Somatostatin

点击蓝字 关注我们 陈洛海，梁贇，陈洁（复旦大学附属肿瘤医院  神经内分泌肿瘤科  复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海  200032） 基金项目：国家自然科学基金（82141104） 通信作者：陈洁 E-mail：chen0jie@hotmail.com 通讯作者 陈 洁  教授 主任医师，教授，博士研究生导师 复旦大学附属肿瘤医院神经内分泌肿瘤多学科首席专家 复旦大学附属肿瘤医院神经内分泌肿瘤中心主任 复旦大学附属肿瘤医院神经内分泌肿瘤科主任 欧洲神经内分泌肿瘤学会(ENETS)顾问委员会委员 欧洲肿瘤内科学会(ESMO)神经内分泌及内分泌肿瘤学组委员 国际神经内分泌肿瘤联盟(INCA)医疗顾问委员会委员 中国抗癌协会神经内分泌肿瘤专业委员会主任委员 中国抗癌协会胰腺癌专业委员会神经内分泌肿瘤学组(CSNET)组长 中国抗癌协会肿瘤内分泌专业委员会副主任委员 中国医师协会胰腺病分会胰腺神经内分泌肿瘤专委会副主任委员 中国临床肿瘤学会(CSCO)罕见肿瘤专家委员会委员 中国抗癌协会理事 中国胰腺病学会理事 上海市抗癌协会常务理事 ENETS官刊Journal of Neuroendocrinology高级编委 Journal of Pancreatology编委 《中国癌症杂志》编委 【摘要】  神经内分泌肿瘤（neuroendocrine neoplasms，NENs）的发病率仍在不断上升，但晚期高分化神经内分泌瘤（neuroendocrine tumor，NET）和低分化神经内分泌癌（neuroendocrine carcinoma，NEC）的治疗仍存在较多挑战。2024年度NENs领域有一定进展，最令人关注的是177Lu-DOTATATE肽受体放射性核素治疗（peptide receptor radionuclide therapy，PRRT）和卡博替尼2项Ⅲ期临床试验NETTER-2和CABINET结果正式发表。此外，新靶向药物、新化疗方案、靶向δ样经典Notch配体3（delta-like canonical Notch ligand 3，DLL3）的免疫治疗药物及不同药物联合治疗等，均有积极的临床研究结果发表。总体上，2024年公布的研究结果仍以Ⅱ期研究为主，Ⅲ期研究仍相对较少。本文将回顾并总结2024年度NENs药物治疗的进展。 【关键词】  神经内分泌肿瘤；药物治疗；肽受体放射性核素治疗；靶向治疗；免疫治疗 神经内分泌肿瘤（neuroendocrine neoplasms，NENs）的发病率在不断上升，随着NENs病理分类分级标准的完善，临床上对于高分化神经内分泌瘤（neuroendocrine tumor，NET）和低分化神经内分泌癌（neuroendocrine carcinoma，NEC）的生物学行为差异认识也逐渐加深。针对晚期NET的治疗，2024年度有数项大样本或Ⅲ期临床试验结果公布；针对晚期NEC的治疗，2024年也有不少积极的Ⅰ期或Ⅱ期研究结果公布。本文将对2024年度NENs药物治疗领域重要研究结果进行总结。 1 生物治疗 长效生长抑素类似物（somatostatin analogues，SSAs）是晚期NET抗肿瘤治疗的重要生物治疗药物，主要包括长效奥曲肽和兰瑞肽水凝胶。在晚期支气管肺NET中，尽管长效SSAs被国内外多部指南推荐用于抗肿瘤治疗，但其临床应用缺乏前瞻性Ⅲ期临床试验数据支持。来自欧洲多中心研究SPINET Ⅲ期试验于2024年正式发表[1]，该试验分析兰瑞肽水凝胶对照安慰剂在SSTR阳性支气管肺典型类癌及不典型类癌中的疗效和安全性，该临床试验因入组缓慢提前终止，共纳入了77例患者，随机进入兰瑞肽水凝胶组（典型类癌29例，不典型类癌22例）和安慰剂组（典型类癌16例，不典型类癌10例），双盲期兰瑞肽水凝胶组患者中位无进展生存（progression-free survival，PFS）时间为16.6个月（典型类癌21.9个月，不典型类癌13.8个月），安慰剂组为13.6个月（典型类癌13.9个月，不典型类癌11.0个月），兰瑞肽和安慰剂对比PFS时间无显著差异。兰瑞肽治疗的客观缓解率（objective response rate，ORR）为14.0%，较安慰剂组（0）有所提升。该研究因提前终止未能纳入足够数量的患者，且揭盲前总体随访时间不足，其结果提示兰瑞肽水凝胶在支气管肺NET的安全性，对典型类癌治疗可能有临床获益。 2 分子靶向治疗 目前针对NENs的分子靶向治疗主要靶向雷帕霉素哺乳动物靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）和血管形成通路，前者以mTOR抑制剂依维莫司为代表药物，后者以主要靶向血管内皮生长因子受体的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）舒尼替尼、索凡替尼等为代表药物。2024年度抗血管分子靶向治疗的重要进展之一为TKI类药物卡博替尼（cabozantinib）的Ⅲ期临床试验CABINET结果正式发表[2]。该研究为国际多中心安慰剂对照研究，共纳入了298例前线治疗进展的高分化、G1～G3级NET患者，分为2个独立队列：胰腺来源（95例）和胰腺以外来源（203例），均以2∶1的比例随机分为卡博替尼组（60 mg/d）和安慰剂组，主要研究终点为PFS。该研究证实卡博替尼能显著延长晚期NET患者的PFS时间，在胰腺NET队列中，卡博替尼组中位PFS时间为13.8个月（安慰剂组为4.4个月），ORR为19%（安慰剂组为0）；在胰腺以外NET队列中，卡博替尼组中位PFS时间为8.4个月（安慰剂组为3.9个月），ORR为5%（安慰剂组为0）。卡博替尼治疗主要不良反应包括疲劳、腹泻、转氨酶升高、高血压、血小板减少等，蛋白尿报道相对较少。与既往舒尼替尼和索凡替尼Ⅲ期临床试验不同，CABINET研究纳入了G3级NET患者（共24例：胰腺队列13例，胰腺以外队列11例），在胰腺队列中，亚组分析提示卡博替尼显著降低进展风险[风险比（hazard ratio，HR）＝0.02，95%置信区间（confidential interval，CI）：0～0.11]，但在胰腺以外队列亚组分析中，卡博替尼治疗未能显著降低进展风险。在2024年欧洲肿瘤内科学会（European Society for Medical Oncology，ESMO）年度会议上，一项单臂Ⅱ期临床试验CABONEN公布了中期分析结果[3]，该研究探索卡博替尼在晚期低增殖指数G3级NET或NEC（Ki-67指数20%～60%）中的安全性和疗效，共纳入29例G3级NET和5例NEC患者，中位Ki-67指数为32%，3个月和6个月疾病控制率（disease control rate，DCR）为90.1%和64.1%，PFS时间为6.7个月，治疗3个月后的DCR（20例可供分析）为85%，其中，部分缓解（partial remission，PR）率为10%。CABINET和CABONEN研究均提示卡博替尼在晚期G3级NET中的潜在应用价值，尤其对于胰腺NET，期待后续进一步大样本临床研究证实卡博替尼或其他TKI在G3级NET肿瘤控制中的价值。 肿瘤的生长离不开营养供应，除了血管内皮构成的血管作为经典营养供应通道外，血管形成拟态（vasculogenic mimicry）是另一种由肿瘤细胞直接形成的不含血管内皮的营养供应管道。在多种肿瘤的研究中发现，抑制血管形成拟态具有抑制肿瘤生长的作用[4]。2024年ESMO年度会议报道了一种新型抑制血管形成拟态的靶向药物CVM-1118在晚期NET中的初步疗效数据[5]，该研究为Ⅱa期单臂研究，共纳入43例晚期NET患者，其中35例患者已有疗效评估数据，包括22例胰腺NET、12例胃肠道NET和1例肺NET，中位PFS时间为10.5个月，联合SSAs患者中位PFS时间达22.4个月，ORR为2.9%，DCR为77%。与既往TKI研究中胰腺与胰腺以外NET疗效数据相反，CVM-1118治疗在胰腺以外NET中显示出更佳疗效，胃肠道NET中位PFS时间为22.4个月，胰腺NET中位PFS时间仅8.4个月。这一研究提示血管形成拟态可能是NET治疗的潜在新靶点，尤其对于非胰腺来源NET，但仍需进一步Ⅲ期对照试验证实。 约5% NENs的发生与胚系基因突变引起的遗传综合征相关，其中，Von Hippel-Lindau（VHL）综合征是遗传性NENs常见类型之一，其发生与抑癌基因VHL基因突变相关，该基因突变导致VHL蛋白表达丢失，继而使缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）通路持续激活，导致多个与肿瘤形成相关的基因表达上调，从而使患者逐渐面临肾细胞癌、胰腺NET、嗜铬细胞瘤、血管母细胞瘤等多种肿瘤的发生风险。贝组替凡作为一种HIF-2α抑制剂，在一项Ⅱ期单臂临床试验LITESPARK-004试验中展现了对VHL综合征相关肿瘤的良好疗效。近期，该研究发布了针对胰腺NET亚组的疗效数据[6]。在22例胰腺NET患者中，贝组替凡治疗的ORR达91%，其中7例患者肿瘤达CR，中位随访时间37.8个月，中位PFS时间尚未达到。鉴于其显著疗效，贝组替凡已于日前在国内获批上市，用于治疗VHL综合征相关肾细胞癌、中枢神经系统血管母细胞瘤及胰腺NET。 3 化疗 目前化疗主要用于NEC或高级别/高肿瘤负荷/肿瘤生长速度快的NET，2024年度化疗相关研究多集中于NEC。一项来自意大利的Ⅱ期随机非对照研究探索卡培他滨联合替莫唑胺（CAPTEM）方案和5-氟尿嘧啶联合伊立替康（FOLFIRI）方案在晚期NEC二线治疗中的疗效和安全性[7]，该研究因有效性原因在中期分析时提前终止。共纳入53例患者，CAPTEM组和FOLFIRI组的12周DCR分别为28.0%和39.1%，12个月总生存（overall survival，OS）率分别为32.4%和28.4%，主要3级不良反应分别为中性粒细胞减少/贫血和血小板减少/呕吐。总的来说，CAPTEM方案和FOLFIRI方案在NEC二线治疗中安全性尚可，但两种方案的疗效无显著差异。意大利开展的另外一项名为TENEC-TRIAL的Ⅱ期多中心单臂研究[8]，探索替莫唑胺间隔1周给药作为晚期NEC二线治疗的疗效和安全性，共纳入38例患者，66.3%的患者Ki-67指数≥55%，采用替莫唑胺每隔1周给药的方式[替莫唑胺75 mg/（m2·d），连续使用7 d，休息7 d，后重复这一方式]，ORR为18%，1例患者出现CR。