Poliovirus vaccine inactivated(Sanofi)

中文摘要疫苗是预防控制传染性疾病的最有效手段，传染性疾病中约80%是由病毒引起的。传统病毒类疫苗的制备需经过病毒培养、抗原收获、抗原浓缩、纯化过滤等过程。由于病毒的生长和繁殖必须在细胞内进行，因此细胞基质的优劣直接影响疫苗的质量。此文对各类细胞基质使用情况及优缺点进行综述，旨在为选择合适的人用疫苗生产用细胞基质提供参考。正文疫苗的研发和使用为人类健康构筑了一道免疫屏障，疫苗的制备首先需要病原微生物的增殖。病毒的生长和繁殖离不开细胞，为病毒增殖提供营养的细胞称为细胞基质，包括原代细胞、传代细胞及二倍体细胞。早期曾使用受感染的人或动物组织以及被感染的血清等生产疫苗，使用细胞基质生产疫苗是当今疫苗生产企业的主流。细胞基质疫苗生产工艺经历了3次重要的变革：第1次变革是使用原代细胞培养技术成功研制脊髓灰质炎疫苗；第2次变革是从原代细胞中获得传代细胞和二倍体细胞；第3次变革是结合基因工程、克隆等分子技术建立专利细胞系。细胞基质的优劣直接影响疫苗产品的产量和质量，选择合适的细胞基质进行疫苗生产对于疫苗企业而言意义重大。本文对各类细胞基质使用情况及优缺点进行综述，旨在为选择合适的人用疫苗生产用细胞基质提供参考。1原代细胞原代细胞是指将来自健康动物的组织或胚胎以适当的方式消化分散后进行培养的细胞。我国已上市的疫苗中，乙型脑炎疫苗、肾综合征出血热疫苗、狂犬病疫苗均使用了地鼠肾细胞，麻疹、腮腺炎疫苗使用了鸡胚细胞，风疹疫苗、轮状病毒疫苗分别使用了兔肾细胞和牛肾细胞。原代细胞无致瘤性，对多种病毒敏感，易于培养，适合规模化生产；缺点是外源因子污染风险大，受动物个体差异影响较大，无法充分鉴定和标准化。1.1鸡胚细胞鸡胚细胞基质灭活流感疫苗上市已有80多年，具有良好的安全性和免疫原性，已在全球范围内大规模接种。德国的人用狂犬病疫苗Rabipur®是采用Flury LEP株狂犬病病毒适应鸡胚细胞培养而成，疫苗有效且耐受性良好，至今仍被广泛使用。鸡胚细胞的优点是对各类病毒广泛敏感且接种病毒不会产生针对性抗体，培养简便易操作；缺点是存在供应不足的风险，产量不一致，耗时，制造成本高以及鸡蛋成分可能引发过敏反应等。1.2地鼠肾细胞我国于1965年使用原代地鼠肾（primary hamster kidney，PHK）细胞成功研制狂犬病灭活疫苗，目前仍在市场上使用。1968年，使用狂犬病病毒SAD株适应PHK细胞制备的狂犬病灭活疫苗在加拿大批准上市。俄罗斯至今仍在使用PHK细胞培养的Vnukovo-32狂犬病灭活疫苗。我国使用乙型脑炎病毒JEVSA14-14-2减毒株接种PHK细胞生产的灭活疫苗和减毒活疫苗，相对于鼠脑灭活疫苗免疫效果良好、成本低、不良反应少。李佳林等建立了PHK细胞工厂传代培养狂犬病病毒工艺，为狂犬病疫苗的规模化生产提供了参考。由于PHK细胞需要贴壁生长，而传统的生物反应器通常用于悬浮细胞的培养，难以提供足够的表面积来支持大量贴壁细胞的生长，因此PHK细胞在生物反应器中进行大规模培养存在一定的困难，制约了其在疫苗研发方面的应用。2传代细胞传代细胞是初始细胞（原代细胞或已建立的细胞系）经过细胞分裂进行连续传代而得到的细胞群。由于肿瘤组织具有致瘤性，出于安全考虑，用于疫苗生产的传代细胞大都来源于正常组织。疫苗生产常用的传代细胞有Vero细胞、Madin-Darby犬肾（Madin-Darby canine kidney，MDCK）细胞、中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞等。Vero细胞适合流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、天花病毒、脊髓灰质炎病毒、虫媒病毒的培养。MDCK细胞适合甲型和乙型流感病毒、脊髓灰质炎病毒等病毒的培养。CHO细胞适合乙型肝炎（乙肝）疫苗、新型冠状病毒重组亚单位疫苗等蛋白类疫苗的生产。2.1Vero细胞Vero细胞对多种病毒易感，感染后不产生干扰素，增殖力强，生产的病毒抗原具有良好的稳定性，可实现大规模培养，被WHO推荐为病毒性疫苗生产的首选细胞系。根据WHO的评估，Vero细胞在150代以内仍能保持其稳定的遗传特性和生长特性，没有观察到明显的细胞异常或致瘤性，上述代次范围内的Vero细胞被认为是适合病毒性疫苗生产的可靠和安全的细胞基质。