LMB-100

摘要：抗体药物偶联物（ADCs）是现代药物开发中增长最快的肿瘤药物类别之一。通过结合细胞毒性化疗和靶向治疗的优势，ADCs在提供将高效细胞毒性药物传递给表达预定细胞表面靶标的癌细胞方面具有独特性。在肺癌领域，近年来治疗模式发生了巨大变化，现在ADCs已成为肺癌患者的潜在选择。自2020年以来，首个用于非小细胞肺癌（NSCLC）患者的ADC已获得FDA批准（曲妥珠单抗deruxtecan），另外两个ADC已获得FDA突破性疗法认定，目前正在评估中（帕妥珠单抗deruxtecan，替利珠单抗vedotin）。此外，几项早期阶段的试验正在评估各种新型ADCs，无论是作为单药治疗还是与晚期肺癌的联合治疗，预计更多选择性和效力更强的ADCs将很快成为临床上的治疗选择。在这篇综述中，我们讨论了ADCs的结构和作用机制，包括来自临床前工作的见解；我们总结了ADCs在肺癌方面的最新进展，描述了ADCs的毒性概况，并探讨了旨在增强ADC效力和克服抗性的战略。此外，我们讨论了在肺癌中感兴趣的新型ADC策略，包括非细胞毒性载荷，如免疫调节剂和抗凋亡剂。 1.引言 抗体药物偶联物（ADCs）可以说是肿瘤药物开发中增长最快的类别，尽管这不是一个新概念，但其改变临床实践的潜力是巨大的。在肺癌领域，近年来治疗模式发生了巨大变化，现在包括了靶向治疗、免疫治疗和系统性化疗，而ADCs现在也作为潜在选择加入了肺癌患者的治疗列表。 ADCs在提供将高效细胞毒性药物传递给表达预定细胞表面靶标的癌细胞方面的潜力是独特的，从而结合了细胞毒性化疗和靶向治疗的优势。因此，ADCs是精准肿瘤学的代表，利用这些靶向特性可以大大增强附着的有效载荷的治疗指数，这些化合物如果单独使用则毒性太大。ADCs由三个关键部分组成，是现代药物开发的“制导导弹”，包括（1）选择性结合肿瘤细胞表面的抗原的单克隆抗体，（2）细胞毒性药物载荷，以及（3）可切割或不可切割的连接子。 至今，已有十二种ADCs获得了FDA在肿瘤学领域的批准（表1），其中自2017年以来有九种获得了批准，这一类别的开发速度正在加快。 在这篇综述中，我们讨论了ADCs的结构和作用机制，包括来自临床前工作的见解；我们探讨了ADCs在肺癌中的活性，并总结了ADCs在临床中的最新进展（表2），描述了这些化合物当前的挑战和毒性概况；最后，我们探讨了潜在的联合策略以及其他旨在增强ADC效力和克服抗性的战略。 2.结构 ADCs在动物模型中的使用最早在20世纪60年代报道，但直到20世纪80年代才开始进行基于小鼠免疫球蛋白G（IgG）分子的ADCs的首次临床试验。经过五十多年的研究，最初的承诺终于实现——第二代ADCs brentuximab vedotin（由Seattle Genetics在2011年开发）和trastuzumab emtansine（也称为ado-trastuzumab emtansine或TDM1，由Roche在2013年开发）的批准为目前大量临床试验铺平了道路，这些试验正在研究临床上潜在的ADCs。许多最近的下一代ADCs对治疗难治性癌症有令人印象深刻的活性，尽管仍有限制，例如与治疗相关的毒性、不充分的生物标记物选择和获得性抗性，但对这个治疗方法有理由保持乐观。 作为一类药物，所有ADCs都由三个主要部分组成：一个结合肿瘤相关抗原的抗体、一个细胞毒性载荷和一个连接两者的连接子（图1）。这三个组成部分在不同的ADCs之间可能不同，可能导致对比鲜明的药理学和临床特性。 图1 典型的抗体药物偶联物的结构和组成部分，包括单克隆抗体、连接子和载荷。抗体：嵌合/人源化单克隆IgG抗体，针对肿瘤细胞表面优先表达的蛋白质。连接子：确保载荷在血浆中附着在抗体上，但在肿瘤细胞中有效释放。连接子可以是可切割的（通过肿瘤相关因子）或不可切割的（溶酶体降解）；载荷：增强细胞毒性，尽管不同的药物：抗体比例影响效力和清除率。ADCs的抗体组分与免疫效应细胞结合，引发抗肿瘤免疫，包括补体依赖性细胞毒性（CDC）、抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）效应。MC 马来酰亚己基，MCC 马来酰亚甲基环己烷-1-羧酸盐；MoA 作用机制。 3.作用机制 ADCs的作用机制复杂，涉及抗体与目标抗原的结合、随后的内化、连接子分解和细胞内载荷释放，虽然这看起来是一个简单的过程，但实际情况更为复杂。与其他现代癌症治疗中的药物不同，ADCs需要癌细胞的作用才能发挥最大的效力。 ADCs是精准医学的代表——“生物制导导弹”，可以特异性地靶向肿瘤细胞并诱导细胞死亡，允许将药物传递到特定选择的肿瘤细胞，同时减少非靶标事件的好处。在ADCs中，单克隆抗体特异性地结合肿瘤细胞上表达的目标抗原；然后ADC被肿瘤细胞内化，最终与溶酶体融合，允许释放细胞毒性物质，最终通过靶向DNA或微管导致细胞死亡或凋亡（图2）。 图2 抗体药物偶联物的作用机制。ADCs选择性地将有毒载荷输送到肿瘤细胞，导致细胞死亡。ADCs的“旁观者效应”改变肿瘤微环境，以增强细胞杀伤。 一些载荷产生旁观者效应，其中自由药物在内化和降解ADC后无意中从目标肿瘤细胞穿过细胞膜释放，杀死相邻的肿瘤细胞，包括那些可能不在细胞表面表达目标抗原的细胞。ADCs的这一特性经常受到讨论，一些药理学特性，如亲脂性载荷或可切割的连接子，在这一现象中似乎起着重要作用。 当释放的细胞毒性载荷可渗透或跨膜时，它也可以诱导“旁观者效应”，这可以提高ADC的效力。此外，ADCs的旁观者效应还可能改变肿瘤微环境，反过来可能进一步提高ADCs的杀伤效果。而且，关于旁观者效应，一些载荷的化学特性，例如亲脂性、疏水性和未带电的载荷，对ADCs的膜渗透性很重要，允许从ADC靶向的肿瘤细胞分布到非靶向的肿瘤细胞。 如上所述，连接子类型，如与赖氨酸残基的结合，也可能导致减弱的旁观者效应，因为带电残基可以促进药物在靶向肿瘤细胞内的停留。在ADC设计中需要考虑的重要因素包括目标细胞选择、抗原的性质、抗体的结构和稳定性、连接子化学以及细胞毒性载荷。 3.1.抗体和抗原 抗原的选择和适当抗体的选择是ADC设计的重要组成部分。首先，根据分子靶标选择抗体。最好是抗体识别肿瘤部位过度表达的目标，以避免不恰当地将载荷传递到非靶标部位，因为ADCs旨在将它们的有毒载荷传递到表达目标抗原的任何细胞。例如，(Erb-B2受体酪氨酸激酶2)(ERBB2或HER2)在肿瘤组织中的表达量是非癌症组织的100倍以上。TROP2和nectin 4是进一步的临床例子，这些蛋白质虽然在非癌症组织中有一定程度的表达，但被肿瘤细胞过度表达的程度显著增加。