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工艺优化在降低生物制药生产成本及提升产能方面扮演着关键角色。尤其在慢病毒载体（Lentivirus Vector, LV）的生产环节，由传统的补料分批模式向灌流工艺的转型，对于满足不断攀升的细胞与基因治疗需求至关重要。不过，灌流工艺往往伴随着较高的培养基使用量。鉴于此，开发经济高效的小规模模型以降低研发成本显得尤为必要。 本研究中，我们探索了将声波分离技术与Ambr 250高通量生物反应器系统相融合，针对稳定表达LV的细胞株开展强化灌流工艺的开发工作。在Ambr 250模型所构建的强化灌流工艺中，以每日3个罐体积（Vessel Volume per Day, VVD）的收获频率及高细胞密度为特点，相较于收获频率为1 VVD的传统对照工艺，实现了单位细胞功能病毒产量的1.4倍增长以及单位体积病毒产量的2.8倍提升。进一步，在完成生物反应器参数的优化之后，该成果在实验室规模的实验中得到了验证，其中单位细胞功能病毒产量提升至1.4倍，单位体积病毒产量更是达到了3.1倍的增幅。 简介 在制药领域，连续生物生产正逐渐占据核心地位。与传统的补料分批工艺相比，用于重组分子生产的细胞培养灌流工艺开发展现出诸多显著优势。例如，通过提升生物质浓度，灌流工艺能够有效降低产品异质性，并显著提升单位体积的生产效率，进而缩减生产设施的占地面积。近期，灌流工艺已经成为最大化提高病毒载体产量的关键手段，这些病毒载体广泛应用于基因和细胞治疗以及基于载体的疫苗生产，包括水泡性口炎病毒、甲型流感病毒、改良安卡拉痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒和慢病毒（Lentivirus, LV）。这一发展尤为重要，因为这些载体的生产成本相对较高，主要是由于所采用的生产技术和较低的工艺产量。通过在灌流模式下强化载体的生产工艺，可以降低每剂的生产成本，最终减少细胞和基因疗法的整体费用，使这些先进的治疗手段更加易于获取。 随着连续生物生产重要性的不断提升，开发合适的缩小模型变得尤为关键，这有助于加速工艺开发流程并有效降低开发成本，尤其是在考虑到每次运行时培养基的消耗量相对较高。目前市面上多数缩小模型主要基于不同类型的孔板、摇管、摇瓶或微型生物反应器系统，例如Ambr 15和Mobius Breez。孔板、摇管和摇瓶因其成本低廉而成为常见的选择。不过，这些设备在半灌流模式下培养时需要进行手动操作，如离心以及用新鲜培养基替换上清液，这使得整个工艺过程较为劳动密集。 相比之下，Ambr 15微型生物反应器系统能够在一定程度上实现自动化操作，并且能够监测和控制诸如溶氧(DO)和pH值等关键工艺参数。然而，该系统在培养基置换过程中采用的细胞分离方法是通过细胞沉淀或手动离心实现的，由于缺乏对细胞分离过程的精细工艺控制，这可能会对细胞培养的代谢产生不利影响。此外，培养基置换仅能以半连续模式进行。 Mobius Breez微型生物反应器系统则允许在灌流模式下以2 mL的工作体积进行无气泡细胞培养，通过1.2 µm膜实现细胞分离，并能够监测相关的工艺参数。不过，该系统的一个缺点是无法模拟搅拌罐生物反应器中的搅拌和鼓泡机制，这在某些工艺要求下可能是一个限制因素。 因此，最近在建立灌流缩小模型方面的进展主要集中在利用微型生物反应器来模拟搅拌罐式生物反应器的独特属性以及通常在更大规模操作中使用的细胞截留方法。最近，一种新型的250 mL灌流反应器系统被介绍，该系统允许在高活细胞密度（VCD）下进行切向流过滤（TFF）介导的灌流工艺。Ambr 250高通量生物反应器系统作为一种广泛应用于工艺开发和克隆筛选的工具，能够并行自动培养多达24个罐，工作体积高达250 mL。Sartorius最近推出了Ambr 250系统的灌流版本，其中灌流过程可由TFF或交替切向流过滤（ATF）介导。Joe等人已经证明，Ambr 250 ATF灌流系统可用于加速生产腺病毒载体疫苗。然而，大多数可用的ATF膜孔径较小，这会导致较大的分子（如病毒）在生产过程中被截留，从而降低如甲型流感病毒或LV等不稳定产品的病毒收率。一些细胞截留技术已被描述，可用于连续收获较大的病毒相关产品。这些技术包括使用截留分子量更大的替代ATF膜、切向流深层过滤（TFDF）技术以及无膜声波介导的细胞分离技术。然而，这些技术尚未转化为合适的灌流缩小模型。 在本研究中，我们对声波介导的细胞分离技术在Ambr 250高通量生物反应器系统中用于LV（慢病毒）灌流工艺开发的可行性进行了评估。