A Phase 2, Randomized, Placebo Controlled Study to Evaluate the Efficacy, Tolerability and Safety of Metabolic Cofactor Supplementation in Alzheimer's Disease (AD) And Parkinson's Disease (PD) Patients

This double-blind, randomized, placebo-controlled, investigator-initiated, multi-centre trial aims to establish metabolic improvements in AD and PD subjects by dietary supplementation with cofactors N-acetylcysteine, L-carnitine tartrate, nicotinamide riboside and serine. Concomitant use of pivotal metabolic cofactors via simultaneous dietary supplementation will stimulate to enhance hepatic β-oxidation and this study's hypothesis is that this will result in increased mitochondrial activity in human brain cell-types.

开始日期2019-12-02

申办/合作机构

Istanbul Medipol University

[+2]

ChiCTR-IPR-14005485 / Recruiting临床4期IIT

Post-marketing Clinical Research on compound Kushen Injection in Treatment of Malignant Neoplasm

开始日期2014-10-25

申办/合作机构

安徽省立医院（中国科学技术大学附属第一医院）

JPRN-UMIN000005081 / Completed临床2期IIT

the phase II study of chemotherapy with Docetaxel+Nedaplatin+5-FU(DNF) to esophageal cancer - the phase II study of DNF therapy to esophageal cancer

开始日期2010-12-01

申办/合作机构-

100 项与 Folitixorin Calcium 相关的临床结果

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100 项与 Folitixorin Calcium 相关的转化医学

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100 项与 Folitixorin Calcium 相关的专利（医药）

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120

项与 Folitixorin Calcium 相关的文献（医药）

2023-05-05·Frontiers in bioscience (Elite edition)

Determination of Vitamin B₁₂ and Folate Compounds in Commercially Available Edible Seaweed Products.

Article

作者: Koseki, Kyohei ; Watanabe, Fumio ; Ido, Koki ; Katsuura, Kiho ; Bito, Tomohiro ; Yoshimura, Ryusei

BACKGROUND:

Information on the contents of both vitamin B12 and folate in edible seaweeds is limited, of which deficiencies disrupt methionine biosynthesis to accumulate homocysteine as a risk factor of cardiovascular diseases.

METHODS:

Both vitamins were determined in commercially available edible seaweed products using high-performance liquid chromatography.

RESULTS:

Dried purple laver (Neopyropia yezoensis) products contain higher levels of vitamin B12 (approximately 30-60 μg/100 g dry weight) and folate compounds (approximately 880-1300 μg/100 g dry weight) than other seaweed products, such as kombu (Saccharina japonica), hijiki (Sargassum fusiformis), and wakame (Undaria pinnatifida). 5-methyltetrahydrofolate was the major folate compound in purple laver products. 5-formyltetrahydrofolate was found at a moderate level, whereas tetrahydrofolate, 5,10-metenyltetrahydrofolate, 10-formyltetrahydrofolate, and folic acid were found to be minor folate compounds.

CONCLUSIONS:

These findings suggest that dried purple laver (nori) products are suitable sources of vitamin B12 and folate compounds for humans, especially vegetarians.

2022-08-31·Bioscience trends

Association of MTHFR 677C>T polymorphism with pregnancy outcomes in IVF/ICSI-ET recipients with adequate synthetic folic acid supplementation

Article

作者: Qi, Qing ; Wang, Ling ; Ye, Feijun ; Zhou, Jing ; Zhang, Siwei ; Du, Yan

Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) genetic polymorphism rs1801133 (677C>T) will decrease the utilization of folate. Folate deficiency and its resulting homocysteine (HCY) accumulation can impair female fertility. Folic acid (FA) supplementation is necessary in pregnant women who are undergoing in-vitro fertilization (IVF)/intracytoplasmic sperm injection (ICSI) - embryo transfer (ET), and especially in women with MTHFR rs1801133 C-to-T mutations. At present, affordable and accessible synthetic FA is mainly used. However, some studies have suggested that 5-methylenetetrahydrofolate (5-MTHF), a type of active FA, may be more suitable for women with the MTHFR 677C>T polymorphism, since it is safer and more effective. This retrospective study aimed to evaluate whether the MTHFR rs1801133 gene polymorphism is related to the pregnancy outcomes of IVF/ICSI-ET recipients after sufficient supplementation with FA instead of 5-MTHF. Data on 692 women undergoing IVF/ICSI-ET and taking adequate FA were collected. Participant characteristics were compared using the Kruskal-Wallis test and Pearson chi-square test. Logistic regressions were used to calculate the odds ratio (OR) and 95% confidence interval (95% CI), after adjusting for age, BMI, method of fertilization, method of embryo transfer and number of embryos transferred. An additive model (T/T vs. C/C), dominant model (C/T + T/T vs. C/C), and recessive model (T/T vs. C/T + C/C) were evaluated. Analysis revealed that MTHFR rs1801133 in IVF/ICSI-ET women with adequate FA supplementation was not associated with the pregnancy rate but with age (OR = 0.91, 95% CI = 0.88, 0.94, P < 0.001) and BMI (OR = 0.95, 95% CI = 0.90, 0.997, P = 0.037). In 349 clinically pregnant women, no association of the MTHFR 677C>T with pregnancy outcomes was found in the additive model, dominant model, or recessive model. Of the 273 women with positive pregnancy outcomes, 34 had a preterm delivery. MTHFR 677C>T was not associated with a preterm delivery after adjusting for age and BMI. The current results indicated that MTHFR polymorphism rs1801133 was not related to the pregnancy rate or pregnancy outcomes of women undergoing IVF/ICSI-ET with adequate synthetic FA supplementation, suggesting that simple supplementation with less expensive and readily available FA, rather than expensive 5-MTHF, appeared to be appropriate.

