首届BioAnniversary丨核酸药物研发分论坛：mRNA技术发展的六个十年

2022-08-08

信使RNA疫苗基因疗法合作小分子药物

由BioBAY主办、致力于推动全球生物医药产业创新的高端会议——首届BioAnniversary生物产业大会将于9月2日在苏州金鸡湖畔国际博览中心盛大启幕。我们以Explore The Unknown为题，围绕新药研发和创新医疗器械两大重点领域展开，会议分为 DeviceChina 及 PharmChina 两个版块，就细胞治疗、基因治疗、核酸药物、大分子、小分子药物、BT+IT、IVD产业链、高值耗材、医疗设备、政策法规、资本市场等多个焦点话题展开探索，共同促进中国生物医药的创新发展。值得一提的是，首届BioAnniversary生物产业大会的核酸药物研发分论坛将在9月3日9:00正式开启，与您一同探索核酸药物开发、新型核酸药物技术，欢迎报名参加！mRNA（信使核糖核酸，Messager RNA）由DNA的一条链为模板转录而来，是携带着遗传信息并能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸，也是连接基因和蛋白质的桥梁。mRNA的翻译机制通过体外转录技术合成mRNA，并利用合适的递送系统将mRNA运输进入人体，再依靠细胞自身的翻译系统将mRNA翻译成目标蛋白，可实现临床治疗的目的（mRNA技术的原理）。相比于DNA或病毒载体等其他技术，mRNA技术具有高效性、安全性、生产周期更短、成本更低等优点。基于这些优点，mRNA技术在针对爆发性感染性疾病的疫苗研发上极具优势，特别是应对病毒的快速变异。也正是因为这些优点，在2020年新冠疫情爆发之时，mRNA技术“一战成名”。但在成名之前，mRNA技术还只是一个相对冷门的研究领域。那么，从60年代被发现到2020年“一战封神”，mRNA技术这60年都经历了什么？60年代~70年代证实mRNA存在&发现脂质体证实mRNA的存在1960年伊始，科学界相继迎来了激动人心的时刻。基于1947年至1960 年间的诸多开创性研究，从60年代开始，关于mRNA遗传密码的神秘面纱被逐渐揭开。1960年，Fram ois Jacob和Matthew Meselson确定了蛋白质是在细胞质的核糖体上组装而成。这个重要发现表明细胞核里的染色体和细胞中的核糖体中必然有一种联系的桥梁，即细胞内存在一种将细胞核里的遗传信息转移到细胞质的机制。此后，Jacob和Meselson又选用细菌作为研究对象并做了相关实验，确定核糖体是蛋白质合成的场所。不过，这还是没解开遗传信息是如何翻译成蛋白质的疑惑。如果是核糖体RNA负责将细胞核里的遗传信息传到细胞质，那么细胞内应该有许多不同的核糖体。不同的核糖体应该含有不同的RNA模板，而不同的RNA模板应该来自不同的基因，编码大小不一的蛋白质。然而，这种可能性很快就被排除，因为他们发现核糖体是完全一样的。既然编码遗传信息的DNA在细胞核里，而遗传信息最后的表达发生在细胞质的核糖体，而现在又发现核糖体RNA也不可能是传递信息的媒介，那么，在细胞内肯定存在其他的成分充当遗传信息传递的载体。鉴于细胞内大多数RNA是rRNA，但并不都是rRNA，所以也许细胞内还有其他种类的RNA充当遗传的信使。对此，1961年，Jacob和Jacques Monod提出了信使RNA假说，认为细胞内肯定存在一种特殊的RNA是直接从DNA上合成的，它们的序列与DNA上的基因序列互补，然后被运输到细胞质为蛋白质合成提供模板。在一种蛋白质合成结束以后，它的mRNA将离开核糖体，为其他的mRNAs“让路”。为了验证这个假说，Brenner、Jacob和Meselson在加州理工学院实验室进行了紧张的科研工作。很快他们发现，使用噬菌体感染大肠杆菌后不久，就有一种病毒特异性的RNA被合成并很快和细菌内本来存在的含有细菌rRNA的核糖体结合。但这种新的病毒RNA并不是核糖体的永久性成分，而只与核糖体短暂结合。这正是假说中预测的mRNA分子。[7]发现脂质体脂质体的发现对mRNA技术的发展至关重要（下文将提到），遂在此单独列出说明。