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深度聚焦类器官与3D培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769文章来源： 赛尔生物 Saier Biolabs 类器官（Organoids）指利用成体干细胞或多能干细胞进行体外三维（3D）培养而形成的具有一定空间结构的组织类似物。这些3D体外培养系统可复制出已分化组织的复杂空间形态，并能够表现出细胞与细胞之间、细胞与其周围基质之间的相互作用和空间位置形态。能更好地用于模拟器官组织的发生过程及生理病理状态，因而在基础研究以及临床诊疗方面具有广阔的应用前景。类器官的发展历程：图1. 类器官的发展历程1907年，Henry Van 发现物理分离的海绵细胞可以重现聚集，自行组成一个新的功能完善的海绵。在接下来的几十年里，脊椎动物中也发现了相似的细胞分离再聚合现象，例如1944年Holtfreter的两栖动物肾组织实验和1960年Weiss的禽类胚胎实验。1961年Piercehe和 Verney观察到胚状体的体外分化，随后在1964年Steinberg提出了细胞分化的差异粘附假说（DAH），1981年多功能干细胞（PSCs）被首次从小鼠的胚胎中分离出来，干细胞研究自此蓬勃发展。      1987年李茂林等人通过模拟生物体内微生物环境优化了细胞培养条件。研究表明，EHS (小鼠肉瘤：Engelbreth-Holm-Swarm) ECM(细胞外基质：extracellular matrix)提取物中，乳腺上皮细胞可组织成3D导管和小导管，此外，Shannon JM在ECM细胞中发现肺泡Ⅱ型上皮细胞分化。但是直到1998年，美国生物学家James Thomson才首次从人胚泡中分离培养出人胚胎干细胞。      2006年，通过对小鼠和人成纤维细胞进行重组编程，成功制备了人诱导多能干细胞(iPSCs)，这对干细胞和类器官研究有重大意义。2008年，Sasai等人通过展示人类大脑诱导多能干细胞自组织到形成极化皮质组织的神经细胞，奠定了类脑器官的基础。2009年，Hans Clevers和他的同事首次证明了单个Lgr5+肠道干细胞（ASCs）可以自行组织分化形成包含所有肠细胞类型的肠隐窝-绒毛结构.这开启了类器官技术发展的新时代。在此基础上类器官模型成为替代传统细胞系和异质动物模型的新型研究模型。2010年，研究发现小鼠胚胎肾干细胞分离再组合可形成肾类器官。肠类器官可从体外诱导多能干细胞生成。      Nakano等在2012年证明了在三维构建中PSCs自行组织成为了视杯结构。2013年，人类大脑类器官由小头患者的iPSCs细胞分化形成。Lee等人发现内皮细胞和成年细支气管肺泡干细胞在三维共培养模式下可产生肺类器官。乳腺、输卵管和海马类器官是在2015年研究得出的，蛇毒腺类器官产生于2020年。类器官模型的构建：目前3D类器官培养技术已经成功培养出大量具有部分关键生理结构和功能的类组织器官，常见的类器官可以分为两大类：组织细胞来源类器官（如肿瘤类器官）和多能干细胞来源类器官（如肠类器官、脑类器官）。1、小肠类器官培养：（1）解剖6-8周的小鼠，取胃以下约10cm的小肠，镊子去肠系膜，剪刀沿肠道剪开，用预冷的PBS洗3-5次，用载玻片小心的将小肠表面的绒毛刮去（显微镜下镜检），将刮好的小肠放入50ml离心管中，置于冰上；（2）将小肠转移至生物安全柜中，用含双抗的PBS清洗3-5次，将小肠转移至25ml 2mmol/L的EDTA的溶液中4℃冰箱中消化30min；（3）将消化好的小肠转移至50 ml离心管中用含双抗的PBS清洗2次；（4）加入25ml PBS适当摇晃30-50下，取部分悬液镜检。悬浮液用70um的过滤筛过滤到新的50ml离心管中；（5）重复步骤4，两次收集的滤液800rpm 离心5min；（6）弃上清，用2ml的DMEM重悬沉淀，取适量的悬液计数；隐窝的数量控制在5-15个/ul 最佳；（7）取适当体积的悬液加入到1.5ml的离心管中，室温下800rpm离心5min；（8）弃上清，用预冷的基质胶重悬（需充分混匀）；（9）接板，24孔板接50ul的重悬液（注：基质胶种在孔中间避免贴壁）；（10）将接种好的板于培养箱中放置20-30min；（11）每孔加500ul完全培养基，然后每隔2-3天换一次培养基，5-7天传代一次。图2. 