2022-05-01·In vitro cellular & developmental biology. Animal

Folate derivatives, 5-methyltetrahydrofolate and 10-formyltetrahydrofolate, protect BEAS-2B cells from high glucose–induced oxidative stress and inflammation

Article

作者: Divya, Peethambaran ; Pathikkal, Ajana ; Rudrappa, Sudha ; Puthusseri, Bijesh ; Chauhan, Vikas Singh

Folate (vitamin B₉) and its biologically active derivatives are well-known antioxidant molecules protecting cells from oxidative degradation. The presence of high glucose, often found in diabetic patients, causes oxidative stress resulting in cellular stress and inflammatory injury. Cells in organs such as the lung are highly prone to inflammation, and various protective mechanisms exist to prevent the progressive disorders arising from inflammation. In the present study, the synthetic form of folate, i.e. folic acid, and active forms of folate, i.e. 5-methyltetrahydrofolate and 10-formyltetrahydrofolate, were evaluated for their antioxidant and antiinflammatory potential against high glucose (50 mM)-mediated oxidative stress and inflammation in BEAS-2B cells, an immortalised bronchial epithelial cell line. High glucose treatment showed a 67% reduction in the viability of BEAS-2B cells, which was restored to the viability levels seen in control cultures by the addition of active folate derivatives to the culture media. The DCFH-DA fluorometric assay was performed for oxidative stress detection. The high glucose-treated cells showed a significantly higher fluorescence intensity (1.81- and 3.8-fold for microplate assay and microscopic observation, respectively), which was normalised to control levels on supplementation with active folate derivatives. The proinflammatory NF-κB p50 protein expression in the active folate derivative-supplemented high glucose-treated cells was significantly lower compared to the folic acid treatment. In support of these findings, in silico microarray GENVESTIGATOR database analysis showed that in bronchiolar small airway epithelial cells exposed to inflammatory condition, folate utilization pathway genes are largely downregulated. However, the folate-binding protein gene, which encodes to the folate receptor 1 (FOLR1), is significantly upregulated, suggesting a high demand for folate by these cells in inflammatory situations. Supplementation of the active folate derivatives 5-methyltetrahydrofolate and 10-formyltetrahydrofolate resulted in significantly higher protection over the folic acid from high glucose-induced oxidative stress and inflammation. Therefore, the biologically active folate derivatives could be a suitable alternative over the folic acid for alleviating inflammatory injury-causing oxidative stress.