目前国内使用Vero细胞生产的疫苗有人用狂犬病纯化疫苗、脊髓灰质炎灭活疫苗、新型冠状病毒灭活疫苗等。国外使用Vero细胞生产的疫苗有流感疫苗（Vepacel®和Preflucel®）、脊髓灰质炎疫苗（IMOVAX Polio®和OPV® ）、狂犬病疫苗（VERORAB® ）等。张炎华等报道，新型冠状病毒感染Vero-E6细胞48 h内迅速增殖，平均复制周期约为3.29 h，48 h后病毒感染滴度逐渐下降。刘鹏等使用自主研制的Vero细胞悬浮培养基（VSM-1）在搅拌瓶中驯化贴壁Vero细胞适应悬浮培养，接种H5N1和H7N9流感病毒后，悬浮Vero细胞平均血凝滴度均高于贴壁对照组。Vero细胞的缺点如下：悬浮驯化较难，大多使用微载体培养法，生产成本较高，效率低；可用的无血清培养基较少，疫苗质量和生产效率差异较大。目前研发改进主要从以下两方面进行：开发安全、稳定、可控的无血清培养基，或者通过基因工程手段改造Vero细胞，降低Vero细胞对血清的依赖性；通过Vero细胞的悬浮驯化实现Vero细胞的高密度培养，提高疫苗质量和产量。2.2MDCK细胞MDCK细胞因具有致瘤性而不如Vero细胞使用广泛，主要用于流感疫苗的生产。目前国外已有MDCK细胞基质流感疫苗上市，尚未出现不良反应报道。国内首个MDCK细胞流感疫苗于2022年10月启动临床研究。MDCK细胞对不同型和亚型流感病毒株都具有广泛的敏感性，且可以实现病毒的有效扩增，被广泛应用于流感病毒的分离、培养和感染性滴度检测。张哲罡报道，MDCK细胞基质流感疫苗诱导小鼠的细胞免疫及天然免疫的能力优于鸡胚细胞基质流感疫苗。马萍等报道，使用MDCK细胞进行流感疫苗的生产可以显著提高疫苗的效力。相比于Vero细胞，MDCK细胞对流感病毒更敏感，并且能够获得更高的病毒滴度。赵彩红等建立了无血清悬浮培养MDCK细胞系，实现了从5 L到75 L生物反应器的高密度线性放大培养。随着对细胞系安全性和稳定性的不断关注，无致瘤性MDCK细胞系成为研究和应用的前沿。这种细胞系具有与传统MDCK细胞相似的生长特性和对流感病毒的敏感性，但不会导致肿瘤的发生。目前，美国Medlmmune公司已经成功开发了这种细胞系，裸鼠注射剂量达107细胞后未出现致瘤性，该细胞系还可以在无血清培养基中生长。2.3CHO细胞CHO细胞能对蛋白质进行准确加工和修饰，表达的蛋白质纯度高、杂质少、与天然蛋白质接近，是生产重组蛋白疫苗的首选。20世纪90年代初，中国预防医学科学院病毒学研究所和长春生物制品研究所等机构共同研制了CHO细胞表达的基因工程乙肝疫苗。随后，兰州生物制品研究所、成都生物制品研究所、石家庄华北制药集团等研发的CHO细胞重组乙肝疫苗也获批上市。英国葛兰素史克公司研发的CHO细胞带状疱疹疫苗Shingrix（欣安立适）于2017年10月获FDA批准上市。2021年，中国科学院微生物研究所与安徽智飞龙科马生物制药有限公司共同研发了重组亚单位COVID-19疫苗，该疫苗具有良好的安全性和免疫原性；III期临床试验结果显示，3剂次疫苗接种6个月后，预防新型冠状病毒Alpha、Delta和Kappa等突变株引起的有症状感染的保护力为75.7%；预防重症、危重症感染的保护力为87.6%。CHO细胞在表达蛋白质时存在一定程度的异质性，包括糖基化模式和蛋白质折叠状态的差异，可能需要进一步后处理和纯化步骤来获得所需的产物。CHO细胞在培养过程中对氧气和营养物质的需求较高，特别是对血清和氨基酸的依赖性较大，培养成本相对较高。今后的研究可以从培养基的优化、高产重组CHO细胞株的构建、大规模培养3个方面展开，进一步提高重组蛋白在CHO细胞表达系统中的产量。3人二倍体细胞二倍体细胞通常来源于正常胎儿组织，可在一定代次内进行体外传代培养。目前用于疫苗生产的人二倍体细胞主要包括由英国汉普斯特德实验室制备的MRC-5细胞和我国自主研发的2BS细胞、KMB-17细胞。二倍体细胞作为人源细胞，与原代细胞相比外源因子污染风险低，与传代细胞相比无致瘤性，安全性好。刘欣玉等对疫苗生产用人二倍体细胞2BS和MRC-5中猪圆环病毒进行检测，结果为阴性。人二倍体细胞与人的抗原性一致，避免了疫苗的宿主细胞蛋白和外源DNA残留的问题，可以显著降低疫苗接种不良反应率。范斌等报道，使用Vero细胞生产的纯化狂犬病疫苗可能引发一些不良反应，如注射部位疼痛、发红、肿胀等，而人二倍体细胞狂犬病疫苗的注射往往耐受性更好，不良反应较少。