小肠类器官的培养流程2、肿瘤类器官培养（以肠癌为例）：（1）将组织放入含有特殊组织保存液的组织取样瓶中放入冰盒4℃。（2）取样瓶消毒，组织放入培养皿，结直肠癌类器官缓冲液清洗三次后于培养皿中剪碎，大约1mm3的组织块。（3）癌组织用organo原代酶解液消化，37℃震荡消化10-20 min，（消化过程中随时观察消化情况）加入三倍体积organo原代酶终止液终止消化。（4）使用100μm孔径的筛网进行过滤，取少量滤液在镜下进行观察，可以看到明显的组织块，将滤液收集后于300g富集离心3-5min后移去上清，重新重悬离心。（5）去除上清，使用适量基质胶进行重悬(24孔板为例，每孔30ul）之后进行铺板（4℃下操作）拍照追踪定位。（6）将铺好的板子放入37℃培养箱中10-15min成胶，添加培养基（恢复室温）进行培养。图3. 肿瘤类器官的培养流程类器官的应用：与传统的2D细胞培养模型相比，3D培养的类器官包含多种细胞类型，可以形成功能性“微型器官”，更好地模拟器官组织的发生过程和生理病理状态。类类器官弥补了现有模型系统的某些局限性，提供了一个稳定的系统，易于培养和操作，同时在体内更能代表身体结构。到目前为止，类器官培养物由于能够更好地模拟体内环境已用于多种组织，包括肠道、心脏、肝脏、胰腺、肾脏、前列腺、肺、视网膜和大脑。这无疑为肿瘤研究、疾病建模、药物筛选、再生医学、精准医学等领域介于动物和细胞水平之间提供了更好的解决方案。类器官以其在体外长期增殖、可传代性、高度保持源器官结构和功能等特性在生物医学领域备受关注。目前类器官在机体生长发育、疾病病理、药物筛选及毒理学评价、再生医学、生物材料等研究中显示出巨大潜力。 图4. 类器官技术的多样化应用1、疾病模型类器官为胚胎发育和成人组织的病理学建模提供了一个平台。类器官在功能和结构上与体内器官相似，也可用于模拟致病过程，包括传染性、遗传性和退行性疾病的模型。例如，如果胃类器官感染了幽门螺杆菌，则可以探索幽门螺杆菌的感染机制。包含病理的细胞可以使用基因编辑技术生成或从患者身上提取。已经使用 CRISPR/Cas9 敲除系统生成了肾脏类器官的病理模型。由人类诱导多能干细胞（ iPSC）产生的皮质类器官已被开发用于模拟 Miller-Dieker 综合征。在疾病建模中，一些动物模型不能完全复现人类的体内状况，例如肺组织。由人体细胞生成的类器官除了伦理问题之外能克服动物模型原有的局限性。类器官通常可以从正常人上皮细胞中获得，可用于体外模拟恶性肿瘤各个阶段的突变，揭示癌症基因组的复杂性以及在肿瘤发展中基因突变的重要作用，发现精准癌症治疗的药物靶点。此外，用于癌症研究的类器官，一个非常有用的发展是与免疫细胞共培养类器官。这些方法是接近生理性肿瘤微环境 (TME) 的重要步骤，并为基于免疫的治疗提供了平台。肿瘤是一种复杂的疾病，无论是发病机制、转移机制，还是患者对治疗的反应和耐药机制，都有许多问题亟待探索。未来的研究需要不断完善对TME的模拟，建立更接近原始肿瘤性质的肿瘤类器官模型，从而对恶性肿瘤有更全面的认识。2、药物发现与筛选一般来说，新药的创制需要经过药物靶点选择、先导化合物鉴定、候选药物选择、动物安全性和有效性评价、人体临床试验等一系列过程。目前的药物研发主要以分子、细胞和动物为主。它涉及药物的毒性和有效性，因此必须经过动物到人类的实验过程，不能直接在人体上进行试验。然而，动物模型离人类还很远。因此，非常需要一种接近人体的疾病模型用于药物研发，以降低新药研发的成本和时间。类器官的应用可以大大提高这方面效率。类器官的出现对药物发现具有很大的吸引力，因为它们可以用于捕捉疾病异质性的一系列亚型并且大规模生产进行长期存储，创建生物库。类器官生物库为测试药物安全性和有效性提供了机会。毒理学研究可用于评估安全性。对于功效测试，已经开发了几种高通量方法，可以在一周内获取药物反应结果。类器官主要优势之一是在药物开发中可以生成正常的类器官并且利用它来筛选仅针对肿瘤细胞而不伤害健康细胞的药物。在临床试验中，不耐受的不良反应是导致药物失败的主要原因，包括肝毒性、心脏毒性和肾毒性。肝脏类器官可用于测试药物的肝毒性。药物相关的肝毒性主要由细胞色素 P450 酶介导，细胞色素 P450 酶的作用可以在接近生理水平的肝类器官中观察到。心脏毒性反应，如心律失常和心脏功能下降也可以在类器官中进行测试。此外，肾脏类器官也已用于药物毒理学研究。将类器官技术应用于临床前药物毒理学研究有助于降低药物临床试验的失败率，减少药物临床试验中不良事件的发生。