中位PFS时间和OS时间分别为5.86个月和12.1个月，1年PFS率为37%。Ki-67指数是否≥55%与中位PFS时间和中位OS时间无关。无3级以上不良反应。该研究证实了替莫唑胺间隔1周给药作为晚期NEC二线治疗的安全性，对于体力状况较差的患者，可能是可行的治疗方案。另外一项来自意大利的Ⅱ期单臂MeTe研究在2024年欧洲神经内分泌肿瘤学会（European Neuroendocrine Tumor Society，ENETS）和ESMO年度会议上公布了中期分析结果[9-10]，该研究旨在探索替莫唑胺单药节拍化疗（60 mg/d，持续使用）在一般状况较差的晚期GEP-NET和肺NET患者中的疗效和安全性，目前已纳入20例患者，7例患者美国东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）体力活动状态（performance status，PS）评分2分、14例患者至少合并1种严重共存病、9例患者存在肾功能减退，超过半数的患者使用该方案作为二线或三线治疗。其中18例患者肿瘤可评估，中位随访9个月后，中位PFS时间和中位OS时间尚未达到，5个月PFS率和OS率分别为71%和83%，ORR和DCR分别为6%和88%。使用该方法治疗的患者3个月时生活质量无明显下降。该研究提示替莫唑胺节拍化疗对于一般状况较差的晚期NET患者可能是耐受性较高的有效方案，目前该研究正在继续入组患者，期待最终结果公布。 针对晚期NET的化疗，2024年也有新发表的研究结果。MGMT-NET研究是一项前瞻性Ⅱ期研究[11]，基于肿瘤细胞O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（O6 -methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）状态，评估以奥沙利铂为基础的化疗方案与以烷化剂为基础的化疗方案在晚期NET中的疗效和安全性，MGMT缺失者以2∶1比例入组烷化剂和奥沙利铂为基础方案，MGMT未缺失者以1∶1比例入组，主要研究目标为烷化剂治疗3个月后MGMT缺失者与未缺失者的ORR达到35%的差异。该研究共纳入105例患者，其中102例患者可评估MGMT状态，58例MGMT缺失。结果提示未能达到主要研究终点，MGMT缺失者和MGMT未缺失者的3个月ORR分别为29.4%和8%，MGMT缺失者有更佳疗效，最佳ORR和中位PFS时间分别为52.9%和14.6个月，MGMT未缺失者最佳ORR和中位PFS时间分别为11.5%和11.3个月。该研究虽未达到主要研究终点，但其结果提示MGMT状态与烷化剂化疗疗效相关，MGMT缺失者烷化剂化疗疗效更佳。 除上述在NENs中应用较多的化疗药物外，在2024年度美国临床肿瘤学会（American Society of Clinical Oncology，ASCO）会议上，NENs领域较少使用的化疗药物，包括白蛋白结合型紫杉醇、脂质体伊立替康，也有2项临床试验结果公布。NABNEC是一项Ⅱ期随机化研究，探索白蛋白结合型紫杉醇联合卡铂作为晚期G3级消化系统NENs的一线治疗方案的疗效和安全性[12]，对照组（依托泊苷联合卡铂）入组12例患者后，终止入组。主要研究终点为ORR。共纳入60例患者，43例（75%）患者肿瘤Ki-67指数＞55%，约20%的患者肿瘤为胰腺原发。58例患者可行肿瘤评估（试验组46例，对照组12例），试验组和对照组的ORR分别为53%和42%，两组PFS无差异，24个月的OS率分别为25%和17%，试验组3级不良反应发生率（52%）更高，对照组为42%。总的来说，白蛋白结合型紫杉醇联合卡铂作为G3级消化系统NENs一线治疗，其疗效并未显著优于依托泊苷联合卡铂。需要注意的是，该研究自2016年开始入组患者，当时世界卫生组织病理分类分级标准中对G3级NENs的定义包含了G3级NET和NEC，因此，该研究可能同时纳入了NET和NEC患者，但目前报道的结果中未对NET和NEC进行区分。另外一项针对GEP-NEC一线化疗的Ⅰ/Ⅱ期临床试验公布了Ⅰ期剂量爬坡结果及初步疗效数据[13]，该研究采用纳米脂质体伊立替康联合卡铂作为一线化疗方案，纳入6例患者，确定了后续Ⅱ期试验纳米脂质体伊立替康和卡铂的剂量分别为80 mg/m2和曲线下面积（area under the curve，AUC）＝4（每3周），疗效分析结果提示4例患者肿瘤达PR，2例患者肿瘤达疾病稳定（stable disease，SD）。该研究初步疗效数据提示该方案具有较高的ORR，但目前纳入患者数量较少，仍需后续进一步Ⅱ期及Ⅲ期研究证实其疗效。 4 核素治疗 肽受体放射性核素治疗（peptide receptor radionuclide therapy，PRRT）是近年NET治疗领域最受关注的治疗方式。2024年度最重要的进展为NETTER-2研究结果正式发表[14]。NETTER-2研究是一项开放标签、国际多中心、随机对照Ⅲ期研究，纳入Ki-67指数10%～55%的G2/G3级未经治疗的晚期GEP-NET患者。试验组采用177Lu-DOTATATE PRRT联合长效奥曲肽30 mg，每4周1次（PRRT组）；对照组采用长效奥曲肽60 mg，每4周1次，主要研究终点为PFS时间。该研究共纳入226例患者，随机进入PRRT组（151例）和对照组（75例），中位PFS时间分别为22.8个月和8.5个月，ORR分别为43%和9.3%。该研究证实了177Lu-DOTATATE PRRT可作为晚期高级别G2/G3级GEP-NET患者的一线治疗，该研究也是G3级NET患者一线治疗的首个Ⅲ期临床研究，对G3级患者治疗有重要意义。同时该研究也提示，大剂量（60 mg）长效奥曲肽一线治疗对这部分患者肿瘤控制也具有一定效果。除了NETTER-2研究，2024年正式发表的PRRT相关研究尚有NEOLUPANET研究，该研究探索PRRT作为胰腺NET新辅助治疗的可行性[15]，共纳入31例患者，其中26例患者完成了4个疗程177Lu-DOTATATE治疗，18例患者肿瘤达到PR。最终有29例患者顺利完成了胰腺NET切除，21例患者出现术后并发症，包括7例患者发生3级并发症，胰漏是最常见的术后并发症（10例），无二次手术、胰腺切除术后出血及术后死亡病例。该研究提示PRRT可能作为胰腺NET新辅助治疗的一种手段，但尚缺乏术后复发及OS数据。 177Lu-DOTATATE通过释放β粒子发挥杀伤肿瘤细胞的作用，与之相比，α粒子具有更短射程和更高的线性能量转化，可引起更多DNA双链破坏，可能具有更强杀伤肿瘤细胞的能力[16]。近期越来越多研究关注释放α粒子的PRRT治疗在NENs中的疗效和安全性，部分研究在2024年ENETS和/或ESMO年度会议上报道了初步结果。ACTION-1是一项国际多中心Ⅰb/Ⅲ期临床试验[17,18]，探索RYZ101（225Ac-DOTATATE）在经177Lu-DOTATATE治疗进展的晚期、高分化GEP-NET中的疗效和安全性，目前公布了剂量研究结果，并确定了10.2 MBq/8周、4个疗程作为后续Ⅲ期临床试验的药物剂量，早期的疗效数据提示ORR为29.4%。另一项公布初步数据的研究是Ⅱ期、开放标签的多中心ALPHAMEDIX 02研究[19]，探索212Pb-DOTAMTATE在未经177Lu-DOTATATE治疗（队列1）和177Lu-DOTATATE治疗耐药（队列2）的晚期GEP-NETs患者中的疗效和安全性，其中，队列1公布了初步数据结果，在纳入的36例患者中，ORR为47.2%，高于先前NETTER-1研究的结果。但该研究目前报道了4次严重不良事件，包括2例死亡/疾病进展、1例类癌综合征和1例脓毒症。总体上，基于α粒子的PRRT研究尚处于早期阶段，初步数据提示其在晚期NET中具有较好的应用前景，尤其对于先前177Lu-DOTATATE治疗失败/进展的患者。 5 免疫治疗 常规免疫检查点抑制剂剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）单药在晚期NENs中效果有限，目前NENs领域免疫治疗的研究重点主要针对NEC的多靶点免疫治疗药物研发。其中，以靶向δ样经典Notch配体3（delta-like canonical Notch ligand 3，DLL3）的免疫治疗药物研发最受瞩目，目前已开展多项临床试验。2024年ENETS和ESMO年度会议公布了DLL3/CD3 IgG样T细胞衔接器药物BI 764532的Ⅰ期临床试验初步研究数据[20]，该研究旨在探索BI 764532在局部晚期/转移性DLL3阳性小细胞肺癌（80例）、大细胞肺癌（13例）和肺外NEC（70例）中的安全性和初步疗效。总体而言，该药物耐受性尚可，初步疗效数据提示总体ORR和DCR分别为23%和42%，其中，小细胞肺癌的ORR和DCR分别为18%和36%，肺外NEC中的ORR和DCR分别为23%和41%，而大细胞肺癌的ORR和DCR可高达54%和77%。该研究提示BI 764532对NEC具有一定疗效，值得进一步研究。另一种靶向DLL3的T细胞衔接器药物HPN328在2024年ASCO年度会议上更新了其Ⅰ/Ⅱ期研究数据[21]，该研究纳入了复发/耐药/转移性小细胞肺癌、前列腺NEC和其他NEC患者，初步疗效数据也较为可观，小细胞肺癌中确认的ORR达到50%（12/24），且出现1例CR；在其他NEC中，确认的ORR达到44%（4/9），也有1例CR；在前列腺NEC中，4/11例患者肿瘤达到PR（未确认）。从这两项靶向DLL3的临床试验初步疗效数据来看，该类药物在NEC中具有较好的前景，有望为NEC治疗带来突破。 LBL-024是一种由国内药企研发的双靶点免疫治疗药物，同时靶向程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）和41-BB（T细胞共刺激受体）。在2024年ASCO年度会议上，北京大学肿瘤医院团队公布了LBL-024的Ⅰ/Ⅱ期多中心临床研究数据，旨在探索其在晚期实体瘤中的安全性以及在至少一线化疗治疗失败的肺外NEC中的初步疗效[22]。研究结果显示，LBL-024总体安全性较高，尤其令人关注的是其在肺外NEC中展现出了良好的疗效。在41例接受LBL-024治疗的患者中，ORR和DCR分别达到42.3%和57.7%。对治疗选择较少且总体疗效欠佳的肺外NEC患者而言，LBL-024单药治疗能达到如此高的ORR和DCR，提示该药在NEC治疗领域也展现出非常广阔的前景，期待后续进一步研究数据发表。 