我们采用了一个稳定的可诱导LV生产细胞池作为模型系统，在诱导条件下表达以水泡性口炎病毒囊膜糖蛋白（VSV-G）假型化的LV，这种LV因其广泛的宿主趋向性，被广泛应用于基因和细胞治疗领域。我们对缩小模型进行了评估，旨在研究与先前建立的生产工艺相比，更高的灌流率和细胞密度对工艺产量的影响。随后，我们将优化后的工艺放大到台式生物反应器规模。在改进技术设置和培养基成分之后，强化的工艺使得单位生物反应器体积的功能性载体产量提升了3.1倍。 详细实验操作，请参考原文 结果与讨论 为了提升我们先前开发的灌流工艺中慢病毒（LV）的产量，我们致力于提高病毒生产过程中的活细胞密度（Viable Cell Density，VCD）。通常，这是通过应用更高的灌流速率来实现的，这样既能提供充足的营养供应，又能有效移除细胞代谢产物。对于像LV这样不稳定的产物，提高灌流速率还可能通过减少在生物反应器条件下的停留时间来影响工艺产量和产品质量。 提高灌流速率虽能带来诸多益处，但也可能引发一些副作用，具体如下： 细胞生理影响 细胞剪切力损伤：较高的灌流速率可能导致细胞受到更大的剪切力。细胞在培养过程中，其细胞膜和内部结构较为脆弱，过高的剪切力可能会破坏细胞膜的完整性，导致细胞内容物泄漏，进而影响细胞的正常生理功能和代谢活动，甚至可能引起细胞死亡，降低细胞的活性和产量。 细胞代谢紊乱：灌流速率的提升改变了细胞所处的微环境。细胞需要一定的时间来适应这种变化，如果灌流速率增加过快或过高，细胞可能无法及时调整自身的代谢途径来应对营养物质和代谢产物浓度的快速变化，从而导致代谢紊乱。例如，细胞可能会过度消耗某些营养物质，或者代谢产物的积累速度超过细胞的清除能力，进而影响细胞的生长和生产效率。 产品质量影响 病毒载体质量下降：对于慢病毒载体（LV）等生物制品，细胞的生理状态和代谢活动对其质量有着重要影响。细胞受到剪切力损伤或代谢紊乱时，可能会导致病毒载体的包装效率降低，病毒颗粒的完整性受损，从而影响病毒载体的滴度、感染力和转导效率等关键质量属性。此外，细胞代谢紊乱还可能产生一些不良的代谢产物，这些代谢产物可能会与病毒载体相互作用，进一步降低病毒载体的质量。 杂质增加：提高灌流速率可能会使细胞代谢加速，产生更多的代谢产物。这些代谢产物中可能包含一些杂质，如宿主细胞蛋白、DNA等。如果灌流系统的设计和控制不合理，这些杂质可能会随着病毒载体一起被收集，从而增加了产品的杂质含量，降低了产品的纯度，给后续的纯化工艺带来更大的挑战。 工艺控制难度增加 营养物质和代谢产物浓度波动：灌流速率的提高使得营养物质和代谢产物在生物反应器内的浓度变化更加迅速和复杂。这给实时监测和精确控制这些参数带来了更大的难度。如果不能及时准确地调整营养物质的添加量和代谢产物的清除速度，可能会导致细胞生长环境的不稳定，进而影响细胞的生长和生产性能。 系统稳定性降低：较高的灌流速率对生物反应器的搅拌、混合、温度控制等系统提出了更高的要求。如果这些系统不能很好地适应灌流速率的提高，可能会出现搅拌不均匀、局部温度差异过大等问题，从而影响细胞的均匀分布和生长条件的一致性，降低工艺的稳定性和可重复性。 VSV-G假型慢病毒具有温度依赖性的有限半衰期，这一半衰期可以通过随时间逐渐丧失感染性来衡量，并且可以用指数衰减函数来近似计算。之前的研究中曾描述过不同的LV半衰期，其在4°C时为34-200小时，而在37°C时为3-35小时。感染性丧失的确切机制尚未明确，但囊膜蛋白似乎起着关键作用，因为囊膜的类型会影响载体的稳定性。此外，通过定向进化已经开发出了具有优异热稳定性的VSV-G变体。逆转录过程也被描述为热敏感的，这可能受到所用囊膜的影响。逆转录病毒（包括慢病毒）的稳定性还受到渗透压、离子强度和pH值等物理参数的影响。因此，VSV-G假型慢病毒半衰期范围广泛很可能是由于生产工艺中使用的生产细胞系、基因构建体、VSV-G变体、培养基、添加物和缓冲液的差异造成的。因此，应针对每个单独的表达系统和生产工艺来表征慢病毒的稳定性特征。 对于使用GPRTGs衍生的稳定生产细胞在搅拌罐灌流生物反应器中生产的携带WAS-T2A-GFP构建体的LV，我们发现在未处理的无细胞收获基质中，4°C下的半衰期为153小时，37°C下的半衰期为6小时（见图1），这在其他研究小组先前描述的范围内。当前已建立的生产工艺采用1 VVD的收获率，细胞废弃高达0.33 VVD，最大灌流率为1.33 VVD。应当注意，在采用声波介导的细胞分离操作的灌流生物反应器中，含病毒的上清液会不断从容器中稀释出来，可以通过假设灌流生物反应器的行为类似于理想混合的连续搅拌罐反应器来近似计算（见公式5）。