Cycloserine

摘要：在当前形势下，免疫接种至关重要，因为它能保护我们免受传染病原的侵害。尽管疫苗学领域取得了巨大成功，但我们不仅需要开发安全、理想的疫苗来对抗致命感染，还需要在部分或不一致的保护方面提高现有疫苗的质量。通常，亚单位疫苗被认为是安全的，但它们大多无法产生最佳免疫反应。因此，通过新型佐剂的配方改进疫苗的潜力有很大的可能性，这些新型佐剂能有效提供更强的免疫力。与新型佐剂配方的疫苗也可能有助于对抗抗原多样性高的病原体。然而，由于安全性和毒性的限制，很少有人类兼容的佐剂获得批准。在这篇综述中，我们主要关注新疫苗和改进疫苗的需求；佐剂的定义和需求；人类兼容佐剂的特性和机制；疫苗佐剂的现状，粘膜疫苗佐剂和临床开发中的佐剂；以及未来的发展方向。 1.引言 疫苗的发明被认为是医学研究的一项胜利。免疫接种不仅阻止了儿童期间的感染传播，而且为某些疾病提供了终身保护。然而，科学界在开发针对许多传染病的理想疫苗方面仍面临挑战，例如，瘟疫、结核病、疟疾、人类免疫缺陷病毒（HIV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2），因为存在免疫学障碍，如对疫苗的免疫反应不足和免疫记忆弱。除了这些障碍，疫苗安全问题，如在患有罕见遗传疾病的人群中产生的不良反应，由白喉和破伤风类毒素以及全细胞百日咳（DTwP）引起的系统性和局部反应原性，以及由白喉和破伤风类毒素以及无细胞百日咳（DTaP）显示的逐渐减弱的免疫力，被认为是不可接受的，这进一步增加了解决新兴或再出现疾病威胁的疫苗问题的挑战。这些挑战需要新的战略，以帮助理解免疫接种的免疫反应，并引入新的方法来在不牺牲质量和安全的情况下诱导强大的免疫力。全球科学界最近见证了重大的疾病爆发，即2003年的SARS、2009年的H1N1流感大流行、2014年的埃博拉病毒、2017年的马达加斯加瘟疫、2018年的印度尼帕疫情，以及迄今为止最引人注目的COVID-19大流行。2014年，埃博拉疫情在发达国家造成了巨大恐慌，因为在西非国家的死亡率相当高。这些事件迫使科学界不仅要保持警惕，而且要开辟新途径，追求新战略，以阐明开发针对这些新兴病原体的有效疫苗的机制性方法。目前，正在进行的COVID-19大流行严重影响了全球人类生活，破坏了全球经济；因此，广大科学界正忙于开发针对SARS-CoV-2的有效和安全疫苗。目前，灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗是人类可获得的四种疫苗类型。减毒活疫苗包含可以在宿主体内复制的整个病原体，并诱导强烈的免疫反应。减毒活疫苗已被观察到对脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎和风疹（MMR）、水痘、流感、轮状病毒和黄热病最有效。通过热或化学物质灭活的全病原体疫苗（灭活脊髓灰质炎（Salk）和甲型肝炎）是非传染性的，并且大多是安全的。灭活（杀死）疫苗已被观察到诱导弱和短期免疫力，因此需要加强剂来实现完全保护。研究发现，印度的DTwP是一种获得许可的灭活疫苗，它绕过了逐渐减弱的免疫力，并显示出长期保护效果。与灭活全病原体疫苗类似，纯化或重组亚单位疫苗不包含病原体的活成分，但它们只包含病原体的抗原部分，这使它们与前者不同。亚单位疫苗抗原的免疫原性较差，因此需要添加成分以增强其保护性免疫力。亚单位疫苗有时使用表位，这些表位被显示为识别和与T细胞或免疫球蛋白相互作用。亚单位疫苗通常在毒性和反应原性方面是安全的，因为亚单位疫苗包含纯化或重组抗原，而不是整个细胞。有一些非常成功的亚单位疫苗例子，如乙型肝炎病毒（HBV）、流感病毒（注射）和百日咳疫苗。开发的亚单位疫苗被发现免疫原性较差，因此，需要多次加强剂和适当的佐剂化来增强其保护潜力。最近，在COVID-19大流行期间，mRNA疫苗（核酸疫苗）被发现发挥了重要作用。这些基于mRNA的疫苗通过指导抗体的产生提供良好的免疫反应，从而预防严重并发症。 2.对佐剂的需求 佐剂最初由法国科学家加斯顿·拉蒙（Gaston Ramon）在1920年发现，他的研究结果表明在疫苗中加入铝盐可以增强其潜力。“佐剂”一词源自拉丁语单词adjuvare，意为“帮助”。佐剂通常不具有免疫原性，但它们与给定疫苗一起调节免疫反应，从而不仅减少所需的疫苗剂量，还延长免疫记忆。通常，疫苗与合适的佐剂配方，以增强对接种疫苗抗原的免疫反应，评估阻止传染的潜力。佐剂的另一个重要作用是指导体液和细胞介导的免疫反应，以产生针对病原体的特异性免疫。 目前，佐剂被利用于（a）增强对给定疫苗的免疫反应，增强抗体反应和接种疫苗的接受者数量；（b）增强因年龄、疾病或治疗干预而反应减弱的个体的血清转化率，例如，使用佐剂MF59与流感疫苗一起，以改善/增加老年人的反应；以及（c）减少疫苗抗原的剂量和加强剂的数量，因为佐剂的能力，即使用相当低量的疫苗抗原也能产生相似的反应，可能在疫苗生产设施有限且公众普遍急需免疫的地区至关重要。对需要多次加强剂的疫苗的需求在全球范围内提出了值得注意的挑战。佐剂可以减少提供完全保护所需的加强剂数量（图1）。 图1 疫苗佐剂及其益处的示意图。 将疫苗与佐剂配方的另一个原因是获得免疫反应的质量调节。佐剂在未充分发展的疫苗中被更广泛地使用，以调节疫苗抗原在没有佐剂的情况下不能够有效刺激的免疫反应类型。佐剂在临床前和临床研究中被使用（i）以提供功能适当的免疫反应（例如，体液或细胞，Th1、Th2和Th17）；此外，已观察到平衡的Th1/Th2/Th17反应增加了T细胞反应的持续时间并延长了小鼠的存活时间；（ii）增强长期记忆细胞（例如，T细胞记忆）；（iii）提供在大流行中可能至关重要的初始快速反应；以及（iv）修改反应的广度、特异性或亲和力（图1）。在这篇综述中，我们的主要目标是关注使用各种佐剂调节免疫反应。 3.特性和作用机制 3.1.铝盐（明矾） 铝盐已在临床上获批，是人体疫苗中最广泛使用的佐剂。这些佐剂由用于吸附疫苗抗原的磷酸铝和氢氧化铝沉淀物组成。Brenntag Biosector、Chemtrade和SPI Pharma™是一些准备这些配方的制造商。Alhydrogel®、Rehydragel™和AdjuPhos®是市场上可用的明矾的商品名。 作为佐剂的铝盐已在疫苗研究中使用了80多年，通常刺激Th2类型的免疫反应。明矾已被批准作为许可的人类疫苗的成分，即b型流感嗜血杆菌（Hib）、甲型和乙型肝炎病毒、破伤风、脑膜炎球菌病毒、人乳头瘤病毒（HPV）、白喉，以及最近的SARS-CoV-2。明矾作为佐剂的作用机制几乎已知，现在清楚的是，沉积物形成不是明矾作为佐剂活性的必要步骤。明矾作为佐剂主要唤起先天免疫。明矾刺激B细胞分化以增加抗体产生。也有充分记录表明，明矾在小鼠中刺激Th2类型的免疫反应，但在人类中，几乎所有与明矾佐剂配方的疫苗抗原都诱导混合类型的反应，即Th1和Th2。明矾触发NLRP3炎症体在体外用脂多糖（LPS）对巨噬细胞和树突状细胞（DCs）进行初步培养后表达白介素（IL）-1b。然而，在体内，明矾的佐剂性并不支持数据。已观察到明矾刺激Th2类型的免疫反应，并产生IL-4、IL-5、IgG1和IgE。明矾执行的另一项功能活动是通过使用DCs进行肌动蛋白介导的吞噬作用，从而启动信号级联，导致激活两个激酶蛋白（Src和Syk），进而动员Ca2+，最终激活转录因子NFAT（钙调磷酸酶-活化T细胞核因子），导致产生IL-2。此外，明矾通过激活补体蛋白级联来介导其佐剂性。作为佐剂的明矾由于其安全性、疫苗抗原稳定化以及调节高产量和持久抗体滴度而具有很高的优势。与明矾佐剂配方的疫苗不能被过滤灭菌、冻干或冷冻。 3.2.水包油乳液形式的佐剂（油包水） 3.2.1.MF59 和 AS03 佐剂 MF59 是一种非常安全有效的油包水乳液，由角鲨烯油制成。与弗氏佐剂不同，角鲨烯更容易被代谢，并且经过高度纯化，用于疫苗开发。最近，MF59 被 Fluad™（Seqirus，墨尔本，澳大利亚）授权作为一种重要的流感疫苗成分，用于老年人，并且后来也成功地用于婴儿和儿童。除此之外，它还被授权用作针对 H1N1 的大流行疫苗，用于儿童、婴儿和孕妇。从研究结果来看，含有 MF59 佐剂的三价灭活流感疫苗（TIV）在婴儿中引发了比不含 MF59 佐剂的流感疫苗更强的体液和细胞免疫反应。MF59 佐剂的配方显著调节了流感疫苗在婴儿中的弱效性。随后，与 MF59 佐剂配方的乙肝疫苗被观察到比氢氧化铝诱导了强 100 倍的免疫反应。与其他佐剂类似，MF59 的作用机制尚未完全阐明。MF59 佐剂的有效性并不依赖于在接种部位形成储库，因为 MF59 的半衰期很短。然而，MF59 佐剂显示出了引发强烈 IgG 和细胞介导免疫反应的潜力。此外，MF59 可以诱导单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞（DCs）表达和分泌趋化因子，即 CCL4、CCL2、CCL5 和 CXCL8，这些趋化因子招募更多的白细胞重新摄取更多的疫苗抗原。最后，这种分化将免疫细胞转化为抗原呈递细胞（APCs）。此外，这些 APCs 迁移到淋巴结，在那里它们诱导适应性免疫反应，如图 2 所示。 图2 MF59佐剂及其作用机制。在注射部位，MF59佐剂激活的巨噬细胞分泌趋化因子，这些因子刺激并招募免疫细胞。分化将免疫细胞转变为抗原呈递细胞，以激活B细胞和T细胞，从而产生强烈的体液和细胞免疫反应。 AS03 也是一种油包水乳液佐剂，包括角鲨烯、α-生育酚和聚山梨醇酯 80。将 α-生育酚纳入 AS03 配方使其与其他油包水乳液佐剂不同。AS03 最初是与抗疟疾疫苗一起使用的。最近，这种佐剂已被用于人类流感疫苗接种。最近的临床试验表明，含有 AS03 佐剂的流感疫苗引发了强烈的免疫反应。此外，含有 AS03 佐剂的疫苗也被发现在婴儿中诱导了强烈的免疫反应。此外，AS03 通过刺激核因子κB（NF-kB），一种促炎细胞因子，和趋化因子来唤起免疫。随后，它招募了如单核细胞和巨噬细胞等免疫细胞。将这种佐剂应用于大流行疫苗配方的优势在于其能够用更低剂量的疫苗抗原产生强烈的体液免疫反应，即每株 3.75 或 7.5 毫克，与传统的三价灭活流感疫苗中每株 15 微克相比。