6 药物联合治疗 尽管既往关于不同类型药物或不同靶点药物联合使用治疗NENs收效甚微，但目前仍有不少临床试验探索药物联合治疗的价值，其中主要的联合方案包括免疫治疗与化疗联合、免疫治疗与靶向药物联合，以及不同靶向药物联合等。 6.1 化疗联合免疫治疗 目前免疫治疗与化疗联合的研究主要聚焦于高级别NET或NEC中，以后者为多。NICE-NEC是一项来自西班牙的单臂、多中心、Ⅱ期临床试验[23]，纳入未经化疗且不可手术切除的晚期胃肠道来源或原发不明的G3级NET或NEC，采用依托泊苷＋卡铂化疗（每3周1次，不超过6个周期）联合纳武利尤单抗（化疗期间每3周1次360 mg；后每4周480 mg直至12个月或疾病进展）方案，主要研究终点为12个月OS率。共纳入37例患者，其中25例患者为NEC或Ki-67指数＞55%。总体ORR为56.8%（NET 50.0%，NEC 60.0%），12个月OS率为54.1%，中位PFS时间和OS时间分别为5.7个月（NET和NEC均为5.7个月）和13.9个月（NET 23.3个月，NEC 11.7个月）。尽管该研究报道24个月OS率可达到37.6%，但可能与该研究同时纳入了G3级NET有关。该方案作为一线治疗能否延长G3级NET和NEC患者的OS时间，尚存疑问。另一项来自美国的小样本Ⅰb期临床试验探索在一线化疗方案基础上联合帕博利珠单抗的疗效和安全性[24]，共纳入7例膀胱Ⅲ/Ⅳ期NEC患者（队列1）和8例Ⅲ/Ⅳ期前列腺NEC患者（队列2），采用依托泊苷联合顺铂/卡铂（队列1和2）或多西他赛联合卡铂（队列2）化疗方案，并在此基础上联合帕博利珠单抗。总体ORR为43%，队列1和队列2的2年OS率分别为86%和57%。队列1中有4例患者进行后续膀胱切除术，其中1例患者肿瘤达到病理学CR。另外，该研究对PFS相关的预测标志物进行研究，发现为外周血多样T细胞库克隆性扩增与PFS相关。该研究探索了免疫治疗联合一线化疗在膀胱和前列腺NEC中的潜在价值，但受限于有限的样本量，在化疗基础上联合免疫治疗的有效性尚不确切。四川大学华西医院开展的CAMEC研究也探索了一线EP/EC化疗联合免疫治疗（卡瑞利珠单抗）在肺外NEC中的疗效，其初步结果在2024年ENETS年度会议上公布，在已纳入的7例患者中，ORR为71.4%（5/7），6个月PFS率为71.4%[25]。总的来说，当前临床试验以Ⅰ/Ⅱ期单臂研究为主，尚不能明确在化疗基础上联合免疫治疗作为NEC一线治疗的价值。目前，已有Ⅱ/Ⅲ期临床试验（如SWOG S2012）正在开展，旨在进一步探索该联合治疗方案在晚期肺外NEC中的价值[26]，有待其研究结果发布以证实该联合治疗方式的有效性。 6.2 靶向治疗联合免疫治疗 免疫治疗与分子靶向治疗联合也是目前NENs领域联合药物治疗的研究重点，旨在通过靶向治疗发挥潜在免疫调节作用，以增强免疫治疗效果。一项由北京大学肿瘤医院牵头的多中心Ⅱ期研究[27]，探索了索凡替尼联合特瑞普利单抗在晚期NET、混合性神经内分泌-非神经内分泌肿瘤（mix neuroendocrine non-neuroendocrine neoplasms，MiNENs）、NEC中的疗效，纳入既往治疗进展、不耐受的患者，采用索凡替尼（250 mg/d）联合特瑞普利单抗（240 mg/3周）治疗。共纳入40例患者，包括19例NET和21例MiNENs或NEC，ORR分别为21.1%和23.8%，中位PFS时间分别为9.6个月和4.1个月，中位OS时间分别为27.3个月和10.9个月，18例（45.0%）患者出现3级以上不良反应。这项研究提示索凡替尼联合特瑞普利单抗可能对NENs患者具有一定的抗肿瘤效果。然而，该联合方案治疗NET是否优于单药治疗，仍需进一步明确。同时，对于NEC，该联合方案尚未展现出相较于其他化疗方案的明显优势，仍需进一步研究。另一项靶向治疗联合免疫治疗的Ⅱ期研究在2024年ENETS年度会议上公布了初步结果[28]，该研究纳入了G3 NET和NEC患者，探索索凡替尼联合信迪利单抗及IBI310[细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4）抗体]的疗效和安全性。目前有11例患者可行疗效评估，90.9%的患者曾接受前线治疗。确认的ORR和DCR分别为36.4%和72.8%，中位PFS时间为4.5个月。8例患者既往接受不超过一线治疗，其ORR和DCR可达50%和87.5%。目前该研究3级不良反应发生率为7.1%。从初步结果来看，索凡替尼联合“双抗”免疫治疗对高级别NENs安全性尚可，且似乎具有一定的疗效，有待入组更多患者进一步明确其疗效和安全性。 一项来自美国的Ⅱ期研究探索了帕博利珠单抗联合仑伐替尼在晚期高分化非胰腺NET中的疗效[29]。该研究仅纳入了20例患者，其中2例患者肿瘤达到PR，中位PFS时间为8个月，且14例患者在治疗期间需药物减量或停药。总体来说，在胰腺以外NET中，帕博利珠单抗与仑伐替尼的联合疗效欠佳，不支持进一步开展临床试验。另一项关于免疫治疗与分子靶向治疗联合的临床试验为CABATEN，该研究设计为一项单臂篮式试验，试验组采用卡博替尼与阿替利珠单抗的联合治疗方案。该试验包含了4个NENs队列（共55例）：肺NET、嗜铬细胞瘤/副神经节瘤（pheochromocytoma/paragangliomas，PPGL）、GEP-NET和肺外NEC。在2024年ENETS和ASCO年度会议上公布了这4个队列的研究结果[30-31]。遗憾的是，仅在PPGL队列（ORR为15.4%，中位PFS时间为12.2个月）和GEP-NET队列（ORR为16.7%，中位PFS时间为15.8个月）中观察到有限的肿瘤反应和可能的PFS延长，总体疗效一般。此外，分别有80%和40%的患者因不良反应需中断卡博替尼和阿替利珠单抗治疗。因此，卡博替尼与阿替利珠单抗单抗的联合治疗方案可能仅在GEP-NET和PPGL中展现出一定的疗效，但在GEP-NET中，与CABINET试验中卡博替尼单药治疗相比，其疗效提升似乎并不显著。 6.3 其他联合治疗 不同靶点靶向治疗联合是另一种值得探索的联合治疗策略。在2024年ENETS年度会议上，一项来自美国的仑伐替尼（14 mg/d）和依维莫司（5 mg/d）联合的Ⅱ期临床试验公布了其结果[32]，该研究针对晚期高分化胰腺以外NET，从目前纳入的31例可评估患者的疗效来看，该联合方案的PR率高达39%，中位PFS时间达到15.8个月，56%的患者出现3级不良反应。该研究通过联合应用抗血管生成靶向药物与mTOR抑制剂，两种药物剂量均较单药有所下调，但3级不良反应发生率仍较高，目前的结果提示该联合似乎具有较可观的ORR，但PFS时间较仑伐替尼单药治疗无显著改善[33]，仍需开展进一步的临床对照试验明确该联合方案的价值。 关于靶向治疗与化疗的联合应用，2024年有数项研究的初步结果在ENETS或ESMO年度会议上公布。来自中山大学附属肿瘤医院的一项研究，在2024年ENETS年度会议上公布了索凡替尼与CAPTEM（卡培他滨联合替莫唑胺）化疗方案联合治疗晚期G2、G3级NET的初步结果[34]。该研究共纳入27例G2级NET患者，包括8例胰腺NET和19例胰腺以外NET，目前中位PFS时间尚未达到，12个月PFS率为87.7%。胰腺NET的ORR和DCR分别为16.7%和87.5%。胰腺以外NET的ORR和DCR分别为6.3%和100%。同样在2024年ENETS年度会议上，四川大学华西医院也公布了一项关于索凡替尼联合CAPTEM化疗方案的研究初步结果[35]。该研究主要探索了该联合方案在不可切除胰腺NET转化治疗中的价值，已纳入9例患者，7例患者可评估，ORR和DCR分别为28.6%和100%。已有5例患者完成4个疗程治疗并行R0切除，另外2例患者治疗6个疗程后未能进一步行手术治疗。上述2项研究均提示索凡替尼与CAPTEM化疗方案联合在胰腺NET中具有一定疗效，但与单独CAPTEM化疗方案相比[36]，未见疗效显著提升，这或许与不同研究中纳入患者的肿瘤MGMT缺失情况不同有关。因此，该联合方案的价值仍需进一步探索。另一项来自德国的多中心、单臂Ⅱ期研究在2024年ESMO年度会议上公布了其研究结果，该研究探索了雷莫芦单抗（抗血管生长因子受体2）与达卡巴嗪联合在晚期胰腺NET中的疗效与安全性[37]。共纳入45例晚期进展性G1～G3级胰腺NET患者，ORR为17.8%，3级以上不良反应发生率为12.6%。与上述研究类似，该研究也提示抗血管生成靶向药物与化疗的联合对胰腺NET具有一定疗效。然而，该联合方案是否优于单药治疗，仍需进一步研究明确。 7 总结 2024年度NENs领域最重要的进展为PRRT和卡博替尼治疗晚期NET患者的Ⅲ期临床试验结果正式发表，尤其对于G3级NET的治疗，这两项研究填补了该领域的空白。此外，一些新的靶向药物，如抗血管形成拟态药物，在NET治疗中初露锋芒，期待这些新靶向药物后续研究结果的公布。在NEC治疗方面，靶向DLL3的治疗药物以及LBL-024新型免疫治疗药物的初步研究结果均显示出较高的有效率，有望为肺外NEC的治疗带来突破性进展。对于不同种类药物的联合治疗，部分方案已展现出一定的疗效，但与现有单药治疗相比，疗效提升仍有限，因此后续仍需开展大样本对照研究以进一步验证。总体上，2024年公布的研究结果以Ⅱ期研究为主，虽然多数研究结果尚不足以改变临床治疗决策，但也为后续Ⅲ期研究的开展提供了思路。期待2025年NENs治疗领域能够取得更多突破性进展。 