例如，在给定时间内以1 VVD的灌流速率生产的病毒，24小时后约有37%的病毒仍留在生物反应器中。由于在37°C下孵育21小时后，无细胞的细胞培养上清液中的感染滴度降至可量化的检测限以下（见图1），我们假设更高的灌流速率将通过减少在生物反应器条件下产生的载体的平均停留时间以及更快地将载体输送到4°C环境来增加慢病毒的产量。 图 1 WAS-T2A-GFP 慢病毒的温度和时间依赖性失活。使用灌流生物反应器中的稳定 GPRTGs 生产细胞生产的无细胞载体收获液在冰箱中 4°C 和培养箱中 5% CO2气氛下孵育，然后在不同时间点在 −80°C 下冷冻。使用具有稳健拟合的单相衰减方程通过非线性回归确定 37°C 下 6 小时的半衰期和4°C 下 153 小时的半衰期。 在我们先前的研究中，探索了另一种潜在的机制，即在载体的生产过程中降低温度，旨在减缓慢病毒的失活速率，因为慢病毒的失活过程与温度密切相关。降低温度不仅能够减缓病毒失活，还能通过抑制蛋白水解酶的活性或分泌、抑制细胞增殖以及改变细胞内信号通路等方式来提升生产效率。相关研究显示，适度降低温度对于生产多种病毒，包括甲型流感病毒、重组腺病毒、基于疱疹病毒的载体以及重组蛋白等都是有益的。然而，对于由 GPRTGs 衍生的生产细胞系，当温度从 37.0°C 降低至 35.5°C 时，观察到病毒滴度显著下降（p = 0.0004）。这些数据表明，较低的生产温度可能会对 GPRTGs 衍生细胞系的病毒生产能力产生不利的细胞代谢影响。这一发现也通过贴壁 GPRTG 衍生的生产细胞系得到了验证，并且可能适用于所有 GPRTG 衍生的生产细胞系。与降低温度的结果相反，将温度从 37.0°C 提升至 38.5°C 并未导致 LV 滴度出现显著变化。值得注意的是，由于在 38.5°C 条件下生产过程中平均细胞密度（VCD）较低，单位细胞的生产力甚至更高，尽管这种差异并不显著（p = 0.0506）。这一结果令人意外，因为较高的温度通常会加速 LV 的失活，这可能暗示着细胞生产力的提升。然而，由于在所研究的温度范围内未观察到 LV 滴度的显著提升，因此所有后续的实验均在 37.0°C 下进行。未来还需要进一步的研究来深入了解不同生产温度对病毒质量的具体影响。 为了推进强化灌流工艺的开发，我们采用了一种新型的小规模灌流系统，该系统包括一个用于细胞分离的声学分离室（ASC），可以连接到 Ambr 250 高通量生物反应器系统（见图2）。尽管先前已有研究使用 Ambr 250 系统进行强化 ATF 介导的灌流工艺开发以生产腺病毒载体疫苗，但本研究是首次展示在高通量生物反应器系统中应用声波分离介导的灌流技术。所有的生物反应器生产均利用基于 Tet-off 诱导表达系统的稳定 GPRTGs WAS-T2A-GFP 生产细胞进行，并通过先前开发的稀释方法启动 LV 的生产。 图 2 台式生物反应器和Ambr 250 生物反应器的声波介导灌流装置的示意图。在收获模式下，细胞分离室中的声场允许连续收集无细胞的细胞培养上清液。在反冲洗模式下，关闭声场并反转收获泵的流向以将分离的细胞返回到生物反应器中。对于 Ambr 250 系统中的操作，6个容器分别配备了声学分离室 (ASC)。 以1.50±0.09×10^6 cells/mL的活细胞密度（VCD）接种六个Ambr 250生物反应器，所有反应器在经过3天的批处理阶段后开始进行灌流（见图3A）。先前建立的标准慢病毒（LV）生产工艺采用1体积通气率（VVD）进行收获，并通过可变的细胞废弃来维持大约2×10^7 cells/mL的VCD（见图3A，B）。为了在LV生产过程中提高细胞密度，在诱导后第6天（dpi），将其中三个生物反应器的收获率逐步提高到3 VVD，在开始细胞废弃之前，细胞在第7dpi时生长至平均VCD为3.99±0.34×10^7 cells/mL（见图3A，B）。我们发现，在4-5×10^7 cells/mL的VCD似乎是可使用的技术设置下的极限细胞密度，以保持超过90%的分离效率。在收获率为1 VVD和3 VVD的工艺中观察到相似的细胞活力曲线，在第11dpi时平均细胞活力分别为80.5±2.8%和79.0±2.1%（见图3C）。在这两种工艺中也观察到相似的感染滴度曲线，在收获率为1 VVD时于第10dpi达到最大值7.27±1.74×10^7 TU/mL，在收获率为3 VVD时达到最大值8.47±5.26×10^7 TU/mL（见图3D）。由于Ambr系统的生物反应器体积较小，导致收获管线中的流速相当低，室温下病毒在收获管线中的停留时间增加可能导致病毒降解增加。