其次，抗体所针对的抗原应在癌细胞上存在高拷贝数（>10^5/细胞）。人IgGs包括四个亚类——IgG1、IgG2、IgG3和IgG4——它们在恒定区和铰链区有所不同；此外，亚类之间的微妙变化影响抗体的溶解度和半衰期，以及它们对免疫效应细胞上表达的不同Fcγ受体的亲和力。大多数现代ADCs基于IgG1架构开发，因为与其他亚类相比，IgG1在溶解度、血清半衰期和Fcγ受体结合亲和力方面最佳结合。 其他生物过程也影响ADC活性，包括目标转换率、内化、溶酶体处理和降解。例如，较高的目标转换率可以导致更有效的药物传递和目标补充，从而增加抗肿瘤活性。此外，仅在癌细胞表面存在的致癌靶标，不太可能通过降低表达作为药物抗性的机制，因此可以被利用为额外的ADC活性。肿瘤异质性是另一个考虑因素：在HER2阳性乳腺癌中，与均匀HER2表达的患者相比，具有高水平肿瘤内或肿瘤间异质性的患者对ado-trastuzumab emtansine（TDM1，曲妥珠单抗-DM1）的反应较差。 3.2.连接子 连接子将抗体与载荷连接起来，是与ADC的稳定性和载荷释放特性相关的关键因素。根据它们的切割机制，连接子被分类为可切割和不可切割，对ADC的最终治疗指数至关重要。可切割连接子被设计为响应与肿瘤相关的因素而分解并释放ADC的细胞毒性载荷；因此，利用肿瘤细胞和系统循环之间的差异，以一种有指导、精确的方式释放载荷。可切割连接子分为两类，化学（包括二硫键和腙键）和酶连接子（肽键和葡萄糖苷酸键）。腙是一种pH敏感的连接子，允许ADC在系统循环中保持稳定，并在特定的pH下被水解（例如，pH 4.8在溶酶体中诱导载荷释放）。因此，可切割连接子的降解可以根据许多特定特征而变化，无论是在目标细胞外部还是内部，如外部pH（酸敏感连接子）、特定的溶酶体蛋白酶（蛋白酶可切割连接子）或谷胱甘肽还原（二硫键连接子）。 最近的可切割连接子（例如，enfortumab vedotin、sacituzumab govitecan、trastuzumab deruxtecan (T-DXd)）在系统循环中是稳定的，与不可切割连接子形成对比，例如ado-trastuzumab emtansine (TDM1)。不可切割连接子同时由稳定键组成，这些键对血液中的蛋白水解更具有抵抗力；ADCs被溶酶体或蛋白酶内化并随后抗体降解后，发生切割，然后导致载荷的释放。例如，TDM1是一种使用不可切割连接子（基于硫醚）的ADC，由抗HER2单克隆抗体通过基于硫醚的连接子与DM1（mertansine）连接。TDM1中的不可切割连接子允许ADC在系统循环中保持稳定，然后在抗体降解后释放活性药物，DM1的代谢物，赖氨酸-MCC-DM1。在不可切割连接子中，例如与赖氨酸残基的结合，一些带电残基可以促进药物在靶向肿瘤细胞内的停留，从而减弱旁观者效应。 3.3.载荷 载荷是ADC被内化时对肿瘤细胞施加强大细胞毒性的部分。要用作载荷，需要具有高效力，IC50在纳摩尔和皮摩尔范围内；此外，它们应在生理条件下稳定，并且具有可用于与抗体偶联的功能团。现代ADC载荷大致可分为四类——auristatins（抗微管蛋白）、maytansinoids（抗微管蛋白）、calicheamicins（DNA切割）和camptothecins（拓扑异构酶1抑制）（图1）。通常，这些载荷作用于DNA结构，并通过凋亡机制（拓扑异构酶1抑制剂、calicheamicins）诱导细胞死亡，或影响细胞的微管结构（auristatins和maytansinoids），通过抑制微管聚合诱导G2/M期阻滞和凋亡。无论类别如何，这些药物通常是具有纳摩尔和皮摩尔范围内IC50的强效细胞毒性化合物，如果系统给药将导致严重的毒性。目前正在临床试验中测试的ADCs中，几乎三分之二的细胞毒性载荷基于auristatins或maytansinoids。例如，单甲基auristatin E (MMAE)是一种微管蛋白不稳定剂，已被纳入几种ADCs，如brentuximab vedotin和telisotuzumab vedotin。Maytansinoids，如DM1，与微管蛋白结合并破坏微管稳定性。 非细胞毒性载荷现在正在出现，正在研究的免疫调节载荷就是一个例子。被称为免疫刺激抗体偶联物（ISACs），这些药物旨在促进肿瘤退缩并诱导肿瘤抗免疫。ISACs包括非细胞毒性载荷，激活髓系抗原呈递细胞，以不同于检查点阻断的机制刺激免疫系统。SBT6050就是这样一个例子，它针对HER2并带有toll样受体（TLR）8激动剂载荷。TLRs是先天免疫中的重要受体系统，在肿瘤和先天免疫之间的相互作用中发挥重要作用。TLR7和/或TLR8的激活可以引起一系列信号通路的诱导，这反过来可以激活例如NF-κB，导致细胞因子和趋化因子的分泌，并激活淋巴细胞。BD-C1001是一种新型HER2靶向TLR7/8 ISAC，目前正在早期临床试验中进行研究（NCT04278144），无论是作为单药治疗还是与免疫检查点抑制剂联合用于治疗晚期HER2驱动的癌症。实际上，目前有许多正在进行的临床试验使用免疫检查点抑制剂与ADCs联合，以增加这些药物的效力，并可能增强免疫治疗活动。例如，ImmunoTAC平台由Silverback Therapeutics开发；这包括一些ISACs，使用TLR8激动剂作为载荷（例如，SBT6050、SBT6290和SBT8230）。干扰素基因刺激剂（STING）激动剂是另一种新型载荷，XMT-2056来自Mersana和CRD5500来自Takeda是正在临床开发的突出STING激动剂ADC项目。 3.4.药物-抗体比率 药物-抗体比率（DAR）是每个单克隆抗体上连接的有效载荷的平均数量。这一特性在ADCs之间变化，并通知了ADC的药理学和活性。现在正在进行的努力集中在可能通过利用分子的结构来增强ADC活性的活动上；增加DAR就是这样一个例子，增加旁观者效应是正在探索的另一种策略。Camptothecins，如sacituzumab govitecan，就是增加DAR被利用为成功策略的一个例子。Sacituzumab govitecan是一种ADC，将抗Trop2抗体与SN-38偶联，这是irinotecan的活性代谢物，活性几乎是irinotecan的1000倍，因此，由于其毒性和溶解度差，不能作为未结合药物给药。Fam-trastuzumab deruxtecan-nxki是另一个在诊所中有前景的高活性ADC的例子，具有高DAR 8，这可能是推动其活性的原因。 