项与 Folitixorin Calcium 相关的新闻（医药）

2024-06-13

·生物探索

Nature | 植物免疫系统中的关键角色：柴继杰等合作揭示NRC2蛋白如何保持自我抑制

引言核苷酸结合丰富亮氨酸重复序列(NLR)蛋白通过识别病原体效应在植物免疫中起关键作用。维持平衡的免疫反应是至关重要的，因为过度的NLR表达可能导致意外的自身免疫。与大多数NLR不同，植物细胞死亡所需的NLR 2 (NRC2)属于一个小NLR组，其特征是组成性高表达而不自我激活。NRC2自抑制和激活的机制尚不清楚。 2024年6月12日，西湖大学柴继杰、德国马克斯·普朗克植物育种研究所Paul Schulze-Lefert及湘湖实验室马守偲共同通讯在Nature 在线发表题为“Oligomerization-mediated autoinhibition and cofactor binding of a plant NLR”的研究论文，该研究展示Solanum lycopersicum (番茄)NRC2 (SlNRC2)在高浓度下形成二聚体和四聚体，以及高阶低聚物。Cryo-EM显示了这些低聚物中SlNRC2的非活性构象。二聚化和寡聚化不仅稳定了SlNRC2的非活性状态，而且使SlNRC2从的组装中分离到活性形式。二聚体或二聚体间界面的突变增强了Nicotiana (N.) benthamiana中病原体诱导的细胞死亡和免疫。冷冻电镜结构出乎意料地揭示了肌醇六磷酸酯(IP6)或五磷酸酯(IP5)结合在SlNRC2的C端LRR结构域的内表面，经质谱证实。IP结合位点的突变损害了SlNRC2的肌醇磷酸结合和病原体诱导的SlNRC2介导的N. benthamiana细胞死亡。总之，该研究揭示了NLR激活的一种新的负调控机制，并表明肌醇磷酸是NRCs的辅助因子。植物已经发展出一种双层免疫系统来探测和应对环境中的潜在威胁。第一道防线被称为模式触发免疫(PTI)，当膜上的模式识别受体识别细胞表面上进化的保守的微生物衍生的分子模式时，就会启动。然而，一些病原体已经进化出可以抑制PTI的效应分子，从而促进感染。作为回应，植物进化出了抗性(R)蛋白，这种蛋白通常识别菌株特异性效应器，从而产生更强的防御反应，称为效应器触发免疫(ETI)。ETI通常会诱发超敏反应(hypersensitive response, HR)，这是一种受调控的宿主细胞死亡，局限于试图感染的部位。大多数R蛋白是细胞内核苷酸结合丰富亮氨酸重复序列(NLR) 受体，在植物防御病原体入侵中起着至关重要的作用。NLR受体是多结构域蛋白，包括一个中央核苷酸结合结构域(NBD)和一个C末端富含亮氨酸重复结构域(LRR)。根据特定N端结构域(如CC 结构域)的存在，它们可以分为不同的亚家族。在健康植物中，NLR与ADP结合，并通过域内相互作用保持非活性。对病原体效应物的识别触发NLR的构象变化，并将ADP交换为ATP，将其转化为活性构象。这些分子事件最终导致NLR寡聚化并形成称为抵抗体的高阶蛋白质复合物。NLR抗性小体通过钙(Ca2+)-可渗透通道整合信号，触发下游防御机制。植物中许多NLR的高水平表达导致了在没有病原体的情况下的自身激活和HR细胞死亡。这表明NLR的激活可以通过NLR蛋白的积累来诱导，正如用拟南芥NLR RPS4观察到的浓度依赖性HR细胞死亡所证明的那样。因此，NLR的表达在植物中受到严格调控，以防止自身免疫和确保平衡的免疫反应。 SlNRC2寡聚化的结构机理（Credit: Nature）负责检测效应器的NLR通常被称为“传感器”NLR。这些通常与下游信号NLR一起发挥作用，将识别转化为免疫激活，它们被称为“辅助”NLRs。在茄科植物中，辅助性CC-NLRs (CNLs)，具体称为细胞死亡所需的NLR (NRCs)，在激活众多传感器NLRs的功能中起关键作用。NRCs，包括NRC2、NRC3和NRC4，与大多数其他NLRs相比，属于在无病原体情况下高表达的一小部分核心NLRs。由特定传感器NLR触发的免疫反应可能依赖于一个或几个辅助NRCs。与一些CNLs的五聚体抗性体相反，SlNRC4抗性体最近被证明形成六聚体来触发ETI。该研究发现SlNRC2在升高的浓度下形成二聚体和四聚体，以及高阶低聚物。利用冷冻电镜进行结构分析，发现SlNRC2在二聚体和低聚体状态下均为非活性构象。结构对比表明，SlNRC2的二聚化和寡聚化作用稳定了非活性的构象。SlNRC2二聚化和寡聚化的损伤增强了CP诱导的N. benthamiana细胞死亡，支持分子间相互作用对 SlNRC2激活的抑制作用。冷冻电镜结构出人意料地揭示了一个肌醇磷酸分子，主要是IP6或IP5 (IP6/5)，与C端LRR结构域结合，这是质谱(MS)证实的。IP6/5与该位点的结合是CP诱导的N. benthamiana细胞死亡所必需的，这表明磷酸肌醇在调节SlNRC2 信号传导中的辅助因子作用。总的来说，该研究结果提供了对植物NLR激活的复杂负调控的见解，并提出了关于肌醇磷酸酯在NLR免疫信号传导中的作用的有趣问题。原文链接 https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41586-024-07668-7 责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature” End 往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

