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学以致用 侃侃而言 Drug Discovery Today, 2024, Oct. 10 DOI：10.1016/j.drudis.2024.104205 分子胶降解剂（MGDs）是靶向蛋白降解剂疗法的一种，同时又具有小分子疗法一致的物化特性，因此特别让人瞩目。 近日，Drug Discovery Today刊载了一篇重要评述，以细胞周期蛋白K和锌指蛋白IKZF2为例，深入探讨了MGDs的发现、发展。并重点介绍了MGDs的设计规则、生物学分析、和治疗应用。此外，文中还对分子胶的“化学空间”进行了探讨，并概述了推动该领域创新的合作努力。 主要内容 (1)分子胶发现：发现方法、案例探究 (2)分子胶格局：临床候选、靶点格局、疾病领域 (3)分子胶空间：物化特性空间、计算模型 (4)分子胶布局：制药合作伙伴 (5)相关分享回顾 01 分子胶发现 案例探究、发现方法 生物分子活性的调节是由它们彼此邻近达至某种平衡，进而相互作用所控制的。这种相互作用对于从细胞生成到有效细胞功能、维持和最终程序性细胞凋亡所必需的复杂过程的无缝进展至关重要。而协调的核心是生物分子邻近相互作用，其中蛋白质的多聚、蛋白质-底物复合物的形成等就是邻近性塑造生物功能中关键作用的重要实例证明。 分子胶是低分子量化合物，有助于增强两种蛋白质之间的相互作用，用于促进蛋白质-连接酶相互作用导致的泛素化和随后的靶蛋白降解，称之为“分子胶降解剂”（MGDs）。 如下图a是分子胶驱动的蛋白质降解示意图。图b中的沙利度胺类似物，主要用于与CRBN结合并招募新的底物进行泛素化和降解而作为分子胶发挥作用。 EARLY R&D 最初的最初分子胶之概念由来 最初，是围绕环孢菌素A（CsA）和FK506等免疫抑制剂分子机制的好奇心引发了分子胶的发现。CsA与亲环蛋白和钙调神经磷酸酶的结合，以及FK506与FKBP12和钙调神经元蛋白的结合，为小分子充当“分子胶”的概念奠定了基础。 “分子胶”一词，非常贴切的捕捉到了，用以增强邻近相互作用蛋白对之间的结合亲和力的化合物的本质。2007年，以生长素激素充当分子胶，增强植物连接酶转运抑制剂反应1（TIR1）与其底物的相互作用的发现，进一步阐明了分子胶降解剂的概念。 而早在1980年，Rose、Herschko、Ciechanover等人就提出了蛋白质泛素化的概念，并为他们赢得了2004年的诺贝奖。他们的工作改变了传统对细胞内蛋白质降解和调节过程的理解，为治疗癌症和神经退行性疾病铺平了道路。 在过去的几十年中，泛素化驱动的蛋白质降解在创新疗法中得到了应用，如蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）和分子胶，这得益于沙利度胺及其类似物作用机制的阐明。2010年，发现CRBN作为沙利度胺的分子靶标，引发了靶向蛋白降解（TPD）的革命；2013年，沙利度胺作为分子胶的能力也被揭示了出来。 沙利度胺及其类似物可以招募CBRN和其一系列底物邻近、增强结合、泛素化、及底物降解。这些化合物也被称为“免疫调节酰亚胺药物”（IMiDs），可以抑制炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNFα），并招募新底物蛋白质。而这些蛋白质并非CBRN的天然底物，不会与CRBN发生强烈的相互作用，这也凸显了MGDs在增强结合亲和力和随后泛素化中的关键作用。 目前蛋白质组质谱分析表明，CRBN有40多种新底物，而一种G-loop的特定环，对CRBN识别新底物至关重要。而除了CRBN，其它连接酶也被用于发现靶向各种蛋白质的MGDs。关键的突破是鉴定了一种含羟脯氨酸的缺氧诱导因子-α（HIFα）肽作为von Hippel-Lindau连接酶（VHL）的底物，这导致了一种在基于VHL的PROTACs中广泛使用的小分子的开发。此后更是有更多的E3连接酶被发现、应用。 分子胶的发现多是基于偶然，合理性的设计面临着诸多挑战。首先就是靶标本身的确定，它是某种连接酶的新底物。其次，确定了新底物靶标后，在探索Hit和Lead的过程中，还需要一整套独特的结构研究、建模、生物测定、和数据分析等。 EARLY R&D 案例一细胞周期蛋白K降解剂 细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）参与多种细胞过程的调节，与细胞周期蛋白亚基形成复合物。CDK12-cyclin K就是这样一个参与基因表达调控的复合体。CR8是一种CDK12抑制剂，也诱导周期蛋白K降解，因此具有双重活性。 也有报道研究了DNA损伤结合蛋白1（DDB1)与CDK12结合的结构和生物物理特性，评估了90多种细胞周期蛋白K降解剂。