4.肺癌中已建立的ADC靶点 4.1.HER2 人表皮生长因子受体2（HER2）是一种跨膜蛋白，由erb-b2受体酪氨酸激酶2（ERBB2）基因编码，属于ErbB或表皮生长因子受体（EGFR）家族。HER2在乳腺癌和胃癌中已是成熟靶点，其过度表达也与多种癌症相关，如肺癌、卵巢癌、结直肠癌和唾液腺肿瘤。HER受体既作为单体存在，也作为二聚体存在，无论是同源或异源二聚体，配体结合到HER1、HER3或HER4会迅速诱导受体二聚化。尽管HER2没有已知的配体，但它是与其他HER成员形成异源二聚体的首选伙伴，这导致激活HER信号通路。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，记录的HER2变异包括HER2基因扩增、HER2突变和HER2蛋白过度表达。HER2蛋白过度表达的频率在文献中差异很大，尽管据报道在高达20%的NSCLC患者中观察到，并且与较差的生存结果相关。可靶向的HER2突变发生在约2%的晚期NSCLC病例中。 曲妥珠单抗依美坦辛（TDM1） TDM1是一种ADC，由抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗通过不可切割的硫醚连接子（马来酰亚甲基环己烷-1-羧酸盐（MCC））连接到细胞毒性载荷DM1（依美坦辛）。自2013年以来，TDM1已作为单一药物获批用于治疗转移性HER2阳性乳腺癌，并随后在肿瘤中进行了研究。在晚期NSCLC中，TDM1在II期篮式试验中使用，导致具有激活HER2突变的患者总体反应率（ORR）为44%，中位无进展生存期（PFS）为5个月；39%的患者实现了疾病稳定。此外，治疗耐受性良好，不良事件主要是1或2级。尽管如此，TDM1尚未在这种情况下获得FDA批准，尽管它被纳入NCCN指南作为晚期预处理NSCLC具有激活HER突变的推荐（证据类别2A）。 Fam-trastuzumab deruxtecan（Enhertu，T-DXd） Fam-trastuzumab deruxtecan（T-DXd）是一种ADC，包含人源化抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗，通过可切割的肽连接子（DAR为8）连接到拓扑异构酶抑制剂deruxtecan（DXd）。可切割连接子、膜通透性细胞毒性载荷与高DAR的结合，增加了对邻近细胞的活性，是ADC结构的关键特征，并允许T-DXd在具有异质性HER2表达的癌症中使用，因此，肺癌是这种化合物的主要候选。这一观察在预临床模型中得到证实，T-DXd在对TDM1不敏感的PDX模型中证明是有效的。 T-DXd在晚期HER2表达或HER2突变实体瘤患者中的I期剂量递增和剂量扩展研究包括18名NSCLC患者，包括具有激活HER2突变或HER2表达的肿瘤（定义为IHC ≥ 1+或通过原位杂交或下一代测序扩增）50。其中10名患者实现了部分缓解（ORR 55.6%），中位PFS为11.3个月，中位反应持续时间（DOR）为10.7个月50。在HER2突变NSCLC患者中，ORR为72.7%（n = 8），其中6名患者有第20外显子插入；mPFS为11.3个月，mDoR为9.9个月。在这些令人印象深刻的数据之后，HER2过度表达或HER2激活突变的晚期NSCLC患者被纳入了单臂国际II期DESTINY-Lung01试验。 对HER2过度表达队列的中期分析（中心确认过度表达HER2，IHC 2+或3+）显示，在49名经过大量预处理的HER2过度表达NSCLC患者中，初步证据显示抗肿瘤活性。包括有稳定脑转移的患者，34.7%在入组时有CNS转移；79.6%的患者有HER2 IHC 2+，20.4%有HER2 IHC 3+。独立审查委员会（ICR）确认的总体反应率（ORR）为24.5%（95% CI，13.3%–38.9%），包括1例完全反应（CR）。反应率根据HER2表达的不同而变化：IHC过度表达3+的患者ORR为20.0%（95% CI，2.5%–55.6%），IHC 2+为25.6%（95% CI，13.0%–42.1%）；IHC 3+，中位DOR为6.0个月（95% CI，3.2-NE个月）。疾病控制率（DCR）为69.4%（95% CI，54.6%–81.8%）；估计的中位PFS为5.4个月（95% CI，2.8–7.0个月）。在DESTINY-Lung01（NCT03505710）试验的HER2突变NSCLC队列中产生了更令人印象深刻的反应51。55%的患者发生确认的客观反应（95% CI，44–65），有1例CR，34名患者（37%）疾病稳定（SD）≥ 6周，DCR 92%。观察到的反应多样化，在具有不同HER2突变亚型和跨外显子位置的患者中均有显示；此外，在没有可检测HER2表达和没有HER2扩增的患者中也观察到反应。中位PFS为8.2个月（95% CI = 6.0–11.9个月），中位OS为17.8个月（95% CI = 13.8–22.1个月）51。 安全性概况通常可控，包括ILD，尽管确实发生了两例与治疗相关的死亡，均为ILD相关。大于3级的毒性发生在46%的患者中；这些中记录最多的包括中性粒细胞减少、贫血、恶心和疲劳（分别为19%、10%、9%和7%）。观察到的毒性通常与之前报告的临床试验一致，药物相关不良事件导致25%的患者中断研究药物，包括肺炎13%和ILD 5%，药物相关ILD发生在26%的患者中51。 2022年8月11日，食品药品监督管理局授予T-DXd加速批准，用于治疗携带激活性HER2（ERBB2）突变的NSCLC患者，这些患者已通过FDA批准的测试检测到突变，并且已接受过先前的系统治疗，这代表了首个获批用于HER2突变NSCLC的药物。 4.2.HER3 HER3是ErbB/HER蛋白激酶家族的成员，虽然HER3本身不是致癌蛋白且缺乏酪氨酸激酶活性，但HER3与其他RTKs异源二聚体化，通过PI3K/AKT/mTOR途径激活肿瘤信号，还有MEK/MAPK、Jak/Stat、Src激酶信号，导致细胞增殖并最终促进癌细胞存活、增殖和进展。HER3表达还可以介导对靶向治疗的抵抗（例如，通过维持HER3介导的PI3K/AKT信号激活，对肺癌中EGFR靶向治疗的抵抗）。受体酪氨酸蛋白激酶erbB-3（HER3）在多种实体瘤中表达，并已在83%的原发性NSCLC肿瘤中报告。HER3表达还与转移性疾病进展和患者无复发生存期减少相关，因此，HER3是NSCLC中的一个有吸引力的治疗靶点，特别是由于其在介导对靶向治疗抵抗方面的潜在功能作用。 