脂质体是由类似生物膜结构的磷脂等类脂分散于水相中所形成的封闭囊泡，膜壁厚度约为5～7nm，囊的直径一般在25～500 nm内。药物可根据其亲油、亲水性质，或插入类脂双分子层，或包封于脂质体内水相，也可直接连在脂质体表面。脂质体的结构（图源：参考资料8）追溯脂质体的发现过程，可以知道，虽然研究者们很早就已经通过电子显微镜观察到了细胞周围和内部的生物膜结构，但膜中存在磷脂双分子层这一观点还未被广泛接受。基于对磷脂膜的好奇，Bangham尝试将蛋黄卵磷脂滴于涂布水的载玻片上，显微镜下惊奇地发现卵磷脂与水相互作用自发形成了类似叶状体（“fronds”）的复杂结构。随后，Horne使用负染色法观察此分散体，清晰看到了遍布的囊泡（起初称之为“Banghasomes”），基于这一发现，1964年Bangham和Horne将此多层囊泡的电镜图发表于Journal of Molecular Biology，作为脂质体的雏形首次映入世人眼帘。1965年，Bangham又与同事做了磷脂囊泡的离子透过性实验，发现磷脂双分子层可以维持离子（钠或钾）的浓度梯度，且脂双层打乱的同时离子梯度也不复存在，此实验为脂质体作为载药系统奠定了坚实的基础。而对于如今我们所熟知的“liposomes”一词其实源自于1968年Gerald Weissmann的报道，他最初想法是用Bangham的囊泡系统建立溶酶体模型，将其重命名“liposomes”后，并定义为一层或多层磷脂组成的微小囊泡而广为人知。[8]70年代~80年代使用脂质体包裹mRNA如前所述，发现mRNA是科学史上激动人心的事件。不过，短暂的激动后，该领域的科学家又有了其他烦恼。因为他们发现，mRNA不稳定、易降解，想将mRNA分子送到特定的靶细胞并产生足够的、需要的蛋白质，从而实现期待的治疗效果尚为困难。*mRNA的分子量较大，故很难穿透同时带负电的细胞膜上的脂质双分子层，且mRNA在体内容易被免疫细胞吞噬或酶切导致降解，因此需要合适的递送系统将外源mRNR递送进入细胞质，进而将其成功翻译为功能性蛋白质。彼时，脂质体开始作为“好拍档”进入mRNA领域。基于脂质载体的递送系统能够包裹mRNA分子，包封率较高，以及保护mRNA免受酶降解。另外脂质载体通常会含有对mRNA细胞内转运有利的重要的功能性脂质成分。这些脂质成分在生理环境下带有正电荷，通过静电作用将带有负电荷的mRNA分子包裹起来，并帮助整个载体系统与靶细胞的细胞膜相结合，从而起到递送mRNA的作用。用一个不太精准但形象的比喻，大概就是mRNA分子是馅，脂质体是皮，脂质体包裹mRNA就如“包汤圆”般用皮（脂质体）将馅（mRNA分子）包起来。而通过脂质体的保护，可以让mRNA更好地更完整地进入到体细胞内，诱导出一定的免疫反应。1978年，Dimitriadis等人便首次使用脂质体成功将编码兔球蛋白的mRNA递送至小鼠淋巴细胞并产生功能性蛋白质，验证了“包汤圆”的可行性。图源：参考资料1280年代~90年代人工合成mRNAmRNA技术发展到70年代，其实已经有了很大的进步。但介于那时候的条件和生物工程技术，还没有一种方法能够在实验室中制造这种遗传物质，大多数科学家都是从兔子血液、培养的小鼠细胞等来源中重新使用mRNA。所以当时很少有研究人员把mRNA作为一种医疗产品来考虑，更多地是用它来研究基本的分子过程。如1984年，Krieg和生物学家Douglas·Melton及分子生物学家Tom·Maniatis和哈佛大学的Michael·Green等人利用从病毒中提取的RNA合成酶等在实验室得到了具有生物活性的mRNA（这一核心方法至今仍在使用）。然后Krieg将实验室制造的mRNA注射到青蛙的卵子中，证明它的工作原理与真实一样。这时，Melton和Krieg也仅认为合成mRNA主要是作为研究基因功能和活性的工具。Paul Krieg（左）和Douglas Melton（右）*Malone（mRNA疫苗的发明者）便是使用哈佛团队的方法合成了mRNA。到了90年代，事情迎来了转机。