参考文献 BAUDIN E, CAPDEVILA J, HÖRSCH D, et al. Treatment of advanced BP-NETS with lanreotide autogel/depot vs placebo: the phase Ⅲ SPINET study[J]. Endocr Relat Cancer, 2024, 31(9):e230337. CHAN J A, GEYER S, ZEMLA T, et al. Phase 3 Trial of Cabozantinib to Treat Advanced Neuroendocrine Tumors[J]. N Engl J Med, 2024. Epub ahead of print. KOENIG A O, REINECKE J, HALFEN J, et al. 1146MO Interim analysis of CABONEN: A multicenter phase Ⅱ trial investigating cabozantinib in patients with advanced, low proliferative NEN G3[J]. Ann Oncol, 2024, 35(suppl_2):S752. WEI X, CHEN Y, JIANG X, et al. Mechanisms of vasculogenic mimicry in hypoxic tumor microenvironments[J]. Mol Cancer, 2021, 20(1):7. YEN C J, CHEN M H, CHEN Y Y, et al. 1145MO CVM-005: Phase Ⅱa study of CVM-1118, a novel oral anti-vasculogenic mimicry (VM) agent, in advanced neuroendocrine tumors (NET) after progression on prior therapy[J]. Ann Oncol, 2024, 35(suppl_2):S751. ELSE T, JONASCH E, ILIOPOULOS O, et al. Belzutifan for von Hippel-Lindau Disease: Pancreatic Lesion Population of the Phase 2 LITESPARK-004 Study[J]. Clin Cancer Res, 2024, 30(9):1750-1757. BONGIOVANNI A, LIVERANI C, FOCA F, et al. A randomized phase Ⅱ trial of Captem or Folfiri as second-line therapy in neuroendocrine carcinomas[J]. Eur J Cancer, 2024, 208:114129. VON ARX C, DELLA VITTORIA SCARPATI G, CANNELLA L, et al. A new schedule of one week on/one week off temozolomide as second-line treatment of advanced neuroendocrine carcinomas (TENEC-TRIAL): a multicenter, open-label, single-arm, phase Ⅱ trial[J]. ESMO Open, 2024, 9(5):103003. SPADA F, JEMOS C, PISA E, et al. An Italian multi-center phase Ⅱ trial of Metronomic Temozolomide in unfit patients with advanced neuroendocrine neoplasms: MeTe study[J]. J Neuroendocrinology, 2024, 36:249. SPADA F, JEMOS C, BARBERIS M, et al. 1160P An Italian multicenter phase Ⅱ trial of metronomic temozolomide in unfit patients with advanced neuroendocrine neoplasms: Interim analysis of the MeTe study[J]. Ann Oncol, 2024, 35(suppl_2):S757. WALTER T, LECOMTE T, HADOUX J, et al. Oxaliplatin-Based Versus Alkylating Agent in Neuroendocrine Tumors According to the O6-Methylguanine-DNA Methyltransferase Status: A Randomized Phase Ⅱ Study (MGMT-NET)[J]. J Clin Oncol, 2024:JCO2302724. CHANTRILL L A, RANSOM D, CHAN D, et al. NABNEC: A randomised phase Ⅱ study of nab-paclitaxel in combination with carboplatin as first line treatment of gastrointestinal neuroendocrine carcinomas (GI-NECs)[J]. J Clin Oncol, 2024, 42(3_suppl):589. CHIANG N J, LI C F, BAI L Y, et al. A phase Ⅰ/Ⅱ study of nanoliposomal irinotecan and carboplatin in patients with advanced or metastatic, poorly differentiated gastroenteropancreatic neuroendocrine carcinoma characterized by tissue and liquid next-generation sequencing[J]. J Clin Oncol, 2024, 42(23_suppl):52. SINGH S, HALPERIN D, MYREHAUG S, et al. [177Lu]Lu-DOTA-TATE plus long-acting octreotide versus high-dose long-acting octreotide for the treatment of newly diagnosed, advanced grade 2-3, well-differentiated, gastroenteropancreatic neuroendocrine tumours (NETTER-2): an open-label, randomised, phase 3 study[J]. Lancet, 2024, 403(10446):2807-2817. PARTELLI S, LANDONI L, BARTOLOMEI M, et al. Neoadjuvant 177Lu-DOTATATE for non-functioning pancreatic neuroendocrine tumours (NEOLUPANET): multicentre phase Ⅱ study[J]. Br J Surg, 2024, 111(9):znae178. NAVALKISSOOR S, GROSSMAN A. Targeted Alpha Particle Therapy for Neuroendocrine Tumours: The Next Generation of Peptide Receptor Radionuclide Therapy[J]. Neuroendocrinology, 2019, 108(3):256-264. STROSBERG J, ULANER G, HALPERIN D, et al. Phase Ⅰb portion of the ACTION-1 Phase Ⅰb/3 trial of RYZ101 in gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors (GEP-NETs) progressing after 177Lu somatostatin analogue (SSA) therapy: Safety and efficacy findings[J]. J Neuroendocrinol, 2024, 36:220. HALPERIN D M, MORRIS M, ULANER G A, et al. Phase Ⅰb portion of the ACTION-1 phase Ⅰb/3 trial of RYZ101 in gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors (GEP-NET) progressing after 177Lu somatostatin analogue (SSA) therapy: Safety and efficacy findings[J]. J Clin Oncol, 2024, 42(16_suppl):3091. STROSBERG J R, NAQVI S, COHN A L, et al. Safety, tolerability and efficacy of 212Pb-DOTAMTATE as a targeted alpha therapy for subjects with unresectable or metastatic somatostatin receptor-expressing gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors (SSTR+GEP-NETs): A phase 2 study[J]. J Clin Oncol, 2024, 42(16_suppl):4020. WERMKE M, GAMBARDELLA V, KUBOKI Y, et al. 670P Phase Ⅰ trial of the delta-like ligand-3 (DLL3)/CD3 IgG-Like T cell engager BI 764532 in patients (pts) with DLL3-positive tumors: Updated data[J]. Ann Oncol, 2024, 35(suppl_2):S525-S526. BELTRAN H, JOHNSON M L, JAIN P, et al. Updated results from a phase 1/2 study of HPN328, a tri-specific, half-life (T1/2) extended DLL3-targeting T-cell engager in patients (pts) with small cell lung cancer (SCLC) and other neuroendocrine cancers (NEC)[J]. J Clin Oncol, 2024, 42(16_suppl):8090. LU M, ZHANG P, LUO S, et al. A novel and uniquely designed bispecific antibody (LBL-024) against PD-L1 and 4-1BB in patients with advanced malignant tumors and neuroendocrine carcinoma: A report of safety and robust efficacy of LBL-024 monotherapy in phase Ⅰ/Ⅱ, first-in-human, open-label, multicenter, dose escalation/expansion study[J]. J Clin Oncol, 2024, 42(16_suppl):4010. RIESCO-MARTINEZ M C, CAPDEVILA J, ALONSO V, et al. Nivolumab plus platinum-doublet chemotherapy in treatment-naive patients with advanced grade 3 Neuroendocrine Neoplasms of gastroenteropancreatic or unknown origin: The multicenter phase 2 NICE-NEC trial (GETNE-T1913)[J]. Nat Commun, 2024, 15(1):6753. GU Y, LY A, RODRIGUEZ S, et al. PD-1 blockade plus cisplatin-based chemotherapy in patients with small cell/neuroendocrine bladder and prostate cancers[J]. Cell Rep Med, 2024, 5(11):101824. LI X, LI R, CHENG K, et al. Camrelizumab plus chemotherapy as first-line treatment for advanced extrapulmonary neuroendocrine carcinoma: An investigator-initiated phase 2 study (CAMEC trial)[J]. J Neuroendocrinol, 2024, 36:241. ZHEN D B, MOSELEY A, CHIOREAN E G, et al. SWOG S2012: Randomized phase Ⅱ/Ⅲ trial of first line platinum (P)/etoposide (E) with or without atezolizumab (NSC #783608) in patients with advanced or metastatic poorly differentiated extrapulmonary neuroendocrine carcinomas (NEC)[J]. J Clin Oncol, 2024, 42(16_suppl):TPS4201. ZHANG P, SHI S, XU J, et al. Surufatinib plus toripalimab in patients with advanced neuroendocrine tumours and neuroendocrine carcinomas: An open-label, single-arm, multi-cohort phase Ⅱ trial[J]. Eur J Cancer, 2024, 199:113539. ZHANG P, WANG Y, LI J, et al. Surufatinib plus Sintilimab and IBI310 in patients with high-grade advanced-neuroendocrine neoplasm (HG-NEN): A multi-center, single arm phase 2 study[J]. J Neuroendocrinol, 2024, 36:259. AL-TOUBAH T, SCHELL M J, MORSE B, et al. Phase Ⅱ study of pembrolizumab and lenvatinib in advanced well-differentiated neuroendocrine tumors[J]. ESMO Open, 2024, 9(4):102386. MOLINA-CERRILLO J, GRANDE E, BENAVENT M, et al. Responses to Cabozantinib plus Atezolizumab in a wide population of advanced and progressive neuroendocrine neoplasms (NENs): A prospective multi-cohort basket phase Ⅱ Trial (CABATEN/GETNE-T1914)[J]. J Neuroendocrinol, 2024, 36:245. HERNANDO J, MOLINA-CERRILLO J, GRANDE E, et al. Cabozantinib plus atezolizumab in patients with advanced and progressive neuroendocrine neoplasms (NENs): A prospective multi-cohort basket phase Ⅱ trial (CABATEN/GETNE-T1914)[J]. J Clin Oncol, 2024, 42(16_suppl):4128. DASARI A, QIAO W, HALPERIN D, et al. A phase Ⅱ study of Lenvatinib and Everolimus in advanced well-differentiated extra pancreatic neuroendocrine tumors[J]. J Neuroendocrinol, 2024, 36:232. CAPDEVILA J, FAZIO N, LOPEZ C, et al. Lenvatinib in Patients With Advanced Grade 1/2 Pancreatic and Gastrointestinal Neuroendocrine Tumors: Results of the Phase Ⅱ TALENT Trial (GETNE1509)[J]. J Clin Oncol, 2021, 39(20):2304-2312. WANG W, LIU Z, YANG X, et al. Efficacy and safety of Surufatinib in combination with CAPTEM for patients with advanced G2/G3 NETs: Preliminary results from a single-arm, phase Ⅱ study[J]. J Neuroendocrinol, 2024, 36:255. WANG Z, CAO D, KE N. A prospective, open-label study evaluating the efficacy and safety of Surufatinib (S) in combination with CAPTEM as conversion therapy in patients with unresectable pancreatic neuroendocrine tumors (pNET)[J]. J Neuroendocrinol, 2024, 36:254. KUNZ P L, GRAHAM N T, CATALANO P J, et al. A Randomized Study of Temozolomide or Temozolomide and Capecitabine in Patients with Advanced Pancreatic Neuroendocrine Tumors (ECOG-ACRIN E2211)[J]. J Clin Oncol, 2022:101200JCO2201013. APOSTOLIDIS L, KOENIG A O, KRUG S, et al. 1147MO Ramucirumab in combination with dacarbazine in patients with progressive well-differentiated metastatic pancreatic neuroendocrine tumors (RamuNET): An AIO phase Ⅱ multicenter single-arm study[J]. Ann Oncol, 2024, 35(suppl_2):S752. 推荐阅读 ●   盘点2023 | 陈洁教授：2023年度神经内分泌肿瘤治疗研究进展 ●   盘点2022丨陈洁教授：2022年度神经内分泌肿瘤药物治疗进展盘点 ●   2023年度肿瘤学科盘点集锦(共17个) 声明：本文由“肿瘤界”整理与汇编，欢迎分享转载，如需使用本文内容，请务必注明出处。 排版：lagertha 校对：松月

