Moderna首次利用mRNA技术递送黏膜二聚体IgA，阻止细菌感染

2023-03-12

信使RNA临床1期临床2期

采用 mRNA-LNP 技术在体内生成抗体，很早就有人开始尝试，但是，普遍选择的 IgG 抗体。2018 年，Philip J. Santangelo 等人在 Nature Communications 上发表文章：Engineered mRNA-expressed antibodies prevent respiratory syncytial virus infection。他们通过肺部雾化装置（侵入性的气管给药）将编码RSV 中和性抗体的 mRNA（ palivizumab）直接递送到肺部，从而抑制 RSV 病毒感染。2022 年 10 月 31 日，Philip J. Santangelo 等再次在 Advanced Science 发表文章：Nebulized mRNA-Encoded Antibodies Protect Hamsters from SARS-CoV-2 Infection，在仓鼠模型中，采用雾化吸入朝肺部靶向性递送编码携带质膜锚定序列 GPI 的新冠中和抗体 mRNA，能够在肺部细胞中高效表达出锚定于细胞质膜上的中和抗体，显著抑制感染新冠病毒后的体重减轻，抑制病毒在肺部复制，降低肺部病毒载量。mRNA-1944 编码基孔肯雅病毒（CHIKV）特异性单克隆中和抗体 CHKV-24 的重链和轻链，采用 LNP 进行递送。Moderna 公司在 2019 年到 2021 年对 mRNA-1944 展开 I 期临床试验（NCT03829384），mRNA-1944 成为第一个在临床试验中显示体内表达和体外可检测到中和活性的 mRNA 编码的单克隆抗体。由于易于生产和有利的药效动力学特性，IgG 一直是单克隆抗体的首选同种型。相比之下，重组蛋白 IgAR的临床转化应用存在诸多挑战。首先，人类 IgA 的糖基化程度很高，而 N-糖基化会影响蛋白的构象、热稳定性、折叠效率、可溶性以及对蛋白酶降解的敏感性。此外，由于不完全的唾液酸化和无法通过新生儿 Fc 受体（Neonatal Fc receptor, FcRn）回收，重组蛋白IgAR将会在循环系统中被清除掉，这使得重组蛋白IgAR 的血清半衰期比内源性人类 IgA 短。研究人员正在努力合成出具有具有理想的 Fc 受体相互作用、血清半衰期和粘膜输送的 IgG/IgA 嵌合体，但是，目前并没有进入到临床阶段。哺乳动物体内的抗体可分为 5 种同种型：IgG、IgM、IgA、IgD 和 IgE。IgA 是胃肠道和上呼吸道粘膜分泌物中最主要的抗体同种型，是抵御病原体入侵的第一道防线。人类有两个 IgA 亚类，IgA1 和 IgA2，它们在铰链长度、O-链接糖基化程度和粘膜定位方面存在差异。血清 IgA 通常是单体mIgA，而粘膜 IgA 是二聚体dIgA或多聚体，这是因为铰链（JC）使两个或多个 IgA 单体通过其 C 端共价连接在一起。多聚免疫球蛋白受体(Polymeric immunoglobulin receptor，pIgR)是黏膜免疫系统的另一重要成分，能够将二聚体dIgA，而不是单体mIgA，转运过肠道和呼吸道的上皮细胞屏障，导致dIgA 的分泌，从而捕获病原体并防止其附着在粘膜表面的上皮细胞受体上。Sal4 是一种 IgA 单抗，能识别来自鼠伤寒沙门氏杆菌脂多糖的 O5 抗原，被动注射 Sal4，能阻止沙门氏杆菌对肠道派尔集合淋巴结的入侵。CAM003 是一种 IgG1 单抗，与铜绿假单胞菌生物膜成分 Psl 结合，并在多种不同的 PA 动物模型中显示出保护作用，包括急性肺炎模型。