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深度聚焦类器官应用与3D细胞培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769文章来源： 爱迪尔笔记绝大多数肿瘤是上皮细胞来源的肿瘤，因此用肠道类器官研究上皮细胞的分化，这个角度就很新颖独特。调整类器官培养基的成分，例如去掉干性维持成分，加入notch 信号抑制剂，多加点维生素D等，研究相应处理对上皮细胞分化的影响，同时也可以用同样的条件处理肿瘤类器官，比较两者之间的异同，可以进一步研究肿瘤发生机理。维生素D的作用巨大而广泛，周一介绍了维生素D可以提高ICB的抗肿瘤效果？？？，今天这篇文章则是维生素D如何维持肠道干细胞干性的文章。这篇文章的核心内容是关于维生素D如何影响人类结肠类器官中的多谱系细胞分化。研究人员发现，维生素D（以1α,25-二羟维生素D3的形式，也称为calcitriol）能够抵消Notch信号通路的阻断和BMP4通路的激活所诱导的多谱系细胞分化。具体来说，BMP4通路的激活倾向于促进肠上皮细胞的分化，而Notch信号通路的阻断则倾向于促进黏液分泌细胞（goblet cell）的分化。当BMP4和Notch阻断剂dibenzazepine（DBZ）联合使用时，可以平衡地强烈诱导这两种谱系的分化。然而，结肠肿瘤类器官对BMP4的反应较差，对DBZ则没有反应。研究还发现，calcitriol能够减弱BMP4和DBZ对正常结肠类器官分化基因表达和表型的影响。在机制上，calcitriol通过减少磷酸化SMAD1/5/8的水平来抑制BMP4的早期信号传导。总体而言，这项研究揭示了BMP和Notch信号通路在人类结肠干细胞分化到肠上皮细胞和黏液分泌细胞谱系中的关键作用，并表明calcitriol通过调节这些过程来支持干细胞特性。文章中提到了几个关键的信号通路，它们对肠道干细胞的干性维持和分化有显著影响：1. BMP（骨形态发生蛋白）信号通路：BMP信号通路的激活，特别是通过添加BMP4，倾向于促进肠上皮细胞（enterocyte）的分化。BMP4通过与其类型1受体（BMPR1A/alk3）结合并激活BMPR2，进而磷酸化并激活SMAD1/5/8蛋白，这些蛋白进入细胞核并抑制干细胞基因，推动细胞分化。2. Notch信号通路：Notch信号通路的阻断，使用γ-分泌酶抑制剂dibenzazepine (DBZ)，倾向于促进黏液分泌细胞（goblet cell）的分化。Notch信号在隐窝底部活跃时，与canonical WNT信号共同促进LGR5+干细胞的自我更新和干性。然而，在隐窝顶部，Notch信号在canonical WNT信号缺失的情况下，有助于细胞命运向肠上皮细胞谱系的特异性。3. WNT信号通路：文章中提到，干细胞的特性LGR5在小肠和结肠中是众所周知的标记，LGR5是R-spondins (RSPOs)的膜受体，后者是canonical WNT信号的增强子。在这项研究中，WNT信号的缺乏是肠干细胞分化所必需的。4. Vitamin D/calcitriol：活性维生素D代谢物1α,25-二羟维生素D3 (calcitriol)在维持类器官中的干细胞特性方面起着作用，并且抵消了BMP4和DBZ诱导的分化。Calcitriol通过减少磷酸化SMAD1/5/8的水平来抑制BMP4的早期信号传导，减少了分化基因的表达，并倾向于增加干细胞基因的表达。5. Hippo, Hedgehog, 和非canonical WNT通路：这些通路被提及为在肠道干细胞分化中起作用的其他信号通路，但文章中没有详细描述它们的作用。6. EGFR配体：EGFR配体在肠道干细胞分化中的作用在文章中被简要提及，但未深入探讨。这些信号通路的相互作用和平衡对于维持肠道干细胞的干性以及推动它们向成熟细胞类型的分化至关重要。通过调节这些通路，可以控制肠道干细胞的行为，这对于理解肠道组织的再生、癌症的发展以及可能的治疗策略都是非常重要的。