2024-06-12

·生物探索

Cell Mol Immunol丨吴励课题组揭示调控树突状细胞发育与生存的重要机制

引言清华大学-北京大学生命联合中心吴励课题组近日在Cellular & Molecular Immunology期刊上在线发表了题为“TRIM33通过对Irf8与Bcl2l11转录的调控在树突状细胞的分化与稳态中发挥重要作用”（TRIM33 plays a critical role in regulating dendritic cell differentiation and homeostasis by modulating Irf8 and Bcl2l11 transcription）的研究论文。该研究首次报告了TRIM33通过促进Irf8表达以支持cDC1发育，同时通过抑制Bcl2l11在所有DC亚群及其前体中的表达，在维持DC的稳态中起到关键作用。作为免疫系统中重要的调控细胞，树突状细胞（dendritic cells，DC）的稳态对于维持机体的先天和适应性免疫反应至关重要【1】。本项研究在课题组既往鉴定的调控DC发育分化的关键转录因子和表观遗传修饰因子【2-5】的基础上，确定了TRIM33作为调控DC分化和生存的又一新的调节因子的重要功能。已有研究显示TRIM33通过转录及表观调控对红细胞、淋巴细胞、单核细胞和粒细胞系的谱系生成和功能具有显著影响【6-8】，但TRIM33在DC谱系中的作用仍不明确。此前研究显示TRIM33与转录因子PU.1，一个关键的DC命运调节因子之间具有相互作用【8】，进一步提示TRIM33可能参与了DC的谱系调控。为了研究TRIM33在DC分化及稳态中的作用，作者首先对Trim33fl/fl Cre-ERT2小鼠进行了表型分析，观察到诱导全身性Trim33敲除后，经典1型DC（conventional type 1 DC, cDC1）和浆细胞样DC（plasmacytoid DC, pDC）明显缺失，cDC2数量则显著减少，同时DC前体的数量和DC生成潜能也严重受损。为进一步解释这些发现的分子基础，作者检测了几种关键转录因子的表达，发现TRIM33缺失的DC前体中Irf8，一个调控cDC1分化的关键转录因子的表达显著下降。综合CUT&Tag、co-IP/MS等分子机制研究，作者证实TRIM33通过与Irf8基因体和增强子区域结合，通过影响CDK9和Ser2磷酸化RNA聚合酶II的招募直接调控Irf8的转录。这一发现解释了DC（尤其是cDC1）分化对TRIM33依赖性。此外，作者在DC前体中鉴定到了数百个TRIM33和PU.1的共结合位点，并证实TRIM33通过与促凋亡因子Bcl2l11（Bim）的一个增强子位点结合来抑制Bcl2l11（Bim）的转录，进而抑制DC及其前体的凋亡。同时进一步分析确定了在CD11c+条件性敲除的Trim33fl/fl Itgax-Cre小鼠中，大多数DC亚群的细胞数显著减少，这说明TRIM33的缺失导致了终末分化DC的生存缺陷。此外，研究还显示在DC前体中同时过表达irf8和敲低Bcl2l11可以恢复TRIM33缺失的DC前体产生cDC1的能力，但单一过表达Irf8或敲低Bcl2l11均不能产生此效果。因此，本研究鉴定了TRIM33在转录调控DC发育和维持其生存中的双重新功能，这些功能协同维持了DC的稳态。下图总结了TRIM33在DC谱系稳态中的关键作用。模式图（Credit: Cellular & Molecular Immunology）有意思的是，近期Tiniakou I. et al.发表的一篇文章也描述了非常相似的发现【9】，是对本研究结果的很好佐证。本研究成果为深入了解DC发育和稳态的关键转录调节因子提供了新对知识，今后基于DC的免疫调节和治疗新策略的制定将会从这项研究中受益。参考文献 1. Durai, V. & Murphy, Kenneth M. Functions of Murine Dendritic Cells. Immunity 45, 719-736, doi:https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.immuni.2016.10.010 (2016). 2. Wu, L., Nichogiannopoulou, A., Shortman, K. & Georgopoulos, K. Cell-autonomous defects in dendritic cell populations of Ikaros mutant mice point to a developmental relationship with the lymphoid lineage. Immunity 7, 483-492 (1997). 3. Wu, L. et al. RelB is essential for the development of myeloid-related CD8 alpha(-) dendritic cells but not of lymphoid-related CD8 alpha(+) dendritic cells. Immunity 9, 839-847, doi:10.1016/s1074-7613(00)80649-4 (1998). 4. Carotta, S. et al. The Transcription Factor PU.1 Controls Dendritic Cell Development and Flt3 Cytokine Receptor Expression in a Dose-Dependent Manner. Immunity 32, 628-641, doi:10.1016/j.immuni.2010.05.005 (2010). 5. Zhang, Y. et al. Regulation of pDC Fate Determination by Histone Deacetylase 3. eLife 12, e80477, doi:10.7554/eLife.80477 (2023). 6. Rossmann, M. P. et al. Cell-specific transcriptional control of mitochondrial metabolism by TIF1gamma drives erythropoiesis. Science 372, 716-721, doi:10.1126/science.aaz2740 (2021). 7. Wang, E. et al. The transcriptional cofactor TRIM33 prevents apoptosis in B lymphoblastic leukemia by deactivating a single enhancer. eLife 4, e06377, doi:10.7554/eLife.06377 (2015). 8. Kusy, S. et al. Adult Hematopoiesis is Regulated by TIF1 gamma, a Repressor of TAL1 and PU.1 Transcriptional Activity. Cell Stem Cell 8, 412-425, doi:10.1016/j.stem.2011.02.005 (2011). 9. Tiniakou, I. et al. Genome-wide screening identifies Trim33 as an essential regulator of dendritic cell differentiation. Science immunology 9, eadi1023, doi:10.1126/sciimmunol.adi1023 (2024). 责编|探索君排版|探索君文章来源|“BioArtMED” End 往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