Patritumab deruxtecan Patritumab deruxtecan (U3-1402, HER3-DXd) 是一种新型的针对HER3的ADC，由针对HER3的人IgG1单克隆抗体 patritumab 与拓扑异构酶 I 抑制剂载荷 (MAAA-1181a, 一种exatecan衍生物) 通过稳定的四肽基可切割连接子共价连接，具有高DAR比率45,59。载荷非常强大，系统半衰期短，细胞膜通透，这允许旁观者杀伤效应，影响目标和周围肿瘤细胞60。基于在多种实体瘤异种移植模型中展示HER3-DXd抗肿瘤活性的有希望的临床前数据61，一项I期研究在局部晚期或转移性EGFR驱动的NSCLC患者中启动，这些患者之前接受了EGFR TKI和基于铂类的化疗 (NCT03260491)，最终在2021年12月获得了FDA突破性疗法认定 (BTD)。 在研究报告的剂量递增部分，在接受HER3-DXd 5.6 mg/kg IV Q3W的57名患者中，确认的ORR为39% (95% CI, 26.0–52.4)，中位PFS为8.2 (4.4–8.3)个月，mDOR为6.9个月62。在已知和未知EGFR TKI耐药机制的患者中观察到反应，并且在一系列HER3表达范围内观察到反应，以至于HER3表达水平没有明显区分应答者与非应答者62。接受过奥希替尼和基于铂类的化疗的患者显示出与整体人群相似的疗效，脑转移患者也是如此62。最常见的≥3级TEAE是血液学毒性，包括血小板减少 (28%) 和中性粒细胞减少 (19%)。只有4名患者 (5%) 经历了与治疗相关的ILD，没有一例是4级或56。 最近报告的剂量扩展安全性和活性数据证实，HER3-DXd 5.6 mg/kg为接受大量预处理的晚期EGFR驱动的NSCLC患者提供了有希望的初步抗肿瘤活性和安全性证据63。大多数患者 (n = 49, 86%) 之前接受过奥希替尼治疗，包括有稳定CNS转移的患者 (n = 27, 47%)。ORR为25% (14/56; 14.4–38.4)，包括1例CR (1/56, 2%)，在13/56 (23%)中PR，25/56 (45%)中SD63。有趣的是，跨各种EGFR TKI耐药机制观察到疗效，包括EGFR C797S突变、MET扩增、HER2突变、BRAF融合和PIK3CA突变。达到了70%的DCR (39/56, 范围 55.9–81.2)，DoR为7个月 (3.0–7.0)。 总体而言，HER3-DXd的安全性概况是可控的，最常见的≥3级治疗中出现的不良事件是血液学的。治疗相关的ILD (5%) 发生频率与之前EGFR-TKIs在NSCLC患者中的报告发病率相似 (ILD率，0-5.7%)64。没有死亡。正在进行的II期HERTHENA-Lung01研究目前正在评估至少接受过一种EGFR TKI和一种基于铂的化疗的转移性NSCLC患者中的HER3-DXd。 4.3.Trop2 滋养层细胞表面抗原 (Trop2) 是一种跨膜糖蛋白钙信号转导体，介导细胞迁移和无锚定生长，并且在许多上皮肿瘤中表达65。它与几种实体瘤的总体和无病生存不良相关66,67。在肺癌中，Trop2过度表达在多达64%的腺癌和多达75%的鳞状细胞癌NSCLC中观察到，与生存率降低相关69；还提出了其在对化疗和CD8+ T细胞凋亡的抵抗中的潜在作用70。 Datopotamab-deruxtecan (Dato-DXd) Dato-DXd是一种ADC，由针对TROP2的单克隆抗体组成，通过稳定的四肽基可切割连接子 (DAR 4) 连接到一种强效的拓扑异构酶 I 抑制剂。Dato-DXd在I期TROPION-PanTumor01试验 (NCT03401385) 中展示了令人鼓舞的抗肿瘤活性，这是一项正在进行的多中心、开放标签、剂量扩展研究，评估不同剂量水平的Dato-DXd在实体瘤中的安全性和耐受性71。试验的剂量递增部分评估了逐渐增加剂量的Dato-DXd的安全性和耐受性，而试验的剂量扩展部分正在评估在NSCLC患者和转移性三阴性乳腺癌患者中使用选定剂量水平 (4 mg/kg、6 mg/kg、8 mg/kg) 的Dato-DXd的安全性和耐受性。患者不是基于TROP2表达被选择的。 在世界肺癌大会上报告了159名NSCLC患者接受不同剂量Dato-DXd (4 mg/kg、6 mg/kg或8 mg/kg) 的更新中期结果72；大多数患者之前接受过免疫治疗和基于铂的化疗，分别为84%和94%。ORR范围为21至25%，(4 mg/kg时23% (n = 9)，6 mg/kg时21% (n = 8)，8 mg/kg时25% (n = 20))。有一例确认的CR (6.0 mg/kg)，32例PR由BICR评估 (4.0 mg/kg时29名患者中有8例PR，6.0 mg/kg时20名患者中有4例PR，8.0 mg/kg时76名患者中有20例PR)；29例CR或PR被确认。疗效结果支持持久的临床反应，观察到的DCR为67至80%，中位PFS为4.3至8.2个月，尽管需要更长时间的随访72。4/kg和6 mg/kg剂量更易耐受，最常见的3级不良事件包括贫血、口腔炎、粘膜炎症和疲劳。不出所料，在更高剂量8 mg/kg治疗的患者中，不良事件的频率更高：报告了14例 (8%) 的ILD，大多数ILD病例 (12/14) 出现在8 mg/kg队列中；其中3例为致命的5级事件72。6 mg/kg剂量被确定为注册TROPION-Lung01 III期试验的推荐剂量水平。 在2021年ESMO大会上报告了TROPION-PanTumor01中包括的可操作基因组改变的NSCLC患者的令人鼓舞的结果，包括34名 (中位年龄，62岁；56%为女性) 晚期/转移性NSCLC患者73；研究者报告的可操作基因组改变包括ALK (n = 3)、EGFR (n = 29) 和ROS 1和RET (均为n = 1)。跨剂量的确认ORR为35% (95% CI, 19.7–53.5)，中位DOR为9.5个月 (95% CI, 3.3–NE)。 Sacituzumab govitecan (SG) Sacituzumab govitecan (SG, IMMU-132, Trodelvy®) 是一种首创的抗Trop2 ADC，由针对Trop2的人源化单克隆抗体sacituzumab与拓扑异构酶 I 抑制剂SN-38通过可水解的可切割连接子高DAR比率 (7.6) 连接。