发现强效、选择性CDK12抑制剂，可以将DDB1招募到CDK12！ 针对DDB1-CDK12界面对ZINC数据库进行虚拟筛选，鉴定出了一种CRK抑制剂（RGB-286147），该抑制能够有效地与两种蛋白结合。此外，还发现了两种蛋白间的最小粘合剂，化合物919278，如下图a，是三元复合物晶体结构。 EARLY R&D 案例二Helios降解剂 肿瘤细胞部署多种机制来抑制免疫系统的抗肿瘤反应，一种这样的机制是招募免疫抑制FOXP3+调节性T细胞。研究表明，主要在Treg细胞中表达的helios蛋白（IKZF2）的降解可以增强抗肿瘤免疫反应。 泊马度胺是IKZF1的选择性降解剂，虽然它在50 μM之前不会引起IKZF2水平的变化，但它确实会引起CRBN-IKZF2的参与。此外，泊马度胺结合的IKZF1的锌指-2结构域（ZNF2）与IKZF2的不同之处仅在于一个氨基酸：Q146→H141。 在泊马度胺存在下，全长IKZF2H141Q显示出与全长IKZF1相似的降解曲线。这确立了Q146在IKZF1中在使泊马度胺具有选择性方面发挥的关键作用，研究发现，选择IKZF1降解剂作为起始分子，可发现IKZF2降解的选择性分子胶。 以上两个案例表明MGDs的发现可以以结构为导向，并以典型的基于结构的药物发现方式进行。新底物（靶点）的发现，和Hit的鉴定也可以通过其它筛选来实现，但基于结构的方法可以帮助优化化合物的选择性。 EARLY R&D 分子胶筛选鉴定方法 如下图，分子胶的发现涉及生化、生物物理、和计算技术的结合。 先进的生物物理分析、计算策略、基于细胞的筛选在识别和表征潜在分子胶、加速新治疗剂发现和加深对蛋白质-蛋白质相互作用驱动的复杂细胞过程至关重要。随着研究和分析技术的发展，整合多学科方法将成为分子胶研究和药物开发的突破关键。 02 分子胶格局 临床候选、靶点格局、疾病领域 EARLY R&D 临床中的分子胶候选药物 目前有17种分子胶正在进行临床试验，如下表。 EARLY R&D 临床适应症分布和特定药物靶点 分子胶化合物在各种临床适应症中的靶点分布提供了对该领域当前研究和开发格局的洞察。在已确定的适应症中，分子胶化合物的靶点数量最多的是肿瘤学领域，主要集中在液体肿瘤，包括AML、白血病、骨髓增生性肿瘤（MPNs）和MM，以及实体肿瘤。 其它相关临床适应症及特定靶点分布见下图。 03 分子胶空间 物化特性、计算模型 EARLY R&D 分子胶物化特性空间 如下图，是分子胶存在于与口服药物相邻或略微重叠的物理化学空间中的描述。鉴于其低分子量和低数量的氢键供体（HBDs），MGDs可能是穿越血脑屏障的有前景的候选者，它们可能在未来解决中枢神经系统疾病。 EARLY R&D 计算模型 尽管没有具体的既定程序来设计和模拟分子胶，但涉及分子胶与POI结合的实验可以通过各种分子描述水平的计算机工具进行合理化或预测。基于结构的计算方法特别有吸引力，适合提供有价值的蛋白质-配体相互作用信息反过来，这些信息可以用来合理化和理解分子胶如何与不同的蛋白质结合，从而指导新分子胶的设计，如下图。 从药物设计的角度来看，计算模型可以解决分子胶设计的两个问题： (1) 蛋白质-蛋白质复合物或蛋白质-配体复合物或两者的计算机预测。这可以细分为两个步骤：（i）姿势预测和（ii）姿势排名 (2) 超大虚拟筛选，用于从大型化合物库中鉴定配体 04 分子胶布局 制药合作伙伴 近年来，生物制药领域的几家初创公司与大型制药公司达成了重大合作协议，反映了协同创新和战略投资的趋势。上表中列出了与初创公司合作开发分子胶的大型制药公司。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

BOSTON, Sept. 23, 2024 (GLOBE NEWSWIRE) -- Carrick Therapeutics Inc., an oncology-focused biopharmaceutical company discovering and developing highly differentiated therapies, today announced that the first patient has been dosed in the Phase 1 clinical trial evaluating CT7439, a novel cyclin dependent kinase 12/13 (CDK12/13) inhibitor / Cyclin-K glue-degrader. CDK12/13 is implicated in multiple cancer types, as they regulate transcription elongation, RNA splicing, as well as cleavage