不同收获率下的操作的不同流速可能会扭曲比较结果，因为收获管线中的平均停留时间不同，而收获管线不受温度控制。因此，使用生物反应器中测定的感染性滴度来比较单位体积和单位细胞载体生产力和产量。发现在第11dpi时，3 VVD收获率下单位生物反应器体积的累积病毒产量明显更高（2.27±0.28×10^8 TU/mL对比6.91±2.54×10^8 TU/mL；p=0.0396）（见图3E）。为了研究较高灌流率对病毒收获的影响，病毒生产力按细胞标准化。图3F结果显示，在第6dpi时，即灌流率高于标准工艺后的第一个取样时间点，3 VVD工艺的平均单位细胞病毒产量有所增加（见图3A）。在比较第6-9dpi时的累积单位细胞病毒产量时，我们发现存在显著差异（所有p值<0.002），这支持了以下假设：增加灌流率会增加功能性LV收获率。在1 VVD的收获率下，工艺结束时的累积单位细胞产量为17.1±1.2 TU/cell，在3 VVD的收获率下，累积单位细胞产量为24.2±5.0 TU/cell（p=0.0745；见图3G）。值得注意的是，我们观察到从第9dpi开始生物反应器的体积波动增加，特别是在3 VVD的收获率下，这需要每天重新调整泵速来控制工作体积。这可以解释在后期工艺中VCD和滴度相关参数的标准偏差增加的原因。主要原因是集成浸管入口的堵塞越来越严重，该浸管的内径小于1 mm。两个工艺中的葡萄糖浓度均保持在>9 mmol/L，表明没有发生葡萄糖限制。达到目标VCD后，两个工艺的葡萄糖消耗和乳酸生成速率相似，表明两个工艺的细胞代谢状态相当。 图 3 在 Ambr 250 高通量生物反应器系统中，研究使用声波细胞分离法进行稳定慢病毒生产的强化灌流工艺。将收获率为 1 VVD的标准生产工艺与收获率为 3 VVD 且活细胞密度更高的强化灌流工艺进行了比较。数据是使用每种条件下3个容器 ( n  = 3) 生成的。所有6个容器均使用相同的预培养物进行接种。值显示为 A 的平均值和 B–G 的平均值 ± SD。BR = 废弃率，HR = 收获率，VVD = 每日罐体积。(A) 收获率和废弃率。(B) 活细胞密度。(C) 细胞活力。(D) 感染性病毒滴度。(E)单位反应器体积的感染性滴度产量或体积产量。 非配对t检验的p = 0.0396 。(F) 感染性病毒的单位细胞生产力。（G）单位细胞感染性病毒产量。 为了验证小规模模型的结果，在台式生物反应器规模上测试了较高灌流率的影响。较高的灌流率需要较高的循环率，这会导致更高的腔内湍流并降低细胞分离效率。此外，施加的流速可能会影响细胞悬浮培养（ASC）中的散热，从而影响细胞代谢和病毒稳定性。因此，生物反应器的工作体积从4.5升（收获率为1体积通气率，VVD）按比例缩小到1.5升（收获率为3 VVD）。该设置允许在两个工艺中对声学灌流系统使用相同的技术设置和流速，从而减少技术差异的影响并有助于研究不同收获率对病毒生产力的影响。对于更高灌流率下的慢病毒（LV）生产，采用与Ambr 250类似的工艺策略，在初始批次工艺阶段后逐渐增加灌流率（见图4A）。对于1 VVD工艺，在第6天达到2.27×10^7 cell/mL的活细胞密度（VCD）后，采用连续细胞废弃以控制细胞密度（见图4A、B）。对于3 VVD工艺，在第7天达到4.29×10^7 cells/mL的VCD后开始细胞废弃。由于两个工艺结束时细胞生长减慢，因此在1 VVD工艺中在第16天关闭细胞废弃，在3 VVD工艺中在第15天关闭细胞废弃。在1 VVD和3 VVD的收获率之间获得了相似的活力曲线。在该工艺结束时，活力下降，在第17天1 VVD达到71.4%，在第16天3 VVD达到57.7%（见图4C）。同时，观察到无细胞收获液的浊度增加。这可能是由于细胞抑制和细胞毒性载体成分（如VSV-G和病毒蛋白酶）的持续表达，并且可能特定于单个生产克隆。我们观察到1 VVD和3 VVD的收获率之间感染滴度曲线相似，但在3 VVD时工艺的滴度略高（见图4D）。测定的最高感染滴度为1 VVD时第12天1.24×10^8 TU/mL，3 VVD时第14天1.74×10^8 TU/mL。3 VVD时的最终累积产量高出3.1倍，达到3.31×10^9 TU/mL，而1 VVD时为1.08×10^9 TU/mL（见图4E）。通过测定收集的收获液的滴度，也验证了通过更高灌流率获得的更高功能性病毒产量。值得注意的是，在4°C下收集的最终收获液的滴度平均比生物反应器中测定的平均功能性滴度低25％，因为病毒降解在4°C下仅减慢但并未阻止（见图1）。除培养最后一天外，收获率为3 VVD时单位细胞生产力更高（见图4F）。