尽管人二倍体细胞在疫苗生产中具有明显的优势，但其大规模培养仍面临挑战。人二倍体细胞的培养需要严格的环境控制、特定的培养基配方和复杂的培养技术，增加了生产过程的复杂性和成本。此外，人二倍体细胞的生长特性和代谢特点对培养条件的要求更为苛刻，大规模生产中的稳定性和一致性也是一个挑战。4新型细胞基质为了更好地适应特定生产工艺，生产商正在研发新型细胞基质，已经报道的专利细胞系有PER.C6®、AGE1.CR.pIX、EB66®、PBS-12SF、DuckCelt®-T17和MFF-8C1等。这些细胞系大都可以进行无血清悬浮培养。由荷兰Crucell公司研发的PER.C6®来源于人胚视网膜细胞，对腺病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒、埃博拉病毒敏感。在比利时进行的首次临床研究评估了基于高产PER.C6®细胞系生产的Sabin株脊髓灰质炎病毒灭活疫苗（Sabin inactivated poliovirus vaccine，sIPV），结果表明基于PER.C6®细胞的sIPV在已有抗脊髓灰质炎病毒抗体的成人中具有良好的耐受性和高度的免疫原性。随后在婴儿中进行的评估也显示，基于PER.C6®细胞的sIPV对3个型别Sabin株病毒均诱导了较高的血清转化率和中和抗体几何平均滴度，安全性和免疫原性可接受。AGE1.CR.pIX由德国ProBioGen公司研发，来源于鸭视网膜细胞，对天花病毒、鸡痘病毒、流感病毒敏感。目前英国Vaccitech公司利用AGE1.CR.pIX研发了通用型甲型流感疫苗MVA-NP+M1。Trabelsi 等的研究表明，在 AGE1.CR.pIX 悬浮细胞系中，用化学限定的培养基能以可扩展工艺有效生产兽用狂犬病疫苗。EB66®由法国Valneva公司研发，来源于鸭胚细胞，对流感病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、痘病毒等病毒敏感。2014年，基于EB66®细胞的H5N1大流行流感储备疫苗在日本获得上市许可。Endo等开发了使用EB66®细胞培养平台（KD-295）生产的AS03佐剂H5N1流感疫苗，具有良好的耐受性和高免疫原性。Nikolay等报道，EB66®灌注培养可以有效提高黄病毒和寨卡病毒的产量。Coussens等建立了一种永生化的鸡胚细胞系，称为PBS-12SF，该细胞系适合在无血清条件下生长，能够将人和重组H5N1流感毒株扩增至高滴度。在许多情况下，PBS-12SF细胞培养的流感病毒滴度高于原代鸡胚肾细胞、MDCK细胞和Vero细胞。此外，在PBS-12SF细胞培养中，流感病毒被释放到培养液，不需要外源蛋白酶，这可以简化疫苗生产的下游处理。DuckCelt®-T17细胞系是由鸭端粒酶逆转录酶组成性表达的原代鸭胚胎细胞培养而成，在批量悬浮培养和无血清条件下生长的最高密度可达6.5X106 ml-1，培养体积可以从10 ml放大到3 L生物反应器。通过优化感染条件，使用DuckCelt®-T17细胞系培养各种人、禽和猪流感病毒，大部分可以获得高感染滴度（>5.8 lgTCID50/ml）。Dong等通过单细胞克隆从蹶鱼鱼苗的早期原代培养物中建立了新的成纤维细胞样细胞系，命名为MFF-8C1。MFF-8C1细胞在含10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中生长良好，培养的巨细胞病毒悬浮液对感染的蹶鱼具有高度毒性，是用于巨细胞病毒疫苗生产的有前途的候选细胞基质。5总结与展望引入和建立用于病毒性疫苗生产的新细胞基质是一个繁琐、耗时且成本高昂的过程，目前仍然只有少量的细胞基质可用。用于疫苗生产的理想细胞基质应当显示出“工业友好”的特性：能快速、高密度增殖，具有广泛的病毒敏感性及较高的感染滴度，保持其安全性及传代过程中的稳定性，可以满足大规模生产的需求。此外，细胞基质作为疫苗制剂的组成部分，必须满足安全和监管法规的要求，主要考虑外源因子污染、逆转录酶活性、细胞致瘤性、细胞DNA残留和蛋白残留、抗生素残留等。原代细胞虽然培养简单，可以大规模生产，但是不同个体动物的细胞在质量和病毒敏感性方面存在较大差异，培养过程中容易受外源因子污染。