and polyadenylation. DNA damage response genes are particularly suppressed by loss of CDK12/13 activity. The clinical trial is enrolling patients with advanced solid tumors, including ovarian, breast and Ewing's Sarcoma. "Initiation of our CT7439 Phase 1 clinical trial marks the advancement of our second therapeutic into the clinic for aggressive and resistant forms of cancer,” said Tim Pearson, Chief Executive Officer of Carrick Therapeutics. “CT7439 is the first CDK12/13 inhibitor to enter clinical development, and we are encouraged by its potential as monotherapy or combination therapy across multiple tumor types.” The Phase 1 clinical trial is a modular design, beginning with a dose escalation for the initial administration of CT7439 to patients. The initial clinical evaluation will be focused on safety and pharmacokinetics, with an opportunity for early Proof of Principle using a blood based pharmacodynamic assay of the homologous recombination repair (HRR) pathway. Clinical trial details can also be found on www.clinicaltrials.gov under study ID: NCT06600789. For additional information on the clinical trial, please contact hello@carricktherapeutics.com. About CT7439CT7439 is an inhibitor of CDK12/13 as well as a 'glue degrader' of Cyclin-K, which is the obligate co-factor for CDK12/13, giving both first-in-class and best-in-class potential. This dual modality significantly increases the potency of the compound and leads to the inhibition of DNA repair at the transcriptional level. CDK12/13 regulates gene transcription through the activation of RNA Polymerase II. It has the potential to synergise with other agents targeting DDR such as the PARP inhibitors in multiple cancer types, including breast, ovarian and Ewing’s Sarcoma. About Carrick TherapeuticsCarrick Therapeutics is an oncology-focused biopharmaceutical company developing highly differentiated novel therapies that address significant unmet needs. The Company’s lead program, samuraciclib, is a novel oral first-in-class inhibitor of CDK7 currently in multiple