2023 年 1 月 3 号，Moderna 团队在 BioRxiv上传文章：mRNA delivery of dimeric human IgA protects mucosal tissues from bacterial infection，首次利用 mRNA 技术平台来向人体分别递送编码 Sal4 的 IgA2mRNA或者 CAM003 的IgA1mRNA，从而在体内产生强效的保护性黏膜抗体，阻止细菌感染。利用 mRNA 技术递送 IgA 抗体项目 Moderna 团队负责人👀 在细胞水平或者小鼠体内合成 Sal4 IgA2mRNA 用 LNP 包封编码 Sal4 重链 HC 和轻链 LC的mRNA，转染 HEK293 细胞，无论是否共转染编码铰链 JC 的 mRNA，细胞上清中分泌的IgA2mRNA 均能够被酶标板上固定的沙门氏杆菌所识别。然而，只有共转染 JC-mRNA 时，Sal4 IgA2mRNA才能够被酶标板上固定多聚免疫球蛋白受体（pIgR））识别，这说明形成了二聚体 dIgA2。通过 SEC 峰图也可以看出，共转染 JC-mRNA 时，细胞合成出来的 Sal4 IgA2mRNA 主要以二聚体 dIgA2 为主峰；当缺乏 JC 铰链时，细胞合成出来的 Sal4 IgA2mRNA 由单体mIgA2 和mIgA2 聚集体构成。电镜图显示，与重组蛋白 dIgA2R 结构类似，dIgA2mRNA 通过尾巴-尾巴形成二聚体。EXPI293 细胞表达出来的IgA2mRNA 能够降低沙门氏杆菌对于 Hela 细胞侵染，而且，降低程度类似于重组蛋白 dIgA2R，以上数据首次证实利用 mRNA 技术可编码产生有功能的寡聚体 IgA 蛋白。利用 mRNA/LNP 技术在细胞中可合成出功能性的 Sal4 IgA2mRNA。黏膜靶向性和寡聚体特性是 IgA 蛋白的非常吸引人的地方，但是，IgA 蛋白的药效动力学很差，特别是半衰期非常短。为了知道 mRNA 技术产生的 IgA 药效是否发生改变，研究人员分别向小鼠体内注射 5mg/kg 重组蛋白 IgA2R（单体/二聚体混合物），4.5mg/kg 多克隆抗体人血清 IgA（大部分是单体）以及 1mg/kg 编码 IgA2mRNA 的 mRNA-LNP。与以往的研究结果类似，小鼠血清中的重组蛋白 IgA2R 半衰期为 0.64 天，只能检测到注射后第 2 天，而多克隆抗体人血清 IgA 半衰期为 0.93 天，可检测到注射后的第 12 天。令人兴奋的是，小鼠血清中的 IgA2mRNA 半衰期可达 1.63 天，这说明IgA2mRNA 与重组蛋白 IgA2R两者在结构上存在本质的区别。重组蛋白 IgA2R、人血清 IgA 以及IgA2mRNA 的半衰期差异👀 Sal4 IgA2R 的糖基化模式根据甘露糖残基的替代物，N-聚糖（N-glycan）大致可分为三类：复合体（Complex），高甘露糖型结构(higmannosese)和杂合类型结构(hybrid)。复合体类型包含岩藻糖(Fucose)、唾液酸(Sialic-Acid)和α-连接的半乳糖。高甘露糖型核心结构的一个分支上包含多个甘露糖残基。杂合型，甘露糖在一个分支的核心结构，另一个分支上包含乳糖胺序列。与来自人血清中的 IgA 相比，HEK293 细胞合成的重组蛋白IgA2R唾液酸化不足，从而导致其在循环系统中被快速清除。为搞清除 IgA2mRNA 表现出更好的药效动力学特征是否是由于糖基化差异性造成，研究人员测定了从小鼠血清中纯化获得的 Sal4 IgA2mRNA 糖基化模式和唾液酸化水平。由于血清 IgA 是单体形式，因此研究人员将血清IgA2mRNA 与重组蛋白单体IgA2R 或者含有单体/二聚体混合形式的IgA2R 比较，结果发现，血清 IgA2mRNA 展现出的复合体糖基化程度高达 90%，而IgA2R/mIgA2R 分别只有 30%和 19%。相反，高甘露糖型核心结构在 IgA2R 和 mIgA2R 占据 66%和 76%，而在 IgA2mRNA 中，高甘露糖型核心结构只有 5%。