20世纪90年代，美国科学家Jon Wolff的团队将体外合成的mRNA注射至小鼠骨骼肌内，通过检测发现其在细胞内可表达特定蛋白生成，产生免疫反应，这一发现震惊学术界。如果说，此前mRNA技术的发展仅仅是能“包汤圆”却不能决定汤圆里放什么馅，那么发展到这个时期，基于人工合成mRNA的技术，科学家已经能决定往汤圆里放什么馅了。90年代~2000年正视mRNA“露馅”问题&纳米脂质体出现正视mRNA“露馅”问题当然，仅仅是能决定放什么“馅”还不够。因为即便mRNA能被稳定提取并注射到动物体内，它也会引起一系列免疫反应，就像是身体在对抗病毒入侵一般。也就是说，这时候mRNA进入人体后还面临着容易“露馅”的问题。但这不妨碍mRNA技术的潜力被看到。事实上，早在1990年，宾夕法尼亚大学的Katalin Karikó教授就提出，在基因疗法领域，mRNA疗法也许可以成为DNA疗法的替代。两者的长处一目了然，DNA疗法的作用即便不是永久，也是长效的，而mRNA能提供短期内的修正。对于由于基因突变导致的遗传病来说，DNA疗法也许更为适合。而在其他疾病领域，mRNA有一展拳脚的空间。“但（当时）没有人对它感兴趣。”Karikó教授回忆道。mRNA不是一种容易操作的分子，它不如DNA和蛋白质稳定，很容易被降解。但更重要的是，即便mRNA能被稳定提取并注射到动物体内，它也会引起一系列免疫反应，就像是身体在对抗病毒入侵一般。因此，它在安全性上有巨大隐患，这基本宣判了这种治疗思路的死刑。纳米脂质体出现除了对mRNA有更深入的认识，同期进步的还有mRNA的递送技术。前文提到，脂质体可作为“皮”将mRNA这个“馅”包裹起来送进人体。但“皮”也存在品质上的不同。选择先进的皮，能更好地实现mRNA的递送。而随着纳米科学和纳米技术的发展，纳米颗粒脂质体（Lipid nanoparticles，LNPs）开始崭露头角，LNP便是这种优质皮。LNP的构成结构LNP由于细胞膜和mRNA均带负电荷会产生排斥反应，LNP的阳离子脂质可以协助mRNA进入细胞膜。此外，可离子化脂质分子的应用则实现了 LNP技术的突破，它的极性会随pH值变化而改变，在生理pH值下保持中性，在LNP被细胞吞入形成内体后，pH值会降低，可离子化脂质分子会携带正电荷，改变LNP结构促进mRNA释放到细胞基质内完成抗原蛋白翻译。以及聚乙二醇修饰的脂质分子可以有效防止LNP聚集，控制LNP大小以及防止LNP最初被人体免疫系统识别。脂质纳米颗粒包裹mRNA的结构示意图脂质体是脂质有序排列的双分子层形成封闭囊泡，有亲水的内部空腔结构；脂质纳米粒则没有亲水空腔，相反，脂质纳米粒因为阳离子磷脂和带负电的核酸物质静电络合作用存在于内部，形成的多层核心分散于脂质层间。20世纪90年代中期，Pieter Cullis的团队开始研究大分子，他们发现脂质纳米粒可用于向肝脏输送mRNA并产生蛋白质。当然，一项技术的发现如何助推另一项技术发展往往都要等上多年才知道，LNPs也不例外。把时间拉长到往后的十多年，才能深刻了解LNPs在mRNA技术中的关键作用。Pieter Cullis（不列颠哥伦比亚大学生物化学与分子生物学教授）2009年，库里斯在加拿大温哥华成立了Acuitas Therapeutics公司，公司致力于研发脂质纳米颗粒（LNP）、mRNA疗法以及核酸疗法的细胞内递送等。不过，Acuitas公司后来与Arbutus产生了LNP上的专利纠纷。实际上，LNP递送技术的开山鼻祖是Arbutus，这是一家专注于乙肝的小型生物制药公司。然而，该公司发明LNP递送技术的目的主要是用于递送乙肝RNAi药物。Arbutus曾将LNP递送技术（专利号：US8058069）部分转移给加拿大公司Acuitas，并规定Acuitas只在“antisense”和“基因治疗”两个领域拥有LNP技术的使用和二次授权权利。2016年，Acuitas却违规地将LNP全部技术二次授权给Moderna以及CureVac。但Arbutus并不认可此次的二次授权并向法院提起诉讼。根据法院判决，Moderna只被允许在4种病毒疫苗的研发上继续应用Arbutus的LNP递送系统，其余的应用授权都无效。