自 2009 年以来，约有 470 万剂 AS03 佐剂的 A(H1N1) 疫苗已用于儿童接种。 3.2.2.军用脂质体配方 这种配方由美国军方开发，由胆固醇和含有饱和磷脂和单磷酰脂 A（MPLA）的脂质体组成。军用脂质体配方（ALF）有改进版本，即吸附到氢氧化铝上的 ALF（ALFA）、含有 QS21 皂甙的 ALF（ALFQ）和吸附到氢氧化铝上的 ALFQ（ALFQA）。研究发现，用 ALFA 佐剂的疟原虫周孢子蛋白疫苗候选物提供了足够的体液和细胞免疫反应。沃尔特里德陆军研究所（WRAIR）疟疾疫苗分支开发并测试了 FMP013（法氏疟疾蛋白-013）和 FMP014（自组装蛋白纳米颗粒）SAPN（两种新的合成疟疾抗原）与 ALFQ 佐剂的保护效力。 用 ALFA 佐剂的重组 gp120 诱导了针对不同亚型 HIV-1 的交叉反应性抗体。关于 ALF 和 ALFQ 与重组 HIV-1 包膜 gp140 蛋白的配方，ALF 诱导了主导的 Th2 型免疫反应，而 ALFQ 诱导了更平衡的 Th1 和 Th2 型免疫。此外，ALFQ 佐剂激活先天免疫反应，上调 APOBEC3（载脂蛋白 B mRNA 编辑酶催化多肽样家族），一种抗 HIV 蛋白，并维持促炎环境，结果，允许 HIV-1 感染的 MDMs（单核细胞衍生的巨噬细胞）变得能够限制 HIV-1 感染。 3.2.3.病毒体（脂质和糖蛋白） 病毒体具有佐剂系统的特性，以其可生物降解和无毒性而闻名。通常情况下，病毒体不会产生抗病毒体抗体。病毒体是小型球形单层脂质膜囊泡（150纳米），嵌入有病毒包膜蛋白，如流感病毒的神经氨酸酶和血凝素。这些蛋白被整合到磷脂酰胆碱双层脂质体中。这些制备的病毒体不包含核衣壳，包括源病毒的遗传物质。这些蛋白促进病毒体膜与细胞受体结合，介导与免疫细胞的pH依赖性融合。因此，病毒体将其内容物，即疫苗抗原（s），直接运送到目标细胞，引发抗原特异性免疫反应，同时携带的免疫原性较弱。病毒体是类病毒颗粒，允许疫苗抗原呈现给主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类，以引发B细胞和T细胞免疫反应。病毒体佐剂系统引发的免疫反应类型取决于抗原表位是在病毒体外还是体内。有一些已建立的例子，如PeviPRO™，它诱导体液免疫反应。抗原在细胞的内体中被降解，因此主要产生MHC II抗原呈递。PeviTER™配方的抗原不仅引发CD4+和CD8+ T细胞免疫反应，还产生强烈的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。病毒体佐剂系统通过MHC I途径呈递疫苗抗原，因为抗原自然地被送入抗原呈递细胞（APC）的细胞质中。批准的疫苗如Epaxal®（用于甲型肝炎）和Inflexal®V（用于流感）已成功证明病毒体的卓越性能。迄今为止，这些甲型肝炎（Epaxal®）和流感（Inflexal®V）疫苗已被授权在45多个国家使用，至今已有超过1000万人接种疫苗。这种新一代疫苗提供了额外的好处，因为它们即使在免疫抑制患者和婴儿中也有效。此外，它们具有高安全性，因为嵌入的病毒不会复制。据我们所知，病毒体不再被授权用于人类。 3.2.4.AS04（明矾吸附TLR-4激动剂） 为了开发新型佐剂系统，已经使用了以不同Toll样受体（TLR）激动剂吸附在明矾上的铝盐。佐剂系统04（AS04）已被批准用于与HPV（Cervarix）和HBV（Fendrix）疫苗的配方中。这种佐剂系统包括明矾和主要构成3-O-去酰基-4'-单磷脂A（MPLA）的脂多糖（LPS）来自 Salmonella minnesota。有文件记录MPLA保留通过与TLR-4相互作用刺激先天免疫的能力。它进一步导致诱导NF-kB信号传导和产生促炎细胞因子和趋化因子，招募免疫细胞到疫苗接种地点和引流淋巴结。在疫苗接种后的几小时内观察到单核细胞和DCs数量的增加，它们相互作用以刺激抗原特异性T和B细胞产生强烈的细胞和体液免疫反应。明矾与MPLA没有显示出协同效应；然而，MPLA和AS04的比较研究表明，明矾延长了MPLA在疫苗接种地点引起的细胞反应。因此，研究发现AS04佐剂通过刺激TLR-4诱导先天免疫反应。AS04佐剂的HBV疫苗在人类中引发先天免疫反应。与明矾佐剂的HBV免疫血清相比，在AS04佐剂的HBV免疫血清中观察到IL-6和C反应蛋白的水平升高。然而，报告的HBs Ag特异性T细胞和抗体水平高于明矾配方的HBV疫苗所诱导的水平。与明矾佐剂配方的相同疫苗相比，AS04配方的HBV和HPV疫苗引发更强的体液免疫反应，这表明TLR4激动剂MPLA佐剂对人类使用的重要性。 3.2.5.RC-529佐剂 LPS的连续酸和碱水解产生MPLA，已知MPLA保留LPS的各种免疫刺激功能。体外研究表明MPLA激活并刺激DCs的成熟，并上调人类白细胞抗原-DR、CD80、CD86、CD40和CD83。MPLA也已知诱导Th1和Th2细胞因子的表达并增强抗原特异性Tc细胞反应。MPLA是一种批准的佐剂，已用于乙型肝炎疫苗配方中。在此之后，合成模拟物如氨基烷基葡萄糖胺4-磷酸盐（AGPs）被表征，观察到它们激活先天细胞如巨噬细胞、DCs、B细胞和APCs。一种这样的AGP化合物RC-529，观察到通过TLR-4激活信号并上调细胞表面的共刺激分子，包括细胞因子和趋化因子。RC-529在临床试验中被发现是一种有效的佐剂，健康志愿者接受了针对乙型肝炎的疫苗配方。与明矾相比，RC-529在接受了疫苗配方的受试者中诱导了显著高水平的抗体产生。MPLA的合成模拟物RC-529在临床试验中被观察为安全有效。 4.粘膜疫苗佐剂 这些佐剂唤起宿主的先天免疫系统，帮助提供针对病原体的保护。使用活减毒或灭活病原体的全细胞基础疫苗通常包含内源性佐剂，如细菌细胞壁的产物及其基因组DNA/RNA。这些佐剂作为病原体相关分子模式（PAMPs），足以刺激适应性免疫。然而，亚单位疫苗通常缺失或无法诱导先天免疫反应，因此，包含佐剂对于提供成功的疫苗至关重要。大多数病原体通过鼻或口途径进入宿主。因此，有效的粘膜疫苗对于预防这类粘膜传播疾病至关重要。与肌肉注射/亚单位疫苗相比，粘膜疫苗提供了显著的好处，如低成本、非侵入性，以及最重要的是，传播血液传播感染的风险极低，尤其是对幼儿。然而，由于缺乏理想的粘膜佐剂，只有少数粘膜疫苗被批准用于人类。通常，粘膜佐剂有两个作用：首先，它们作为递送载体，其次，它们作为免疫刺激分子。然而，一些粘膜佐剂表现出免疫刺激剂和递送系统的双重特性，如壳聚糖及其衍生物。有文件记录粘膜佐剂可以刺激对成功粘膜免疫接种至关重要的保护性局部和系统免疫。此外，粘膜佐剂在提供针对远端和局部感染部位的保护方面发挥许多重要作用。例如，胞嘧啶-磷酸硫代鸟嘌呤（CpG）寡脱氧核苷酸作为通过鼻途径接种疫苗的有效粘膜佐剂，针对通过输血和性活动传播的病原体。此外，粘膜佐剂是对抗肿瘤免疫的强有力刺激剂。在众多粘膜佐剂中，TLR激动剂和突变型肠毒素是两种最具吸引力的类型，因为它们不仅有效，而且相对安全。迄今为止，细菌衍生的腺苷二磷酸（ADP）-核糖基化肠毒素是最有特色的粘膜佐剂。这类药物包括大肠杆菌热敏肠毒素（LT）、霍乱毒素（CT）以及LT和CT的突变体/亚单位。这些毒素刺激包括CTLs、Th1、Th2和Th17在内的抗原特异性细胞和体液免疫反应。最重要的是，这些佐剂在通过粘膜途径给药时刺激针对疫苗抗原的抗原特异性IgA抗体和持久记忆细胞。 5.热敏毒素/双突变热敏毒素粘膜佐剂如何工作？ 粘膜佐剂LT是一种84 kDa的聚合蛋白。这种佐剂保持AB5的活性形式，包含一个A亚单位和一个五聚体B亚单位。dmLT是其母分子LT的突变形式。佐剂dmLT在通过粘膜或肠道途径接种疫苗后，免疫调节针对疫苗抗原的系统和粘膜免疫反应。它可以简单地与疫苗抗原（s）在水缓冲液中配制。由于佐剂的双重方法，即免疫刺激特性和普遍细胞结合，疫苗抗原（s）的细胞摄取量增加了许多倍，这就是粘膜免疫被增强的方式。这是递送疫苗配方，特别是亚单位疫苗到难以接近的部位，特别是舌下（s.l.）、口服（p.o.）和经皮（t.c.i.）递送的最适宜方法。这些策略不仅无针头，而且显示出增强给药便利性和依从性的能力。此外，它降低了使用危险注射接种疫苗传播疾病的风险。dmLT佐剂唤起针对疫苗抗原的强烈Th17反应，并诱导IL-17，它主要在粘膜部位提供保护。IL-17的表达有助于通过诱导B细胞分化为IgA分泌细胞，增加粘膜组织腔中分泌sIgA抗体的运输。dmLT佐剂还在肠道接种后刺激粘膜免疫反应。然而，这些研究只在动物模型中进行了测试，这种佐剂在人类中的使用还有待确定。LT、CT及其相关突变体在最近过去被很好地表征。LT或CT佐剂的活性形式AB5的亚单位具有独特的功能。亚单位B与受体结合并导致进入细胞。在粘膜接种疫苗期间，B亚单位有助于在整个粘膜部位运输疫苗抗原。亚单位A负责与ADP-核糖基化因子（ARFs）结合，并对Gsa进行ADP核糖基化，导致环磷酸腺苷（cAMP）的积累。然后，LT刺激树突状细胞（DCs）的激活、细胞因子的表达和Th17反应的刺激。也有文件记录，单独使用LT的亚单位A唤起混合Th1/Th2/Th17类型的免疫反应，但影响比LT的活性AB5形式弱。亚单位B的使用唤起Th2/T调节细胞（Treg）偏向的反应。然而，毒性一直是这些佐剂的关注点。 6.dmLT佐剂如何诱导免疫系统？ 图3描述了免疫级联反应。（I）在接种疫苗部位，疫苗抗原被摄取后，激活先天免疫系统。上皮细胞分泌细胞因子和趋化因子，如IL-8和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）。（II）树突状细胞被招募到接种疫苗部位并激活以进行抗原处理和呈递给主要组织相容性复合体（Ag-MHC）。CD80和CD86的上调和极化细胞因子的分泌，例如IL-1、IL-23、IL-6和G-CSF，发生。（III）携带疫苗抗原的活化树突状细胞然后迁移到次级淋巴器官，并促进抗原特异性T辅助细胞和B细胞分化为分泌IgA和IgG抗体的浆细胞。最后，赋予混合Th1/Th2/Th17类型的免疫反应，特别是强烈刺激Th17细胞和粘膜归巢标记。