1.概述 一个健全的生物制药生产过程受几个要素的支配：集成的工艺设计和关键工艺要素；起始材料的质量；以及质量体系，以确认生产过程是可复制的、一致的和稳健的。工艺设计本身在上游和下游都面临一系列挑战。然而，一个上游工艺和一个能够提供最大回收率的高效纯化工艺可以产出高纯度的产品，这是任何生产过程最理想的特征。 由于生物制药具有复杂的化学结构，目前可用的技术无法合成它们。此外，即使能够合成这些大分子，也很难生产出没有固定结构的分子。因此，生物制药的生产依赖于重组系统，其中DNA产生这些分子；包含感兴趣基因的DNA片段相对容易构建，允许它们作为引擎在活体中制造目标分子。因此，生产生物制药的起始材料是表达目标治疗蛋白的基因改造的细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞培养系统。 重组制造技术受到专利的广泛保护，包括关键步骤和方法，如目标基因序列的分离（编码所需蛋白）、其扩增、重组DNA的生成、宿主细胞的转化、筛选以及随后选择表达细胞系。例如，美国专利号4,237,224（Cohen等人）现已过期，详细描述了在微生物如大肠杆菌中进行转化过程以生成重组质粒DNA。该专利还描述了制造第一个转化载体的程序。Cohen的专利现已过期，技术已进入公有领域。 重组表达在多种活体系统中进行，如： 原核生物，如古菌和细菌，是单细胞生物，具有外细胞膜，但没有任何膜结合的细胞成分，包括核或线粒体。因此，转录和翻译过程同时进行，mRNA翻译在成熟的mRNA转录本完全合成之前发生。 真核生物，如动物和植物，是多细胞生物，具有核、线粒体和高尔基体；这些也是。转录和翻译过程顺序发生。转录，即DNA到RNA，发生在核中，翻译，即RNA到蛋白质，发生在细胞质中。翻译后修饰（PTMs），是蛋白质功能所需的化学修饰，在蛋白质合成后在内质网和高尔基体中发生（在不同阶段，例如蛋白质折叠前、定位后等）。最常见的PTMs包括糖基化、磷酸化、乙酰化、蛋白水解、特定构象和寡聚反应。这些PTMs的程度和复杂性在真核生物中有所不同。因此，根据要表达的蛋白质，表达系统的选择也有所不同。例如， 糖基化和磷酸化是在简单真核生物如酵母和真菌中发生的至关重要的PTMs。然而，酵母产生的甘露糖残基已经广泛地N-糖基化，这些残基对人类可能具有高度免疫原性。因此，这种表达生物的选择限制在生产简单蛋白质。 需要高度糖基化或其他PTMs的复杂蛋白质最好使用真核生物如哺乳动物细胞（例如，中国仓鼠卵巢[CHO]、人类细胞等）、昆虫细胞和植物细胞来生产。其中，哺乳动物细胞，特别是CHO细胞，已经成为生产一系列复杂蛋白质（单克隆抗体）最广泛使用的表达系统。超过90%的目前批准的产品，大肠杆菌、CHO细胞和酿酒酵母是最常用的表达系统（宿主）。其他细胞系包括婴儿仓鼠肾（BHK）细胞、小鼠C127、非洲猴肾细胞、激活的淋巴细胞、小鼠骨髓瘤、骨髓瘤NS0和前列腺上皮细胞，除了这些细胞宿主。 表9.1总结了批准的生物治疗蛋白及其用于蛋白质生产的相应宿主细胞系统的例子。 DNA负责生产细胞生存和生理功能所需的蛋白质。重组蛋白表达差异很大——从体内用于结构研究到大规模开发用于生物治疗药物。 转录和翻译分别是基因调控和蛋白质表达的基本机制。遗传密码（DNA）中的信息转录成mRNA。然后，mRNA编码的信息翻译成特定的氨基酸序列，导致形成所需的蛋白质（图9.1）。R DNA是通过一个过程产生的，其中感兴趣的基因首先插入到质粒（例如，病毒）中，然后引入到活细胞（如细菌或哺乳动物细胞）中。质粒修改细胞DNA并迫使它开始产生目标蛋白。 图9.1 重组蛋白表达和生产系统开发流程图 在原核生物中，转录和翻译同时发生，而在真核生物中，这些过程顺序发生，随后是PTMs，进一步改变蛋白质结构或功能，这对于复杂的治疗蛋白至关重要。这些过程是利用活细胞，包括微生物系统、动物细胞和植物细胞，使用重组DNA技术构建所需蛋白质的关键。 根据所需蛋白质的编码构建DNA序列，并插入到宿主系统（也称为生产系统或表达系统）。第3章详细讨论了微生物和哺乳动物表达系统的细胞系开发。 基因插入过程从选择一个宿主质粒开始，该质粒在被指定生产重组蛋白的实体中持有感兴趣的基因（图9.2）。克隆涉及将感兴趣的基因或DNA片段转移到表达载体。 图9.2 pBR322质粒的示意表示，这是最早广泛用作克隆载体的质粒之一 来源：由Ayacop (+Yikrazuul) - 自己的作品，公有领域，commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=11840365 表达载体必须具备以下四个基本关键特征：（i）感兴趣基因盒，（ii）抗生素选择盒，（iii）细菌表达起源（ori），（iv）多个克隆位点链接器，表位标签，蛋白酶识别位点，内质网进入位点和分泌信号。然而，并非所有元素都是必需的。 在图中，箭头表示基因转录的方向。ori表示DNA复制的起源。标记为“amp”和“tet”的区域分别表示抗生素抗性基因氨苄青霉素和四环素。在特定序列（核苷酸）编号处用蓝色标记的区域代表限制酶识别并切割DNA质粒中特定区域的限制位点。 2.表达系统 选择生物体和细胞系类型作为宿主生物是生物治疗生产过程的主要和最重要的方面。制造重组药物的起始材料，也是当今生物制药的主要焦点，是表达目标治疗蛋白产品或感兴趣的单克隆抗体的基因改造的原核生物（细菌）或真核生物（例如，哺乳动物细胞如CHO、酵母、昆虫或细胞）。生物仿制药开发商不必使用与参考产品相同的表达系统，但如果涉及PTMs，则不建议这样做。 系统化的细胞库管理，辅以控制监测和测试，是确保细胞系完整性和生物特征的关键。在声誉良好的存储库或商业细胞系开发商处，可能会有一个受控的环境。在获得新的细胞系时，收集中心通常会对细胞系进行表征，以建立和验证其身份，并确保培养的纯度——对于动物细胞来说，至关重要的是要证明细胞系没有微生物污染和支原体。在细胞系中无意中引入错误（例如，交叉污染、外来病毒污染等）的可能性是无限的，而且相当普遍。因此，在处理所有材料时必须小心，以确保尽可能安全的工作环境。这适用于细胞和处理它们的个人。细胞培养被认为是生物危害，危害程度取决于细胞和实验协议。原代培养有很高的风险携带未检测到的病毒。 生物体的稳健性对生物制造过程的成功至关重要，并决定了商业制造的可扩展性。必须提供生物体的历史证据，从创建的第一阶段开始，到建立用于未来生产的细胞系。鉴于生物制药的高成本，产品滴度、细胞密度甚至产品质量的持续显著改进。例如，在早期，使用哺乳动物培养过程生产的抗体产量相对较低，<0.8-1.0 g/L，而近年来，商业工艺的生产力已提高到>3 g/L。 3.细菌细胞 然而，细菌表达系统（如大肠杆菌、芽孢杆菌、链球菌）能够在没有任何PTMs的情况下进行细胞内和细胞外蛋白表达。使用细菌表达系统生产简单目标药物的关键好处是它们的相对短的倍增时间、易于操作、简化处理、高生产力和成本效益，特别是对于大规模生产。 涉及基因表达、克隆和小规模蛋白生产的蛋白质生产过程，大约需要5-7天才能产生足够的蛋白质（每升从几百毫克到克）。细菌生产系统的营养和通气需求简单，允许在发酵罐中相对直接的放大操作。此外，细菌系统在承受增加操作规模和体积时发生的剪切力方面非常稳健。这些发酵过程可以以批量和分批进料模式运行。自1982年批准Humulin（胰岛素）以来，大肠杆菌是最广泛使用的表达系统，特别是用于小蛋白和肽，最近，它已被用于生产抗体片段和衍生物，如不需要任何PTMs的Fab片段单链可变片段抗体。使用大肠杆菌成功生产的一些重组蛋白包括人生长激素、干扰素α2a和2b、白细胞介素、粒细胞-集落刺激因子、甲状旁腺激素和生长抑素。在欧洲和美国批准的生物制药中，大约39%是使用大肠杆菌制造的。表9.1列出了使用大肠杆菌生产系统生产的蛋白质的例子。 图9.3详细说明了基因表达、克隆和重组细菌细胞生成的过程。 图9.3 细菌表达系统 大肠杆菌表达系统生产非糖基化分子的关键特点包括快速生长速率和基本营养需求，同时不妥协滴度。因此，最佳条件包括温度、pH值、溶解氧、通气和搅拌，以及方便的营养进料，是决定发酵生产力的关键参数。 在大肠杆菌中，重组蛋白的表达和生产发生在细胞内（例如，细胞质、周质）和细胞外（细胞外空间）。通常，以细胞质或周质为目标的蛋白表达往往导致称为包涵体的聚集体，其中包含蛋白。这些包涵体在发酵后从其他细胞组分中分离出来，以提取和纯化蛋白。存在于包涵体中的蛋白以非活性状态存在，需要转换为活性状态。这通常通过溶解和重新折叠来实现，以使蛋白进入其天然构象。大肠杆菌表达系统缺乏进行PTMs（如糖基化、二硫键形成和磷酸化等）的能力和机制。因此，通常使用细菌细胞生产不需要任何PTMs的相对简单的蛋白分子。包涵体的形成可以被认为是有利的，特别是在生产的蛋白容易降解或丧失其活性和功能的情况下。产品在其非活性状态下，安全地储存在这些包涵体中。包涵体通常通过离心回收，并用各种化学物质进行额外洗涤，以获得高纯度的包涵体。为了促进二硫键的形成，通常在蛋白重新折叠期间，可以在溶解和/或溶解后添加适当的氧化还原对（例如，GSH/GSSG）或还原剂如二硫苏糖醇或巯基乙醇，以减少任何不希望的分子间和分子内二硫键的形成。在重新折叠过程中，控制产品/蛋白聚集是确保聚集体有限的关键。这通常通过将介质稀释到相对较低的蛋白浓度和控制速率来实现。额外的处理步骤——溶解和重新折叠，尽管在这些步骤中恢复正确的蛋白构象和活性至关重要，但被认为是不利的，增加了液体处理体积（由于在低蛋白浓度下重新折叠）从而增加了总体成本，并可能降低产量。 细菌生产系统经常遇到的另一个重大缺点是细胞-基质杂质的产生/存在，包括内毒素和宿主细胞蛋白（HCPs）。这要求各种过程控制进行监控，以确保内毒素和HCPs在可接受的限度内，并满足剂量中允许量的监管要求。一些可能需要额外过程控制或监控的常见处理步骤包括细胞裂解步骤、体溶解和重新折叠。因此，下游操作必须非常稳健，能够最大限度地减少这些杂质。其他选择，如体外折叠和N端切割，可以作为整体过程改进。尽管存在这些限制，大肠杆菌细胞仍然很受欢迎，是生产简单蛋白分子的首选。 两种最常用的大肠杆菌菌株是K12和B。表9.2详细说明了源自大肠杆菌B菌株和K12菌株的常用菌株。B和K12菌株的生长特性完全不同。因此，这些菌株的特征和特性必须仔细考虑和评估，以确定适当的菌株作为所需蛋白的表达系统的使用。此外，这些菌株在编码蛋白中的二硫键或甚至编码有毒蛋白方面也有所不同。 近年来，各种新菌株有显著改进，被用于生产生物制药（例如，芽孢杆菌、Ralstonia eutropha、Staphylococcus carnosus）。 4.酵母 酿酒酵母（S. cerevisiae）和毕赤酵母（Pichia pastoris）是两种作为表达系统越来越多被使用的酵母种类（表9.3）。它们具有高效率（短倍增时间、高细胞密度、由于单细胞生长形态中更好的营养物质传递而获得的高产量）、低发酵成本。1991年，食品药品监督管理局（FDA）授权Novo公司的人胰岛素作为第一个由酿酒酵母菌株S. cerevisiae制造的产品。此后，这种酵母已被用于表达和合成40多种不同的重组蛋白，如胰岛素肽、人血清白蛋白和肝炎疫苗。S. cerevisiae的完整基因组序列已知，FDA已将其指定为“普遍认为安全”。与细菌不同，酵母细胞可以直接将蛋白质表达或分泌到培养基中，表达的蛋白质可以经历PTMs。 