2017年，Arbutus终止了Acuitas继续使用和二次授权LNP递送技术的权益。2018年，Moderna开始挑战Arbutus的LNP专利，包括当年授权给Acuitas的US8058069，但是该专利挑战失败。此后，Moderna开始自主研发LNP递送技术。（又是一段医药“恩怨情仇史”......）2000年~2010年发现假尿苷&商业化雏形出现时间来到2000年后。发现假尿苷实际上，在注意到mRNA易被身体的免疫系统识别并清除掉后，科研人员一直在寻求技术上的突破。2005年，Katalin Karikó和她在宾夕法尼亚大学的合作者Drew Weissman有了诺奖级的大发现——修饰mRNA。他们发现，用假尿苷去替换mRNA中的尿苷，不但能够让合成的mRNA免受免疫系统的攻击，而且显著增强了mRNA表达蛋白的能力。这一突破性的发现结果发表在Immunity杂志上，解决了mRNA临床应用的最大难题，从此揭开了mRNA临床应用的序幕。Katalin Karikó（左）和Drew Weissman（右）为将mRNA应用至药物平台，20世纪90年代，Karikó在一直在实验室辛苦工作，不过资助机构一直拒绝她的资助申请。1995年在多次被拒绝后，她被要求离开宾夕法尼亚大学或接受降职和减薪。但最终她选择留下来继续顽强追求改进Malone的方案并设法诱导细胞产生具有治疗意义的大而复杂的蛋白质。1997年她开始与Weissman合作，当时Weissman刚刚在宾夕法尼亚大学建立了一个实验室。他们一起计划开发一种基于mRNA的艾滋病疫苗。但是当Karikó将mRNA注射到小鼠体内后，引发了大量的炎症反应。她和Weissman很快就发现了原因：合成的mRNA激发了一系列被称为Toll样受体的免疫传感器，这些受体对病原体发出的危险信号起首要反应。2005年他们报告说重新排列mRNA的核苷酸尿苷上的化学键，产生一种类似物“伪尿苷”，似乎可以阻止人体将该mRNA识别为敌人。随后，Katalin、Drew以及美国宾夕法尼亚大学将mRNA分子修饰的专利独家授权给mRNA RiboTherapeautics，该公司将该专利二次授权给Cellscript，Cellscript又将专利二次授权给Moderna和BioNTech。mRNA商业化雏形出现除了技术上的突破，在2000年至2010年的10年间，mRNA技术的商业潜力也逐渐被看到。这时候，已经开始有大型药企向mRNA进军。如2008年，诺华和Shire都成立了mRNA研发部门——前者关注疫苗，后者关注药物。当然，还有人们熟知的mRNA三巨头CureVac、BioNtech、Moderna也是先后在这十年间成立。2000 2000年，CureVac成立于德国，是mRNA药物技术领先的生物技术公司。公司拥有20年的专业经验，专注于癌症疗法、抗体疗法、罕见病治疗和预防疫苗的开发。2008 2008年，BioNtech成立于德国，公司未来发展战略为全球领先的癌症个性化医疗生物技术公司。公司拥有独特的四大技术平台。四大技术平台分别为：mRNA疗法平台、细胞和基因治疗平台、蛋白质疗法平台和小分子治疗平台，涵盖肿瘤、传染病和罕见疾病等领域。2010 2010年，Moderna成立，公司致力于开发以mRNA技术为基础的创新疗法。2018年12月，Moderna在纳斯达克上市。目前，公司拥有世界领先且自助完整的mRNA研发生产平台，包括mRNA的改造、LNP递送系统和生产平台。2010年~2020年临门一脚 & 一战成名临门一脚纵览过去的几十年，可以发现，为发挥mRNA技术作为药物的潜力，多年来业界一直在攻克mRNA自身稳定性差、易被体内的核酸酶降解等致命缺陷。而在2000年至2010年的10年间，从对mRNA的修饰到mRNA递送系统的选择，mRNA技术的发展已取得长足的进步，但还差临门一脚。如前文所述，90年代时，科研人员已对LNP在mRNA领域中的应用进行了探索，但LNP如何作为mRNA的载体还未有具体的表述，直到2015年。2015年，帕迪和韦斯曼首次描述了将脂质体纳米颗粒（LNP）作为mRNA的载体。