IgA2R 和mIgA2R 蛋白结构中展现出高水平的高甘露糖型核心结构和低水平的唾液酸化（13-14%），与此相反，IgA2mRNA 蛋白结构中展现出高水平的唾液酸化。对于IgA2mRNA和 IgA2R/mIgA2R 来说，检测单个氨基酸的 N-聚糖结构，糖基化模式也是类似的。重组蛋白 IgA2R 与 IgA2mRNA 的糖基化模式和唾液酸化水平差异。👀 Sal4 IgA2mRNA 在血清和黏膜的分布研究人通过静脉注射 2.5mg/kg IgG1R 到小鼠体内，能够在循环系统（血清）中检测到 IgG1R，但是，注射 2.5mg/kg dIgA2R 到小鼠体内后，在任何时间点，小鼠血清中均检测不到 dIgA2R。相反，如果注射 1mg/kg 编码 IgG1mRNA 和 IgA2mRNA 的 mRNA/LNP 到小鼠体内，在注射后的 24h-48h，小鼠血清中检测到的 IgG1mRNA 和IgA2mRNA 抗体滴度可达 69ug/ml 和 27ug/ml。尽管 IgG1R 在小鼠血清中的抗体滴度很高，但是，注射后第 24h 的小鼠排泄物中检测不到 IgG1R 和 IgG1mRNA。静脉注射 SaI4 dIgA2R 到小鼠体内，注射后第 6h 的小鼠排泄物中可检测到 SaI4 dIgA2R，但是，往后的所有时间点，小鼠排泄物中的 SaI4 dIgA2R 均处于检测线以下。相反，在注射后第 24h 的小鼠排泄物中的 IgA2mRNA 滴度可达到 67ng/ml，其能够被检测到的时间可抑制持续到注射后的第 96h。IgA2mRNA 能够在血清中表达，并且转运到黏膜部位👀 IgAmRNA 阻止细菌入侵沙门氏杆菌小鼠模型静脉注射 1mg/kg 编码 Sal4 IgA2mRNA 或者 IgG1mRNA 的 mRNA/LNP 和 5mg/kg 相同类型的重组蛋白抗体到小鼠体内，在攻毒试验之前，小鼠血清中的 IgA2mRNA 滴度为 11ug/ml，但是，在血清中检测不到 IgA2R。相反，小鼠血清 IgG1mRNA 和 IgG1R 滴度分别为 291ug/ml 和 84ug/ml，要远高于血清 IgA 抗体滴度。在小鼠排泄物中，IgA2mRNA 抗体滴度是最高的，为 125.2ng/ul，IgG1mRNA 抗体滴度为 51.66ng/ml，IgG1R 抗体滴度为 9.71ng/ul。排泄物中的IgA2mRNA 抗体滴度要远高于血清中，这是由于 IgA2mRNA 分泌到肠道，而排泄中检测的 IgG 抗体是由于漏出造成的。更加重要的是，在小鼠肠道沙门氏杆菌模型中，IgA2mRNA 要比 IgA2R 或者 IgG1 更加有效地阻止沙门氏杆菌的在肠道的入侵。Sal4 IgA2mRNA 能够阻断沙门氏杆菌入侵肠道黏膜铜绿假单胞菌肺炎胞菌肺炎小鼠模型静脉注射 1mg/kg 编码 CAM003 的 IgG1 或者 IgA1 型抗体，在攻毒试验之前，小鼠血清中的 IgG1mRNA 可达到 68.73ug/ml，IgA1mRNA 可达到 7.95ug/ml。尽管在血清中，两种类型的抗体存在滴度差异，但是，IgA1mRNA 和 IgG1mRNA 均能够保护小鼠免于铜绿假单胞肺炎发的肺炎铜绿假单胞菌肺炎胞菌肺炎死亡小鼠模型中，注射编码 CAM003 的 IgG1 或者 IgA1 型抗体，保护小鼠免于死亡。👀 结论这项研究首次利用 mRNA-LNP 技术在细胞水平和小鼠体内合成出功能性的 IgA 抗体，当存在铰链 JC-mRNA 时，可形成二聚体 dIgAmRNA。相比于重组蛋白抗体，mRNA 编码的 IgA 具有更好的药效动力学特征，例如，更长的半衰期，这可能是由于糖基化模式和唾液酸化水平的差异造成的。在沙门氏杆菌和铜绿假单胞菌小鼠模型中，与重组蛋白 IgAR 一样，静脉注射编码 IgA 的 mRNA-LNP 同样能够有效阻止细菌在肠道和肺部的侵染。总之，这篇文章为采用 mRNA 技术向人体黏膜部位递送 IgA 细菌感染制细菌感染，打开了新窗口。