临床结果

2024-06-09

·药研

CDE老师文章｜我国双特异性抗体药物注册申报现状及药学审评思考

（点击图片查看详情）摘要：近年来，国内外双特异性抗体发展迅速，截至2023年12月，全球已有近200个双特异抗体正在进行临床研究，10余个双特异性抗体药物获批上市。本文分析了国内外双特异性抗体注册申报现状，并结合药学审评经验及相关文献，对此类产品药学开发中的常见技术问题进行探讨，以期为双特异性抗体药物的药学开发及评价提供参考。 NISONOFF等[1]在20世纪60年代首次提出将不同特异性的单价抗体片段的混合物重组，自此双特异性抗体（简称双抗）的发展拓展了癌症免疫治疗领域。但由于免疫原性和链错配问题的存在，双抗的发展受到了很大限制，近年来，随着科学技术的快速发展以及对双抗认知的提高，这些问题已逐渐被克服。双抗由于能同时结合2个不同的靶点或同一个靶点的2个不同表位而具有更强的抗原结合能力，在复杂疾病的治疗中十分关键[2]。LAN等[3]报道，靶向人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2）的双抗已显示出将免疫细胞定向至HER2阳性乳腺癌细胞的能力，从而有效杀伤肿瘤细胞。已完成的临床研究显示，Roche的法瑞西单抗（Vabysmo）靶向血管生成素-2(angiopoietin-2,Ang-2）和血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A），用于治疗新生血管性或湿性年龄相关性黄斑变性和糖尿病黄斑水肿，相比1～2个月眼部给药1次的阿柏西普，Vabysmo在达到同样治疗效果下可将给药时间延长至3～4个月，有效降低了治疗负担[4]。自2009年首个双抗卡妥索单抗（Catumaxomab）批准上市以来，多个双抗药物进入研发的不同阶段。截至2023年12月，全球已有近200个双抗正在进行临床研究，10余个双抗药物获批上市。本文分析了国内外双抗注册申报现状，并结合药学审评经验及相关文献，对此类产品药学开发中的常见技术问题进行探讨，以期为双抗药物的药学开发及评价提供参考。1 国内外双抗药物受理情况分析1.1 国外已上市双抗情况分析根据已经公开的信息，截至2023年底，全球已获批14款双抗药物（包括已退市的），其中10款为2022年后上市。获批的双抗药物涉及的靶点多样，包括分化簇3(cluster of differentiation 3,CD3）、分化簇19(CD19）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）、细胞间质上皮转换因子（cellular-mesenchymal epithelial transition factor,c MET）、程序性细胞死亡蛋白-1(programmed cell death protein-1,PD-1）、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4(cytotoxic T lymphocyte associated protein-4,CTLA-4）、B细胞成熟抗原（B cell maturation antigen,BCMA）、凝血因子Ⅸ（coagulation factorⅨ，FⅨ）、凝血因子Ⅹ（FⅩ）、VEGF-A和Ang2等。适应症多为血液瘤、多发性骨髓瘤、消化道肿瘤、非小细胞肺癌、黑色素瘤等恶性肿瘤，也进行了血友病、眼科及关节炎等适应症的扩展探索。见表1。全球已上市双抗药物中，有4家已在国内获批上市，包括Amgen的贝林妥欧单抗、Roche的艾美赛珠单抗、法瑞西单抗、格罗菲妥单抗，其中贝林妥欧单抗在国外获批5～6年后在国内上市，Roche的3种双抗国内外获批时间从1年逐渐缩短至1月，可见双抗在国内的上市时间与欧美的差距逐渐缩短，这得益于国内近年来加快审评、审批的各项举措及国际多中心临床的开展，明显提高了国内用药的可及性。在国内进行新药上市申请且处于审评中的包括Janssen的特立妥单抗、Roche的莫妥珠单抗、Johnson&Johnson的埃万妥单抗。表1 国外已上市双抗药物汇总 Tab.1Summary of foreign marketed bispecific antibody drugs 注：FDA(Food and Drug Administration）为美国食品药品监督管理局；EMA(European Medicines Agency）为欧洲药品管理局；NMPA(National Medical Products Administration）为国家药品监督管理局；Ep CAM(epithelial cell adhesion molecule）为上皮细胞黏附分子；Gp100(glycoprotein 100）为糖化蛋白100;TNF-α(tumor necrosis factor-α）为肿瘤坏死因子-α;CD20(cluster of differentiation 20）为分化簇20;GPRC5D(G protein-coupled receptor,class C,group 5,member D）为G蛋白偶联受体C5D。