与之相比，传代细胞使用细胞种子库生产，经过充分鉴定和标准化，外源因子污染风险较小，有利于进行质量控制，但是存在致瘤的潜在风险。二倍体细胞无致瘤性，安全性好，但是培养难度大，难于大规模生产。新型细胞基质的研发产生了专利细胞系，可以进行无血清悬浮培养。无血清培养可以降低培养基成本，以及避免血清差异带来的批间差异，而悬浮培养可以加大细胞培养密度从而提高产量。专利细胞系适合大规模生产，但是其安全性和有效性还有待评估和验证。目前尚无细胞基质能满足所有的标准，每种新候选疫苗都需要考虑和评估不同的细胞基质，以选择最佳的细胞基质平台。作者程尧  程小玲  申瑷琳综述  施金荣审校武汉生物制品研究所有限责任公司质量控制室，武汉 430207通信作者：施金荣，Email：jrshi2002@sohu.com引用本文：程尧, 程小玲, 申瑷琳, 等. 人用疫苗生产用细胞基质使用现状及研究进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(5): 295-299.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20221108-00078识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

点击上方图片链接可报名随着社会进步和人类健康需求的提高，人用疫苗研发及生产技术发展迅速，我国在疫苗研发技术和生产工艺的改进取得了长足的发展。分别阐述了灭活病毒性疫苗、多糖蛋白结合疫苗、基因工程疫苗规模化生产工艺和技术的国内外现状和未来发展趋势。✦✦疫苗在保障国民健康和国家生物安全方面发挥了巨大作用。我国自实施计划免疫以来，传染病的发病率和死亡率得到有效控制，成功消灭了天花、脊髓灰质炎和孕妇新生儿破伤风，常见儿童传染病如麻疹、腮腺炎、风疹、百日咳、白喉、破伤风、乙型性脑炎、流行性脑脊髓膜炎等疾病的发病率和死亡率下降幅度在95% 以上，乙肝感染降到1% 以下，具有巨大的社会效益和经济效益。我国疫苗产业虽已取得了长足的进展，但疫苗产业的自主创新能力、新产品转化、关键核心技术应用、规模化生产工艺和技术水平，同发达国家相比仍有一定差距。而且随着全球经济一体化和社会的迅速发展，抗生素滥用、大气污染等多种因素影响，传染病的多发和高发态势仍然没有得到根本改变，生物恐怖的危害也不断加剧，一些重大疾病及新发、突发传染病，如艾滋病、流感、登革热、手足口病、埃博拉等仍严重威胁着人类生命健康。Part1国内外灭活病毒性疫苗的生产工艺与技术灭活病毒性疫苗为通过化学、热处理或辐射处理经培养纯化的病毒性疫苗，其主要优点是：与活病毒疫苗相比更稳定和安全，不会发生因疫苗接种而导致的感染；被灭活但仍可被机体的免疫系统识别，并产生有效的免疫应答；可用于免疫系统相对较弱的个体；稳定性较好，无需冷冻，方便运输。其缺点主要为免疫原性相对较弱，一般需进行多次接种。目前已经上市的灭活病毒性疫苗主要有脊髓灰质炎灭活疫苗、甲型肝炎灭活疫苗、流感病毒灭活疫苗、人用狂犬灭活疫苗、乙型脑炎灭活疫苗、双价肾出血热灭活疫苗（表1）[1]。表1　已上市灭活病毒性疫苗1.1细胞基质和培养方式目前国内外灭活病毒性疫苗的细胞基质主要为人二倍体细胞、原代细胞、鸡胚细胞和Vero细胞。其中人二倍体细胞主要有2BS 株、KMB-17 株、WI-38 株和MRC-5 株。各种细胞的特性不一样，培养方式也不一样。人二倍体细胞传代比例和传代代次比较受限，不利于大规模细胞培养，且对培养基和牛血清质量要求较高。原代细胞主要有地鼠肾细胞、沙鼠肾细胞，操作繁琐，存在外源因子污染风险。人二倍体细胞和原代细胞的培养方式主要为转瓶、细胞工厂，这两种培养方式较为传统，每批培养体积较小，较为费时费力，其生产规模仅仅是转瓶或细胞工厂数量上的增加，难以规模化放大。Vero细胞是第一个可连续传代的哺乳动物细胞，来源于非洲绿猴肾细胞，目前广泛用于疫苗的生产，为灭活病毒性疫苗常用的细胞基质。国内外主要采用微载体生物反应器进行Vero细胞培养。与细胞工厂培养方式相比，微载体生物反应器培养具有明显的优点：可进行高密度培养；可保证细胞在规定细胞传代限定代次内进行分级放大，易于进行规模化放大。国外已有企业建立了在8 周内从1mL 安瓶到6000L 生物反应器的Vero细胞放大生产工艺，在整个规模化放大过程中Vero细胞的产量和活性并不降低[2]。