Phase 2 clinical trials for metastatic HR+ breast cancer. The Company is collaborating with Roche, Menarini Group and Arvinas/Pfizer to evaluate novel combinations of samuraciclib with oral SERD endocrine therapies. Additionally, Carrick is developing CT7439, a novel CDK12/13 inhibitor / Cyclin-K glue-degrader, which is currently in a Phase 1 clinical trial. For more information about Carrick Therapeutics, please visit www.carricktherapeutics.com Carrick Contact Carrick TherapeuticsJenny Horsfield, Chief Business Officerjenny.horsfield@carricktherapeutics.com Investors and MediaLuke Heagle, Real Chemistrylheagle@realchemistry.com

蛋白质与小分子相互作用的调节是近年药物发现中发展最快的领域之一。在这篇综述中，讨论了过去十年（2014-2023）的进展，重点是分子胶（MG）——通过稳定天然蛋白相互作用或诱导蛋白新形态相互作用来诱导接近的单价小分子。分子胶进一步可分为三大类：降解型分子胶、非降解性 分子胶 或 蛋白互作稳定剂，以及诱导自缔合(induce self-association)的分子胶。这里首先介绍降解型分子胶的分子机制。 1. 背景介绍 蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 网络在生物过程中发挥着核心作用，包括细胞信号传导、稳态、细胞增殖和分化。它们在疾病中经常失调，因此已成为化学生物学和药物发现的重要焦点。 在过去十年中，PPI 调节领域迅速发展并扩展到新的、令人着迷的方向。稳定（而不是抑制）PPI 有可能靶向本质上无序的蛋白质（IDP）。然而，在与蛋白质伴侣结合后，无序结构域可能在 PPI 界面上形成有序且可配位的结构。此外，靶向蛋白质对可以调节与许多蛋白相互作用的支架蛋白的单一复合物。 最近出现了许多术语来描述这些新兴概念，包括“化学诱导接近”、“分子胶”、“分子胶降解剂”和“PPI 稳定剂”。尽管这些模式存在根本差异，但这些术语经常可以互换使用。在这里，我们将“分子胶”（MG）视为在 PPI 界面上协同结合的单价小分子。通常，分子胶 对至少一种蛋白质伴侣具有低或无法测量的亲和力；结合后，它们增强或加强界面处的相互作用。分子胶 可以与天然或非天然/新形态的PPI 结合。术语“分子胶降解剂”（MGD）是指 分子胶 的亚类，其中结合配偶体是 E3 泛素连接酶（E3 连接酶）。E3 连接酶将泛素转移到底物蛋白上，通常通过蛋白酶体靶向该蛋白进行降解。降解型分子胶 诱导天然或非天然目的蛋白 (POI) 被 E3 泛素化，并导致蛋白质的蛋白酶体降解。 “PPI 稳定剂”是 分子胶 的另一种亚型，通常是指在没有分子胶的情况下具有内在亲和力的两种蛋白质伙伴，表明天然 PPI 是靶标。在这里，将 PPI 稳定剂与单一蛋白质的变构稳定剂区分开来。分子胶的另一种亚型包括诱导自缔合的化合物，其结果是靶标降解或不降解。在这种情况下，分子胶的结合通常会以意想不到的方式产生高聚蛋白质组装。形成的（三元）复合物与蛋白质靶标的天然状态显著不同。 文献中没有使用特定术语来描述这些分子胶，但偶尔会出现术语“靶标聚合”。在我们看来，“靶标聚集”与能量稳定的蛋白质组装体的形成有关，其中错误折叠或错误组装的蛋白质聚集，通常与疾病表型相关，而不是与化合物诱导的状态相关。最后，术语“诱导接近”更广泛，尽管在某些情况下适用于分子胶，但它还包括不一定属于胶合型作用机制的变构效应。 2. 天然类降解型分子胶  2001 年，发现植物激素生长素促进转录抑制因子AUX/IAA的降解。2007 年，解析了基于生长素的结构的作用机制。晶体结构表明，植物生长素通过与 AUX/IAA 结合位点下方 TIR1 的 β 螺旋桨结构域结合，增强了 AUX/IAA 和 TIR1 之间形成的弱相互作用，TIR1 是 E3 连接酶复合物 SCFTIR1 的一部分。2010 年，研究表明植物激素茉莉酸甲酯通过类似的机制发挥作用，并通过招募E3连接酶SCFCOI1 来降解转录阻遏物JAZ。