国外已上市双抗药物在我国正开展临床试验的包括Pfizer的Elranatamab、Johnson&Johnson的Talquetamab、Abbvie/Genmab的Epcoritamab-bysp，目前在国内均已进入关键的临床试验阶段。除此之外，全球尚未上市，国内外同步开展临床试验，且已进入关键临床试验的包括卡妥索单抗（Catumaxomab）、Amgen的Tarlatamab（靶点CD3E x DLL3）、Medimmune Llc研发的Volrustomig(PD-1 x CTLA4）、诺和诺德制药的Mim8（靶点F9 x F10）、阿斯利康的Gefurulimab(C5抑制剂）、默克雪兰诺的Bintrafuspalfa（靶点PD-L1 x TGF-β）、Zymeworks Inc的Zanidatamab（靶点HER2）、Abl Bio Inc的TR-009（靶点DLL4 x VEGFA）。值得注意的是，首个双抗药物卡妥索单抗（Catumaxomab）于2009年被欧盟批准上市，用于恶性腹水治疗，于2017年因商业原因退出市场。广州凌腾生物医药有限公司重启了卡妥索单抗在国内的开发，目前最高研发阶段为临床Ⅲ期，用于治疗胃癌[5]。1.2 国内双抗注册受理情况分析中山康方生物医药有限公司的卡度尼利单抗注射液（代号：AK104，商品名：开坦尼）已于2022年6月由NMPA获批上市，靶向人PD-1和CTLA-4，用于治疗既往接受含铂化疗治疗失败的复发或转移性宫颈癌患者，是全球首个获批上市的肿瘤双免疫检查点抑制剂双抗，也是国内首个获批上市的双抗[6]。新药上市申请方面，中山康方生物医药有限公司研发的依沃西单抗（AK112）是一种特异结合人VEGF和PD-1的人源化双抗，用于治疗联合培美曲塞与卡铂用于经EGFR酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptortyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）治疗后进展的EGFR突变的局部晚期或转移性非鳞非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC），目前已申请上市，处于审评中。除已上市及正申请上市的品种外，国内双抗药物的临床研究也取得了阶段性进展，截至2023年底，中国大陆已有152个双抗获得临床试验申请（Investigational New Drug,IND）的批准，用于基于免疫肿瘤学的癌症及自身免疫性疾病治疗，且已成为双抗临床开发的重点。根据靶点组合和适应症的区别，主流的双抗类型可分为3类：含PD-1/PD-L1轴类、CD3招募类及其他类。目前国内处于临床Ⅲ期的双抗见表2。2 双抗药学审评中常见问题及思考双抗具有与单抗相似的理化性质，单抗典型质量研究方法大部分也适用于双抗，但双抗由于分子固有特性、特异性纯化工艺、产品相关杂质与单抗存在一定差异，质控研究又有自身特点。本文结合审评经验，列举了双抗药物审评中常见药学问题，着重强调了质量研究中可能遇到的问题，以期为双抗药物的药学开发及评价提供参考。表2 国内处于临床Ⅲ期的双抗药物 Tab.2Domestic bispecific antibody drugs in clinical phaseⅢ 注：PD-L1(programmed cell death 1 ligand 1）为细胞程序性死亡-配体1;HER3(human epidermal growth factor receptor 3）为人表皮生长因子受体3。2.1 双抗特异性 FDA于2021年5月发布的《Bispecific Antibody Development Programs Guidance for Industry》[7]在双抗药学研究和控制（Chemical Manufacturing and Control,CMC）方面提出，应研究可能影响药理学的质量属性，包括抗原特异性、与抗原表位结合的亲和力、与抗体结合的亲和力（针对同一细胞上的2个分子的双抗）、效价、产品相关杂质（如聚集体、片段、同源二聚体及其他错配形式）、稳定性及半衰期等，并指出“某些情况下，FDA可能会要求将双抗与针对相同抗原靶点的已批准单特异性产品进行比较（与类似单特异性产品相比安全性和/或有效性应有所提高），以便为双抗的获益风险评估提供信息”，此处强调了双抗特异性的重要性，与仅具有组合效应的双抗相比，更倾向于特异性双抗。双抗药物开发时比传统的单抗药物面临更多的挑战，如某些双抗形式可能显示出不如其母体单抗的药代动力学特性[8]。该研究评估了两种Ig G融合双抗形式（Ig G-ECD和Ig G-sc Fv）在食蟹猴体内的代谢，结果显示，两种Ig G融合双抗形式清除较快、较其单抗分子半衰期短，因此选择合适的双抗形式是开发的关键部分[9]，通常需要大量的筛选研究工作，重点是提高稳定性，降低多反应性和自缔合潜力，去除免疫及消除化学和蛋白水解切割位点。早期的体外研究可能会对选择具有最佳亲和力和稳定性的工程细胞株具有指导意义。如文献报道，艾美赛珠开发时曾从40 000个双抗中筛选，针对靶向FIX x FX活性、药代动力学改善、溶解度改善、脱酰胺和去免疫等进行了优化，最终筛选出emicizumab。部分抗体通过添加透明质酸酶等辅料制备皮下注射剂型，以高浓度形式给药，延长半衰期，方便患者给药[10]。