表2 显示了不同反应器规模细胞培养的生长状态。从中可以看出，在反应器内进行15 ～ 6000L 规模化放大培养时，Vero细胞密度体现较好的一致性[2]。表2　不同规格生物反应器培养Vero细胞正是由于Vero细胞在病毒性疫苗生产中的应用，使得现代病毒性疫苗的生产进入工业化、规模化时代，生产过程更加可控，批间一致性更好。目前国内外主流的以Vero细胞为基质的疫苗生产均采用微载体生物反应器培养工艺。以Vero细胞为基质生产的灭活病毒性疫苗主要有脊髓灰质炎灭活疫苗、狂犬病灭活疫苗、日本乙型脑炎灭活疫苗，目前Vero细胞还被用于小儿轮状病毒活疫苗Rotateq1（Merck）和Rotarix1（葛兰素史克）[3]、H5N1大流感疫苗Preflucel1（Baxter）[4]、日本脑炎疫苗Ixiaro1（Intercell）的生产[2]。此外，还被批准用于天花活疫苗ACAM20001（Sanofi Pasteur）的生产[2]。Vero细胞等传代细胞培养均采用含血清培养，但含血清培养对于病毒性疫苗的下游纯化也有较高的要求，需要严格控制血清中BSA的含量、纯化的回收率等一些关键的指标，所以无血清细胞培养技术成为国内外细胞培养研究热点之一。Vero细胞的研究的另一个热点是进行细胞悬浮化高密度培养。与使用微载体不同，细胞进行悬浮化培养后，细胞的贴壁特性发生了改变，细胞不需要消化可直接传代，并且可以提高细胞的发酵密度。1.2生产工艺国内外的灭活病毒性疫苗均需要经过收获、澄清、浓缩、纯化、灭活等生产工艺。其中纯化主要采用柱层析或蔗糖密度梯度离心法。这两种方式各有优缺点：层析法便于线性放大，批间一致性较好，但是试剂成本较高；蔗糖密度梯度离心法纯化的抗原成分单一，可有效区分空心和实心病毒颗粒，但每批处理量较小，后期需要除糖处理。国内外上市的灭活病毒性疫苗多采用层析纯化工艺。目前病毒灭活主要采用β-丙内酯和甲醛两种灭活剂。β-丙内酯常温下是无色黏稠状液体，主要通过作用于病毒RNA从而达到灭活病毒的效果。目前上市的疫苗中采用β-丙内酯灭活的主要有狂犬疫苗和双价肾出血热灭活疫苗。在疫苗研究初期人们就已使用甲醛进行细菌和病毒性疫苗的灭活。甲醛对于病毒核酸和蛋白质都具有破坏作用。甲醛对单链核酸的破坏最为有效，因此常被用于RNA 病毒的灭活。脊髓灰质炎灭活疫苗、甲型肝炎灭活疫苗、流感病毒灭活疫苗、乙型脑炎灭活疫苗等均采用甲醛灭活工艺。1.3质量控制灭活病毒性疫苗的主要控制指标为病毒抗原活性成分、纯度以及宿主细胞DNA、宿主细胞蛋白（HCP）、灭活剂等的残留成分控制。纯度的检测方法主要有HPLC、SDS-PAGE 或比活等指标。其中不同疫苗对Vero细胞残余DNA 含量要求不太统一，WHO生物学标准化专业委员会评估残留DNA引起的转化事件的风险后认为注射产品的DNA含量每剂小于10ng均可以接受[5]。目前，国内的狂犬疫苗等中的Vero细胞残余DNA含量标准为每剂不高于100pg。但美国上市的IPV（IPOL®，Sanofi Pasteur）Vero细胞残余DNA含量每剂低于10pg。国内上市的sIPV DNA含量为每剂不高于50pg。Vero细胞HCP含量一般为每剂不高于50ng。Part2多糖蛋白结合疫苗规模化生产工艺与技术2.1国外行业现状2.1.1　肺炎球菌结合疫苗目前，全球已上市的肺炎球菌结合疫苗有3 种，分别是惠氏（Wyeth）公司生产的7 价肺炎球菌结合疫苗Prevnar7（2000 年上市）和13 价肺炎球菌结合疫苗Prevnar13（2010 年上市），以及葛兰素史克公司生产的11 价肺炎球菌结合疫苗Synfl orix（2009 年上市）[6-8]。（1）PrevnarPrevnar7 配方中包括了4、6B、9V、14、18C、19F、23F 共7 个血清型的结合物，Prevnar13 包括了1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F 共13 个血清型的结合物，比Prevnar7 多6 个型别的结合物（1、3、5、6A、7F、19A），两者均以CRM197 为载体蛋白，均为磷酸铝佐剂吸附剂型。惠氏公司结合物制备采用的工艺路线为：将天然多糖进行酸水解降低分子量至适宜范围（有些型多糖在氧化反应中自行降解，不需要预先进行水解），用高碘酸钠氧化多糖邻羟基使多糖重复单位产生醛基，醛基与CRM197 分子上的氨基，在还原剂（如NaBH4）存在的条件下发生还原胺化反应生成酰胺键，该方法被称为还原胺化法。