酵母细胞具有特征性的坚硬细胞壁。因为酵母细胞将表达的蛋白质分泌到培养基中，与细菌细胞不同，宿主细胞相关杂质的可能性较小，但在细菌细胞中更为突出。与细菌系统相比，酵母表达系统的纯化过程也相对简单（由于产品分泌），并消除了需要额外处理的需求，如回收包涵体、它们的溶解和重新折叠以实现天然蛋白质折叠。尽管有这些优点，酵母系统的缺点之一是缺乏PTMs和意外的单糖和二糖基化形式的目标蛋白，这些可能很难去除。 虽然S. cerevisiae是最常用的酵母，裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）和脂解酵母（Yarrowia lipolytica）也有使用。使用S. cerevisiae的普及主要归因于其高细胞密度和快速生长特性，这些特性可以在不影响成本和生产时间表的情况下轻松实现。表9.3详细列出了使用S. cerevisiae生产的重组蛋白。 另一种常用于生物制造的酵母菌株是毕赤酵母（Pichia pastoris）。与S. cerevisiae一样，甲型毕赤酵母（Pichia pastoris）可以生长到非常高的细胞密度，并具有严格调控的表达系统。与S. cerevisiae一样，Pichia pastoris菌株能够将重组蛋白分泌到培养基中或在细胞内表达。毕赤酵母是一种甲型微生物，将甲醇作为其主要能源（碳源），这一特性用于准备表达系统。酒精氧化酶基因1（AOX1）启动子用于克隆感兴趣的基因。在发酵过程中添加甲醇以诱导蛋白表达。处理大量甲醇时必须遵循额外的保护措施，因为它是一种挥发性溶剂。在Pichia pastoris中生产的一些重组蛋白包括人血清白蛋白、人胰岛素、激肽释放酶抑制蛋白、干扰素α2b和微纤溶蛋白肝素结合表皮生长因子样生长因子，等等。该系统的N-糖基化模式与高等真核生物不同，这一观察可以推广到其他酵母菌株。P. pastoris的一个主要缺点是蛋白水解降解，这在高细胞密度培养中尤其成问题。这导致产量和生物活性的损失。提出了各种策略，包括添加蛋白酶抑制剂（例如，苯甲基磺酰氟、乙二胺四乙酸、苯甲酰胺和蛋白酶抑制剂混合物）、酵母蛋白胨；优化发酵培养条件（例如，pH值）；使用培养基、进料或补充物中的某些特定成分（例如，胱氨酸；使用其他替代碳源；优化诱导策略，正在评估以克服这一挑战。 酵母被认为是大规模生产重组蛋白的理想选择，这些蛋白大多可以在高度复杂的真核生物中生产，这得益于其高度进化但定义明确的遗传系统、高生产力、快速生长、易于放大、能够支持某些PTMs以及减少制造时间和成本。然而，管理酵母中存在的蛋白酶是具有挑战性的，因为这些酶可以降解重组蛋白。 表达载体是酵母生产系统的核心。由于其有丝分裂稳定性，通常使用能够整合并建立在宿主细胞中的载体进行表达研究。对于某些酵母系统，染色体外载体（在宿主细胞中能够自主复制的非染色体DNA）是基因组整合的替代品。表达载体包括酵母启动子/终止子和可选择标记盒，它们允许克隆基因插入下游的分泌领导者。表达载体的这一能力允许异源蛋白从细胞分泌到培养基中。在酿酒酵母中用于蛋白表达的三种最常见载体是： 酵母整合质粒（YIp）：这是单拷贝质粒，可以整合到宿主基因组中。 酵母着丝粒质粒（YCp）：这是复制的单拷贝质粒，用于互补研究。 酵母染色体外质粒（Yep）：这是复制的多拷贝质粒，用于重组蛋白生产。 图9.4展示了使用S. cerevisiae创建目标蛋白表达系统的过程。 图9.4 酵母蛋白表达系统：酿酒酵母 使用S. cerevisiae创建目标蛋白表达系统的典型过程从识别编码感兴趣蛋白的感兴趣基因开始。然后使用感兴趣基因生成cDNA，克隆到细菌系统（有能力的E. coli细胞）。使用选择标记识别携带修改质粒的阳性克隆，然后分离克隆，将其转化为酵母细胞以整合质粒到酵母染色体，并筛选阳性转化子。最后，选择一个高表达克隆并放大，以创建细胞系以进一步生产感兴趣的蛋白。转化到酵母的常用方法包括原生质体转化、使用醋酸锂的全细胞转化和电穿孔。醋酸锂和聚乙二醇的组合也是一种广泛使用的转化方法，主要用于单链DNA。通常，通过应用可选择标记来选择转化子，以便在筛选阳性克隆时可以检测到它们（图9.4）。 使用优势选择标记，如对G418、甲醛、铜离子或环己酰胺的抗性。 通过互补，其中质粒包含宿主菌株中不存在（突变）的功能基因（例如，trp1、his3和ura3）。 针对提高产量、改变N-糖基化组成和提高亲和标签性能的目标工程化酵母菌株的数量正在增加。 尽管酵母细胞具有快速生长、简单的培养基要求和PTMs等优点，但主要缺点之一是可能发生过度糖基化，这可能会显著影响免疫原性，如前所述；鉴于蛋白质在培养基中表达和分泌，蛋白质降解的可能性仍然是一个主要问题。此外，培养基的低氧化还原电位也常常导致二硫键断裂。 重组蛋白的过度表达，导致细胞内积累和低产量，是酵母系统的另一个常见问题，常常导致细胞应激增加。正在开发几种新系统，以促进酵母细胞中重组蛋白的轻松表达。为了改进重组生物制药的处理，CRISPR/Cas9已成功用于酵母工程，以插入特定位点的基因或敲除特定不需要的基因。 5.哺乳动物细胞 细胞培养对人类的影响以及在生物学上取得的进步是巨大的。例如，疫苗、新药实体或抗体药物偶联物、双特异性抗体、细胞治疗和基因治疗等生物制药的进步主要依赖于细胞培养。人们越来越倾向于使用哺乳动物系统（人类和非人类[动物细胞系]）进行生产，特别是对于需要PTMs的复杂蛋白。所有细胞类型在其生长特性、最佳条件和营养需求方面都有所不同。 动物细胞的动态代谢需要多种营养物质。因此，胎牛血清，作为乳制品和牛肉行业的副产品，现在广泛用于细胞培养基。最近对传染性海绵状脑病（TSEs）和血液传播感染的担忧，以及对TSEs和牛海绵状脑病（BSEs）严格的监管要求，导致了大量的无血清、无动物产品甚至无蛋白培养基配方的出现。最近，重组胰岛素、转铁蛋白和牛血清白蛋白（由细菌发酵产生），以及由酵母发酵产生的人类血清白蛋白，已经在各种现代细胞培养过程中替代了动物源血清，而没有显著影响过程性能或产品质量。 哺乳动物细胞对培养条件极为敏感，它们经常对温度、pH值、通气和搅拌速度的微小变化反应过度。在对数生长期，动物细胞的增殖速度比细菌细胞慢，倍增时间为15-48小时。 动物细胞自然比微生物细胞更脆弱，因为它们的细胞壁缺乏强度。因此，它们无法耐受微生物细胞能够忍受的大多数发酵条件，需要使用特制的发酵罐。对于动物细胞的培养友好方法，出现了几种新型的“气升”和“发酵罐”设计，用泵代替叶轮。 在搅拌过程中，传统的叶轮破坏悬浮在培养基中的脆弱细胞的风险很大。尽管使用圆刃叶轮（如用于驱动摩托艇的三叶轮）来产生减少的剪切应力，但它们与细胞接触的剪切力可能同样有害。 在动物细胞的生长和培养中，使用强制空气吹扫或其他方法将空气引入混合物。在悬浮培养中，一些动物细胞系通过在液体介质中浮动而增殖，而其他细胞则需要一个固体基质来粘附在滚瓶的内壁、“中空纤维”生物反应器中的气体渗透聚合物管或微载体珠或塑料微载体珠或平板上。 对于动物细胞培养操作，强制空气吹扫是将空气注入生物反应器培养基的一种方式。培养一些动物细胞（附着依赖性）需要一个坚固的基质，这些基质粘附在滚瓶的内壁、“中空纤维”生物反应器中的气体渗透聚合物管或塑料微载体珠或平板上。某些动物细胞系通过在液体介质中悬浮来增殖。 传统上，附着依赖性细胞（主要是原代细胞系）表现出高水平的表达。为了达到高表达水平，如NS0、CHO、人类子宫颈（HeLa）和HEK-293等流线型细胞系已成功用于悬浮培养。相反，悬浮细胞系被证明更有用和有利，特别是对于更大体积的蛋白质生产程序。 至关重要的是要意识到，一些生物反应器培养条件可能导致细胞凋亡（细胞死亡），这种培养条件可以收集不需要的产品和细胞碎片，这将减慢下游过程。 5.1.非人类细胞系 5.1.1.中国仓鼠卵巢细胞 通常在如CHO细胞、HeLa细胞、非洲绿猴肾细胞（COS）、BHK细胞和杂交瘤等哺乳动物细胞中生产单克隆抗体和需要PTMs的复杂真核蛋白。这些哺乳动物细胞被用来生产单克隆抗体和其他经过PTMs的复杂真核蛋白等生物制药。 在大多数情况下，目标蛋白以原始形式产生，并直接分泌到培养基中。建立一个能够生产从每升几毫克到克的蛋白质的小规模过程可能需要大约4-5个月，从基因组装、克隆生成和选择开始。因为蛋白质在培养基中表达，下游处理是直接的。下游程序应该是健全的，能够消除或最小化宿主细胞蛋白（HCPs）、细胞碎片、核酸和其他在发酵过程中通常产生的组分。由于病毒污染的可能性很大，下游处理过程中必须包括病毒灭活和去除的步骤。为了验证病毒清除，必须应用广泛的控制措施（例如，生产结束时的测试，验证病毒的存在）。在N-1或最终纯化阶段之后，通常的做法是通过降低培养基的pH值来加入病毒灭活步骤，并通过过滤来加入病毒消除步骤。 动物细胞比微生物细胞更脆弱，生长非常缓慢，这使它们特别容易受到剪切力的影响；批次或分批进料培养通常用于抗体合成，而其他重组蛋白可以在持续4-8周的培养中产生。动物细胞的生长比微生物细胞慢，其生长特性也更复杂。此外，这些动物细胞的脆弱性使它们极易受到剪切力的影响。最常用的发酵模式是批次或分批进料培养，但最近的进展使连续培养和灌注同样成功，特别是对于高产量。 培养基的营养需求类型使其相对于用于微生物和酵母蛋白表达的培养基来说极其昂贵。这，加上低表达水平，使得整个生产过程成本过高。然而，鉴于复杂蛋白不能在微生物或酵母细胞中表达，哺乳动物细胞比转基因植物或动物更受青睐。 在细胞遗传学研究中，T. Puck在1957年创造了第一个CHO细胞系。Genentech创造的组织型纤溶酶原激活剂Activase最初在1987年使用CHO细胞生产。自从CHO细胞系一直主导着生物制药行业，作为重组蛋白制造的首选系统，所有目前批准的重组产品都是使用CHO细胞系生产的。最初的CHO细胞系已经被亚克隆很多次，产生了大量变体。生物制造中最常用的细胞系是CHO-K1、CHO DG44和CHO-S细胞，它们源自不同的CHO谱系（图9.5）。这幅图展示了几篇发表的论文的插图，记录了今天广泛使用的CHO细胞系的历史和演变。 图9.5 CHO细胞系 CHO-K1是从原始CHO细胞（卵巢组织分离物）的单克隆产生的第一细胞系。后来，这些细胞被修改用于悬浮和无血清培养基的工业用途。使用这个定制的CHO-K1细胞系开发了几种表达系统。它们与谷氨酰胺合成酶（GS）选择策略结合使用，在这种策略中，感兴趣的基因与GS基因的副本一起被引入宿主细胞，这允许稳定的细胞仅在无谷氨酰胺培养基中被选择。此外，使用甲磺酸乙酯对CHO-K1细胞系进行突变，形成了CHO-DXB11（也称为CHO-DUKX）细胞系，该细胞系缺乏二氢叶酸还原酶（DHFR）活性。 