类器官药物试验模型不能完全替代动物模型，但可以起到重要的补充作用。到目前为止，类器官已被用于治疗结肠癌和囊性纤维化等疾病的药物筛选。3、再生医学与器官修复除了体外应用外，类器官也被用于移植到其他生命体中研究以评估再生能力，成功的移植为类器官在再生医学中的应用铺平了道路。与植入式医疗设备相比，自体器官移植更不易受到磁场或物理攻击的影响，并且与同种异体器官移植相比，排斥的机会更低。类器官还可以通过用恢复的组织替换受损器官来在当代遗传基因异常的情况下进行基因校正。4、个性化用药预测患者对治疗的反应是类器官技术的另一个潜在应用。类器官提供了对个体患者疾病的独特见解，并显示出个性化治疗的潜力。通过在体外对患者来源的类器官进行一些治疗操作，可以根据类器官的反应来预测提供活检的患者对治疗可能出现的反应，从而为患者选择最合适的治疗方案。个性化医疗旨在通过在分子和药物基因组水平上更好地描述疾病，为每位患者制定有效的治疗方案。例如，测量来自囊性纤维化患者的直肠类器官中囊性纤维化跨膜电导调节剂的功能可以确定从囊性纤维化跨膜电导调节剂矫正治疗中的受益对象。对14例转移性结直肠癌患者1977个类器官癌相关基因的遗传分析显示，90%的体细胞突变与来自同一患者活检标本的类器官相同，与原始肿瘤对应的DNA拷贝数谱的相关系数为0.89。该实验表明，类器官可以很好地捕捉到原发肿瘤的遗传特性，这一实验为类器官在个体化医疗中的应用提供了有力的证据。5、癌症免疫治疗类器官与免疫细胞的体外共培养可以扩增免疫细胞，增强免疫应答，为后续的免疫治疗提供有力保障。此外，肿瘤微环境的研究也离不开类器官与免疫细胞等细胞的共培养技术。综上所述，来源于不同人体组织的类器官可用于药物研究、药物筛选和新药开发。它们还可以通过基因编辑来研究肿瘤出现和恶化的机制，并在体外用于预测患者对临床治疗的反应，从而帮助患者制定个性化的医疗计划。虽然类器官有许多潜在用途，但目前仍存在很大的局限性。迄今为止建立的所有类器官系统在体内发育的可重复性方面仍需要改进。例如，视网膜类器官虽然很好地表现出典型的层状组织，但外部部分未能形成，光感受器官不能完全成熟以变得对光敏感。类似的，大脑类器官呈现了大脑发育中早期的特征，但随后的特征（如皮质层）还没有完全形成。并且需要开发更多的培养方法来提高生成效率，缩短类器官模型的培养周期，降低培养成本。发育成熟问题似乎是类器官技术中的一个常见障碍，它是否会显着影响其治疗还有待观察。但确定的是，人类肠道类器官已被证明具有成熟肠道的特征并产生 Lgr5+ 成体干细胞。一旦异位移植成功用于治疗，其他类器官就可能会被诱导完全成熟，这些研究方向可能成为未来类器官研究的主要焦点。案例展示：案例一文章描述了一个由患者来源的膀胱癌类器官生物样本库，它概括了人类非肌肉浸润性和肌肉浸润性膀胱癌的组织病理学和分子谱特征。类器官保留了原发肿瘤的异质性，并在传代培养和异种移植过程中出现克隆进化。通过患者在疾病复发前后获得的活检样本，可以有效地建立类器官，这些来自复发性膀胱癌患者的类器官为研究原发实体肿瘤的肿瘤演化和药物反应提供了一个很好的模型系统，用以阐明复发的体细胞突变的生物学功能及其在介导转化和促进疾病进展方面的作用。此外类器官可与原位异种移植高效地进行转换，发挥不同模型的特定实验优势。对膀胱肿瘤器官的药物反应分析表明，分子突变谱与治疗抗性变化相关，并且可以通过体内异种移植来验证药物的特异性反应。整个研究表明，患者来源的膀胱肿瘤类器官代表了一个准确的模型系统，在肿瘤精准医学的背景下，患者的膀胱癌类器官是研究肿瘤演化和治疗反应的可靠模型。通过在类器官筛选鉴定出的药物可以在类器官的异种移植中得到验证，并且原则上可以用于指导膀胱内治疗。文章作者指出，下一步必须进行“联合”（肿瘤类器官与患者）临床试验，以确定患者来源的膀胱肿瘤类器官对药物治疗的反应是否能概括患者对体内相同治疗的反应，证实类器官在预测肿瘤临床药敏方面的作用。 案例二本文作者采用了一种在毫米流控芯片上（流式培养）体外培养肾器官的方法，该方法扩大了内皮祖细胞的内源性集群，并通过管壁细胞所包围的可灌注腔生成血管网络。为了评估不同培养方式得到的类器官在某一方面的性状和生理功能，常常需要对类器官的各种发育与细胞分化相关标志物进行鉴定。在文章中，研究人员发现具有粘附作用的胞外基质（ECM）比不具有粘附作用的ECM为类器官中的血管发生提供了更好的培养条件，从血管发生相关标志物MCAM、PECAM1以及PODXL的染色情况可以明显观察到两者的效应差异。