这种方法的优点是对多糖重复单位上的邻羟基进行可控的修饰，不破坏多糖分子的其他结构，易于质控。缺点是还原胺化反应需要的时间较长，有的型结合反应需要5d。在0.5mL Prevnar13 中，有12 种血清型多糖各2μg，4μg 6B型多糖，0.125mg 磷酸铝佐剂。Prevnar13的剂型为不含胶乳的单剂预充式注射器灌装注射液[9-10]。（2）Synfl orixSynfl orix 配方包括1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F 共10 个血清型结合物。该产品使用了3 种不同的载体蛋白，其中1、4、5、6B、7F、9V、14、23F 载体蛋白为不可分型流感嗜血杆菌表面蛋白D（PD），19F 载体蛋白为白喉类毒素（DT），18C 载体蛋白为破伤风类毒素（TT）。剂型同样为磷酸铝佐剂吸附剂型（0.5mg 磷酸铝佐剂/ 剂）。每剂疫苗含1、5、6B、7F、9V、14、23F 这7 个血清型多糖各1μg，4、18C、19F 各3μg。所采用的技术路线为对除5、6B、23F 这3 个型外的其他天然多糖分子进行微流化（microfl uidization）处理以降低分子量，在不同条件下用1- 氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸盐［1-cyano-4-（dimethylamino）pyridinium tetrafl uo-roborate，CDAP］将多糖的羟基活化为氰酸酯，活化后的多糖的氰酸酯通过与载体蛋白或己二酸二酰肼（adipicdihydazide，ADH）衍生的载体蛋白的氨基或肼基形成异脲衍生物而实现结合。其原理与传统的溴化氰活化法相同，但活化条件更加温和，活化物副反应发生率低，对多糖的结构改变较少。与还原胺化法相比，耗时少。此方法的缺点是活化时间仅几十秒，要在这几十秒内对溶液迅速变化的pH 进行控制并不容易，由于多糖活化和结合是连续完成的，难以对多糖活化进行有效质控，反应条件偏碱性，对多糖上碱性条件敏感的基团难免会造成破坏，结合载体蛋白利用率不高[11]。2.1.2　脑膜炎球菌多价结合疫苗当前国际上脑膜炎球菌结合疫苗的发展趋势为包含A、C、Y、W135 等4 个血清群的多价结合疫苗，目前全球已上市的有3 家产品，分别为赛诺菲巴斯德的Menactra、诺华的Menveo（2014 年被葛兰素史克收购）、葛兰素史克的Nimenrix。此外，还有一种联合疫苗，葛兰素史克的C、Y 群脑膜炎球菌与b 型流感嗜血杆菌结合疫苗，其产品名为Menhibrix。（1）Menactra液体剂型，2005年获得批准上市，规格为0.5mL，其中含A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖各4μg，含载体蛋白白喉类毒素DT约48μg。其基本工艺路线为：①用弱酸和双氧水水解多糖，制备多糖水解物；②各群多糖水解物分别按照不同工艺进行衍生（A 群衍生物为多糖溶液中加入EDAC 和ADH，在A 群多糖的磷酸基团上连接肼基。C 群、Y 群、W135 群衍生物为利用氰基硼氢化钠将ADH 与多糖的末端醛基结合，衍生出肼基。然后多糖衍生物溶液加入EDAC，直接与DT 结合）。（2）Menveo2010 年获得批准上市。A群为冻干剂型，C、Y、W135 群为液体剂型，规格为0.5mL。每剂含A群多糖10μg，C、Y、W135 群多糖各5μg，载体蛋白为CRM197 蛋白。其基本工艺路线为：首先多糖用弱酸水解为分子量约为12 ～ 16 个重复单位的片段；在还原剂作用下，将多糖的末端醛基还原成氨基；然后经酯化产生末端活性酯基团；最后与CRM197 结合[12]。（3）Nimenrix2012 年获得批准上市，为冻干剂型，蔗糖作为赋形剂。每剂含A、C、Y、W135 群多糖各5μg，载体蛋白为破伤风类毒素。其基本工艺路线如下。①将荚膜多糖进行降解。②采用氰基活化法活化多糖。③ A 群和C 群结合：多糖用CDAP 活化后与ADH 进行衍生，然后与TT结合；④ Y 群和W135 群结合：用CDAP 活化后直接与TT 结合。