两个生物反应器在第14天时均获得了最高的单位细胞生产力，在1 VVD时显示7.7 TU/cell/day的数值，在3 VVD时显示11.1 TU/cell/day的数值。最终累积单位细胞病毒产量在1 VVD时为61.9 TU/cell，在3 VVD时为89.1 TU/cell（见图4G）。整个工艺中在3 VVD时获得了更高的单位细胞物理载体RNA生产力（见图4H），最终累积产量为5.02×10^12 RNA拷贝/mL，而1 VVD时为1.66×10^12 RNA拷贝/mL。上清液中的DNA浓度随工艺时间而增加，在1 VVD工艺中在第12天达到峰值浓度9452 ng/mL，在3 VVD工艺中在第16天达到峰值浓度9522 ng/mL（见图5A），表明两个工艺之间的杂质分布相似。 图 4 使用优化设置的声波细胞分离法进行台式生物反应器灌流工艺，实现慢病毒的稳定生产。在 5 L 生物反应器中以 1 VVD 的收获率进行标准工艺。在 2 L 生物反应器中以 3 VVD 的收获率进行强化工艺。使用 #17 PharmaPure 泵管来循环细胞悬浮液，以进行灌流模式操作。培养基中添加了0.5% 泊洛沙姆 188 和 0.4% 胆固醇脂质浓缩物。每个条件下使用一个容器进行运行。BR = 废弃率，HR = 收获率，VVD = 每日罐体积。(A) 收获率和废弃率。(B) 活细胞密度。(C) 细胞活力。(D) 感染性病毒滴度。(E) 单位反应器体积的感染性滴度产量或体积产量。(F) 感染性病毒的单位细胞生产力。(G) 单位细胞感染性病毒产量。(H) 载体 RNA 基因组的单位细胞生产力。(I) 载体 RNA 基因组的单位细胞产量。 图 5 经优化设置，从台式生物反应器中采集的细胞培养上清液中 DNA 浓度和每 ng p24 衣壳蛋白的感染性颗粒数量。(A) DNA 浓度。(B) 每 ng p24 衣壳蛋白的感染性颗粒数量。 在对比Ambr 250与台式生物反应器中相同工艺持续时间的生产数据时，我们发现台式生物反应器在生产感染性病毒的生产率和产量方面似乎表现更佳（见表1）。这一发现颇出意外，因为通常认为循环泵引入的剪切应力会对细胞转录产生负面影响，进而降低单位细胞的生产率，而这仅是台式装置的一个组成部分（见图2）。然而，Gränicher等人的研究使用声波分离技术比较了在灌流模式下生产甲型流感病毒的不同再循环策略。他们的报告指出，与基于阀门的再循环相比，基于泵的再循环虽然具有更高的机械剪切应力，但腔内最高温度更低，且细胞生产率更高。较高的腔体温度可能是导致Ambr 250生产率较低的一个潜在原因，因为它可能影响细胞代谢和病毒灭活动力学。实验室规模的再循环可能有助于声波分离器（ASC）更有效地散热，并减少腔体中的溶氧（DO）波动。此外，连接到Ambr 250系统的ASC仅通过安全柜的气流进行冷却，而实验室规模的ASC则通过压缩空气冷却。尽管小型ASC的功率输入大约低10倍，且表面积与体积的比值高于实验室规模的ASC，这有利于散热，但必须考虑不同规模之间温度分布和散热的潜在差异。不过，两种规模的单位细胞和体积感染性载体产量都实现了数倍的增长。在强化灌流工艺中，当收获率为3 VVD时，无论是在Ambr 250还是在台式规模下，单位细胞病毒产量都提高了1.4倍。在Ambr 250中，单位体积产量提高了2.8倍，而在台式生物反应器规模下，单位体积产量提高了3.1倍。 新研发的工艺所实现的单位体积LV产量的提升，凸显了灌流工艺强化在LV生产中的关键作用。该工艺能够在相同的工艺周期内，显著增加每个生物反应器体积所累积的LV产量（见图4E），从而使时空产量增长了三倍。这不仅能在维持相同产量的前提下缩减生产设施的占地面积，还能在固定占地面积的基础上提升产量，进而有效降低生产成本。提升时空产量的关键因素之一是采用更高的细胞密度。通过进一步提升目标VCD（活细胞密度），可以获取更高的LV产量，这亦可能通过减少总体细胞废弃来降低产品损失。然而，应用更高的VCD可能会对工艺的稳健性造成影响。由于声波分离技术缺乏物理细胞屏障，当细胞截留装置达到其技术极限时，细胞密度的无序增长会干扰分离效率，并导致细胞通过收获液流失。这将影响收获特性，并可能波及后续的下游工艺环节。因此，利用细胞废弃来调控特定的目标VCD或许是一种有利的策略。 提升灌流工艺的时空产量的另一关键因素是单位细胞慢病毒产量的提高（见图3G和4G）。在较高收获率下获得的数据支持以下假设：鉴于载体在37°C下的半衰期仅为6小时，减少慢病毒在生物反应器中的停留时间可以提高慢病毒的回收率（见图1）。