LNP的作用就是保护mRNA，防止其降解，同时帮助mRNA顺利进入细胞。至此，mRNA疗法发展史上面临的最艰巨的两大难题，随着mRNA修饰问题的解决与LNP技术的应用迎刃而解。一战成名不过，尽管在过去的数十年间，mRNA技术已在技术上相继取得重大突破，但当时传统观点仍认为mRNA太不稳定且价格昂贵，所以几乎所有涉足mRNA领域的公司都选择了将资源投资到别处。而因为外部投入少，在2020年之前，还未有一款mRNA疫苗或药物正式获批上市。但很快，局势发生了变化。2020年，全球性新冠疫情爆发。2020年12月，由辉瑞/BioNTech开发的全球首款mRNA新冠疫苗获得了FDA的紧急使用授权，开始了在全球范围内的免疫接种。mRNA新冠疫苗的初步尝试点燃了业界对这项技术的期望，市场热捧，资本迅速涌入。mRNA技术的时代至此到来。现在，除了疫苗，mRNA还正在拓宽“自己的边界”，有望为多个疾病预防和治疗领域带来新方法，比如肿瘤、免疫疾病等。2020年是mRNA技术平台突破性的一年，针对COVID-19的mRNA疫苗的推出和广泛使用。目前正在开发的基于mRNA的药物可以根据其潜在的作用机制分为三种主要应用：预防性疫苗、治疗性疫苗和治疗性药物。结语所谓高科技即建立在基础科学上的应用科技，一旦基础受限，应用这座高楼大厦，将因为没有基石而坍塌。而回溯mRNA技术六十年的发展可以发现，mRNA技术能发展至今，最为关键的其实是基础科学研究数十年的铺垫。但在mRNA技术爆火之前，谁都难以预料这项技术今后的发展。这正是基础研究最大的特性——不可预见性。你没法知道自己的研究将会是一颗哑弹还是一场革命。或许，对基础研究而言，过于功利和以目标为导向反而可能一无所获。扫描二维码即可报名点击【注册参会】填报个人信息少量免费参会名额，先到先得参考资料：1.mRNA vaccines — a new era in vaccinology2.The tangled history of mRNA vaccines3.Lipid nanoparticles for mRNA delivery4.Who discovered messenger RNA?5.AN UNSTABLE INTERMEDIATE CARRYING INFORMATION FROM GENES TO RIBOSOMES FOR PROTEIN SYNTHESIS6.Genetic Regulatory Mechanisms in the Synthesis of Proteins7.mRNA的发现故事8.脂质体药物传递系统的50年发展历程概述9.Negative Staining of Phospholipids and their Structural Modification by Surface-active Agents as observed in the Electron Microscope10.Phospholipid spherules (liposomes) as a model for biological membranes11.基于脂质体的mRNA疫苗递送系统研究进展12.Translation of rabbit globin mRN A introduced by Iiposomes into mouse lymphocytes13.Lipid Nanoparticles─From Liposomes to mRNA Vaccine Delivery, a Landscape of Research Diversity and Advancement14.mRNA技术会改变世界吗？ | 青橙资本、2021-04-0915.从新冠大流行中崛起的 mRNA | 辉瑞招聘、2022-07-0116.药理革命者mRNA | 佰傲谷BioValley、2021-05-2417.其他公开资料推荐阅读上市企业丨51亿元！信达生物与赛诺菲达成深度合作临床进展丨普方生物：ADC药物PRO1184获得FDA临床许可政策服务丨2022年度第一批姑苏创新创业领军人才计划拟立项名