有文件记录，Th17细胞是免疫的重要组成部分，促进次级淋巴器官中生发中心的形成，并增强IgA抗体分泌。 由LT/dmLT佐剂刺激的树突状细胞(DCs)因激活caspase 1炎症体和随后的趋化因子和细胞因子如IL-1和IL-23的表达，引发了非常高的Th17类型的免疫反应。科学研究表明，用LT激活的小鼠DCs诱导了IL-1b的表达，这对于Th17细胞的产生至关重要。用dmLT配方的疫苗抗原重新刺激免疫个体的人外周血单核细胞(PBMC)增强了IL-17A和IL-13的表达。总之，在用dmLT配方的疫苗抗原免疫后，发生了一系列明确的事件，这是一个有效的APCs和疫苗免疫的刺激剂。 图3 dmLT佐剂的作用机制。(I) 在接种部位，dmLT佐剂刺激先天免疫反应，激活的上皮细胞分泌IL-8和G-CSF。(II) 树突状细胞（DCs）在注射部位被激活并被招募，它们处理并呈递抗原。它还上调共刺激分子，即CD80和CD86，并刺激IL-1、IL-6、IL-23和G-CSF的表达。(III) 激活的DCs迁移到次级淋巴器官，在那里它们刺激抗体分泌浆B细胞的分化和抗原特异性Th细胞的产生。总体而言，赋予了强烈的Th17免疫反应。Th17细胞被确定为在免疫中至关重要，并在次级淋巴器官中刺激生发中心的形成以及增强IgA分泌。 7.作为粘膜疫苗佐剂的TLR激动剂 与基于TLR配体的佐剂配方的疫苗触发并激活先天免疫反应，有助于增强疫苗候选物所赋予的保护潜力。基于TLR的佐剂需要额外的适配蛋白MyD88，它刺激APCs和B细胞进行抗体产生。此外，MyD88信号也诱导生发中心的形成，这对于产生抗体分泌细胞至关重要。基于TLR配体的佐剂包括依赖TLR9的佐剂CpG DNA（CpG）和依赖TLR2的佐剂Porin B（PorB），它们都需要MyD88来适当刺激APCs。CpG是未甲基化的细菌DNA基序，而PorB是脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白。有文件记录TLRs在APCs上表达，包括巨噬细胞、DCs和B细胞。因此，使用TLR激动剂作为疫苗制备中的佐剂的主要目的是刺激这些细胞以赋予强大的免疫反应，连接先天和适应性免疫。各种TLR4配体不仅已在临床前研究中使用，而且已被食品药品监督管理局批准用于临床试验，如卡介苗（BCG）和MPLA。作为TLR4的已知配体的LPS，被用作体内急性炎症的诱导剂，用于小鼠模型中的肿瘤回归。据报道，TLR4激动剂，如第二代脂质佐剂SLA-SE，通过在小鼠模型中肌肉免疫接种肠毒素大肠杆菌（ETEC）疫苗抗原，促进粘膜抗体的增加。为了测试L-pampo的效果，一种TLR1/2和TLR3激动剂的组合用于SARS-CoV-2雪貂模型，引发了强烈的体液和细胞介导的免疫反应。最近，一种口服SARS-CoV-2疫苗（VXA-CoV2-1），目前正在进行III期临床试验，使用了双链RNA佐剂，主要针对TLR3并有助于通过该受体激活DC人群。这项研究中使用的佐剂不仅扩大了模式识别受体（PRR）目标范围，而且对于口服疫苗来说，是有前途的代替类毒素佐剂的选择。在我们看来，这种在粘膜免疫中发现的佐剂的进步可以为对抗病原体株提供新的希望，并能实现成功的疫苗设计。 8.佐剂和临床试验的现状 安全性一直是开发新型疫苗佐剂过程中的重大关切；因此，许多佐剂已在临床前和临床研究中进行了全面评估。非常常用的佐剂，例如氢氧化铝，已在美国获得批准。含氢氧化铝的疫苗在70多年前获得批准。与乳化剂MF59配方的流感疫苗于1997年获得许可并在欧洲上市。此外，与流感疫苗配方的乳化剂AS03于2009年获得许可。作为甲型肝炎和流感疫苗的重要组成部分，脂质体佐剂于2000年获得批准。此外，含有MPLA吸附到氢氧化铝的组合佐剂AS04已在欧洲获得批准，并在美国获得许可。已批准用于人类的佐剂列在表1中。 尽管提供了许多值得注意的好处，如降低成本、高产量和更安全的高纯度疫苗抗原，但大多数由于缺乏内在的免疫刺激因子如各种PAMPs，提供了较弱的疫苗潜力。了解免疫细胞受体如TLRs是如何被PAMPs刺激的，即革兰氏阴性细菌的LPS，以及适应性免疫反应是如何由先天免疫反应协调和调节的，是至关重要的。有报道称颗粒物质刺激先天免疫信号。因此，为了刺激先天免疫细胞上特定的受体，这些受体可以轻易地感知危险信号和细胞应激，已鉴定出佐剂。不幸的是，由于高反应原性和耐受性差，早期开发的佐剂无法达到临床发展。由于HIV和疟疾疫苗的特点，出现了不同佐剂组合是更好的选择以协同促进广泛的免疫反应，即体液和细胞反应的理由。这种佐剂的组合涉及一个传递系统，即脂质体、氢氧化铝或乳化剂，以及一个自然免疫刺激免疫增强剂，如细菌MPLA、病毒dsRNA或植物Quillaja皂甙。新一代佐剂大多被称为免疫刺激剂或免疫增强剂，已在人类中进行了测试，并正在进行临床试验，列在表2中。这些新一代佐剂系统是基于现有的药物传递模型和已建立的药物原则设计的。因此，传递系统主要在免疫信号激活上执行，可以局部化并集中在配方疫苗抗原上。GSK的佐剂系统（AS）是这种进步的最好例子，以制造有效的疟疾疫苗。 传递系统对疫苗开发有多重要？在GSK两种替代疫苗的人类临床试验中提到并强调了这一点。两种疫苗都含有相同的免疫增强剂，但它们的配方不同。含有AS01佐剂系统（脂质体配方）的疫苗比含有相同成分的AS02佐剂系统（乳化剂配方）的疫苗提供了更好的保护。因此，疫苗候选物RTS,S与佐剂系统AS01配方，这个例子证明了两种免疫增强剂的组合是必要的。佐剂系统AS01包含MPLA和皂甙QS-21。研究表明，当这两种免疫增强剂（MPLA和QS-21）在脂质体中配方时，它们协同工作并引发先天免疫反应，进一步增强适应性免疫反应。AS01佐剂系统刺激人类对各种疫苗抗原的强大T细胞免疫反应的能力是通过这种独特的免疫增强剂组合，例如MPLA和QS-21所赋予的协同效应来阐明的。这些发现为开发潜在的佐剂系统开辟了大门，并提供了新的途径。 大多数佐剂作为候选疫苗或已许可疫苗的理由从临床研究收集的数据中变得清晰。这些佐剂通常被认为能够非常迅速地在免疫部位刺激先天免疫反应，并及时将刺激的免疫细胞排入淋巴结，这对于增强针对病原体的特异性适应性免疫至关重要。PAMP和危险信号通路的刺激，即TLR、caspase-1和溶酶体不稳定-Syk/Card9，不仅促进了效应细胞的招募，包括T细胞和B细胞，还促进了APCs的招募和激活。许多研究通过靶向耗竭激活的APCs证明这一步对于有效诱导疫苗抗原特异性T细胞非常重要。将产生的抗原特异性T细胞表型的类型将取决于先天免疫信号激活的性质。被刺激的皮质下巨噬细胞分泌的IL-18可能促进分泌IFN-g的CD4+ T细胞的发展。同样，被刺激的APCs分泌的IL-6或IL-12也可能促进滤泡辅助T细胞（TFH）的产生，这促进了B细胞分泌高亲和力IgG，例如流感免疫。含有TLR配体的佐剂系统可以通过刺激具有更好TCR亲和力的T细胞克隆的扩张来调节克隆排列和抗原特异性T细胞库的质量。 Novavax, Inc.开发了一种名为matrix-M的重要佐剂。它基于从Quillaja saponaria（皂树皮树）树皮中提取的皂甙化合物。目前，matrix-M佐剂正在与针对SARS-CoV-2的重组刺突（S）蛋白配方中使用。目前，这种疫苗配方（COVID-19疫苗）处于I期临床试验。matrix-M佐剂不仅诱导产生高中和抗体滴度，还诱导强大的T细胞免疫反应，并对各种冠状病毒株提供高保护效果（193–195）。Matrix-M也已在其他疫苗配方中使用，如目前处于IIb期的疟疾疫苗（R21/Matrix-M）和已达到I期的流感疫苗。观察到像Q-21这样的皂甙通过在引流淋巴结的皮质下窦巨噬细胞（SSMs）中激活caspase 1来诱导OVA特异性CTL反应和高抗体滴度，通过在内吞作用后破坏溶酶体激活酪氨酸蛋白激酶SYK。此外，像matrix-M这样的皂甙在激活先天免疫系统、节省疫苗剂量和诱导体液和细胞介导的免疫反应中发挥着关键作用。然而，这种佐剂的分子机制仍有待阐明。这种佐剂的作用机制可以通过使用系统疫苗学方法来定义。 目前，机制方法和理由与佐剂疫苗在人类中的有效性和可接受性相关。这些信息可能有助于提供如何在非临床模型和临床中对新佐剂系统进行评估和表征的协议，以进行面对面比较。最近的一项研究表明，五种不同的佐剂疫苗只影响了针对疫苗抗原的CD4+ T细胞的数量，但未能调节这些细胞表型的范围。因此，佐剂并不总是对所有抗原的免疫反应质量产生影响。通常，疫苗的有效性在很大程度上依赖于疫苗抗原本身以及保护所需的免疫力类型，例如HIV疫苗研究。 9.在COVID-19大流行期间使用佐剂和未来展望 迄今为止，我们已经对新一代佐剂的免疫学有了深刻的见解，这些见解可能对提供未来开发新型佐剂疫苗的途径非常有帮助，通过选择适当的佐剂和抗原组合。随着组学和系统生物学的出现，人们可以轻松阐明理想疫苗刺激的复杂人类免疫反应。通过这些研究，可以将独特的分子签名与新表征的疫苗进行比较。此外，还可以开发和推进兼容的动物模型，以评估潜在的佐剂疫苗。此外，在临床中，大多数分子分析是基于外周血样本和非人灵长类动物模型进行的，这允许评估对免疫接种的局部免疫反应，并为已经可用的外周血签名提供逻辑验证的机会。对于新一代佐剂的快速开发，非临床研究在连接临床解释方面总是发挥着关键作用。 佐剂主要由天然成分组成。当前技术不断发展，新佐剂的开发也在不断进步；不久的将来，含有合成成分的佐剂将取得重要进展。尽管经过批准的佐剂始终被视为未来宝贵的资产，但许多这些佐剂的关键成分都是从自然资源中开发出来的，可以被具有类似功能的合成分子所替代。目前正在对有潜力成为更有效的激活剂和激动剂的新分子进行表征。这些分子可以以低成本大量高效生产，因为它们可以被轻松纯化和评估，并且对内在的生物变异性不太敏感。此外，这些合成分子的大规模生产过程可能不太容易受到获取和提取天然成分所面临的众多困难和挑战的影响。然而，在用这些新佐剂候选物替代现有佐剂中的天然成分之前，应该在临床试验中解决对疫苗配方中这些新佐剂候选物的安全性和保护效力的担忧。如前所述，在过去的100年中，已经研究了一些有前景的佐剂候选物；然而，只有少数佐剂被批准用于人类。