（4）Menhibrix2012 年获得批准上市。为冻干剂型，赋形剂为蔗糖。每剂含b 型流感嗜血杆菌荚膜多糖2.5μg，C、Y 群多糖各5μg。载体蛋白为破伤风类毒素。每剂含12.6mg 蔗糖。2.2国内行业现状2.2.1　13 价肺炎球菌结合疫苗国内企业尚无上市的产品，当前进度领先的为玉溪沃森，已经完成Ⅲ期临床疫苗的接种工作，兰州生物正在进行Ⅱ期临床研究，民海生物也已进入了临床研究。2.2.2　AC 群脑膜炎球菌结合疫苗我国在20 世纪80 年代已开始研发A 群脑膜炎球菌结合疫苗（TT 为载体），上海生物制品研究所采用的先将蛋白质衍生后与多糖偶联的工艺，动物实验表明该法可增强结合物中多糖的免疫原性[13]，但研究未能进一步持续下去。后来国内多使用先将多糖衍生，再与蛋白质载体偶联的方法研制脑膜炎球菌结合疫苗。2006 年以来我国先后有4 家企业的AC 群脑膜炎球菌结合疫苗获准生产（表3）。这些产品都以TT 为载体，每剂每群多糖含量为10μg，以乳糖为保护剂；均采用氰基活化法进行多糖的衍生；结合物都采用柱层析纯化工艺。表3　我国已上市的AC 群脑膜炎球菌结合疫苗2.2.3　ACYW135 群脑膜炎球菌结合疫苗ACYW135 群脑膜炎球菌结合疫苗在国内尚未形成上市产品，据统计，国内已有6 家企业获得临床研究批件并进入临床阶段。进度最快的已经完成Ⅲ期临床研究，正在进行数据统计。Part3基因工程疫苗规模化生产工艺和技术基因工程疫苗是指使用DNA 重组技术，改造病原微生物的基因组，以降低其致病性，提高其免疫原性；或者将病原微生物基因组中的一个或多个保护性抗原编码的基因片段克隆到表达载体，通过原核或真核表达系统诱导表达外源蛋白，经纯化等工艺步骤制成疫苗，接种动物产生保护性抗体，达到防治传染病的目的。近年来，随着分子生物学、反相遗传学和结构生物学等理论研究和技术方法的不断突破，以及专业仪器的不断升级，基因工程疫苗的进展也日新月异。目前利用基因工程技术已经使用和正在研制开发的新型疫苗主要有基因工程亚单位疫苗、基因工程活载体疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗、转基因植物疫苗等，这些疫苗统称为基因工程疫苗。与传统疫苗相比，基因工程疫苗具有如下诸多优势：①抗原成分明确，表达通路清楚可控，安全性高；②生产成本低，工艺步骤稳定，易于规模化放大；③质量控制的方法和标准具有一定通用性，从而提高安全性；④通过载体或抗原蛋白的上游设计，可构建能够对多种疾病产生保护的多价疫苗。现在基因工程疫苗已成为生物制品产业发展的一种趋势，在各种疾病的防控方面发挥重要作用。基因工程疫苗的生产技术流程包括四个步骤：上游保护性抗原/ 表位和表达载体设计，基因工程菌/ 细胞构建，大规模发酵培养，目的蛋白纯化。基因工程蛋白的研发和规模化生产进入门槛高，尤其是建立工业规模生产平台，需要技术、人才和资本的多年积累。其中，高表达工程菌株/ 细胞株的构建和下游生产纯化工艺是关键技术[14]。以提高单位制品产量、细胞高密度培养及表达[15]、简化生产工艺、降低生产成本、保证大规模生产制品质量为目的的核心工艺开发已成为各大生物公司竞相开展的前沿课题。3.1国外基因工程疫苗规模化生产工艺与技术国际上一些知名疫苗制造企业在基因工程疫苗的制备方面已开始逐渐走向工艺规模化、自动化和一次性化制备阶段。工艺的规模化情况在一定程度上反映了制造工艺的先进性和稳定性。在大幅降低了疫苗产品成本的同时也降低了疫苗批间质量差异带来的风险。规模化培养是常规疫苗生产领域的主要技术，目前国际主流的培养规模为3000 ～8000L，多采用批式或批式加量培养，进行计算机二级控制，实现完全自动化[16]。近几年，针对不同宿主细胞特点和疫苗制品生产工艺，用于疫苗生产的个性化细胞培养基的需求不断增加，市场供求已趋于正规化。自动化是规模化生产的目标和趋势，即采用自动化的分离纯化体系，包括细胞破碎、微滤、超滤和层析等技术，同时，整体柱、移动模拟床色谱、膜色谱等新兴技术也逐渐应用于规模化生产中。自动化的优点在于生产过程中减少人力成本，提高效率，降低人为操作误差及污染风险。一次性产品包括规模化生产过程中接触制品的装置、器具和耗材，其应用可使制品质量可控、便于验证。一次性细胞培养反应器已发展为生物医药（包括疫苗）产品生产的主要形式，其发展对于降低疫苗生产成本、提高经济效益、确保制品的安全具有重要意义。