目前国内外制药企业构建了高通量双抗制备和筛选平台，如苏州康宁杰瑞生物科技有限公司的电荷排斥诱导双特异性（Charge Repulsion Improved Bispecific,CRIB）平台、武汉友芝友生物制药股份有限公司的Ybody、Roche双抗筛选平台、Merck的SPLIT INTEINS平台、赛诺菲的CODV-Ig等，为快速、高效获得高质量、疗效好的双抗提供了平台支持。2.2 结构研究部分双抗与Ig G单抗结构类似，分子较大，研发时采用传统的生物物理学工具，如圆二色谱（circular dichroism,CD）、傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectrometer,FTIR）和差示扫描量热法（differential scanning calorimetry,DSC）等，对大的、多结构域蛋白或小部分变体微小结构变化的检测灵敏度下降，导致采用这些生物物理学技术对双抗提供的额外表征有限。但仍应尽可能采用多种正交方法对双抗的高级结构进行表征，以便从多角度了解蛋白质高级结构，这对发生可能影响产品安全、有效性的药学变更时，如何证明产品变更前后的可比性也具有益处。此外，双抗分子结构较为复杂，氨基酸序列测定时，部分双抗的氨基酸覆盖率可能达不到100%，建议尽可能采用多种酶切形式结合肽图提高序列覆盖率。2.3 产品相关杂质/有关物质双抗产品相关杂质/有关物质可能包括分子大小变异体、电荷异构体、序列变异体、错配抗体、半抗体、糖化变体、氧化变体、天冬氨酸异构化等。对于分子大小变异体、电荷异构体等含量较多产品相关杂质/有关物质可采用色谱法富集，对于序列变体等痕量变异体可通过强降解方法制备，开展进一步的质量研究，分析对活性的影响。部分双抗开发研究时出现序列变异体，已知治疗性抗体恒定区的异型变异体可在异型错配患者中引发免疫原性反应，但与临床影响无关[11]。开发者应从DNA水平、蛋白水平研究序列变体的来源、不同代次细胞中的含量，并对序列变体进行鉴别，结合已有的非临床、临床研究鉴定该变异体对安全性、有效性、免疫原性不会产生影响。若与基因突变有关，应严格控制细胞限传代次，必要时在质量标准中拟定合理的限度。双抗因二硫键偏多，可能会出现二硫键错配结构，另外如果抗体轻链和重链可变区中存在游离巯基，可能会影响其生物活性，导致生物学活性降低[12]，应在研究时采用合适的方法（如非还原变性-酶切肽图结合纯度方法）表征二硫键配对方式、游离巯基含量等，鉴定二硫键已正确配对。考虑到抗CD3或抗Fc受体的同源二聚体可能会导致细胞因子的释放，而后者又是双抗类产品常见的安全性风险，应对同源二聚体进行定量分析，这对于与效应细胞结合的双抗十分重要。此外，新的结构可能会导致增加免疫原性[7]。部分双抗互补性决定区（complementarity determining region,CDR）存在一定的氧化、脱酰胺、异构化、糖基化等，考虑到CDR区影响样品的有效性，增加免疫原性风险，CHUNG等[13]报道，聚糖结构α1-3连接半乳糖和N-羟乙酰神经氨酸（N-glycolylneuraminic acid,NGNA）可能参与不良免疫反应，应明确具体位点、含量，分析对活性、药代、安全性及免疫原性等的影响，制定合理的控制措施。2.4 生物学活性由于双抗的作用机理多样，如细胞连接、受体桥接失活、受体桥接激活、双靶点同时作用、双靶点顺序作用等，因此双抗分子开发时，除抗原结合试验、细胞表面配体结合试验、效应器功能测定外，还应尽可能开发反映双抗2个靶标结合/协同效应的生物学活性测定方法（mechanisms of action,MOA）。完善的生物测定法对于生物制品的表征和控制以及临床研究结果的解释至关重要，要求具有较好的准确性和重现性，充分体现分子作用机制，最好使用单一检测形式满足检测所需性能（即捕获分子的双重活性和潜在的协同效应），以及检测多方面的结构变化[14]。根据分子的作用机制，除应测定主要生物学活性外，还需考虑开发多种免疫学方法，如细胞杀伤、细胞因子分泌、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（antibody dependent cellular phagocytosis,ADCP）等，对产品进行表征。REGISTER等[15]汇总了目前双抗生物学检测常用方法，通过案例分析结合检测、MOA、功能检测（其他支持MOA表征方法）、效应器功能检测、杂质生物测定等表征方法，为不同类型双特异性分子的生物测定开发提供策略。目前部分企业仅开发分子水平的生物学活性检测方法，未开发细胞水平的活性研究方法。一方面与方法开发难度有关，据文献报道[16]，开发稳健且适合质量控制（Quality Control,QC）的基于细胞的生物检测方法比开发非基于细胞的结合检测方法更具挑战性，细胞水平检测方法方法变异度大；另一方面，生物测定的开发、执行、转移和维护成本很高。FDA曾在2023年8月发表了针对三阴性乳腺癌双抗的研究，比较了2种不同形式双抗的生物学活性。一种具有2个针对每种抗原的结合位点的双可变结构域免疫球蛋白（dual variable domain-Ig,DVD-Ig），另一种针对每种抗原具有1个结合位点的杆臼结构（knobin-hole,KIH）。