2020年4月，SG获得了FDA加速批准，作为至少两种先前转移性疾病治疗后的三阴性乳腺癌 (TNBC) 治疗，基于I/II期IMMU-132-01篮式试验的结果，在治疗难治性转移性上皮性癌症中74，最近在尿路上皮癌中获得了FDA加速批准。 在I/II期IMMU-132-01篮式试验中，无论Trop2表达如何，患者都被纳入，并在3周周期的第1天和第8天接受8至18 mg/kg剂量的治疗。包括NSCLC和SCLC：在NSCLC队列中，54名患者接受了8、10或12 mg/kg治疗；ORR为16.7% (7.9–29.3)，有9个PR (16.7%)，22个SD (40.7%)。mDOR 6.0个月 (2.5–21.0)，mPFS为4.4个月，mOS为7.3个月74。10 mg/kg剂量被选为进一步的剂量扩展研究。 在NSCLC队列中，59.6%的患者经历了3级或更高级别的治疗相关不良事件（TRAEs），包括中性粒细胞减少症（42.4%）、贫血（10.3%）、腹泻（7.9%）、疲劳（6.3%）和发热性中性粒细胞减少症（5.2%）。在SCLC队列中，已在大量预处理的mSCLC患者中确认了安全有效的治疗概况，包括对一线化疗敏感或耐药的患者。该队列中的ORR为17.7%，中位PFS为3.7个月，中位DOR为5.7个月，中位OS为7.1个月。3级及以上TEAEs与其他肿瘤类型相当，包括中性粒细胞减少症（34%）、疲劳（13%）、腹泻（9%）、低氧血症（4%）和发热性中性粒细胞减少症（2%）。 4.4.MET Telisotuzumab vedotin。MET信号通过受体过度表达而在NSCLC的发生中发挥作用，同样也在乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌和前列腺癌中发挥作用。Telisotuzumab vedotin (Teliso-V)由针对c-Met的人源化单抗ABT-700通过缬氨酸-瓜氨酸连接子与MMAE连接而成，I期研究证实该化合物在c-Met阳性NSCLC中耐受性良好，并展示了抗肿瘤活性。 2022年1月，基于LUMINOSITY试验（NCT03539536）的数据，FDA授予Telisotuzumab vedotin (Teliso-V)突破性疗法认定，这是一项正在进行的II期研究，针对不同c-Met表达水平的NSCLC患者，作为二线或三线治疗。在EGFR野生型非鳞状NSCLC患者中，c-Met高表达组的ORR为53.8%，c-Met中等表达组为25.0%。Teliso-V目前正在与奥希替尼（I期，NCT02099058）联合治疗c-MET过度表达的NSCLC患者的临床试验中进行评估；它也在III期随机研究TeliMET NSCLC-01 (NCT04928846)中作为单药治疗进行研究，针对先前治疗过的c-MET过度表达的NSCLC患者。 4.5.肺癌开发中的ADC靶点 目前正在进行几项早期临床试验，积极评估在晚期肺癌中使用新型ADCs的感兴趣致癌靶点。值得注意的是，目前在早期NSCLC中没有注册的ADC试验，尽管这可能只是暂时的。正在进行的对晚期NSCLC的兴趣包括NECTIN4、组织因子（TF）、CEACAM5、间皮素和LIV1。这些靶点及其相关ADCs在临床试验中的情况总结在表3中。Enfortumab vedotin是一种针对Nectin 4 (PVRL4)的ADC，Nectin 4是一种与免疫球蛋白样粘附分子有关的1型跨膜蛋白家族成员，在先前治疗的晚期尿路上皮癌中已显示出临床效益。这导致FDA批准enfortumab vedotin-ejfv用于这种情况，目前正在NSCLC中进行调查（表3）。Tisotumab vedotin-tftv是一种针对组织因子（TF）的抗体和微管抑制剂偶联物，是另一种最近获得FDA加速批准的ADC：这是基于II期innovaTV 204试验，在先前治疗过的复发或转移性宫颈癌患者中。鉴于组织因子表达在晚期NSCLC中已被证明更高，TF是另一个引起兴趣的目标，目前正在NSCLC中进行调查（表3）。 4.6.毒性 ADCs的开发目的是通过其设计限制毒性，然而，在临床上管理与ADCs相关的毒性仍然是一个持续的挑战。虽然现代新型ADCs的安全性概况更为有利，但ADCs仍可能导致一些使人丧失能力甚至可能致命的毒性。ADC剂量限制毒性可能范围广泛，已被证明包括肝脏、神经系统和眼科不良事件，这些主要由ADC载荷在循环中的过早释放引起的非靶标效应，以及ADC结合到靶抗原的非癌症表达细胞所致。例如，曲妥珠单抗deruxtecan已在各种肿瘤类型中导致5级ILD，auristatin类ADCs已与高级别神经和眼科毒性相关联。 总的来说，毒性可以由“靶标/非肿瘤”或“非靶标/非肿瘤”引起；此外，这些毒性可能与载荷本身的AEs有关，也可能无关（尽管“非靶标，非肿瘤”AEs似乎主导了大多数现有ADCs的毒性概况）。因此，靶抗原的表达模式不可避免地影响载荷的分布以及随后的积累位置。然而，荟萃分析实际上表明，MMAE与贫血、中性粒细胞减少和周围神经病变相关，与靶抗原无关；同样，DM1与血小板减少和肝毒性相关，MMAF和DM4与眼科毒性相关，所有这些都与靶抗原无关。毒性并不总是可预测的——例如，尽管具有相同的载荷、连接子和类似的DARs，brentuximab vedotin和enfortumab vedotin具有不同的毒性概况。曲妥珠单抗deruxtecan和曲妥珠单抗duocarmycin都是针对HER2的ADCs，使用不同的载荷，然而，两者都通过未知机制引起肺部毒性；这种毒性在使用T-DM1的患者中也观察到，尽管程度较小。 Destiny-lung01报告了26%的ILD/肺炎，使用6.4 kg/mg每周3次给药，然而，对九项T-DXd单药治疗研究的汇总分析评估了1150名大量预处理患者的ILD/肺炎风险，T-DXd在1000多名乳腺癌和肺癌患者中表现出15.4%的ILD率，其中2.2%为5级ILD。在最近DESTINY-LUNG02试验中，调查了5.6 kg/mg剂量，试验资格要求没有当前或历史上的ILD，没有肺切除术，也没有疑似ILD。因此，使用T-Dxd需要对有ILD或疑似ILD的肺癌患者谨慎。 在肺癌患者中，与间质性肺疾病 (ILD) 相关的死亡在ADC临床试验中报告的发生率不同，并且可以想象这个数字在现实世界中可能更高。迫切需要对医生进行适当的培训，以识别和管理这种有毒和潜在致命的效应。通常，在有症状的ILD中，应停用ADC；在无症状的情况下，可以在完全缓解后考虑重新引入ADC，并且皮质类固醇仍然是ILD治疗的基石。