先前的研究也报道了类似现象，因为载体在37°C下的半衰期仅为2-8小时，所以在生产假型带有GALV囊膜的逆转录病毒载体时也观察到了这一点，这表明3到4体积置换的灌流率可能对细胞生长和载体生产最为有利。由于VSV-G假型病毒载体在37°C下的半衰期范围为3-35小时，因此可能需要针对每个单独的生产系统确定最佳应用灌流率。收获率的提高导致病毒降解减少，这不仅影响病毒载体工艺的产量，还影响所生产病毒载体的质量。在选定的时间点测定了每ng衣壳蛋白p24中的感染性颗粒数量，作为病毒载体质量的指标（见图5B）。比较10 dpi和14 dpi时达到各自目标收获率的值时，3 VVD时获得的2.23×10^4 TU/ng p24和3.41×10^4 TU/ng p24的值高于1 VVD时的1.13×10^4 TU/ng p24和2.25×10^4 TU/ng p24。结果表明，更高的灌流率可带来更高的LV质量。 虽然通过减少生物反应器停留时间而降低LV失活可能是单位细胞生产率提高的最可能原因，但也应考虑其他因素。强化工艺的平均单位细胞灌流率略高。在Ambr 250模型中，两种工艺的葡萄糖消耗率无显著差异，达到稳定状态后，台式规模下的消耗率仅略高（见图4A、E）。然而，其他培养基成分的可用性和细胞消耗率可能会影响细胞生产力，以及通过更高的灌流率更好地去除潜在的细胞代谢物。强化工艺提高单位细胞生产力的另一个潜在因素可能是通过更高的流速改善声波分离器（ASC）的冷却。其他研究小组报告称，腔室顶部的温度升高至40°C，这可能会影响细胞培养代谢和病毒稳定性。ASC中的较高流速可以改善散热并减少暴露在较高温度下的时间。然而，对于台式规模比较，与标准工艺的1 VVD和4.5 L工作体积相比，在较高的3 VVD灌流率下用于生产的生物反应器工作体积按比例减少至1.5 L。事实上，两个工艺之间的流速以及散热是相当的。 提升慢病毒载体（LV）在生物反应器中的产量可以通过多种策略实现，以下是一些有效的方法： 优化细胞培养条件 选择合适的细胞系：不同的细胞系对LV的生产效率不同。例如，293T细胞常用于LV的生产，因为它具有高效的转染效率和良好的病毒包装能力。选择具有高病毒产量潜力的细胞系是提高产量的基础。 优化培养基成分：培养基中的营养成分对细胞生长和病毒生产至关重要。通过添加特定的生长因子、氨基酸、维生素等，可以促进细胞的增殖和代谢，从而提高LV的产量。例如，添加胰岛素、转铁蛋白等成分可以增强细胞的生长和病毒生产。 控制培养条件：维持适宜的培养温度、pH值、溶解氧等条件对细胞的生长和病毒生产非常重要。一般来说，慢病毒载体生产的适宜温度为37°C左右，pH值在7.2-7.4之间，溶解氧水平应保持在较高水平以满足细胞的代谢需求。通过精确控制这些条件，可以为细胞提供最佳的生长环境，进而提高LV的产量。 提高细胞密度 增加初始接种密度：在生物反应器启动时，适当增加细胞的初始接种密度可以更快地达到目标细胞密度，从而缩短生产周期并提高LV的产量。但需要注意的是，过高的初始接种密度可能会导致细胞竞争营养物质和空间，反而影响细胞的生长和病毒生产。 应用细胞截留技术：利用细胞截留装置，如中空纤维过滤器、旋转过滤器等，可以将细胞保留在生物反应器内，实现细胞的高密度培养。这样可以在相同的反应器体积内容纳更多的细胞，从而提高LV的产量。例如，通过优化细胞截留装置的操作参数，如过滤压力、流速等，可以有效提高细胞截留效率，实现细胞密度的提升。 优化病毒载体构建 选择高效的包装信号：慢病毒载体的包装信号决定了病毒颗粒的组装和释放效率。选择具有高效包装信号的载体构建，可以提高病毒颗粒的产量。例如，一些经过优化的包装信号序列可以增强病毒RNA的包装效率，从而增加LV的产量。 优化载体基因组结构：合理设计载体基因组结构，去除不必要的序列，可以提高载体的稳定性和生产效率。例如，去除载体中的重复序列可以减少重组事件的发生，提高载体的稳定性；优化载体的启动子和增强子序列，可以提高病毒基因的表达水平，从而增加LV的产量。 应用灌流培养技术 提高灌流率：灌流培养技术可以通过不断更新培养基，为细胞提供充足的营养物质，同时及时移除代谢废物和抑制因子，从而维持细胞的良好生长状态和高效的病毒生产能力。适当提高灌流率可以在一定程度上提高LV的产量，但过高的灌流率可能会导致细胞剪切力损伤和病毒颗粒的稀释损失。因此，需要根据具体的细胞系和生产系统，确定最佳的灌流率。 优化灌流策略：除了控制灌流率外，还可以通过优化灌流策略来提高LV的产量。例如，采用分段灌流或脉冲灌流的方式，可以在不同的生产阶段提供不同的营养物质和环境条件，满足细胞在不同生长阶段的需求，从而提高LV的产量。