由细菌Acinetobacter calcoaceticus产生的复杂酰化多糖乳化剂可能是一个好候选物，因为它可以进行结构定制，并且具有乳化行为。我们发现乳化剂可以激活巨噬细胞，并显示出显著的佐剂活性，这通过特异性抗体滴度来确定。这种免疫反应的特点是免疫球蛋白G2a滴度高，与Th1反应一致。这种复杂聚合物所展示的显著免疫增强作用确立了乳化剂作为一种令人兴奋的新佐剂候选物。我们提出，通过操纵乳化剂的化学结构，我们可以探索PRRs和巨噬细胞激活的物理基础。在过去的几年中，我们对先天免疫信号有了深刻的理解和丰富的知识，这为关注具有更高潜力的佐剂靶点提供了新的途径，即TLR、干扰素基因刺激因子（STING）、视黄酸诱导基因I（RIG-I）、C型凝集素受体（CLRs）、核苷酸结合寡聚化结构域、富含亮氨酸的重复和Pyrin结构域（NLRP），以及干扰素诱导蛋白（AIM2）。此外，一些复杂的探索性佐剂概念已经开发出来，包括包含许多不同组分的多聚体配方。尽管在临床前研究中取得了令人鼓舞的结果，但这些佐剂在理想的预防性疫苗中几乎没有任何作用，但如果治疗性疫苗的出现，如果能够解决大规模生产、稳健性、可重复性问题等，可能会有额外的途径。尽管在佐剂方面取得了巨大的进步，但仍有一些值得注意的限制，例如无法在人类中刺激强烈的CTL反应。然而，为了刺激广泛和多样化的免疫反应，佐剂也可以在包含核酸和载体的初次/增强背景下使用。已经尝试使用初次/增强技术来开发针对HIV的有效疫苗，并且在用载体进行初次免疫后，正在评估佐剂疫苗抗原作为增强蛋白。因此，临床研究对于定义异种初次/增强设置的最佳组合至关重要。通过使用更好的方法来表征新开发的佐剂，可以解决几个基本问题，即通过阐明先天免疫特有的信号级联，这是支持特定疫苗潜力所需的。疫苗效力特定的快速及时刺激的影响是什么？先天免疫反应的信号途径之间是否存在冗余？是否可能通过更特定的刺激获得更好的结果？先天免疫效应器（如细胞-细胞相互作用和细胞因子信号）与适应性免疫效应器（如B细胞和T细胞）之间的确切时间和空间关联是什么？这些反应是否是时间依赖的，即疫苗抗原和佐剂在接种部位停留的时间，以及局部APC是如何被激活的？在人类群体中，佐剂的特定免疫反应如何受到生态因素和个体遗传倾向的影响？同时使用的药物和已经患病的个体对免疫接种有何影响？ 10.结论 免疫接种的最终目标是提供有效和持久的保护，以抵御各种传染病。这种免疫保护只能通过使用携带适当佐剂和抗原的疫苗配方来实现。佐剂是疫苗配方的重要组成部分，可以调节疫苗反应。早期的疫苗配方方法专注于单一类型的佐剂，即铝盐或乳液。然而，新的疫苗配方需要刺激明确定义的细胞和体液免疫反应。因此，为了引发强大的免疫反应，如体液和细胞免疫反应，迫切需要新的免疫增强剂或免疫刺激佐剂在疫苗配方中。粘膜佐剂dmLT是25年研究的成果。通过临床前和临床研究已经证明，dmLT是一种安全有效的佐剂，可以在适当的配方中诱导保护性免疫。需要关注一些未解决的问题，以改进dmLT佐剂，如抗原-佐剂组合的安全性和稳定性问题。dmLT所赋予的佐剂性和保护性免疫的诱导机制也值得进一步研究。已经建议dmLT可以促进婴儿的先天和适应性免疫反应。含有dmLT的疫苗制备已被发现对粘膜感染有效。已经得出结论，dmLT将有助于克服对其他整细胞或LPS基础疫苗（如霍乱、伤寒沙门氏菌和志贺氏菌疫苗）在经济欠发达国家的婴儿中的低反应性。我们预测，dmLT在婴儿疫苗制备中的使用将在未来非常有效。在最近的过去，我们已经在佐剂研究领域获得了许多见解；现在，我们可以选择一个合适的佐剂，而不是像免疫增强剂或其组合这样的经典佐剂，以增强疫苗效力。最近，铝盐、MF59、AS03、CpG和Matrix-M已经获得许可，并在全球范围内用于COVID-19疫苗制备。已经建议合成基因编码的刺突蛋白，无论是预融合稳定还是仅受体结合域，用于工程哺乳动物细胞、杆状病毒或植物细胞以生产重组蛋白，然后纯化、与佐剂结合并用作疫苗。在COVID-19疫苗制备期间，我们获得了与蛋白基疫苗结合使用许可佐剂的工业和临床知识，我们相信，基于这些方法的疫苗制备在未来将被良好耐受、有效，并且大量可用。此外，在COVID-19大流行期间使用RNA成熟和病毒载体创造疫苗开辟了新途径，以在未来为新出现的感染生产更有效的疫苗。最近完成的临床研究与新佐剂推荐在未来人类疫苗配方中使用一系列新的免疫增强剂或免疫刺激剂。这些新一代佐剂在不同组合中的可获得性将使成功疫苗的开发策略合理化。

摘要:免疫细胞治疗作为一种革命性的治疗方式，显著改变了癌症护理。这是一种专业的免疫疗法，利用活的免疫细胞作为治疗癌症的疗法。与传统药物不同，细胞疗法被认为是“活药”，这些产品目前是定制的，需要先进的制造技术。尽管嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在治疗血液恶性肿瘤方面受到了行业的极大关注，但其在治疗实体瘤方面的有效性常常受限，导致替代性免疫细胞疗法的出现。肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）细胞疗法、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）细胞疗法、树突状细胞（DC）疫苗和DC/CIK细胞疗法旨在利用身体的自然防御机制来定位和消除癌细胞，通常具有较少的副作用或风险。另一方面，如嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞、T细胞受体（TCR）-T、嵌合抗原受体-自然杀伤细胞（CAR-NK）或CAR-巨噬细胞（CAR-M）等细胞疗法通常使用自体干细胞、同种异体或异种细胞，或基因修饰细胞，需要更高水平的操作，被认为是高风险的。这些高风险细胞疗法通常在肿瘤靶向和信号传导方面具有特殊特性，触发新的抗肿瘤免疫反应。最近，在抗肿瘤机制和细胞疗法产品设计的基本和临床研究以及技术创新方面取得了显著进展。随着技术的迅速整合和高创新格局，关键的未来发展方向已经出现。为了满足细胞疗法技术进步治疗癌症的需求，我们在本研究中全面系统地调查了免疫细胞疗法的技术创新和临床进展。基于免疫细胞疗法的治疗机制和方法学特点，我们分析了这些疗法的主要技术优势和临床转化风险。我们还分析和预测了应用前景，为相关企业提供必要的信息，以便他们做出关于研发方向选择的明智决策。 1.引言 癌症是一种利用多种逃逸机制来躲避抗癌免疫的全身性疾病，并且显著改变整个免疫系统的功能和组成。抗癌治疗的演变跨越了一百多年，其效果和特异性不断提高，旨在消除癌细胞的同时尽量减少对健康组织的损害。为了实现这一目标，免疫细胞治疗在现有方法中脱颖而出，成为了一种改变游戏规则的解决方案。2017年，食品药品监督管理局（FDA）批准了两种嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞疗法，即Kite Pharm的axicabtagene ciloleucel（Yescarta）和Novartis的tisagenlecleucel（Kymriah），用于治疗淋巴瘤。这些批准标志着抗癌治疗加速发展的一个重大里程碑。免疫细胞治疗的基本概念是通过外部供应具有所需功能的细胞来增强免疫反应，以帮助患者对抗癌症。它不仅重新激活了现有的免疫反应，还推动了新的免疫反应加入到抗肿瘤努力中。免疫细胞治疗的反应通常涉及多种免疫细胞类型的激活和协作，包括抗原呈递细胞，如树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，T淋巴细胞（T细胞）和自然杀伤（NK）细胞。肿瘤负担的免疫系统不仅在免疫细胞数量上失衡，而且在调节抗癌免疫反应的分子和信号通路上也表现出功能异常。因此，精确施用适当的治疗策略是必要的，以防止免疫细胞治疗的效果不佳。 根据癌症类型及其机制，免疫过程的各个领域为治疗干预提供了途径。方法包括，例如，提取和扩增具有预先癌症识别能力的免疫细胞（例如，肿瘤浸润性免疫细胞），外部分化有效的细胞类型[例如，细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞]，以及基因修饰细胞以实现特定识别和肿瘤细胞消除[例如，T细胞受体（TCR）工程，嵌合抗原受体（CAR）]。在本综述中，我们将讨论最新的免疫细胞治疗，总结应用于实现和优化这些治疗类别的策略，并提供未来的展望。 2.用低风险免疫细胞治疗癌症 低风险免疫细胞治疗旨在使用患者自己的免疫细胞来消除癌细胞。需要注意的是，“低风险”强调的是细胞治疗领域内某些治疗相对更安全、副作用较少，属于再生医学或先进治疗药物产品（ATMPs）。低风险免疫细胞治疗包括四种关键技术：肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）疗法、CIK细胞疗法、DC疫苗和DC/CIK细胞疗法。为了更全面地理解这些方法，必须深入研究促进这些细胞治疗的基本机制和临床进展。 2.1.TIL细胞治疗 TILs是存在于实体肿瘤微环境（TME）中的天然单核细胞，包括肿瘤内肿瘤浸润性淋巴细胞（iTILs）和基质肿瘤浸润性淋巴细胞（sTILs）。与iTILs相比，sTILs主要是效应记忆T细胞，更容易被检测到。作为一群已经接触过肿瘤组织的异质性淋巴细胞，TILs“预训练”攻击癌细胞，同时留下健康的细胞。在小鼠肿瘤模型中，这些异质细胞已经显示出治疗晚期癌症的潜力，第一个人类TIL治疗导致转移性黑色素瘤显著消退。实体瘤缺乏理想的肿瘤标志物，使得靶向肿瘤相关抗原（TAAs）具有挑战性。TILs作为具有多样化受体的多克隆细胞，为实体瘤提供了独特的治疗选择。与基因修饰的免疫细胞相比，TILs在克服实体瘤的异质性方面表现出优越性，特别是像黑色素瘤这样高度异质性的肿瘤。此外，它们具有注射后迁移至TME的趋化因子受体，并且与CAR-T细胞相比，它们的非靶向毒性较低，这归因于T细胞成熟过程中的负选择。 TILs可以从切除的肿瘤组织中分离出来。鉴于TIL在原始TME中的稀缺性，可供扩增的TIL数量有限，以及阻碍TIL抗肿瘤细胞毒性的额外因素（例如，Treg，肿瘤相关巨噬细胞，髓系抑制细胞和各种免疫抑制分子）。