为了研究不同信号通路对肠道类器官干性维持和分化的影响，作者对培养基成分进行了特定的调整，并设置了多个条件进行肠道类器官的培养。具体的调整和条件如下：1. 基础培养基（PROL）：用于正常肠道类器官的生长，包含Wnt3a、RSPO1、Noggin等因子，这些因子有助于维持干细胞的特性。2. 分化培养基（DIFF）：基础培养基中去除Wnt3a、RSPO1和Noggin等干细胞维持因子。3. BMP4培养基：在DIFF培养基的基础上，去除Noggin（一种BMP信号通路的抑制剂），并添加BMP4，以激活BMP信号通路。4. DBZ培养基：在DIFF培养基中添加γ-分泌酶抑制剂dibenzazepine (DBZ)，以阻断Notch信号通路。5. BMP4和DBZ联合培养基（B + D）：同时激活BMP信号通路（通过添加BMP4）和阻断Notch信号通路（通过添加DBZ）。6. Calcitriol处理：在上述各种培养基中添加100 nM的calcitriol，以探究其对肠道类器官分化的影响。Calcitriol 是维生素D的一种活性形式，具体来说，它是维生素D的代谢产物。维生素D主要有两种形式：维生素D2（麦角钙化醇，主要来源于植物）和维生素D3（胆钙化醇，主要来源于日晒合成或动物源性食物）。在人体内，维生素D3 可以通过皮肤在日晒下合成，或者通过饮食摄入。研究结果显示：- 在基础培养基（PROL）中，肠道类器官表现出干细胞特性。- 在分化培养基（DIFF）中，细胞开始出现分化现象，但程度有限。- BMP4培养基诱导了偏向肠上皮细胞的分化。- DBZ培养基则促进了黏液分泌细胞的分化。- 联合培养基（B + D）导致了肠上皮细胞和黏液分泌细胞两谱系的平衡且强烈的分化诱导。- Calcitriol处理减弱了BMP4和DBZ对正常肠道类器官分化的影响，减少了分化基因的表达，并倾向于增加干细胞基因的表达。此外，作者还观察到结肠肿瘤类器官对BMP4和DBZ的响应较差，表明肿瘤干细胞与正常干细胞在信号通路响应上存在差异。这些发现有助于理解维生素D如何在调控肠道干细胞分化中发挥作用，并可能对炎症性肠病和结直肠癌的治疗提供新的见解。维生素D的代谢过程涉及两个主要的羟化步骤转化为Calcitriol：1. 肝脏：在肝脏中，维生素D3（胆钙化醇）被转化为25-羟基维生素D3（25(OH)D3），这是维生素D的主要循环形式，但尚未完全活化。2. 肾脏：在肾脏中，25(OH)D3 进一步被转化为1α,25-二羟维生素D3，也称为calcitriol。这是维生素D的活性形式，能够发挥其生物学效应。Calcitriol 作为一种激素，通过与维生素D受体（VDR）结合，调节基因表达，影响多种细胞功能，包括细胞增殖、分化、免疫反应和钙磷代谢等。在文章中，calcitriol 被发现能够调节肠道干细胞的分化，这与其在维持肠道健康和可能影响结直肠癌发生中的作用相一致。根据提供的文件内容，calcitriol 对肿瘤类器官的影响相对有限。在研究中，尽管calcitriol 在正常结肠类器官中减弱了BMP4和DBZ诱导的分化，但在肿瘤类器官中，calcitriol 并没有显著改变肠上皮细胞或黏液分泌细胞基因的RNA水平。这表明肿瘤类器官对于calcitriol 的反应与正常类器官不同。然而，通过电子显微镜的超微结构分析，研究人员观察到calcitriol 在肿瘤类器官中具有有限的促进分化的效应。具体来说，在B + D（BMP4和DBZ联合）培养基中，calcitriol 促进了一部分细胞形成更成熟的微绒毛（在数量、排列和根部存在方面），增加了细胞间粘附结构（紧密连接、粘附连接和桥粒），以及诱导了适度的异染色质化。此外，与正常类器官相比，肿瘤类器官对BMP4和DBZ的联合处理反应较差，大多数细胞在B + D培养基中仍然保持未分化状态。这可能是因为肿瘤类器官中WNT信号通路的组成性激活，而已知WNT信号的去除是正常类器官分化所必需的。