这些早期的例子表明小分子能够诱导接近 E3 泛素连接酶并降解结合配偶体。激发了对天然降解胶的鉴定的进一步研究。例如，2020 年，报道了链霉菌衍生的手霉素聚酮化合物（手霉素 A 和明日香霉素）可作为共价降解型分子胶，靶向假定的 E3 连接酶UBR7 的 Cys374，并促进与新底物肿瘤抑制因子TP53 的相互作用。  3. 人工合成降解型分子胶 1.  降解型分子胶CRL4CRBN 2010 年，首次描述了人工合成的降解型分子胶 的作用机制。使用沙利度胺包被的珠子对 HeLa 细胞提取物进行亲和纯化，然后在体内模型中进行实验，他们鉴定了cereblon (CRBN)，它是 CUL4-RBX1-DDB1-CRBN (CRL4 CRBN ) E3 泛素连接酶作为药物沙利度胺的分子靶点。沙利度胺于 1957 年在西德被用作孕妇的止吐剂和镇静剂，但由于其致畸副作用于 1962 年从市场上撤出。目前，沙利度胺及其类似物（泊马度胺、来那度胺，也称为免疫调节药物(IMiDs)或CRBN E3连接酶调节药物(CELMoDs）用于治疗多发性骨髓瘤和其他血液恶性肿瘤。2014年，Chamberlain等人的关键结构研究。阐明了来那度胺、沙利度胺和泊马度胺与 CRBN-DDB1（DNA 损伤结合蛋白-1，DDB1-CUL4-Rbx1泛素连接酶 [CRL4] 的接头蛋白成分）的三元复合物的结构。晶体学数据表明，IMiD 结合在 CRBN 表面的浅疏水口袋中，包含三个色氨酸残基（Trp380、Trp386、Trp400）。这个浅袋容纳了戊二酰亚胺环，它与 His378 和 Trp380 (CRBN) 形成氢键。异吲哚酮环暴露在 CRBN-来那度胺复合物的表面，表明该部分参与了用于底物招募的新形态界面的形成。与CRBN 结合后，IMiD 抑制内源性 CRL4 CRBN 底物的泛素化，同时重新编程E3连接酶以靶向新蛋白质进行降解。IMiD 促进与 C2H2 型锌指转录因子 Ikaros (IKZF1) 和 Aiolos (IKZF3)的新形态相互作用，导致它们被 E3 连接酶 CRL4  CRBN 泛素化以及随后的蛋白酶体降解。  后续研究表明，IMiD 具有不同的降解特征，并且可以招募不同的新底物，包括酪蛋白激酶 1A1 (CK1α) 和翻译终止因子 GSPT1。晶体学研究支持这样的假设：新相互作用形成的特异性确实是由 IMiD/CRBN 二元结构中化合物的溶剂暴露面积决定的。来那度胺/DDB1-CRBN/CK1α的晶体结构表明这种结合是协同的，因为CK1α与CRBN的结合严格依赖于来那度胺的存在。CRBN 和来那度胺为位于激酶 N 叶的 CK1α β-发夹环提供了结合界面。除了前面描述的与 CRBN 的相互作用外，CK1α 还通过残基 Ile37、Thr38和 Gly40 与化合物的溶剂暴露部分相互作用。 就CC-885而言，一种具有改善的抗肿瘤活性的新型 CRBN 调节剂 GSPT1 被招募到 CRL4 CRBN 并被降解。晶体学显示 CC-885 保持了与 CRBN 的关键相互作用，并与 Glu377 (CRBN)、Val570 和 Gly575 (GSPT1) 形成了额外的相互作用，以及 CRBN 和 GSPT1 之间的直接相互作用，从而参与GSPT1 的招募。 介导GSPT1 与 CRBN 结合的关键特征是含有关键甘氨酸残基(Gly575) 的表面转角。还报道了一种可改善 Ikaros 和 Aiolos 降解的 CRBN 调节剂CC-220。 戊二酰亚胺环与 CRBN 具有类似的结合模式，而溶剂暴露区域中的其他环则与 CRBN 形成更多相互作用（Glu377、Pro352、Phe102、Phe150）这些额外的相互作用与观察到的 CRBN 亲和力增加相关。 总的来说，对 IMiD 招募看似不同的新底物的观察得出了降解决定子假说。尽管 Ikaros、Aiolos、CK1α 和 GSPT1 在结构和功能上不相关，并且缺乏明显的序列同源性，但同源序列的存在相互作用的结构特征（降解决定子）由关键位置含有甘氨酸残基的特定环定义，足以招募它们。关键的甘氨酸突变为丙氨酸导致功能丧失。进一步的研究表明，IMiD 被定义为降解几个 C2H2 锌指转录因子、 和人类 C2H2 锌指片段。 沙利度胺及其代谢物 5-羟基沙利度胺的致畸作用与其诱导胚胎转录因子 SALL4 的降解有关。 此后不久，SALL4-pomalidomide-CRBN-DDB1的晶体结构得到解析，为设计降低致畸风险的IMiD提供了合理的基础。  新型 CRBN 调制剂的合理优化催生了新一代 IMiD/CELMoD。2020 年报道了两种靶向转录因子 ZBTB16 的 CELMoD（CC-3060 和CC-647）。 有趣的是，这两种化合物识别ZBTB16 不同锌指结构域（1 和 3）内不同的结构降解决定子。 