此外，结合细胞截留技术和灌流培养技术，可以实现细胞的高密度培养和高效的病毒生产，进一步提高LV的产量。加强过程控制与监测 实时监测细胞状态：通过在线监测细胞的生长参数，如细胞密度、活率、代谢产物浓度等，可以及时了解细胞的生长状态和生产性能。例如，利用光学传感器、电极传感器等在线监测设备，可以实时获取细胞的生长数据，为过程控制提供依据。根据监测结果，可以及时调整培养条件和操作参数，确保细胞处于最佳的生长状态，从而提高LV的产量。 优化收获时机：确定最佳的病毒收获时机对于提高LV的产量至关重要。一般来说，当细胞的生长达到稳定期，病毒产量达到峰值时，进行病毒收获可以获得较高的产量。通过监测病毒滴度、感染性颗粒数量等指标，可以准确判断收获时机。此外，采用连续收获或分段收获的方式，可以提高病毒的回收率，进一步增加LV的产量。 值得注意的是，灌流台式生物反应器装置之前已经进行了优化，以支持在更高灌流率下生产慢病毒。当使用未优化的装置，且收获率设置为3 VVD时，与1 VVD的对照工艺相比，在工艺初期，单位细胞和体积累积功能载体产量呈现出增加的趋势。然而，作为台式装置的一个特定部分，循环泵（见图2）在较高的收获率下引入了细胞剪切应力，这导致了细胞生长的停滞，随后活细胞密度（VCD）下降。通过使用内表面光滑、内径较大的特定低散裂泵管，并在相同流速下降低泵速，能够将细胞再循环的负面影响降低到可容忍的水平。其他研究小组也报告了在使用中国仓鼠卵巢（CHO）或HEK293衍生细胞系在灌流模式下生产重组蛋白时的类似发现。 并且，用于LV生产的细胞正在表达一些载体成分，例如VSV-G和由gag-pol基因编码的人类免疫缺陷病毒1蛋白酶，这些成分据称具有细胞抑制或细胞毒性作用。这可能是导致本研究中使用的细胞系剪切敏感性增加的一个因素。因此，我们将培养基中的泊洛沙姆188浓度从0.1%增加到0.5%。泊洛沙姆188是一种广泛使用的非离子表面活性剂，它可以保护细胞培养物免受生物反应器中的流体动力和气泡诱导剪切力的影响。也有报道称，增加泊洛沙姆188浓度可以保护HEK293细胞免受灌流工艺中生产腺病毒时蠕动泵产生的剪切力的影响。 在这一研究背景下，需要强调的是，像慢病毒（LV）这样的感染性囊膜病毒的产生依赖于病毒从细胞表面出芽的过程，在此过程中形成病毒囊膜。细胞膜的组织和组成对于产生功能性HIV颗粒至关重要，这些颗粒选择性地从具有特定组成的富含胆固醇的脂质筏中出芽。同样，胆固醇的存在对于逆转录病毒载体的生产力和感染性是关键因素，包括用VSV-G假型化的HIV-1衍生LV。然而，一些细胞模型表明，剪切应力会增加细胞膜流动性并降低膜脂质的有序性。此外，在使用HEK293细胞的灌流工艺中，高剪切应力会下调脂质生物合成过程。Zhan等人还描述了剪切应力引起的乳酸生成率增加，这与我们的发现相关。因此，增加的剪切应力可能会影响产生的囊膜病毒的感染性。尽管我们在摇瓶实验中没有发现胆固醇脂质添加物对LV生产力有显著影响，但在剪切应力条件下添加可能是有益的，因为这被描述为可以阻止负面影响，例如降低质膜胆固醇水平。 我们开发的3 VVD强化灌流工艺，根据生物反应器中测定的感染滴度计算，累计功能产量达到3.31×10^12 TU/L。考虑到收集的批次收获液的回收率为75%，可以推断通过执行的收获策略，理论上可获得2.48×10^12 TU/L的累计功能产量。我们之前曾报道，在生物反应器生产工艺中，对于本研究中生产的WAS-T2A-GFP LV，累计功能产量为2.4×10^11 TU/L，这表明通过新工艺，累计功能产量提高了10倍以上。其他研究小组此前也已报道了利用切向流深层过滤（TFDF）技术进行LV生产的强化灌流工艺。Tran和Kamen报道，在2 L工作体积下，累积功能产量高达3.9×10^11 TU，相当于1.95×10^11 TU/L的单位体积产量。Tona等人报道，在2 L工作体积下进行的3次灌流运行中，平均累积功能产量为每批122×10^11 TU，相当于6.10×10^12 TU/L的单位体积产量。尽管由于使用了不同的包装结构、稳定的生产细胞和滴度定量方法，结果无法直接比较，但数据表明我们开发的工艺能够获得相当的功能性载体产量。Tran和Kamen也报告了使用TFDF技术的单位细胞生产力，峰值达到7 TU/cell。Manceur等人报告了使用与Tran和Kamen相同的细胞系，但在灌流工艺中使用声波介导的细胞分离操作，峰值为11.5 TU/cell。我们在收获率为3 VVD的工艺中获得了高达11.1 TU/cell的相当峰值单位细胞生产力。