TIL的生产和扩增是TIL治疗成功的至关重要步骤。TIL在体外的扩增涉及快速扩增协议（REP）。在REP前阶段，TILs在高剂量白细胞介素（IL）-2下进行初级扩增。一些方法涉及选择肿瘤特异性TILs进行进一步扩增，而其他方法则扩增大量TILs以保持疗效。在REP阶段，同时给予高剂量IL-2和抗CD3，并使用辐照的同种异体外周血单核细胞（PBMCs）作为饲养细胞，直到获得足够数量的细胞。然后，经过质量控制的扩增细胞产品准备用于患者给药后进行淋巴细胞减少。 自1988年Rosenberg等人成功将TIL治疗应用于转移性黑色素瘤患者以来，一系列临床试验相继出现。1996年，TIL治疗首次被引入用于治疗非小细胞肺癌（NSCLCs），在涉及113名患者的临床研究中。结果显示，TIL与IL-2联合使用对NSCLCs是一种有效的治疗方法，与II期或IIIa期相比，对IIIb期NSCLCs有选择性益处。在初步成功后，TIL治疗的后续发展一直朝着提高治疗其他肿瘤类型的疗效方向发展，包括皮肤、肾脏和胃癌。这些发展中的具体方法旨在阐明TIL细胞类型的组成及其与临床结果的相关性。例如，成功生成的肿瘤浸润性B淋巴细胞（TIBs）已被发现可以预测转移性肾细胞癌（mRCC）患者的临床结果改善。另一项关于胃癌TIL治疗的研究表明，TIL的组织学亚群与不同的存活时间相关。目前，TIL治疗的临床转化仍处于初步阶段，缺乏长期临床观察。然而，初步成功表明有机会开发具有更有效分离和扩增方法的有希望的治疗性TILs，并可能与其他抗肿瘤疗法结合使用。 2.2.CIK细胞疗法 CIK细胞是具有混合T和NK细胞样表型的异质免疫效应细胞。它们是通过将人的PBMC或脐带血单核细胞与干扰素γ（IFN-γ）、抗CD3抗体、重组人IL-1和IL-2一起体外培养产生的。CIK细胞独特地表现出对肿瘤的主要组织相容性复合体（MHC）不受限制的靶向性，减少异体反应性，并能够攻击各种肿瘤类型。在体外培养过程中，CIK细胞分泌各种细胞因子以激活巨噬细胞、NK细胞和CD8+ T细胞的细胞毒性活性，从而直接抑制肿瘤细胞的生长并促进间接杀伤效果。CIK细胞诱导凋亡基因和抗肿瘤基因的表达，进行细胞毒性活动并促进肿瘤细胞凋亡。它们主要通过粘附分子淋巴细胞功能相关抗原-1/认知配体细胞间粘附分子-1（LFA-1/cam-1）与肿瘤细胞上的抗原结合的机制来实现肿瘤杀伤效果。这促进了MHC-I或MHC-II分子的表达，导致增强的呈递、激活、识别和直接杀伤肿瘤细胞。 激活的CIK细胞分泌各种细胞因子，包括IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和其他细胞因子，不仅直接增强细胞毒性效果和抑制肿瘤细胞，还通过调节免疫系统间接杀死肿瘤细胞。主要由CIK细胞产生的IFN-γ增强了NK细胞、巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性。它还可以促进肿瘤细胞上MHC-I分子的表达，导致CTL杀伤增加。最近的研究指出，CIK细胞分泌的IFN-γ可以促进慢性淋巴细胞性白血病（CLL）细胞上ICAM-1的表达，对细胞毒性效应细胞的凋亡诱导产生积极影响。肿瘤细胞的凋亡基因也可以被CIK细胞激活，因为这些细胞表达FasL，一种属于TNF超家族的Fas配体，它诱导肿瘤细胞凋亡。Verneris指出，某些肿瘤细胞（如黑色素瘤和卵巢癌）通过诱导表达FasL的淋巴细胞凋亡来逃避免疫清除，但它们对CIK细胞敏感。这是因为，在CIK细胞的诱导过程中，Fas敏感或激活的T细胞被IFN-γ等细胞因子的作用或激活诱导的细胞死亡机制选择性地消除。结合CIK细胞中高水平的抗凋亡基因表达，这些因素使CIK细胞能够耐受表达FasL的肿瘤细胞诱导的凋亡。 尽管存在复发和无反应性的担忧，CIK细胞的异质性使它们能够靶向并杀死各种肿瘤细胞。自1991年引入CIK细胞疗法以来，已有超过5,000名患有多种肿瘤类型的患者，包括肺癌、乳腺癌、脑癌和结肠癌等，参与了CIK细胞疗法。全球CIK细胞（或CIK细胞与DC联合）的临床试验已超过80项。CIK细胞的治疗潜力超出了它们与NKG2D的相互作用，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）轴。与其他免疫疗法、常规化疗或放疗一起，CIK疗法表明了协同的抗肿瘤效果，正在发展中，是治疗癌症的一条令人鼓舞的途径。虽然临床前景看好，但一些公开讨论是必要的。与其他免疫细胞相比，CIK细胞输注后的毒性效应、最小化额外的支持性护理、确定与其他免疫疗法的优势、了解与CIK细胞在癌症微环境中的串扰的关键决定因素，以及在多个中心推广这种方法需要探索。 2.3.DC疫苗 操纵患者的自体DCs进行“疫苗接种”以对抗肿瘤组织是一种有前景的方法。DC疫苗涉及用TAAs（如肽、蛋白质、DNA/RNA或病毒）处理体外培养的DCs。DCs将摄取抗原，然后在仔细控制的培养过程中激活。DCs作为强大的抗原呈递细胞，对影响免疫系统起着至关重要的作用。虽然未成熟的DCs处理外来抗原，触发成熟和迁移到淋巴结，成熟的DCs可以在TME内促进肿瘤耐受，可能导致T辅助型2反应。 DC疫苗，通常采用体外成熟的自体单核细胞并用抗原冲击，已在多种肿瘤患者中显示出良好的耐受性和最小的毒性。然而，抗原特异性免疫反应的幅度和持续时间普遍较弱，限制了客观的临床反应。尽管在儿童肿瘤中的反应有限，正在进行的研究集中在增强疫苗生产的每一步上。策略包括扩大DC来源、提高免疫原性、优化抗原选择、开发新的免疫佐剂以及探索同时进行的免疫调节或化疗。 Sipuleucel-T是唯一获得FDA批准的自体DC疫苗，为有效的成人恶性肿瘤治疗提供了希望，特别是对于去势抵抗性前列腺腺癌。通过培养患者的PBMCs与一种由TAA（前列腺酸性磷酸酶（PAP））和GM-CSF组成的重组蛋白（PAP-GM-CSF）来生产。这种开创性的疫苗代表了DC疫苗领域的一个重要进展，展示了在成人和儿童恶性肿瘤中改善结果的潜在途径。在临床试验中，DC主要用于与CIK细胞、免疫检查点抑制剂（ICI）以及化疗和放疗结合的免疫疗法中以改善结果。研究表明DC能够激活自然杀伤T（NKT）细胞，或同时激活CD4+和CD8+ T细胞。 2.4.DC/CIK细胞疗法 当多种低风险的免疫细胞疗法一起使用时，可以实现积极的综合协同效应，特别是在DC和CIK的共同应用中尤为明显，它们是可适应和协同的。这种协同作用旨在增强身体对疾病的免疫反应。CIK细胞以其广谱的肿瘤杀伤效果而闻名，但由于缺乏特定的识别能力而受到限制。DC目前被认为是最有效的抗原呈递细胞，最近的研究表明CIK和DC之间的相互作用会在两个群体内部引起免疫刺激性表面分子表达的变化。实际上，与CIK细胞共同培养DCs发挥了互补作用，相互促进成熟，共同增加抗肿瘤活性，并展现出有希望的协同效应，即使在之前对CIKs有抵抗力且之前未与DCs共同培养的肿瘤细胞系上也是如此。DC分泌的细胞因子，如IL-2、IL-12和IFN-γ增强了CIK细胞的成熟，导致CIK细胞中CD3+、CD8+和CD56+亚群的水平增加。值得注意的是，DCs显著增加的IL-12分泌显著增强了CIKs的细胞溶解功能。此外，这种合作环境还减少了IL-10的分泌和调节性T细胞（CD4+CD25+ Treg细胞）的数量，减弱了它们对肿瘤免疫的抑制作用，并增强了CIK细胞的肿瘤杀伤效果。同时，CIK细胞增强了DCs的抗原呈递特异性和共刺激分子的表达，有助于整体增加抗肿瘤活性。此外，DC和CIK细胞的共同培养抑制了人类端粒酶逆转录酶（hTERT）蛋白的表达，抑制了端粒酶活性，并阻碍了肿瘤细胞的增殖。 基于上述机制，DC-CIK疗法以相互适应和协同为特点，已成为近年来肿瘤治疗领域的研究焦点。基础和临床研究迅速发展，并证明了在显著增强抗肿瘤免疫方面的有效性。尽管存在轻度移植物抗宿主病（GvHD）的担忧，试验经验表明结果是可控的。案例研究已经证明了安全性和提高的疗效。DC/CIK细胞疗法针对免疫系统的多个方面，从而形成了更全面的对抗疾病的方法。这在复杂情况或难治性恶性肿瘤中尤为有益，其中多种免疫功能障碍发挥作用。总的来说，低风险的免疫细胞疗法可以帮助增强免疫系统识别和消除有害实体的能力，从而改善健康结果。这些疗法的协同效应有潜力显著提高基于免疫的治疗的有效性，并为患者提供更好的结果。然而，评估和定制这些疗法的确切组合和剂量以确保其对个体患者的安全性和有效性至关重要。 3.高风险免疫细胞治疗技术的进步 高风险免疫细胞治疗使用自体干细胞、异体或异种细胞，或基因修饰细胞，所有这些细胞都需要进一步的操作和评估。这些治疗的设计非常适合其预期目的。这些治疗刺激针对肿瘤的新免疫反应，通常有潜力重新激活已有的反应。在这里，我们描述了高风险免疫细胞治疗中的特征设计、转染方法、细胞来源，以及克服抑制性肿瘤微环境（TME）的方法，包括CAR-T、T细胞受体-T（TCR-T）、CAR-NK和CAR-巨噬细胞（CAR-M）。此外，我们提供了对未来趋势的见解。 3.1.CAR的设计 CAR是工程受体蛋白，为免疫细胞提供了识别癌细胞表面特定抗原的新能力，从而可能触发免疫细胞消除癌细胞的潜力。当前研究表明，即使是对CAR结构的微小修改也可能会显著影响治疗效果。它通常由三个模块化域组成：细胞外域、跨膜域和细胞内域。 细胞外域：靶向的艺术。细胞外域包括一个用于目标结合的单链可变片段（ScFv）和一个铰链区域，通常在CAR工程细胞中的免疫球蛋白（Ig）样域铰链，并通过跨膜域锚定到细胞膜。通过CAR的细胞外域引入了驱动免疫细胞激活的新功能，包括T细胞、NK细胞和巨噬细胞。CAR工程免疫细胞能够识别癌症特异性靶标表位，不受MHC和共受体的限制，使它们在寻找和杀死癌细胞方面更有效。 CAR工程免疫细胞已经从针对单一抗原发展到针对两种不同抗原，以优化治疗阴性抗原癌细胞逃逸或抗原丢失的复发，并且结合任一抗原都将触发CAR工程免疫细胞的激活。这可以通过几种方式实现（图1A-C），例如将编码两个独立CAR分子的单个双顺反子向量转导到单个细胞中，或将编码双价CAR分子的向量转导到细胞中，或共同给药两种不同的CAR工程免疫细胞产品，或共同转导两个向量到单个免疫细胞中编码不同的CAR。