随后发现了 CC-92480，CC-92480 是一种专为高效快速降解动力学而设计的 CELMoD，目前正在进行多发性髓瘤的临床试验。还报道了具有更高效力和选择性的改进的 GSPT1 降解剂，例如 ZXH-1-161  和 CC-90009 。CC-90009是第一个选择性靶向 GSPT1 的临床候选药物。在结构上，CC-90009 与 CC-220 的结合模式相似，包括与 CRBN 和 GSPT1 的相互作用。一个显著的结构差异是缺乏与 Glu377 (CRBN) 的相互作用；相反，与 His353 形成了新的键。总之，这些晶体学研究对于定义 IMiD 与 CRBN 及其新底物的结合模式，以及基于降解决定子假说建立合理的药物开发至关重要。 2022 年，Watson 等进行了一项开创性研究， 表明IMiD/CELMoD化合物调节CRBN的构象。使用冷冻电子显微镜 (cryo-EM) 将 DDB1-CRBN 的 apo 复合物与有或没有新底物的 CELMoD-DDB1-CRBN 的结构进行比较。CELMoD 与 CRBN 的沙利度胺结合域的结合足以诱导 CRBN 从开放构象到晶体结构中可见的闭合构象的变构重排。使用 CELMoD 在晶体结构中观察到的闭合构象使得 CELMoD 的结构引导优化能够产生更有效和更具新底物特异性的化合物。值得注意的是，在冷冻电镜研究中，Ikaros 仅与闭合 CRBN 构象相关。三种化合物（pomalidomide、iberdomide [CC-220] 和 mezigdomide [CC-92480]）对观察到的 CRBN 构象有明显影响，这与化合物的效力相关。泊马度胺仅足以诱导约 20% 的颗粒形成 CRBN 的闭合构象。Iberdomide 的亲和力提高了约 20 倍，Ikaros 降解能力提高了约 24 倍，将近 50% 的颗粒转变为 CRBNclosed 构象异构体。对于美齐格多胺(mezigdomide)，它能诱导新底物快速降解，并且对对来那度胺和/或泊马度胺的主要治疗不再有反应的复发或难治性患者有效，其100% 的颗粒处于闭合构象。因此，该研究阐明了变构的神秘作用以及 CRBN 降解型分子胶 构象控制的重要性，从而可以进一步合理设计降解型分子胶，提高新底物选择性和功效。 2. 降解型分子胶（ CRL4DCAF15 ） 在 IMiD/CELMoD 之后，发现将新底物招募到 E3 连接酶的第二种分子胶是剪接抑制剂磺酰胺（SPLAMS：indisulam、tasisulam、E7820 [NSC 719239] 和氯喹喔啉磺酰胺 [CQS 或NSC 339004]）。 2017年，两个研究小组报告说，SPLAMS促进了RBM39（RNA结合基序蛋白39，也称为CAPERα）向E3泛素连接酶CUL4-RBX1-DDB1-DCAF15（CRL4DCAF15 ）的募集，导致RBM39多聚泛素化和蛋白酶体降解。生化和结构研究，包括通过晶体学解析的三元复合物和两种冷冻电镜结构，并阐明了分子胶作用机制。这些研究表明磺胺类药物对单个蛋白质的结合亲和力较低，并强调了磺胺类药物与三元复合物的结构互补性。例如，DCAF15-DDB1-DDA1 复合物的 indisulam Kd 值 >50 μM，而 RBM39 存在时其Kd值下降至 187 nM，增强 >100 倍（由 ITC 测定）。在所有三项结构研究中，芳基磺酰胺协同结合，促进 DCAF15 与 RBM39 (RBM39 RRM2 ) 的RNA 识别基序 (RRM) 的结合，并通过功能化浅层、非- DCAF15 表面的保守空腔。  RBM39 与 DCAF15-磺酰胺界面的结合和募集是通过 RBM39 的单个 α 螺旋介导的，该螺旋通过主链羰基氧和侧链与 DCAF15-磺酰胺相互作用。RBM39 RRM2 -DCAF15 PPI (1,150 Å2 ) 的埋藏表面积能够补偿化合物单独与 DCAF15 的弱结合亲和力。所有报道的 RBM39 降解剂共有的芳基磺酰胺部分通过氧原子与 DCAF15 的 Ala234 和Phe235 主链形成氢键。通过磺酰胺的氮原子与 RBM39 的 Thr262 和 Asp264 形成水介导的氢键。此外，DCAF15-RBM39 侧链之间广泛的非极性疏水网络形成了高亲和力的三元复合物。值得注意的是，在冷冻电镜结构中，DCAF15 与 RBM39 的第二个RRM 结构域接合，其具有扩展的非保守表面积，这在 CRL（Cullin-Ring E3 连接酶）底物受体中并不常见。除了 RBM39 之外，在检测到的约 11,000 个蛋白质中，只有所有相互作用残基具有 100% 序列同一性的 RBM23 被降解。 2020 年，报道了一种可扩展的化学分析方法，作为使用 E3 连接酶不可知方法发现降解型分子胶的合理策略。