为了评估流式培养肾脏类器官的血管形成情况，研究人员继续观察了在高流体剪切力（FSS）下体外培养的细胞器中MCAM和PECAM 1血管网络在灌注10d后(即分化第21天)中的增强形成，并随着时间的推移形成了新的肾单位，提示FSS是促进体外培养肾脏类器官的血管生成的环境因素。 案例三肺上皮来源于内胚层胚芽层，经过一系列复杂的内胚层-中胚层介导的信号事件，最终形成由支气管、细支气管和气体交换单位组成的树枝状网络。这些阶段包括内胚层诱导、前后和背腹图案化、肺规格化、肺出芽、分枝形态发生，以及最后成熟。这篇文章中，作者详细概括了这几个发展阶段，以便分化人类多能干细胞(hpscs)为腹前前肠球状体和进一步分化为两种不同类型的器官: 人类肺脏器官和芽尖祖细胞器。由此产生的人类肺脏器官具有类似于发育中的人类气道的支气管/细支气管的细胞类型和结构，它们被肺间质包围，细胞表达肺泡细胞标志物。芽尖前体细胞具有高度增殖的多能细胞群，具有体外多向分化潜能和体内植入潜能。人肺组织可以在50-85d内由 hpscs 产生，22d 内可以产生芽尖前体细胞，这两个hpsc 衍生的模型已经用人胎儿组织进行了基准测试，发现它们是人类胎儿样组织的代表。因此，芽尖前体类器官是探索上皮细胞命运决定的理想选择，而人类肺脏类器官可用于模拟人类肺发育过程中的上皮细胞间质交流。除了在发育生物学中的应用，人类肺脏类器官和芽尖前体类器官还可应用于再生医学、组织工程和药物安全性和效能测试。 案例四糖尿病的发病率不断上升，已成为全球性流行病。糖尿病是导致失明、肾衰竭、心脏病发作、中风或下肢截肢的主要原因。这些通常是由于血管的变化引起的，例如基底膜的扩张和血管细胞的缺失。糖尿病还会损害内皮细胞的功能，干扰内皮细胞和周细胞之间的沟通。内皮细胞和/或周细胞功能障碍如何导致糖尿病血管病变，目前尚不清楚。文章中，作者报道了从多能干细胞中发展出自组织的三维人血管类器官。这些人类血管器官含有内皮细胞和周细胞，它们自我组装成毛细血管网络，被基底膜包裹。将人类血管器官移植到小鼠体内，形成一个稳定、灌注的血管树，包括动脉、小动脉和小静脉。在体外，血管类器官暴露于高血糖和炎性细胞因子会引起血管基底膜增厚。在小鼠体内暴露于糖尿病环境中的人体血管，也模拟了糖尿病患者体内微血管的变化。Dll4和 notch3被认为是糖尿病血管病变的关键驱动因素。因此，来源于人类干细胞的类器官忠实地再现了人类血管的结构和功能，并且可以用于建模和识别糖尿病血管病变的调节因子，糖尿病血管病变影响着全世界数亿患者。 参考文献[1] Lee SH, Hu W, Matulay JT, et.al. Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer. Cell. 2018 Apr 5;173(2):515-528.e17. doi: 10.1016/j.cell.2018.03.017. PMID: 29625057.[2] Homan KA, Gupta N, Kroll KT, et.al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nat Methods. 2019 Mar;16(3):255-262. doi: 10.1038/s41592-019-0325-y. Epub 2019 Feb 11. PMID: 30742039.[3] Miller AJ, Dye BR, Ferrer-Torres D, et.al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nat Protoc. 2019 Feb;14(2):518-540. doi: 10.1038/s41596-018-0104-8. PMID: 30664680.[4] Wimmer RA, Leopoldi A, Aichinger M, et.al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 2019 Jan;565(7740):505-510. doi: 10.1038/s41586-018-0858-8. Epub 2019 Jan 16. PMID: 30651639.END深度聚焦类器官与3D培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769戳“阅读原文”立即领取限量免费参会名额！