总结来说，calcitriol 在肿瘤类器官中的作用似乎与正常类器官中的作用不同，其在肿瘤类器官中主要表现为有限的促进分化效应，并且这种效应并不伴随着基因表达水平的显著变化。这些发现可能表明肿瘤干细胞与正常干细胞在信号响应上存在显著差异，这可能对癌症治疗策略的开发具有重要意义。文章中进行了一系列实验和检测来研究维生素D（calcitriol）对肠道类器官的影响，具体包括：1. 类器官培养：使用来自结直肠癌患者的健康组织的结肠类器官进行实验。这些类器官在缺乏干细胞因子的培养基中培养，以诱导分化。2. BMP4和Notch信号通路的激活与阻断：通过添加BMP4和使用γ-分泌酶抑制剂dibenzazepine (DBZ) 分别激活BMP信号通路和阻断Notch信号通路。3. Calcitriol处理：在不同的培养基中添加calcitriol，并观察其对类器官分化的影响。4. 光镜和电镜观察：使用光镜和电子显微镜（EM）观察类器官的形态和超微结构变化。5. 实时定量PCR (RT-qPCR)：分析类器官中干细胞标志物和分化标志物基因的表达水平。6. Western blot分析：检测类器官蛋白提取物中特定蛋白（如磷酸化SMAD1/5/8、CA1、PTK7和TFF2）的表达。7. 免疫荧光分析：使用特定的抗体对类器官进行染色，以评估特定蛋白的表达和分布。8. RNA测序 (RNA-seq)：对在不同培养条件下的类器官进行全基因组表达分析，以了解calcitriol对基因表达的影响。9. 细胞活力检测：通过测量细胞内ATP含量来评估类器官的细胞活力。10. 基因集富集分析 (GSEA)：使用RNA-seq数据进行基因集富集分析，以了解特定生物学过程的基因表达模式。11. 形态计量和定量分析：对电子显微镜图像进行分析，以量化细胞分化的程度。这些实验和检测方法使研究人员能够从分子、细胞和组织层面全面了解维生素D对肠道类器官分化的影响。通过这些数据，研究人员得出了calcitriol在调节肠道干细胞分化和维持干性特征中的作用。本文的研究结果揭示了维生素D（calcitriol）在调节肠道干细胞分化和维持干性特征中的作用，以及BMP和Notch信号通路在肠道类器官分化中的重要性。这些发现对以下几个方面的潜在临床应用具有重要意义：1. 结直肠癌治疗：了解肿瘤类器官与正常类器官在信号响应上的差异，可能有助于开发针对结直肠癌的新疗法。2. 炎症性肠病（IBD）管理：维生素D与肠道健康之间的联系可能为炎症性肠病的治疗提供新的策略，特别是考虑到维生素D在调节免疫系统中的作用。3. 干细胞治疗：通过调节BMP和Notch信号通路，可以更好地控制干细胞的分化，这对于干细胞治疗的发展具有潜在的应用价值。4. 药物筛选和个性化医疗：利用类器官作为模型系统，可以进行药物筛选和个性化治疗方案的测试，以预测药物对个体患者的疗效。5. 组织工程和再生医学：对肠道干细胞分化的深入理解可以促进组织工程策略的发展，用于治疗肠道损伤或疾病。6. 营养和预防医学：研究结果强调了维生素D在肠道健康中的重要性，可能有助于开发预防措施，减少结直肠癌和IBD的风险。7. 癌症干细胞靶向治疗：了解癌症干细胞与正常干细胞之间的信号通路差异，有助于开发专门针对癌症干细胞的治疗策略。8. 化疗药物的增敏：BMP4被报道能够增加某些癌细胞对化疗药物的敏感性，这可能有助于提高现有癌症治疗的效果。9. 微环境对肿瘤的影响：研究结果表明，calcitriol可能通过影响肿瘤微环境（如肿瘤相关成纤维细胞和内皮细胞）来发挥作用，这为开发针对肿瘤微环境的治疗策略提供了新思路。10. 衰老和年龄相关疾病：维生素D在维持干细胞功能和促进组织再生中的作用可能对延缓衰老过程和治疗年龄相关疾病具有潜在影响。这些潜在应用需要通过进一步的研究和临床试验来验证和优化，以确保它们的安全性和有效性。END深度聚焦类器官应用与3D细胞培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769戳“阅读原文”立即领取限量免费参会名额！