这些方法对于B细胞淋巴性白血病特别有前景，尤其是对于复发或难治性B细胞急性淋巴性白血病（B-ALL），因为临床研究表明CD19/CD22共转导CAR-T细胞具有显著的疗效，以及CD19/CD22双特异性CAR-T细胞。同样，I期临床试验表明，双特异性CD20/CD19 CAR-T也可用于治疗复发和难治性B细胞恶性肿瘤患者，治疗28天后的总体反应率为82%，显示出治疗目的的安全性和有效性。此外，Wang等人表明，CD19/CD22双顺反子CAR-T与单特异性CD19或CD20 CAR-T细胞相比，在体外和体内表现出相当或更好的功能。 除了ScFv的优化，细胞外区域也得到了改进。与传统CAR直接作用于靶细胞不同，研究人员提出了一个新概念：模块化CAR（modCAR）。这种CAR-T（图1D、E）通常与其适配器一起工作，适配器的一端结合到细胞上，另一端用于识别和结合肿瘤表面抗原。适配器分子可以是单克隆抗体、抗体片段（图1D）、小分子或任何结构（图1E），只要能针对至少一个所需的抗原并介导目标与效应细胞之间的交联。它提供了一种高度灵活、可定制和通用的方法，以快速优化效应细胞活性，潜在地实现智能抗原靶向。 图1. CAR的设计策略。针对肿瘤的CAR设计示意图。(A) 通过将编码两个独立CAR分子的双顺反子载体转导到单个细胞中，可以生成双顺反子CAR工程细胞。(B) 通过将编码串联CAR分子的载体转导到细胞中，生成双价CAR。(C) 通过共同给予两种不同的CAR工程免疫细胞产品（上图）或共同转导两种编码不同CAR的载体到免疫细胞中（下图），实现双特异性，但产品将复杂且昂贵。可以使用抗体（D）或其他适配器（E）生成modCAR。(F) 设计装甲CAR以共表达分子，包括细胞因子和/或趋化因子，以增加效果和持久性。(G) SynNotch CAR通过添加分泌蛋白和结合剂，并利用特设计对机制执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。这也可以通过特设计的转录因子和转录机制（H）实现。CAR：嵌合抗原受体；modCAR：模块化CAR。 装甲CAR细胞（图1F）旨在分泌细胞因子或其他分子，以帮助抵消肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性，潜在地提高CAR工程细胞的持久性和有效性。有时被称为第四代CAR细胞或TRUCKs（T细胞重定向用于抗原无限制的细胞因子启动的杀伤），它们为CAR靶向组织提供了一种多功能治疗，超越了传统CAR-T细胞的能力。TRUCK概念目前正在通过共表达分子如趋化因子配体或基于第二代或第三代CAR的细胞因子组合进行探索。其中，IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23以及这些分子的各种组合正在早期阶段试验中。值得注意的是，IL-7和IL-15已被发现可以促进CAR-T细胞的增殖，而IL-12和IL-18增强了T细胞的效应能力。此外，表达特定分子的工程CAR-T细胞，如CCL-19或CCL-21，能够趋化其他免疫细胞或CAR-T细胞向附近的癌细胞移动。这增强了免疫细胞的渗透和CAR-T细胞的存活，从而提高了CAR-T细胞的有效性。 CAR设计中的最新发展是合成Notch（SynNotch）受体（图1G，H），它提供了一种精确的靶向策略，允许精确控制CAR工程细胞的激活，同时通过引入可诱导的开关来最小化非靶向效应。一个典型的案例使用了布尔逻辑和逻辑门的原理，当所有条件满足时，通过构象变化激活的共定位依赖的蛋白开关（Co-LOCKR）可以执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。在体外已经证明了针对癌细胞的特异性，但在临床应用中仍面临各种挑战。 细胞内域：信号和细胞功能。细胞内域由一系列共刺激域组成，CAR的分类基于共刺激域的数量。第一代CAR仅由CD3ζ组成，而第二代CAR除了CD3ζ外还含有一个共刺激域，第三代CAR则涉及一个以上的共刺激域以及CD3ζ。 在T细胞中，第一代CAR已构建包含编码针对2,4,6-三硝基苯酚（TNP）抗体的可变区域的重组基因片段，这些片段被拼接到α或β T细胞受体（α或β TCR）的C区之一。转导T细胞后，这种结构可以稳定地表达在T细胞表面，并能够识别MHC非限制性的肿瘤细胞，但在临床试验中显示出较弱的抗肿瘤效果。第二代CAR-T利用T细胞激活的经典信号，并增加了一个共刺激分子，如4-1BB（也称为CD137）或CD28，这显著提高了CAR-T细胞的激活水平和增殖能力。临床数据支持接受第二代CAR-T细胞治疗的患者对其肿瘤负担有延长和有效的控制。新发现的共刺激分子包括可诱导的共刺激分子（ICOS）、OX40（也称为CD134）和CD40等。第二代CAR结构在临床实践中最广泛使用。第三代CAR-T细胞包含两个共刺激分子，导致增强的细胞毒性。在临床试验中，当共同给予淋巴瘤患者CD19导向的第二代CAR-T细胞（带有CD28共刺激域）和第三代CAR-T细胞（带有CD28和4-1BB）时，观察到更长的持久性和优越的扩张。然而，目前评估仅第三代CAR-T的临床数据有限。在一个研究者发起的试验中，HD-CAR-1，一种第三代CAR-T治疗，在成人复发/难治性ALL患者中进行了评估。在90天的研究期结束时，80%的患者实现了完全缓解。此外，最近的研究表明，配备有4-1BB和CD28共刺激域的CAR-T细胞增强了T细胞记忆表型，与仅有一种共刺激分子的细胞相比，表现出更好的增殖和细胞因子释放水平。 迄今为止，大多数涉及CAR-NK细胞的研究都使用了最初用于T细胞的CAR构建。已经开发了包含CD28或4-1BB共刺激域的第二代CAR-NK。最近的研究报告称，含有细胞内域的CAR-NK，包含4-1BB和CD3ζ，克服了抑制信号并诱导了NK细胞特异性，导致杀死CD19+ aALL细胞。然而，已经为NK细胞特别创建了新的CAR设计，这些不同的CAR构建对NK细胞的细胞毒性和细胞因子产生有不同的影响。研究表明，包含NK特异性共刺激域2B4（也称为CD244）的CAR-NK细胞对肿瘤细胞有显著增强的细胞毒性活性，诱导快速增殖，增加细胞因子产生，并减少凋亡。这表明，与NK细胞上的常规4-1BB CAR相比，NK细胞特异性激活信号在CAR性能中起着至关重要的作用。此外，利用不同的信号域，如CD3ζ、DAP10和DAP12的CAR构建，在原代NK细胞或NK92细胞系中表现出不同的抗肿瘤活性。具体来说，与包含DAP10域的CAR相比，具有CD3ζ信号域的CAR表现出优越的性能，而使用DAP12域的CAR优于包含CD3ζ域的CAR。 CAR-M细胞与CAR-T细胞具有相同的结构和代级分类，但其细胞内信号域的功能不同，主要是为了增强吞噬作用。CAR-M细胞能够直接利用CD3ζ细胞内域传递吞噬信号。Fc受体（FcRγ）的γ亚基和多个表皮生长因子样域蛋白10（Megf10）也可以作为细胞内信号域。最近的研究结果表明，添加一个串联的PI3K招募域可以增加对癌细胞的吞噬。CAR-M的第一个临床试验产品是第一代产品，包含CD3ζ作为其细胞内域，并且第一阶段的临床试验结果显示了有希望的初步安全性和有效性结果，并获得了FDA的快速通道指定。 4.提高基因转移方法的效率 在免疫疗法中引入核酸，包括基因表达和CRISPR基因编辑，是一个至关重要但具有挑战性的步骤。近年来，非病毒转染技术因其在克服与病毒载体生产相关的劳动密集和昂贵程序以及cGMP合规性方面的经济利益而越来越受欢迎。例如，转座子或移动遗传元素被用来实现高效和持久的转基因表达，在产生稳定的CAR-T细胞方面引起了极大的兴趣。此外，电穿孔或机械穿孔能够使免疫细胞如T细胞短暂表达基因组编辑核酸酶，例如CRISPR-Cas9的表达，并已在基于mRNA的人类T细胞修饰中进行了探索。这些非病毒转染技术在程序简单性、容量和吞吐量以及有利的安全概况方面提供了优势。 与非病毒转染相比，病毒转导方法在临床环境中是主流模式，并被广泛认为是转染困难细胞类型（如免疫细胞）的一种高效方法。常用的病毒载体，如腺相关病毒载体和腺病毒载体，不能整合到宿主基因组中。然而，逆转录病毒载体和慢病毒载体可以整合，并且表现出高传递效率，使它们非常适合转导高度复制的细胞，如免疫细胞。Tecartus和Yescarta都是由Kite Pharma生产，依赖于γ逆转录病毒（GRV）载体将CAR构建体转导到T细胞中，而Kymriah则使用慢病毒（LV）载体进行转导。一般来说，γ逆转录病毒和LV系统经常用于将基因转移到T细胞中，研究表明它们通常可以获得30%-80%的转导效率。然而，安全性、效率和便利性问题是必须考虑的问题。 与T细胞相比，病毒基因传递到原代NK细胞已被证明既具挑战性又效率低下，可能由于NK细胞的固有特性。研究表明，使用逆转录病毒载体成功转染原代扩增的NK细胞，单轮转染效率范围为27%-52%，经过两轮转染后为47%-75.4%。虽然逆转录病毒已被广泛用于最近的临床前和临床研究中生产CAR-NK细胞，但缺乏有效的基因转移方法仍是NK细胞在免疫疗法中使用的主要障碍。此外，与逆转录病毒转染相关的插入性突变和对原代NK细胞活性的有害影响是临床应用中的主要限制。与逆转录病毒载体相比，基于慢病毒的转染具有较低的遗传毒性和插入性突变风险。然而，原代NK细胞在LV转导中的效率很低，需要多轮转染。最近，Bari等人表明，用狒狒包膜糖蛋白变体（BaEV-LV）伪型的LV载体的转导效率比用泡状口炎病毒糖蛋白（VSV-G-LV）伪型的高20倍以上，这是用于伪型LV载体的第一种且仍最广泛使用的糖蛋白。他们通过这种转染方法成功地在约70%的不同供体的原代人类NK细胞中表达了CD19-CAR，这些CD19-CAR NK细胞有效地且特异性地根除了CD19阳性肿瘤细胞。用BaEV-gp伪型的慢病毒带有肿瘤特异性CAR在NK92细胞中的转导率几乎达到100%，在iPSC衍生的NK细胞或激活的原代NK细胞中为50%-80%。因此，它可能是NK细胞CAR基因转移的有希望的载体。此外，用长臂猿白血病病毒（GaLV）包膜蛋白伪型的慢病毒可以有效转导原代NK细胞。