清除，否则猪场将受到地方性PED的影响，并在污染-传播-感染循环中面临重复感染的风险。因此，在受污染的WTF猪群中消除病毒是根除地方性PED的主要任务。因为PEDV在泥浆中可以持续存活一个多月，因此对WTF猪舍的泥浆样本进行联合消毒和病毒监测是从环境中消除病毒的不可或缺的措施。当病毒在WTF猪舍中循环时，病毒可能会在后备母驯化过程中悄悄感染后备母猪，然后这些母猪会在粪便中长期亚临床传播PEDV。因此，合适的后备母猪管理计划对于控制感染很重要，因为无症状感染的后备母猪可以充当“特洛伊木马猪”，将病毒传播到产房，以导致PED的反复爆发。这篇综述强调了在地方性感染猪场场中稳定群体免疫和消除PEDV所需的艰苦和合作工作的重要性。本研究还强调了研究人员、兽医、生产者、养猪业专家、生产商协会和当局之间综合协调合作的重要性，以最大限度地发挥预防策略的效果，战胜地方性PED。风险评估和协调干预工具有望帮助制定区域或国家预防和控制政策，并为在其他国家制定地方性PED的定制控制策略提供见解。参考资料：Jang G, Lee D, Shin S, Lim J, Won H, Eo Y, Kim CH, Lee C. Porcine epidemic diarrhea virus: an update overview of virus epidemiology, vaccines, and control strategies in South Korea. J Vet Sci. 2023 Jul;24(4):e58. doi: 10.4142/jvs.23090. PMID: 37532301; PMCID: PMC10404706.为了推动兽用生物制品行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展、乘风济海将于2024年4月17日-18日在南京共同举办“兽用生物制品研发和产业化大会”，系中国医药全产业链新资源大会（CBC大会）中的一个分领域专业会议。诚邀全国相关领域研究者共享学术盛会。名称：兽用生物制品研发和产业化大会时间：2024年4月17日-18日（周三-周四）地点：南京国际展览中心主办单位：生物制品圈、抗体圈、四叶草会展，乘风济海媒体支持：药时空、细胞基因研究圈报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请（严格审核通过）。大会日程注：大会日程以会议现场为准。中国医药全产业链新资源大会（CBC大会）是一场将“政、产、学、研、用、管、投”各方精英围绕全产业链新资源展开的合作大会，将于2024年4月16日-18日在南京国际展览中心举办。大会将主打“全产业链新资源对接”，围绕投资、立项、临床前研发、临床研究、生产、供应链国产化、销售、MAH合作、国际品种合作、公司股权合作与并购全产业链，为中国医药同仁带来全新的资源与商机。大会下设的同期会议包括：宠物药品、食品、保健品新资源大会兽用生物制品研发和产业化大会透皮技术研发生产与注册开年分享会吸入制剂研发、生产与注册新机遇新进展分享会中国改良新药与缓控释制剂全产业链合作大会多肽产业创新与发展大会新药典新型辅料与包材产品与技术交流会新药典新型实验室仪器与耗材实操演示交流会陆续更新中......识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。