国外疫苗生产企业多采用“个性化”服务的方式与某些企业合作建立一种“协议服务”的商业关系。通过模块化、平台化操作研制最适合自身产品特点的个性化技术应用于生产实践，厂家为客户提供最优化的技术服务以及相关的技术支持，例如定制培养基、定制层析介质等，帮助其提高产能，实现生产效率的大幅度提升[16]。规模性自动化、多参数系统化的疫苗生产技术平台为疫苗生产效率提高、生产工艺的一致性以及疫苗质量的稳定提供了保障。3.2国内基因工程疫苗规模化生产工艺与技术中国生物医药企业起步于20 世纪80 年代初期，经过30 年的努力，生物医药产业取得一定发展，生物产业已初具规模，在发展中国家属于较高水准。但我国疫苗的规模化生产工艺研究起步较晚，大多处于半自动化阶段，其根本原因在于，研发人员在“研究和生产的关联意识”和“质量源于设计”等理念上认识的差距，致使初期的研发设计与规模化生产制备脱节。临床前期的研究很少考虑到工艺的可放大性和终产品质量的可控性。制备工艺往往仅限于实验室规模，不适合规模化生产。如纯化工艺中，实验室研究阶段广泛的采用超速离心和亲和层析法，均为间断性操作且费用较高，很难应用于生产。随着国外疫苗研发和生产企业在国内广泛设厂投产及国内疫苗质量控制监察体系的不断完善，这方面差距在逐渐缩小。此外，疫苗生产用表达系统和宿主细胞方面，国外的研发机构通常拥有专利技术保护，具有相对成熟的技术储备；规模化生产的仪器设备方面，无论是高密度发酵的生物反应器还是规模化分离纯化的层析介质、膜分离技术[17]，几乎所有的关键仪器设备都依赖进口，这极大地限制了我国疫苗规模化发展的进程。基因工程疫苗领域重点在于上游设计，在疫苗研发初期综合考虑工艺放大可行性、质量可控性甚至厂房和设备需求，可迅速实现规模化生产占领市场，同时降低生产成本，提高生产效率，确保安全。因此，相比传统疫苗，我国的基因工程疫苗更容易在产业化能力方面与国际接轨。Part4未来发展趋势与展望4.1灭活病毒性疫苗技术和工艺的发展趋势灭活病毒性疫苗技术和工艺的发展趋势主要体现在以下几点。产业化与规模化程度进一步提高，微载体生物反应器规模更大、高密度发酵技术参数的优化等；新型细胞基质研究，进一步提高细胞基质的安全性和培养浓度；细胞和病毒培养基的优化，包括无动物来源的培养基配方研究等；纯化技术的进一步提高，最大限度提高目标抗原纯度和比活；利用反向遗传学等技术进行疫苗生产用毒株的改造。4.2多糖蛋白结合疫苗技术和工艺的发展趋势使用符合欧盟标准的原料多糖, 并在此基础上把原料多糖的C 多糖、残余蛋白和核酸含量控制在1% 以内。载体蛋白质使用精制后进一步纯化的TT，TT 单体含量达到90%，并使用基质辅助激光解吸- 飞行时间（MALDI-TOF）质谱技术检测蛋白质准确的分子量和单体含量。通过这些技术研发，使结合效率提高至30% ～ 40%，建立新的过程质量控制方法和临床效果评价方法，与国际接轨。4.3基因工程疫苗技术和工艺的发展趋势目前以基因工程制品为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景广阔。基因工程制品主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核苷酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程制品起到了传统化学药物难以达到的作用。中国生物医药市场将成为仅次于美国的全球第二大生物医药市场，预计在10 年创新发展的基础上，基因工程疫苗行业将迎来最佳时期。同时，基因工程疫苗的产业化也面临不小的挑战。由于在规模化方面中国长期以来以仿制为主，没有形成具有技术优势的领域，不能发挥技术的累积效应，制约了具有自主知识产权的产品的研发。因此， 面对国际新药研发的过程细化精准， 拥有自主知识产权，并依托研发产品的创新性平台技术是基因工程疫苗规模化生产的重中之重。平台技术的延续性和创新性将为更多基因工程疫苗的开发提供更广阔的发展空间。参考文献［1］ 普洛特金. 疫苗学[M]. 梁晓峰，罗凤基，封多佳，译. 北京：人民卫生出版社，2011.［2］ BARRETT P N，MUNDT W，KISTNER O，et al. 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