电穿孔和脂质体介导的转染方法也用于在NK细胞中传递外源基因。与上述病毒转染相比，这些方法提供了更快的转基因表达、降低的凋亡水平、更小的个体间差异和更高的基因转移效率。然而，外源DNA通常不会整合到目标细胞的基因组中，导致转基因表达在转染后约3-5天内下降。但当与DNA整合技术结合时，这些方法可以产生稳定转染并表达转基因的细胞。DNA转座子是可以通过切割和粘贴机制在载体和染色体之间有效转座的移动DNA元素。PiggyBac（PB）和Sleeping Beauty（SB）是迄今为止最常用的两种转座子系统，与其他系统相比，在哺乳动物细胞中显示出最高的转座活性。通过将含有CAR的质粒和转座酶DNA转染到iPSC中，成功地稳定创建了表达CAR分子的CAR-iPSC-NK细胞。 与病毒载体相比，转座子系统提供了许多好处，例如较低的免疫原性、增加的生物安全性、降低的生产成本，以及能够转移基因片段，其载荷能力接近9-10 kb。这些优势使其成为将CAR整合到NK细胞基因组中以实现持久表达的一个有力选择。然而，要充分利用转座子系统对原代NK细胞进行转染，需要进行优化，例如通过电转染提高转导效率和细胞活性。 巨噬细胞比其他造血系统中的细胞更难转染和抵抗遗传操作，因为它们有能力识别并响应外来核酸。Bobadilla及其同事创建了一种基于HIV-1的慢病毒系统，该系统通过感染时Vpx诱导的SAMHD1降解，已被证明可以有效传递转基因到骨髓细胞。Klichinsky团队使用复制缺陷的嵌合腺病毒载体Ad5F35有效地传递CAR到巨噬细胞，并同时促进M1表型的表达，最终增强了肿瘤杀伤活性。这些结果强调了基因工程巨噬细胞在癌症免疫疗法中的潜力。与生成CAR-NK细胞的方法类似，转座子系统也被用来将感兴趣的基因整合到宿主基因组中。 4.1.新型细胞来源方法推动现成的免疫细胞治疗产品 迄今为止，所有商业批准的癌症免疫细胞疗法都依赖于自体使用，即使用的材料是患者自己的细胞。尽管这种方法已证明有效，但存在一些重要的限制，例如在处理快速癌症进展的患者时制造的不良等待时间，由于患者T细胞功能障碍可能导致的生产失败，与健康淋巴细胞一起提取的恶性白血病细胞污染产品的风险，高生产成本，标准化的复杂性，以及再剂量机会的限制。因此，当前的研究工作集中在开发同种异体疗法上，以克服自体疗法的限制。特别是，CAR-NK是一种有前景的同种异体细胞治疗，对实体瘤和血液系统恶性肿瘤均无重大毒性副作用。它是一种更简单、可再注射、更实惠的通用治疗。 然而，当前的治疗尚未显示出强大的疗效和/或长期持久性，并且NK细胞更难进行工程改造。CAR-NK细胞的研究主要在临床前和早期临床试验阶段，很少有临床试验报告。尽管如此，通用的同种异体CAR-NK细胞在癌症治疗中仍显示出巨大潜力。 目前，CAR-M主要是自体疗法，但“现成的”同种异体CAR-M已经出现并正在进行进一步研究。 在开发同种异体方法时，必须系统地解决最重大的风险：免疫排斥和GvHD（移植物抗宿主病）的发展。免疫排斥可能限制治疗的效力，因为接受者的免疫系统可能会排斥移植物。GvHD可能是致命的，由供体T细胞内源性的αβ TCR复合体识别宿主肽-人类白细胞抗原（HLA）复合体引起，导致组织损伤。为了解决同种异体风险，可以采用两种主要策略。第一种是在供体αβ T细胞上除了引入CAR转基因外，还进行额外的遗传修改。另一种是选择替代的细胞来源或亚群，如诱导多能干细胞（iPSCs）、脐带血（UCB）细胞、γδ T细胞、记忆T细胞亚群、病毒特异性T细胞（VST）等。 为了消除内源性αβ TCR介导的GvHD，最直接的方法是破坏编码T细胞受体恒定（TRAC）α链的基因。Eyquem等人开发了一个案例，通过腺病毒转染和CRISPR-Cas9敲入技术将CAR构建体整合到TRAC位点，同时诱导CAR表达和TCR失活。与随机整合相比，CAR表达可以由内源性TCR启动子调控，并在暴露于抗原时模仿TCR转录，防止恒定的和过度的T细胞激活，这可能导致T细胞分化和耗竭。此外，研究结果表明，这些TRAC-CD19 CAR-T细胞在ALL小鼠模型中显示出比用逆转录病毒编码的CAR的T细胞更大的抗肿瘤效力。 此外，除了CRISPR-Cas9，基因编辑技术，如TALENs和锌指核酸酶（ZFNs），也被发现在消除TCR表达以创建“通用”供体T细胞方面有效。然而，尽管TCR缺失的CAR-T细胞降低了GvHD的风险，但其长期持久性较短，可能是由于免疫排斥。因此，科学家们敲除了β2-微球蛋白（B2M）基因以限制HLA类I分子的表达。这种方法防止了异体CAR-T细胞通过它们的TCR被识别为外来物，但仍然容易受到宿主NK细胞的溶解。因此，一项研究使用突变的B2M融合蛋白来解决这个问题。为了在激活的异体CAR-T细胞生产过程中提高HLA-II消除的效率，一些学者提出抑制CIITA或HLA-DRA、HLA-DQA和HLA-DPA基因。 iPSCs具有无限的增殖和分化潜力，使它们成为创建众多同质HLA组合库的理想资源。通过从库中选择一个HLA匹配的iPSC来源，可以最小化宿主和移植物之间CAR-T细胞的免疫排斥风险，但必须进行严格的质量控制以确保安全，因为未分化的、增殖的iPSCs可能引发不良结果。Wang等人生成了缺乏HLA-I/II、B2M和CD155的低免疫原性iPSC衍生的CAR-T细胞。 研究通过体内发挥效应功能证明了它们抑制肿瘤进展的有效性。此外，iPSCs也为生产满足临床需求的CAR-NK和CAR-M细胞铺平了道路。与分化的NK细胞或巨噬细胞相比，iPSCs可以更有效地被工程化以稳定表达CARs。Li等人通过在培养基中添加各种细胞因子和促分化蛋白来分化CAR转染的iPSCs为CAR-NK细胞。这些iPSC衍生的CAR-NK细胞在体外和体内都显示出强大的抗肿瘤活性。Zhang等人建立了一个骨髓/巨噬细胞分化协议，诱导CAR-iPS向骨髓细胞系分化，成功产生了足够的CAR-iMac细胞（iPSC衍生的CAR-M细胞）。然而，当在小鼠模型中测试时，CAR-iMacs的有效性有限。总的来说，iPSC衍生的工程免疫细胞的发展涉及复杂的生产程序，需要精确的细胞产品制造和质量保证，以支持更广泛的临床应用。 γδ T细胞表达TCRγδ并以HLA独立的方式识别恶性细胞。它不需要消除TCR表达或信号，并且GvHD的风险低或不存在。研究表明，γδ CAR-T细胞显示出与传统的αβ CAR-T细胞相似或更大的细胞毒性效应，并且在体内没有观察到GvHD。然而，它们在体外的细胞毒性能力持续性较差。此外，针对CD20的γδ CAR-T细胞在B细胞淋巴瘤的动物模型中取得了有希望的结果，目前正在进行第一阶段的临床试验。 脐带血（UCB）提供了一个容易获得的NK细胞和同种异体T细胞来源。它们富含γδ T细胞和造血干细胞（HSCs），尽管总细胞数量有限。UCB衍生的CAR-T细胞在体内显示出增强的肿瘤抑制作用，减少了IL-10的分泌，并降低了调节性T细胞（Tregs）的比例，表明了改善的治疗潜力。Van Caeneghem等人从脐带血中分离出CD34+ HSCs，然后生成CAR-T细胞。这些CAR-T细胞具有原始表型（CD45RA+ CD62L+），并且不表达TCRαβ复合体，显著降低了GvHD的风险，并有效地消除肿瘤细胞。 记忆T细胞的特征是CD45RA−CD45RO+表型，它们不太可能发展为GvHD，也不太可能迁移到表现GvHD的器官。研究表明，T记忆干细胞（TSCM）和中央记忆T细胞（Tcm）与它们的分化对应物相比，具有优越的增殖和干细胞潜力，并且在T细胞转移后的临床研究中表现出高扩张和持久性。 VSTs拥有能够识别病毒抗原的TCR，如巨细胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）等。经过CAR改造的VSTs在实体瘤中显示出有希望的结果，但与CARs相比，工程化针对肿瘤的转基因TCR VSTs更具挑战性。在肿瘤细胞中表达EBV相关抗原的霍奇金淋巴瘤患者中，输注CAR-VST细胞取得了良好的耐受性和缓解率。针对HER2的CAR-VST细胞产品在CMV血清阳性和进行性胶质母细胞瘤患者的第一阶段临床试验中显示出既安全又临床有效。值得注意的是，可以建立VST库，以覆盖大多数患者，并促进CAR-T或TCR-T重定向到肿瘤的临床使用。 PBMCs通常来自外周循环或脐带血等。它是临床目的的主要NK细胞来源。PBMC衍生的NK（PB-NK）细胞可以从HLA匹配和不匹配的供体中分离出来，扩大了潜在供体池。通常，它们显示出成熟的表型，增殖能力降低，细胞毒性增加，没有GvHD的风险。Töpfer等人已经证明，表达CAR的NK细胞系YTS以及PB-NK细胞可以成功地重定向针对前列腺干细胞抗原（PSCA）阳性肿瘤，导致大部分治疗小鼠的肿瘤被完全根除。一种短暂表达针对间皮素的mRNA CAR，MCY-M11的CAR-PBMC细胞产品已进入临床试验，它是一种混合产品，包含不同的CAR工程T细胞亚群、单核细胞和B细胞群体，展现出理想的功能和免疫表型特征。 NKT细胞，也称为CD1d限制性T细胞，是一类同时具有T细胞和NK细胞特性的异质性T细胞群。这些细胞主要识别非多态性CD1d分子，这是一种结合自身和外来脂质以及糖脂的抗原呈递分子。I型NKT细胞或称为iNKT细胞不具有HLA限制性，可能作为通用供体细胞发挥作用，但其在体内的持久性尚未知晓。研究表明，CAR19-iNKT细胞表现出抗淋巴瘤活性，并且具有增强的消除脑淋巴瘤的能力。另一种异体NKT细胞，表达带有CD28和IL-15的抗CD19嵌合受体，目前正在进行临床试验，针对复发或难治性B细胞恶性肿瘤患者（NCT03774654）。 4.2.改善肿瘤微环境以增强治疗性免疫细胞的效果 免疫细胞治疗实体瘤的效果受限于低持久性和注入后的不充分增殖，这在很大程度上归因于免疫抑制微环境，它不是被动的旁观者，而是癌症进展的积极推动者。肿瘤细胞居住在这个由浸润和驻留宿主细胞（如T细胞和巨噬细胞）、分泌因子（如IL-10和转化生长因子-β（TGFβ））以及细胞外基质（ECM）组成的异质微环境中。这些组分可以相互作用，为恶性细胞的生长、迁移和转移创造支持性环境，从而逃避免疫系统和肿瘤特异性细胞毒性T细胞。