该策略利用了CRL的 neddylation 被激活的要求，通过比较低水平neddylated(UBE2MmutKBM7) 与 高水平的neddylation  (KBM7) 的细胞对化合物的敏感性- 介导的细胞死亡。在野生型和 UBE2M mut KBM7细胞中筛选约 2,000 个细胞抑制/细胞毒性小分子，鉴定出化学骨架，这些化学骨架似乎在功能上依赖于不间断的 neddylation 水平。其中，一种新型磺酰胺 dCeMM1 被鉴定为能够重编程 CRL4 DCAF15 连接酶并选择性降解RBM39，而不影响 RBM23。 令人兴奋的是，靶向 CRL4 DCAF15 的 降解型分子胶 在化学结构、E3 连接酶靶标、新底物结构和 PPI 界面大小方面与 IMiD 不同。两种完全不同类别的 降解型分子胶 的存在表明，如果人们知道如何寻找它们，那么分子胶可能无处不在。 3.  细胞周期蛋白 K 的降解型分子胶 另一种发现新的降解型分子胶的成功方法侧重于已知抑制剂，以识别可疑缺失的降解蛋白。2020 年，三项独立且几乎同时进行的研究报道了结构多样的小分子，这些小分子诱导了细胞周期蛋白的降解。研究人员假设细胞毒性化合物可以根据所需但未鉴定的泛素连接酶成分的表达来证明细胞系选择性。他们进行了系统的数据库挖掘，将 4,518 种临床和临床前小分子的细胞系敏感性与 578 种人类癌细胞系中 E3 连接酶成分各自的 mRNA 水平关联起来。他们观察到细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDK) 抑制剂 CR8 的细胞毒性与 CUL4 接头蛋白 DDB1 的mRNA 水平之间的相关性。进一步的机制研究证明，CR8 通过诱导 CDK12/cyclin K 和 DDB1 之间复合物的形成而发挥 降解型分子胶 的作用。值得注意的是，在 ITC 实验中，DDB1+CDK12 形成了一个弱蛋白质复合物，具有一个大的、结构互补的界面(2,100 Å2 )，基础亲和力约为 50 μM。CR8 将相互作用增强了 500 至1,000 倍 (Kd = 100–500 nM)。在结构上，CR8 占据 CDK12 的 ATP 结合位点，桥接 CDK12-DDB1 界面并与 DDB1 的 β 螺旋桨结构域之一形成离散接触。  CR8 的关键结构特征是疏水性苯基吡啶环系统，该系统暴露在激酶表面的溶剂中，并通过与 Arg928 (DDB1) 相互作用诱导与连接酶接头 DDB1 形成复合物。细胞周期蛋白 K 结合在 CDK12 的反面，不与DDB1 直接相互作用。值得注意的是，CDK12 不是组成型E3 连接酶组分。结构引导突变分析和 TR-FRET 分析表明，在 CR8 存在的情况下，CDK12 承担了胶诱导底物受体的角色，并将细胞周期蛋白 K 置于通常由 CRL4 底物占据的位置；因此，与典型 DCAF 底物受体的结合是相互排斥的。 Mayor-Ruiz 等人采用了不同的方法。在连接酶活性广泛敲除的hyponeddylated细胞模型中建立了一种比较化学筛选测定法。如前所述，该策略通过降解 RBM39 的磺酰胺 dCeMM1 的鉴定得到验证。此外，三种小分子 (dCeMM2/3/4) 被确定依赖于功能性 CRL 来发挥毒性。细胞处理和定量表达蛋白质组学表明，dCeMM2/3/4 严重破坏了细胞周期蛋白 K 的稳定性，并且更轻微地破坏了相关激酶 CDK12 和 CDK13 的稳定性。通过正交测定的进一步验证，包括定量蛋白质组学、功能基因组学、药物亲和色谱法和细胞邻近测定法，揭示了化合物诱导的 CDK12-细胞周期蛋白 K 和DDB1-CUL4B 的关联。 与此同时，Lv 等报道了一种NRF2 抑制剂的高通量表型筛选方法，该方法令人惊讶地鉴定出 HQ461，即相同 CDK12/细胞周期蛋白 K/DDB1 复合物的降解型分子胶。基于超突变的功能获得筛选、CRISPR-cas9 筛选、生化测定和交联证实了分子胶作用机制。 2021 年，报道了一个由 80,000 个小分子组成的文库的高通量筛选，该文库对来自患者的转移性结直肠癌类球体的异质细胞集的活性筛选。后续转录组学和化学蛋白质组学验证了化合物 NCT02 是一种分子胶，可诱导细胞周期蛋白 K 泛素化及其伴侣 CDK12 的蛋白酶体降解。与 CR8 的显著差异是 NCT02 缺乏可检测的 CDK12 激酶抑制活性。 2022 年，Jorda等报道了一系列基于3,5,7-取代吡唑[4,3-d]嘧啶的CDK抑制剂。其中，化合物24 诱导细胞周期蛋白K的降解。分子对接研究表明与CR8有类似的结合模式。必须指出的是，除了CR8的晶体结构外，原始研究中没有报道其他细胞周期蛋白K降解剂的晶体结构。 这些研究的一个显著观察结果是，具有相同分子胶作用机制的降解细胞周期蛋白 K 的化合物具有结构多样性。 