类固醇剂量取决于事件的严重程度，早期诊断和治疗是关键，同样需要我们的肺科医生同事的参与。早期和准确的诊断ILD在临床上是一个重大挑战，尽管技术的最新发展已导致呼吸分析被用作ILD诊断的有前途的工具。一项研究表明，使用呼吸分析的eNose技术，可以准确地从健康对照组中识别出ILD患者，此外，还可以区分不同的ILD亚组，表明可能成为未来ILD的生物标志物，可以在疾病的早期阶段识别ILD。由于ILD等肺部毒性的频率，在使用ADCs治疗晚期转移性肺癌患者时需要谨慎，并需要高度警惕这些和其他罕见但潜在致命的事件。因此，在考虑使用ADCs治疗患者时，应始终考虑ADCs的毒性概况。 7.未来的挑战和考虑 随着ADCs在临床实践中的应用，了解抗性机制对未来药物开发可能至关重要，但由于ADCs在肺癌领域的相对不成熟，关于抗性机制的临床数据很少。然而，临床前数据可以提供一些潜在的见解。例如，在临床前乳腺癌模型中，经过TDM1长期暴露后，细胞表面HER2表达减少，导致TDM1结合减少。蛋白质组学分析还发现，在这些对TDM1耐药的细胞系中，药物外排泵上调，而在TDM1耐药细胞中也发现了内吞作用的转化机制以及ADCs运输到溶酶体的失调。此外，在临床前NSCLC模型中，SLC46A3表达的丧失是获得性抗DM1（依美坦辛载荷）的机制，而在NSCLC中，TUBB3和FOXO3α的高表达与对基于紫杉醇的ADC载荷的抗性相关。 另一个积极研究的领域是患者选择。TROP2 ADCs的成功证实了ADCs不仅适用于由致癌基因驱动的肺癌，而且抗原表达并不一定是ADC成功所需的关键特征。细胞表面抗原表达水平是一个连续变量，这引发了是否应该根据特定水平的抗原存在来预先筛选和排除患者接受治疗的问题。选择参加评估ADCs的临床试验的患者仍然不确定，一些正在进行的试验采用了预先筛选阶段，以招募仅表达特定靶标患者，而其他试验则将纳入标准限制在具有特定高水平靶标表达的肿瘤类型。例如，T-DXd等ADCs已在靶标表达减少的患者中诱导反应，显然迫切需要开发验证的检测方法和临界值来定义抗原阳性，以及预测反应的生物标志物。 展望未来，合理的联合策略可能对增强ADC活性和克服潜在抗性机制很重要。ADCs与其他抗癌疗法的联合试验已经在进行中，从抗血管生成剂，旨在改变肿瘤血管并改善向肿瘤组织的药物传递，到免疫疗法，这可能增加ADCs诱导的抗肿瘤免疫，通过增强细胞介导的肿瘤识别和免疫效应功能，ADCs的细胞毒性作用或通过增强抗体依赖性细胞毒性。将这些药物与ADCs联合使用可能会增加肿瘤细胞表面靶标抗原的表达，并促进抗体-抗原结合，这可能会改善抗原的周转或降解。 为了扩大ADCs的治疗窗口，正在开发位点特异性ADCs、双特异性ADCs或前药型ADCs。技术的快速发展正在推动这些努力：例如，pClick技术正在开发中，允许位点特异性结合。pClick技术可能为ADC开发中的位点特异性结合提供了一种新的、更便捷、更有效的选择。双特异性抗体技术允许引人注目的ADC设计，这可能会改善ADC的内吞作用并提高肿瘤特异性。例如，针对同一肿瘤抗原的不同位点的双特异性ADCs，可能导致受体聚集改善和更快的目标内吞作用。 双载荷ADCs是克服潜在抗性机制的另一种方法。这些ADCs巧妙地使用两种不同的载荷，具有不同的机制，并合理地通过将这两种协同载荷以控制的方式传递到癌细胞中，可能提供更强的细胞毒性反应。一个例子是含有MMAE和MMAF的抗HER2 ADC，在临床前动物模型中显示出有希望的疗效。 细胞毒性药物的替代品也在开发中。免疫毒素和Bcl-2抑制剂是载荷的例子，它们不是细胞毒性的，而是诱导凋亡。例如，ABBV-155靶向B7-H3，载荷为clezutoclax，通过抑制Bcl-XL诱导凋亡。ABBV-155目前正在进行I期试验，作为单一药物和与多西他赛或紫杉醇联合使用的策略，计划为小细胞肺癌和NSCLC进行扩展队列（NCT03595059）。LMB-100是另一种实验性ADCs，包含促凋亡载荷，假单胞菌外毒素A，通过抑制延伸因子-2诱导凋亡。免疫调节载荷是另一个有趣的概念：这些非细胞毒性载荷通过激活髓系抗原呈递细胞和使用与检查点阻断不同的机制刺激免疫系统。例如，SBT6050是一种靶向HER2的ADC，载荷为toll样受体8（TLR8）激动剂。在ADCs的构建中，包括替代单克隆抗体的新技术（例如，Nanobodies，蛋白质框架（设计的ankyrin-repeat蛋白质（DARPins）等）也很有趣。 8.结论 经过数十年的研究、可观的技术进步和对作用机制的改进理解，ADCs开始实现最初的承诺。在肺癌中，有两个ADC已获得FDA突破性疗法认定并正在评估中（patritumab deruxtecan，telisotuzumab vedotin），一个ADC已获得加速批准（Fam-trastuzumab deruxtecan-nxki (T-DXd)）。在各种肿瘤类型中，有数百种ADC处于临床前和临床开发中，该领域没有任何放缓的迹象。在晚期肺癌中，ADCs对于治疗选择有限的患者具有变革性潜力。正在进行的临床试验继续评估新的ADCs，无论是作为单一疗法还是作为肺癌的联合策略。因此，ADCs在临床上的持续成功可能是不可避免的，肺癌治疗的新范式变革即将到来。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：治疗性抗体在临床上的广泛应用已经改变了包括罕见和具有挑战性条件在内的许多疾病的药物疗法格局。然而，外源生物制剂的给药可能会潜在地触发不希望的免疫反应，例如产生抗药物抗体（ADAs）。现实世界的经验已经揭示了ADA发生与不满意的治疗结果以及免疫相关不良事件之间的明确相关性。通过回顾性检查涉及免疫原性分析的研究，我们注意到人们越来越强调阐明基于抗体的治疗药物的免疫原性表位谱，以机制性理解免疫原性的产生，并理想地减轻风险。因此，我们在这里全面总结了实验和计算方法在治疗性T细胞和B细胞表位表征方面取得的进展。此外，本文特别强调了生物治疗药物去免疫原性驱动的表位成功实践。 1.引言 由于其卓越的生物活性、特异性和安全性，治疗性单克隆抗体（mAbs）是治疗蛋白（TPs）中最有前途的类别之一，现在已成为生物制药行业组合的重要组成部分。尽管有许多优点，作为外来大分子，mAbs和其他基于抗体的TPs（图1a）可能会引发不需要的体液免疫反应，通过触发抗药物抗体（ADAs）的发展，这些抗体通过调节生物治疗药物的效力、药代动力学和药效学（PK/PD）以及免疫相关的安全性特征，表现出多样的临床意义（图1b）。