原始的CHO细胞通过伽马辐射诱变，导致DHFR等位基因的丢失和DHFR缺陷型CHO-DG44细胞系的出现。嘌呤、胸腺嘧啶和其他氨基酸的从头合成，以及CHO细胞的增殖需要DHFR。因此，CHO-DG44细胞必须在含有甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧啶（GHT）的培养基中生长。这个特性与GS选择系统在胸腺嘧啶或GHT缺乏的培养基中筛选转化体（选择标记）时的方式相同。如果转化的克隆（表达感兴趣基因和替代DHFR基因的重组质粒DNA）有效地吸收了重组质粒DNA，那么它们将在GHT缺乏的培养基中生长。 作为一种筛选转化DHFR缺陷细胞的选择压力，甲氨蝶呤（MTX）被广泛用于筛选转化体。缺乏DHFR的CHO细胞将在MTX处理的细胞中扩增转基因。MTX与DHFR酶的催化位点结合，阻止二氢叶酸转化为活性形式的四氢叶酸，而四氢叶酸是DNA合成所必需的。通过增加转化的DHFR缺陷CHO细胞（编码感兴趣基因、DHFR和载体）的培养基中MTX浓度来诱导选择压力。这导致DHFR和感兴趣基因在基因组中被扩增，使细胞能够产生更多的重组蛋白。然而，MTX介导的基因扩增可能会导致由于染色体异常导致的克隆不稳定，这是生物制造中的一个重要问题。 CHO-S是CHO细胞的一个亚群，可以在没有锚定或粘附表面的情况下作为悬浮生长（源自CHO pro-5细胞系）。CHO细胞在悬浮中生长的能力是颠覆性的，为在搅拌罐式反应器中大规模重组合成铺平了道路。市售的符合cGMP储存条件的CHO-S细胞可用。 CHO细胞的多样性决定了不同的生长条件、选择压力和用于蛋白表达的培养基，以实现包括PTMs和高细胞密度以及过程的特定生产力在内的功能属性。CHO工艺特别感兴趣的是糖链分布，因为糖链模式的变化可能影响产品质量、功能甚至安全性。在很大程度上，PTMs是细胞系选择和过程条件（包括培养基、进料、补充物、温度、pH值和溶解氧）的结合。因此，优化这些参数是生产满足其关键质量属性的所需产品的关键。 CHO细胞通常用于表达重组蛋白并生成稳定细胞系。使用缺乏DHFR酶的CHO细胞进行重组蛋白表达的标准方法是将目标基因和DHFR基因都克隆到单一的哺乳动物表达系统中。然后，重组DNA质粒（携带两个基因）转染到宿主细胞（DHFR缺陷型CHO细胞）。DHFR基因作为选择标记，只允许转染的细胞在无胸腺嘧啶的培养基中生长。接下来，使用限制稀释法获得单细胞稳定克隆。然后进一步评估这些克隆的表达水平、产品质量和稳定性，以生成表达感兴趣蛋白的最终细胞系。 5.1.2.CHO表达系统 用于大规模制药加工的其他哺乳动物非人类细胞系包括小鼠骨髓瘤细胞系NS0和Sp2/0、BHK细胞、非洲绿猴的Vero细胞和狗的Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞。Vero和MDCK细胞主要用于疫苗研究，而其他细胞则用于生产重组蛋白。 5.1.3.骨髓瘤细胞 自20世纪70年代以来，骨髓瘤细胞在杂交瘤技术中被使用，已成为抗体开发的主力军，直到最近才被CHO细胞超越用于重组蛋白表达。骨髓瘤细胞的一些优点包括在悬浮培养中生长、使用无血清培养基和易于放大。然而，鉴于骨髓瘤细胞能够产生非人糖型，可能导致免疫原性和不良反应，它们被视为潜在风险。小鼠细胞中内源性逆转录病毒丰富，这使得病毒清除非常繁重。最常用的骨髓瘤细胞系是NS0和Sp2/0，它们已成功用于生产生物制药。例如，Sp2/0细胞系用于生产Remicade（英夫利昔单抗）和Erbitux（西妥昔单抗），NS0用于Zenapax（达克珠单抗）和Soliris（依库珠单抗）以及其他畅销产品。NS0细胞缺乏完整的内源性GS表达，需要在培养基中添加外源胆固醇以促进生长和蛋白生产。使用动物源性成分的风险和合成胆固醇的价格导致了胆固醇独立型NS0克隆的发展。缺乏完全功能的GS被用作识别转染细胞的选择压力。 为了有效使用骨髓瘤细胞，至关重要的是要识别产生这些非人糖结构低水平的克隆。 5.1.4.人类细胞 第一个人类细胞系HeLa于1951年建立。在20世纪60年代，人类二倍体细胞被用于疫苗生产，但当时对肿瘤病毒的担忧阻碍了人类细胞的广泛使用。相反，非人类细胞，即CHO和鼠骨髓瘤细胞系，已成功用于生产批准的重组治疗剂。就人类细胞系而言，HEK293、成纤维肉瘤HT-1080细胞系和Namalwa淋巴瘤细胞已被用于批准的产品。最近，Per.C6和CAP被用于开发中的产品。 HEK293细胞系于1977年建立，自那时以来，它已成为生产重组治疗剂、病毒载体（腺病毒、逆转录病毒和慢病毒）和其他研究用蛋白的多功能系统。HEK细胞可以作为无血清培养基中的悬浮培养。在HEK细胞中生产的四种重组产品（Xigris、Alprolix、Eloctate和Nuwiq）已获批准。 Per.C6于1998年从非肿瘤人类胚胎视网膜母细胞瘤细胞中建立，已被用于腺病毒载体和重组蛋白生产。这个细胞系也可以在无血清培养基中悬浮培养，并能达到高细胞密度。 在重组蛋白生产过程中，哺乳动物细胞通常面临的挑战是低生产力和低过程效率。正在评估稳定和瞬时表达过程，以提高生产力和可扩展性。 6.藻类 绿色微藻，如莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii），已被用于生产全长人类抗体、信号分子如血管内皮生长因子以及具有强二硫键的结构蛋白如纤维连接蛋白。藻类叶绿体与其他真核物种（如酵母）一样具有表达基因的能力。虽然由于基因沉默减少和蛋白积累增加，藻类核基因组也可以转化，但叶绿体基因组在大多数情况下是迄今为止转基因表达的来源。 使用藻类平台生产了100多种抗体、亚单位疫苗、免疫毒素、亚单位口服疫苗和生长因子。 虽然丝状真菌被广泛用于生产酶，但由于产量低和蛋白质产生的变异性或引入的形态缺陷，它们在重组治疗蛋白生产中的有效利用并不广泛。用于制造重组蛋白的常见真菌包括曲霉（Aspergillus nidulans）、黑曲霉（Aspergillus niger）、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）和里氏木霉（Trichoderma reesei）。 7.昆虫细胞 在20世纪90年代，昆虫细胞杆状病毒表达系统被创建为哺乳动物表达系统的替代品。杆状病毒系统迅速获得认可，因为它有潜力将鳞翅目昆虫细胞转化为高水平的表达系统。此外，与酵母和细菌表达系统相比，这些系统具有更好的糖基化能力。昆虫细胞最常见的表达机制是瞬时的。 为了创建表达系统，需要昆虫宿主细胞和病毒载体，例如杆状病毒Autographa californica多重核多角体病毒，简称AcMNPV。杆状病毒是一种在鳞翅目昆虫中经常扩增的裂解性双链DNA病毒。它在脊椎动物中不具传染性，在哺乳动物细胞中的启动子不活跃，这使得它对人类使用是安全的。草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda，Sf9和Sf21）和粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）是最常见的昆虫宿主细胞系。为了学术和工业研究与开发，MultiBac，一种复杂的杆状病毒/昆虫细胞系统，已经被设计和使用，以产生包含以前无法获得的组分的多蛋白复合物。自推出以来，已经生产了许多MultiBac载体衍生物，以表达带有可切割N端信号肽的蛋白。 2009年，FDA批准了GSK的开创性昆虫细胞产品Cervarix，一种人类乳头瘤病毒疫苗。 将编码感兴趣基因的重组DNA质粒表达（与含有形成和繁殖病毒颗粒所需的病毒基因的第二质粒）共转染到宿主昆虫细胞中。感兴趣基因插入到一个强启动子后面，杆状病毒基因组转导到昆虫细胞导致病毒基因和感兴趣基因的表达。然后纯化并扩增重组病毒库。在确定的时间点（感染时间）将病毒库添加到宿主细胞中，每个细胞有特定数量的病毒。蛋白生产一直进行到细胞裂解，通常在感染后48小时。昆虫细胞可以在无血清和无蛋白培养基中作为悬浮细胞或细胞团生长。适宜生长的最佳温度大约为27°C–28°C，但昆虫细胞比哺乳动物细胞更容易受到剪切力的影响。昆虫细胞非常适合生产细胞质和分泌蛋白。 7.1.昆虫细胞表达系统：Sf9和Sf21 与哺乳动物细胞相比，昆虫细胞的整个生产周期更快，尤其是从重组病毒的产生到感兴趣蛋白的纯化结束。这个周期大约需要4周才能完成。由于细胞对剪切应变的脆弱性，发酵只以单批或半连续批次进行。在发酵周期中，昆虫细胞数量在大约一周内增加了近50倍，但只有在单批或半连续批次中，因为它们对剪切力的敏感性。 培养基费用从中等（无血清培养基）到昂贵（细菌和酵母培养基）。由于细胞可以在感染前健康培养，该技术非常适合生产危险细胞产品。尽管如此，由于需要特殊通风和高表达水平所需的质粒感染类型，放大是有问题的。 杆状病毒不感染脊椎动物，因此没有健康危险，而外来病毒的风险仍然未知，需要病毒灭活和主动过滤。宿主细胞的反复死亡和随后的裂解导致细胞内蛋白和核酸释放到培养基中，使下游纯化过程承受极大压力（例如，带有包涵体的细菌细胞）。昆虫细胞具有主要的监管轨迹，但尚未有FDA批准的产品。 与哺乳动物细胞培养相比，昆虫细胞培养在成本较低和更容易培养方面具有优势。通过这种技术实现的异源蛋白表达水平通常变化很大，从1到600 mg/L培养基。在10-40 mg/L的蛋白表达水平下，某些胶原蛋白在昆虫细胞中合成。昆虫细胞的一个问题是它们很少产生重组蛋白，因为它们更倾向于将合成的蛋白保留在细胞质中。这一特性归因于使用的转染方法，这可能使下游处理更加困难。杆状病毒表达载体（对人类不具传染性）通常被用作培养昆虫细胞中异源蛋白的表达系统。多亚单位蛋白复合物的生产、共表达蛋白修饰酶以增加异源蛋白生产以及新的杆状病毒展示技术应用是最近的一些进展。 基于昆虫细胞的表达系统有几个缺点，包括非哺乳动物糖基化模式和低生产力。昆虫细胞无法消化最初作为较大的不活性前体蛋白产生的蛋白质（例如，肽激素、神经肽、生长因子和基质金属蛋白酶）。然而，已经研究了几种解决这个问题的方法。一种方法是在杆状病毒中与感兴趣基因共表达这些酶，另一种方法是将哺乳动物糖基转移酶引入昆虫细胞。 8.比较分析 表9.3比较了商业生产重组产品的工业属性，指出了负面属性（因此，较低的评级更受欢迎）。目标蛋白的类型、PTMs、表达水平、知识产权和制造成本影响表达系统的选择。每个当前的表达系统都有自己的优缺点（表9.4）。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。