Tran和Kamen还确定了收获液中的残留DNA浓度，并报告了诱导后72小时内约为5000–8000 ng/mL的值以及在诱导后96小时高达20,000–30,000 ng/mL的值，而我们测定的最大DNA浓度为9522 ng/mL，在较早的工艺时间中浓度较低。 最适合生产较大囊膜病毒的灌流技术涵盖了使用具有较大截留孔径膜的交替切向流（ATF）、切向流深层过滤（TFDF）以及本研究中采用的声波介导的细胞分离技术。基于膜的方法有助于收获液的预澄清，尤其是TFDF技术，因为它集成了深层过滤功能。此外，ATF和TFDF技术被认为可以放大到工业规模。然而，基于膜的细胞截留技术的一个主要缺点是，随着工艺时间的延长，过滤器可能会受到污染和堵塞，这会影响病毒的回收效率并限制整个工艺的持续时间。Tona等人报告称，使用TFDF在后期收获时间点的LV回收率明显下降，同时在运行3.5天后跨膜压显著增加。鉴于GPRTGs衍生的细胞系能够在长达数周的时间内产生高滴度的感染性病毒，声波分离技术的优势在于它不会发生膜堵塞，从而可以延长工艺时间并最终提高工艺产量。声波分离技术的一个缺点是在放大生产工艺中可能会产生和耗散热量。尽管如此，该技术可以放大到200–1000 L/day的体积灌流率，这表明开发的工艺有潜力放大到工业规模的生物反应器。此外，生产商引入了一种新颖的多室配置，目的是规避与散热相关的问题。不过，这种配置尚未在超出早期研究规模的更大规模上得到验证。 本研究中开发的强化工艺最初是结合声波分离技术与Ambr 250高通量生物反应器系统进行的。小规模模型的开发对于降低开发成本至关重要，尤其是在灌流工艺中，因为与批次或补料分批工艺相比，灌流工艺通常涉及更高的培养基消耗和更长的工艺时间。与同等数量的台式生物反应器相比，小规模模型可将培养基消耗减少至少十倍。虽然本研究中仅并行操作了6个Ambr 250容器，但该系统可扩展到并行使用多达24个容器，从而有可能加速灌流工艺的开发。此外，声波分离器（ASC）可以与Ambr 250模块结合使用，这可能是学术环境中研究的更经济实惠的替代方案。我们的数据显示，小规模模型可以预测增加灌流率对累积功能性和单位细胞LV产量的影响。与使用Ambr 250小规模模型的1 VVD收获率相比，在3 VVD收获率下，单位生物反应器体积的累计LV产量增加了2.8倍，单位细胞LV产量增加了1.4倍。在台式生物反应器规模上成功实现更高的收获率后，发现单位生物反应器体积的累计LV产量增加了3.1倍，单位细胞LV产量增加了1.4倍。获得的数据证明了该模型作为预测性小规模模型的功能。 本研究中使用的技术设置存在一个限制，即预集成浸管的入口直径较小。这可能导致在长时间培养期间出现体积波动，特别是在使用高灌流率和HEK293T细胞的工艺中，这些细胞倾向于在悬浮液中形成聚集体。可以通过采用具有更大连接到声波分离器（ASC）管线内径的不同Ambr 250容器设计来规避这一限制。或者，使用更高浓度的抗结块剂可能有助于减少细胞聚集体的形成。 为了在台式规模上实现更高的灌流率，必须考虑再循环泵引起的剪切应力。我们发现，与用于生产重组蛋白的CHO衍生细胞系相比，本研究中使用的基于HEK293T的LV生产细胞对更高泵送速率的耐受性要低得多。我们引入的细胞再循环优化措施将所用生产细胞的剪切应力降低到了可容忍的水平，从而成功地在台式规模上放大了强化灌流工艺。 结论 本文介绍了一种创新的小规模灌流系统，该系统利用声波介导的细胞分离技术，并能与高通量生物反应器系统有效整合。这一系统为灌流工艺的开发提供了有力的工具，不仅有助于降低培养基的成本，还适用于开发利用稳定生产细胞的强化型慢病毒（LV）生产工艺。通过采用更高的灌流率和细胞密度，该系统实现了单位细胞LV产量的1.4倍增长以及单位体积LV产量的2.8倍提升。此外，通过优化技术设置，实验室规模的实验成功验证了小规模模型所得结果的可靠性。本研究的数据有力地证明了工艺强化在最大化LV产量以及潜在地优化LV质量方面的重要性，为未来LV生产的规模化和效率提升提供了科学依据和技术支持。 参考资料： M.Klimpel, B.Pflüger-Müller, M.A.Cascallana, et al., Perfusion Process Intensification for Lentivirus Production Using a Novel Scale-Down Model. Biotechnology and Bioengineering, 2024. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，代表本站立场。