根据mAbs（即，嵌合型、人源化、全人源）的遗传来源，位于框架区（FR）或互补决定区（CDRs）中的非生殖系内容可能导致治疗后显著的ADA出现。ADA（既有预先存在的也有治疗后出现的）的程度需要在整个药物给药过程中密切监测，正如监管当局所要求的。对于涉及具有高免疫原性风险的生物治疗药物的临床研究，可能需要在研究结束后延长ADA监测，因为一些个体中ADA的持续存在。 图1. 免疫原性对基于抗体治疗药物的影响。(A) 不同基于抗体治疗药物的结构图。mAb，单克隆抗体。KIH，旋钮-孔洞。BiTE，双特异性T细胞引导剂。ADC，抗体-药物偶联物。Fv，可变片段。(B) 对基于抗体治疗药物的影响。结合到mAb的表位的ADA引发中和能力，从而导致治疗效果减弱。ADA还可能触发I型（IgE介导）和II型（IgG介导）超敏反应的发生。一旦ADAs（IgM或IgG）和治疗药物形成免疫复合物，就可能发生与III型超敏反应相关的不良事件。免疫复合物的大尺寸也导致治疗药物从血液中更快清除。该图表是在BioRender.com上创建的。 近年来，许多工程化基于抗体的治疗药物（例如，抗体-药物偶联物、多特异性抗体）和抗体类似分子（例如，重链可变域[VHHs]、设计的ankyrin重复蛋白）正在作为药物或TP组分开发，许多产品已进入临床阶段。值得注意的是，随着多域生物治疗药物（MDBs）、细胞疗法和基因疗法等创新生物模式的爆发，ADA风险的复杂性和特异性有所增加。因此，需要一种综合策略来评估和表征免疫原性，以促进生物制药的非临床发现、临床开发以及上市后监测。 ADAs的产生涉及两种机制：T细胞非依赖性（Ti）和T细胞依赖性（Td）B细胞激活（图2）。Ti过程是由治疗药物的重复表面抗原通过多价交联B细胞受体（BCR）启动的，随后是BCR信号的激活和抗体的快速分泌。通过Ti途径产生的抗体主要是短暂存在的五聚体免疫球蛋白M（IgM），由于缺乏体细胞超突变和亲和力成熟过程，它们对目标的结合亲和力低。在生物制药研究中，一个已经很好地阐明的Ti介导的抗体产生情况是，在给药聚乙二醇化纳米药物后出现的抗聚乙二醇（PEG）IgM。另一方面，IgG类型的ADAs，具有高亲和力和长期持久性，主要是通过Td途径产生的，这涉及通过内质体-溶酶体系统由抗原呈递细胞（APCs）如树突细胞（DCs）摄取和水解TPs。从TPs衍生的短肽可能与抗原处理细胞内的MHC II类分子复合，然后被运输到DCs表面，允许与生发中心的滤泡辅助T淋巴细胞（Tfh）表达的特定表位T细胞受体（TCR）结合。 图2. T细胞依赖性和非依赖性B细胞激活途径的示意图。DC，树突细胞。pMHC II，肽-MHC II复合物。TCR，T细胞受体。BCR，B细胞受体。该图表是在BioRender.com上创建的。 DCs在抗原处理过程中成熟并产生对CD4+辅助T细胞激活所必需的细胞因子。与MHC II限制性肽段相关的互补TCR被定义为T细胞表位（TCEs）。激活的、抗原许可的Tfh群体进一步与已经遇到并呈现相同抗原的B细胞结合，并产生诱导B细胞向分泌ADA的浆细胞成熟的必需细胞因子。在这一点上，一部分B细胞获得了在二次免疫后更快反应的潜力，并分化为记忆群体。在B细胞的抗原处理过程中，称为B细胞表位（BCEs）的抗原内特定区域被BCRs识别，以促进它们的摄取和处理。虽然理论上TCEs可以分布在整个抗原蛋白中，但BCEs限于BCRs/抗体直接可访问的表面积。TCEs和BCEs的存在共同决定了ADA产生的可能性。因此，研究人员需要通过检查TCEs和BCEs（它们可能重叠也可能不重叠）来明确评估生物治疗药物的免疫原性风险。 进行分层免疫分析以检测总ADA和中和ADA（Nab）是TPs开发的标准实践，正如监管指南和行业白皮书（或建议）所支持的。然而，基于完整治疗药物的免疫分析并不能提供深入的信息，如表位谱，这些信息包含了概述抗治疗免疫影响的关键见解。因此，已经开发了许多方法来表征TCE/BCE以满足不同的研究目的。在这项工作中，我们旨在通过重点介绍用于特别分析基于抗体的治疗药物的TCEs和BCEs的方法，提供免疫原性评估的战略概述。 2.实验策略用于TCE发现和免疫风险降低  TPs的免疫原性主要由Td免疫反应决定。因此，可以预先在早期发现阶段进行TCEs为重点的免疫原性评估，用于领先评估，或事后用于临床免疫原性表征，对于勾画候选药物的开发能力至关重要。由于外源性Td免疫反应的一些关键步骤可以通过培养的细胞重现，因此开发了许多体外检测平台来监测生物治疗药物的T细胞介导的免疫原性。这些方法涉及测量与HLA II分子的物理或功能性结合的治疗药物衍生肽，如表1所总结。以下段落中的例子说明了不同的TCE表征方法。值得注意的是，这些策略，即体外结合、免疫肽组学和基于细胞的方法，通常以综合方式利用。 2.1.体外HLA结合 肽-MHC II结合是Td免疫原性先决条件，在CD4+ T细胞激活之前。考虑到肽-MHC II相互作用的分子特征得以保留，研究人员试图通过检查合成肽与MHC II分子的结合来调查抗原的TCE谱。体外HLA结合测定用于鉴定或验证治疗性mAbs（如英夫利昔单抗）的TCE簇，这是一种嵌合型肿瘤坏死因子（TNF）靶向mAb，在人类中具有相当的免疫原性。Hamze等人的研究中合成了来自英夫利昔单抗重链和轻链的重叠15-肽，并将其分组为亚池进行体外结合测定。结果发现，位于重链（HCDR2、HCDR3）、轻链框架区1和2（LFR1、LFR2）附近的肽与许多HLA II等位基因结合得足够好。由于结合测定通常与其他方法一起进行，而不是单独用于TCEs的去新识别，我们在后续部分讨论了更多涉及基于抗体的药物免疫原性分析的例子。 体外结合测定的使用也促进了对许多治疗蛋白（TPs）酶替代疗法免疫原性风险的理解。促红细胞生成素（EPO）通常用于恢复纯红细胞再生障碍患者对EPO产生自身抗体的红细胞生成。因此，提出了诸如引入N-糖基化或消除T细胞表位（TCEs）的蛋白质工程策略来规避免疫原性问题。Tangri等人使用来自野生型人类EPO的合成肽库进行了体外HLA II结合筛选。令人惊讶的是，几乎所有肽都显示出与一个或多个HLA II等位基因结合的亲和力。在肽筛选阐明的TCE景观基础上，通过修改最具免疫原性的肽并随后通过外周血单核细胞（PBMCs）增殖测定来实现EPO的去免疫原性。HLA II结合测定也用于表征和减少因子VIII（FVIII）的免疫原性，FVIII是血友病A患者缺乏的关键凝血因子。