研究发现，用于分析的细胞类型（MDA-MB-231和BT-20细胞）以及抗肿瘤活性的测定会影响检测能力，如一种分析法（细胞活力）可检测2种细胞系的抗肿瘤作用，但另一种分析法（台盼蓝细胞增殖）不够灵敏，无法检测BT-20细胞的抗肿瘤作用[17]。因此进行双抗的生物学活性研究时，开发合适的细胞系以及灵敏的检测方法非常重要。2.5 不溶性微粒（sub-visible particle,Sv P）问题目前开发的双抗产品浓度均较高，可能会引发Sv P升高。Sv P形成原因很多，包括分子的固有特性、处方、制剂工艺及贮存/稳定性等均可影响Sv P，分析方法也会影响Sv P检测结果的可靠性。已知可逆的蛋白质-蛋白质（自缔合）相互作用会导致光散射增加，可能会影响聚集和乳光度[18]，观察到澄清度/乳光度升高。蛋白质聚集，尤其是在高浓度时，可能会导致制剂中的Sv P计数升高。SIMLER等[19]报告了蛋白质聚集与Sv P形成之间的机制途径。抗体处方中常添加聚山梨酯80或聚山梨酯20保护蛋白质免受搅拌强制降解，已知聚山梨酯20降解可能因形成不溶性游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）微粒导致Sv P[20]。抗体制剂工艺多存在搅拌、冻融环节，可能会影响Sv P形成。有研究报道，抗体冻融时蛋白质的疏水基团和亲水基团会发生一定程度上的反转，液体中的气泡在冻融过程中可能会溶解和逸出，导致蛋白质结构的变化，易于聚集形成Sv P[21,22]，此时需结合冻融研究、运输稳定性研究证实。根据《美国药典》<787>、《欧洲药典》2.9.19和《中国药典》三部（2020版）通则0903要求，推荐采用光阻法、显微计数法检查Sv P，如果光阻法测定结果不符合规定或供试品不适于用光阻法测定时，应采用显微计数法进行测定，并以显微计数法测定结果作为判定依据。对于滴眼液，应按照《美国药典》<789>规定，限度更严。两种分析方法的变异性可能会影响观察到的Sv P水平。针对抗体药物储存时出现Sv P，应采用多种分析方法，如显微镜、FTIR光谱、拉曼光谱、Energy Dispersive X-Ray Spectroscopy(EDX光谱）、流动成像等，尽可能对Sv P进行鉴别，分析Sv P的组成，形成原因，是否随储存时间而增加等，进行必要的安全性评估，并采用合理的控制策略进行控制（如使用前过滤、替换为纯度更高的辅料等），原则上应符合现行药典及同类品种的要求。3 结语随着双抗平台技术的发展，双抗药物免疫原性和链错配问题等逐渐被克服，贝林妥欧单抗、艾美赛珠单抗等10余个双抗药物已在全球获批上市，用于治疗癌症、血液系统、眼科、免疫系统疾病等。双抗药物的开发仍在快速发展中，是当下制药行业最热门的新药研发方向之一，国内外药企研发速度正在逐渐缩短差距。本文基于对多个双抗品种的审评经验，结合文献调研等对双抗药物的国内外注册申报现状进行了分析，并汇总探讨了双抗审评中常见的技术问题，以期通过研发生产方与监管方共同努力，强化技术和共性问题交流，为患者提供安全有效、质量可控的新型双抗药物。参考文献［1］ NISONOFF A，WISSLER F C，LIPMAN L N. 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适应症	最高研发状态	国家/地区	公司	日期
结肠癌	临床3期	美国	Mast Therapeutics, Inc.	2006-05-01
结肠癌	临床3期	黑山	Mast Therapeutics, Inc.	2006-05-01
结肠癌	临床3期	塞尔维亚	Mast Therapeutics, Inc.	2006-05-01
转移性结直肠癌	临床3期	美国	Mast Therapeutics, Inc.	2006-05-01
转移性结直肠癌	临床3期	黑山	Mast Therapeutics, Inc.	2006-05-01
直肠癌	临床3期	美国	Mast Therapeutics, Inc.	2006-05-01
直肠癌	临床3期	黑山	Mast Therapeutics, Inc.	2006-05-01
直肠癌	临床3期	塞尔维亚	Mast Therapeutics, Inc.	2006-05-01
结直肠癌	临床3期	欧洲	Mast Therapeutics, Inc.	-
乳腺癌	临床2期	阿根廷	Mast Therapeutics, Inc.	-

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研究	分期	人群特征	评价人数	分组	结果	评价	发布日期


ASCO2008	临床2期	晚期乳腺癌	-	5,10 methylenetetrahydrofolic acid + fluorouracil	醖鹽網構鏇製醖鹽觸製(構鏇選獵鬱齋廠鏇艱遞) = 觸膚鹹壓壓鹽鹽範製網獵顧範顧廠範蓋餘艱網 (鑰鬱築蓋膚獵襯築鏇鑰 )	-	2008-05-20
ASCO2006	临床2期	转移性结直肠癌一线	50	5,10-methylenetetrahydrofolic acid + 5-fluorouracil	廠襯獵艱鏇艱衊網築選(淵糧構衊夢膚鹹齋顧蓋) = median survival has not been reached 製壓鏇製範鏇觸構網網 (齋築齋選壓遞繭鹹製壓 )	-	2006-06-20