为了根除肿瘤，科学家们开发了几种策略来促进CAR工程或TCR工程治疗性免疫细胞向癌症焦点的迁移和渗透，包括利用趋化因子受体如CCR2、CXCR2、CCR4、CXCR4等。这些研究表明，CAR-T、TCR-T和NK细胞显示出增加的肿瘤渗透率，导致肿瘤退缩和增强的抗肿瘤效果。然而，将基因工程免疫细胞渗透到肿瘤中只是抗癌的第一步。有时，可能需要直接转化方法来修改免疫抑制微环境。使用免疫检查点抑制剂，如抗PD-1、抗PD-L1抗体和抗CTLA4抗体，可以改善免疫抑制肿瘤微环境。然而，它可能导致药物抗性的出现、T细胞耗竭和复发，有时甚至会导致危及生命的毒性。在肿瘤微环境中阻断TGF-β信号是另一种提高检查点抑制剂效果和增强抗肿瘤反应的方法，因为它在肿瘤信号、重塑和代谢中起着至关重要的作用。临床证据也表明TGF-β信号与对检查点阻断剂无反应的患者之间存在相关性。为了解决这个问题，已经开发了双功能抗体-配体陷阱，使用针对CTLA-4或PD-L1的抗体与TGFβ受体II外域（TGFβRIIecd）融合。它可以在肿瘤微环境中隔离TGF-β，耗尽调节性T细胞，并促进CTL共刺激。此外，通过转导优势负性TGFβ受体-II（dnTGFβRII），开发了对TGFβ有抵抗力的肿瘤特异性T细胞，并已在动物模型和临床研究中显示出治疗益处。另一种新策略是利用肿瘤微环境中高浓度的免疫抑制信号分子，通过引入嵌合开关受体（CSR），如PD-1:CD28、TIGIT:CD28、CTLA-4:CD28、TGF-βRII:4-1BB、Fas:4-1BB。CSR由PD-1、CTLA-4或TGF-βRII的细胞外域和CD28或4-1BB的细胞内域组成。T细胞与CSR一起被转导，与CAR或TC共表达，以产生工程化CTL。这些工程化CTL仍然与肿瘤细胞上的免疫抑制分子相互作用，但通过细胞内域传递共刺激信号而不是抑制信号。最近，这一策略已经进行了临床测试。这些工程化细胞被发现能有效克服免疫抑制肿瘤微环境，例如分泌更多的IFN-γ，积聚在肿瘤中，并展现出优越的抗肿瘤功能。细胞外基质为各种抗癌疗法创造了物理屏障。然而，巨噬细胞在调节ECM和展示肿瘤归巢行为方面发挥着关键作用。CAR工程巨噬细胞被证明能主动迁移到肿瘤部位，可以作为药物递送系统在抗原特异性环境中局部递送细胞因子和/或细胞毒性物质，显著改变免疫抑制肿瘤微环境，并通过吞噬作用消除肿瘤细胞。张等人使用CAR修饰的巨噬细胞解决了ECM引起的免疫细胞渗透不足的问题。体外研究表明，CAR-147巨噬细胞能够重塑肿瘤的ECM，诱导CD3+ T细胞渗透，并提高肿瘤微环境中IL-12和IFN-γ的水平，最终展现出抗肿瘤效果。 4.3.临床研究进展 从临床进展的角度来看，自2017年FDA批准首个CAR-T细胞疗法产品以来，全球已有10个CAR-T产品获得批准（补充表1）。自2013年以来，CAR-T、CAR-NK和TCR-T疗法的临床研究迅速增加，到2022年CAR-T细胞疗法的数量达到258例，值得注意的是，2023年的数据来自1月至10月（图2A）。从国家角度看，高风险细胞疗法的临床研究主要分布在美国和中国，占全球研究的80%以上（图2B）。CAR-T疗法的主要临床治疗靶点是CD19、CD22、CD20和B细胞成熟抗原（BCMA）。在血液肿瘤中，增长最快的适应症是淋巴瘤和骨髓瘤。目前，TCR-T有一种治疗产品在市场上，用于转移性葡萄膜黑色素瘤。总的来说，TCR-T在实体瘤中的进展速度比血液肿瘤快（图2C）。TCR-T的靶抗原主要集中在MART-1、HPV16-E6、NYESO、HPV16-E7等。在病症方面，TCR-T的临床研究主要用于实体瘤的治疗。这些实体瘤大多与病毒感染有关，如与人类乳头瘤病毒（HPV）感染相关的宫颈癌。此外，TCR-T在头颈、肝脏和结肠癌症的临床研究正在迅速进展（图2C）。就CAR-NK病症而言，血液肿瘤仍然是进展最快的，其中淋巴瘤病症的进展速度更快（图2C）。 图2. CAR-T、TCR-T和CAR-NK疗法的临床试验。临床试验数据统计。(A) 2018年至2023年细胞疗法临床研究的数量，分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组。(B) 按国家分组的细胞疗法临床研究数量，同样分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组，Y轴在50到450之间中断。(C) 针对不同适应症的细胞疗法药物的临床进展，细胞疗法药物的分组与(A)相同，适应症分为液体和固体肿瘤两组。原始数据下载自https://classic.clinicaltrials.gov/，更新至2023年10月30日。CAR-T：嵌合抗原受体T细胞；CAR-NK：嵌合抗原受体自然杀伤细胞；CNS：中枢神经系统；HPV：人乳头瘤病毒；TCR-T：T细胞受体T细胞。 CAR-NK的临床治疗靶点主要是血液肿瘤的CD19、CD22和BCMA，以及实体瘤的PSMA、HER2、ROBO1和MUC1。总的来说，TCR-T和CAR-NK仍处于早期临床开发阶段。到目前为止，CAR-M的临床研究仍处于起步阶段，只有一个I期临床试验（NCT04660929）。图2的数据可从补充表2获得。 5.结论与展望 免疫细胞治疗在肿瘤治疗中变得越来越重要。与替代免疫治疗方法（如免疫检查点抑制剂和细胞因子）相比，免疫细胞治疗表现出了优越的疗效、特异性，并倾向于引起可接受的副作用。当作为某些癌症的独立治疗时，特别是采用性T细胞转移疗法，在血液系统恶性肿瘤如白血病和淋巴瘤中显示出了显著的成功。然而，由于免疫抑制肿瘤微环境、肿瘤异质性、靶标抗原表达低等因素，一些实体瘤对单独的免疫细胞治疗更具挑战性。在许多情况下，转向另一种免疫细胞治疗或将免疫细胞治疗与其他治疗策略（如化疗、放疗、其他免疫治疗或靶向治疗）结合起来被认为是有益的，可以通过不同的机制增强整体治疗效果。目前，全球已有10个CAR-T产品获批，而DC疫苗和TCR-T各有一个获批产品。在低风险免疫细胞治疗方面，TIL和DC疫苗在治疗实体瘤方面显示出了希望。此外，CIK治疗与其他免疫策略结合使用时显示出协同的抗肿瘤效果。这些方法通常由具有不同功能特征的异质细胞组成，在治疗相对高异质性的恶性肿瘤方面具有优势。另一方面，高风险免疫治疗如CAR-T和TCR-T通常是定向的和高度特异性的，使它们特别适合相对快速增殖的恶性肿瘤。在血液肿瘤中，CAR-T和TCR-T已经得到了临床验证，它们在治疗实体瘤方面的应用正在稳步进展。而基于其生物学特性，CAR-NK和CAR-M在治疗实体瘤方面具有固有优势。TCR-T专注于特定的肿瘤相关抗原和新抗原，使它们在外来抗原如病毒相关恶性肿瘤方面受益。研究人员目前正在努力突破包括CAR-T在内的细胞治疗技术的瓶颈。新的细胞来源和降低GvHD风险和其他风险的方法为“现成的”或同种异体细胞治疗创造了机会，这些治疗可以事先准备并在需要时轻松地给多个患者使用，实现更快的诊断和癌症治疗。此外，针对CAR的新颖设计最小化了对健康组织的损害，并与传统治疗相比减少了副作用。某些设计甚至为治疗实体瘤提供了可能性。此外，修改肿瘤环境和诱导记忆T细胞的策略使得实现长期效果成为可能。同时，由于这些疗法新颖、复杂和技术性，它们可能对公共卫生和个体患者构成以前未探索的风险。TIL细胞治疗、DC/CIK细胞治疗和DC疫苗被认为是低到中等风险。风险因素包括生产中使用的生物活性物质，如抗体、细胞因子、血清、生长因子和抗生素，以及在保存、冷冻、解冻和冷链运输过程中的产品稳定性和活性风险。此外，产品本身可能存在固有风险，如不完全去除肿瘤细胞或其他不需要的细胞，以及与归巢、植入、迁移和增殖相关的潜在并发症或降低的产品活性。然而，高风险免疫疗法需要更多的操作，使用基因修饰细胞、自体干细胞或同种异体或异种细胞，这需要额外的评估。在临床上，这些疗法有时可能引发细胞因子风暴和细胞因子释放综合征（CRS），这两种都是危及生命的全身性炎症综合征。因此，这些产品的风险管理考虑相应更具挑战性。必须仔细评估产品与患者相互作用产生的即时和延迟影响的潜在风险。这些风险包括不需要的免疫原性及其相关效应，包括CRS、GVHD、移植物排斥、过敏反应、超敏反应和免疫缺陷。此外，评估与患者细胞的预期和非预期遗传修饰相关的潜在风险也很重要，包括细胞功能、细胞凋亡、生长或分化的变化、插入性突变或遗传毒性以及恶性转化的可能性。然而，准确评估免疫细胞治疗的风险仍然具有挑战性。一些真正的风险超出了预期或在临床前研究中没有被揭示。重要的是要理解风险在临床研究中无处不在，它被定义为在特定时间框架内发生不利结果的可能性。评估可接受的免疫细胞治疗风险水平涉及权衡各种因素，而不仅仅是绝对风险，而是可能随之而来的潜在治疗益处。与患有较轻微肿瘤或癌症适应症且存在适当治疗方法的患者相比，患有危及生命的晚期或严重恶性肿瘤的患者可接受的风险水平要高得多。总的来说，免疫细胞治疗的技术障碍相对较高，创新动力强，技术发展多。近年来进展呈爆炸性增长。尽管CAR-T、TCR-T和DC疫苗已获批准，但其他免疫细胞治疗仍处于早期临床和临床前研究阶段。低风险疗法如TIL面临由于无法完全消除Tregs而有限的效力。CIK细胞治疗在获取和扩增方面遇到困难。DC肿瘤疫苗受到缺乏理想的肿瘤特异性抗原、TAA免疫原性弱、难以高效诱导免疫原性DC以及体外DC致敏方法的静脉回输无法有效激活DC分化和成熟的影响。高风险细胞治疗在克服肿瘤异质性的障碍方面仍有很长的路要走。CAR-T细胞仍面临效应T细胞耗竭、细胞因子风暴和免疫抑制微环境等挑战。TCR-T细胞治疗的挑战包括如何减少TCR不匹配和针对新抗原的最小选择。CAR-NK疗法正在经历遗传操作和细胞增殖困难。尽管CAR-M可能成为有希望的抗癌疗法，但它们尚未完全实现。临床研究需要确认肿瘤相关巨噬细胞在决定TME是否可以将肿瘤靶向CAR-M转化为肿瘤支持表型方面的高适应性。然而，免疫细胞治疗在抗癌疗法的未来开发中仍具有至高无上的潜力。人们普遍认为，快速的技术创新将使这些疗法成为高效的癌症治疗手段，显著改善治疗效果，推进人类医疗保健。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。