2023 年，Kozicka 等彻底研究了细胞周期蛋白 K 降解剂的结构-活性关系 (SAR)。对 90 多种结构不同的化合物进行了评估；首先，在体外使用 TR-FRET 测定法测量小分子存在下 CDK12-细胞周期蛋白 K 和DDB1 之间的复合物形成，然后进行细胞测定。其中 40 种化合物对 CDK12-DDB1 复合物表现出低纳摩尔亲和力（体外<100 nM），并且通过晶体学解析了 28 种三元复合物的结构。DDB1 中的 Arg928 作为粘合部分的热点残基的作用得到了证实。这些分子胶优先通过 π-阳离子与Arg928相互作用，在某些情况下通过氢键和疏水相互作用。总体而言，不同大小的芳烃和杂芳烃甚至较弱的脂肪族基团能够与 Arg928 结合并实现 CDK12/DDB1 相互作用。π-阳离子与 DDB1 相互作用的适当电子和空间效应对于形成高亲和力复合物至关重要。值得注意的是，与铰链激酶残基（CDK12 中的 Met816、Glu814、Tyr815）相互作用的嘌呤部分无法独立增强粘合活性，而仅在 Arg928（DDB1 中）被适当靶向的情况下才具有协同作用。甚至更小的类似物（如化合物 919278所示）缺乏典型的基于嘌呤的激酶抑制剂部分，也能够与激酶铰链残基和 Arg928 形成足够的相互作用，从而充当降解型分子胶。这些观察结果表明，细胞周期蛋白 K 降解剂的最小药效基团是铰链相互作用的受体-供体基序（这对于激酶抑制剂来说很常见），以及一个额外的粘合部分，包括从氢键供体延伸的芳香系统。 4.  β-catenin的分子胶降解剂 2019 年，描述了分子胶的鉴定和合理设计，该 分子胶恢复了致癌转录因子 β-catenin 与其同源 E3 连接酶 SCF β-TrCP 之间的天然 PPI。WNT 通路在癌症中经常失调，多种机制导致磷酸降解子残基 Ser33 和 Ser37 处的β-catenin 磷酸化减少。磷酸化的丧失会损害其有效结合 SCF β-TrCP 的能力并阻止其降解。利用 β-catenin 磷酸化残基和重组 β-TrCP/Skp1 复合物（以下简称β-TrCP）开发了荧光偏振 (FP) 结合测定。单磷酸化肽（磷酸化 Ser33/Ser37）的结合亲和力比未磷酸化或磷酸化 Ser37 肽更适合 HTS 测定的开发。通过筛选 350,000 种化合物库，鉴定出四种结构相似的化合物，其中包括 NRX-1532。该化合物通过 TR-FRET 和SPR 测定进一步验证。β-catenin/β-TrCP/NRX-1933（一种结构相似但更易溶解的四唑类似物）三元复合物的晶体结构已被解析。该化合物结合在 PPI 界面上并与双方形成相互作用。三氟甲基吡啶酮基团填充了一个额外的小疏水袋，该疏水袋由于缺乏 Ser37 磷酸化而显露出来，并充当磷酸盐模拟物。 TR-FRET 测定进一步支持了协同结合模式。 晶体结构表明 β-连环蛋白肽的 N 末端结合不紧密，可能会揭示更大且更容易成药的结合袋。这一假设已经用 NRX-2633 等包含苯氧基取代基的化合物进行了测试，这些化合物能够诱导 Leu31重排，从而产生更大的口袋。NRX-2633 在结合测定中显示出改进的效力和增强的协同性（13 倍）。苯氧基取代基对二芳基硫醚进行结构引导优化，得到了类似物 NRX-252114和 NRX-252262，两种效力均显著提高（NRX-252114的 EC 50 值为6.5 nM，NRX-252262 的 EC 50 值为 3.8 nM ；与筛选命中相比，提高了 >10,000 倍）和协作性（>1,500 倍）。这两种化合物在细胞测定中进行了进一步评估，能够增强 S37A 突变型 β-连环蛋白与 β-TrCP 的结合，增加突变型 β-连环蛋白的 K48 连接泛素化，并恢复其蛋白酶体降解。 该研究强调了协同性的重要性，因为分子胶与三元复合物结合，但不单独与 β-TrCP 结合。如此处所示，用 分子胶 恢复天然 PPI 的一个重要优势是，底物上存在天然存在的界面和可接近的赖氨酸残基，可用于泛素化和降解。此外，分子胶 对 β-连环蛋白的突变形式具有选择性。因此，正常组织中的野生型功能不应受到该策略的影响。这项工作代表了分子胶靶向天然底物-E3 连接酶相互作用的第一个合理例子。该策略可应用于因 PPI 界面突变而减弱的其他天然 PPI。β-连环蛋白的例子还凸显了弱质子泵抑制剂生化筛选的潜在陷阱；也就是说，如果结合太弱而无法检测，则可能难以开发检测方法，并且生物学相关性可能会受到损害。 参考： https://www-cell-com.libproxy1.nus.edu.sg/cell-chemical-biology/fulltext/S2451-9456(24)00130-2 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