与EPO类似，临床研究表明，在治疗过程中，大量接受野生型FVIII的患者发展出抑制性抗体。Steinitz等人使用合成肽库鉴定了八个T细胞表位簇。在随后的研究中，通过使用具有单突变肽的HLA II结合测定定位了一个关键的表位肽后，研究人员随后定位了关键残基。相应地产生了去免疫原性FVIII突变体，并通过T细胞功能测定进行了验证。 肽-MHC II结合的机制理解得到了大规模体外肽结合研究的证实。例如，Wang等人进行了最全面的肽-MHC II结合筛选，共有180个库，每个库有一个固定氨基酸的位置和另外19个位置是所有20种天然残基的等量混合物。这些库被测试了结合亲和力，并产生了约40,000个结合亲和力数据点，涉及全球人群中频率较高的26个HLA II等位基因。基于对肽-MHC II结合的深入阐明以及实验结合亲和力数据的积累，许多计算TCE预测算法已被实施，以替代体外MHC II结合测定用于初始表位筛选。体外结合测定通常用于验证来自替代策略的候选肽。然而，需要注意的是，结合表位不一定是随后引发免疫反应的“功能性表位”。因此，MHC II结合测定通常与体外T细胞测定结合使用，以功能性验证抗原衍生肽。 2.2.免疫肽组学 体外结合测定提供了一种无偏的方法，全面检查任何给定TPs的潜在TCEs，但它并不考虑生理条件下的抗原处理。MHC相关肽蛋白质组学（MAPPs）测定是一种基于细胞的体外方法，用于鉴定由DC自然呈现的MHC II限制性肽。为了建立这种测定，需要从PBMCs中最初分离出CD14+单核细胞，并通过分化混合物处理以获得高HLA II表达的DCs。通过TPs脉冲处理后细胞裂解，pMHC II复合物可以免疫沉淀，通过质谱（MS）鉴定HLA相关肽组。通常需要来自多个捐赠者的原代细胞，以覆盖HLA II的多态性。 MAPPs测定已广泛用于确定来自基于抗体治疗药物的TCEs。例如，涉及MAPPs测定的多项研究揭示了英夫利昔单抗的CD4 TCEs。在英夫利昔单抗的重链CDR2、CDR3、轻链LFR1等几个区域鉴定了TCE簇。正如预期的那样，MAPPs测定鉴定的大多数肽根据体外数据被确认为HLA II配体。在Karle等人的研究中，通过MAPPs结合细胞增殖测定评估了secukinumab（临床批准的抗白细胞介素[IL]-17A mAb，用于治疗斑块状银屑病）的免疫原性。与五种具有不同免疫原性风险的市场mAbs相比，secukinumab在MAPPs测定中发展出最低密度的TCE簇。有趣的是，所有六种mAbs的肽呈现水平与临床ADA发生率之间发现了相关性，强调了MAPPs测定对临床免疫原性风险评估的预测能力。Casotta等人对natalizumab（一种用于治疗多发性硬化症的抗整合素4 mAb）的Nab进行了深入表征。通过使用来自患者衍生的、natalizumab特异性B细胞的pMHC II纯化的MAPPs测定，发现了一个单一的TCE，略位于LCDR2上游，决定了对natalizumab的免疫原性。有趣的是，这个表位似乎是可工程化的，这促使产生了去免疫原性变体在体内进行测试。 为了提高MAPPs测定的效率和一致性，Lee等人开发了一种半自动化工作流程，以简化样品准备步骤（即，细胞裂解、免疫沉淀、洗涤和洗脱）。通过这种工作流程测试了一系列临床mAbs，结果表明，具有临床免疫原性风险的抗体可以鉴定出肽簇。更重要的是，一些揭示的肽与其他小组以前发表的结果很好地一致，表明这种新型测定工作流程的稳健性和可靠性。此外的研究还表明，其他因素的选择，如DC培养基、免疫沉淀珠子和抗体对MAPPs测定结果的影响。与依赖于给定长度的合成肽的体外结合测定不同，MAPPs测定作为一种强大的工具，展现出额外的生理相关性，因为它只揭示了自然呈现的TCEs。这也使得可以检查参数，如侧翼氨基酸和翻译后修饰等对TCE形成的影响。尽管如此，肽检测灵敏度仍然是MAPPs测定的最大限制因素，特别是当测试具有低免疫倾向的分子时。包括但不限于细胞培养、pMHC II免疫沉淀、色谱分离和MS检测的因素需要优化，以实现满意的免疫肽组学结果。 2.3.基于细胞的功能测定 体外功能测定为从计算预测、体外结合筛选和MAPPs测定中鉴定的抗原肽诱导的免疫反应提供了可靠的验证。此外，基于细胞的实验可以用来确认通过表位消除成功去免疫原性。 在T细胞依赖性（Td）免疫原性生成途径中，pMHC II-TCR结合后的抗原特异性CD4+ T细胞扩增（图2）。因此，测量T细胞增殖和激活是监测免疫原特异性T细胞反应的有利方法。T细胞增殖测定可以在PBMCs的背景下执行，或者使用纯化的DCs和自体CD4+辅助T细胞（也称为DC-T细胞测定）。在前一种情况下，测试化合物被置于PBMCs中足够时间以刺激T细胞增殖，这反映了分析物的免疫原性。对于DC-T细胞测定，需要先用治疗剂脉冲处理纯化的DCs，然后刺激自体CD4+ T细胞。如Gokemeijer等人在一项调查中指出的，T细胞增殖测定在两种格式中在测定参数方面都有很大的不同，例如供体数量、对照选择、读数等，由生物制药行业的研究人员执行。 许多例子强调了T细胞增殖测定在推进基于抗体治疗药物的开发能力方面的价值。例如，治疗性mAbs的结晶片段（Fc）可以被工程化以适应不同的药理特性，例如减少抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。在Wilkinson等人的研究中，创建了ADCC消除的人类IgG1 Fc变体，并通过T细胞增殖测定筛选了携带相应突变的肽的免疫新表位。与代表野生型Fc序列的肽相比，含有L234/235A突变的肽，这是mAb工程中常用的ADCC耗竭策略，在PBMC增殖测定中没有显示出增量的T细胞反应。Steven等人报道了通过体外成熟过程对针对人血清白蛋白（HSA）的鲨鱼可变域（VNAR）的去免疫原性。将随机突变引入到先前构建的huE06v1.10中，这是一个人化的抗HSA VNAR，并对其进行了DC-T细胞测定以评估免疫原性。因此，建立了表现出完整目标结合能力和最小免疫原性的克隆BA11。 T细胞增殖测定不断发展，以增强其在免疫原性评估中的稳健性。例如，由于抗原特异性CD4+ T细胞自然丰度低，T细胞增殖测定的灵敏度有些不尽人意。在这方面的限制下，Siegel等人开发了一种创新的DC-T共培养测定，涉及重新刺激步骤以增强测定灵敏度。具体来说，在CD4+ T细胞和抗原脉冲DCs共培养几天后，向共培养中添加新鲜制备的、抗原挑战的自体单核细胞，以进行额外的T细胞刺激。通过这个工作流程，作者成功地再现了以前出版物中鉴定的TP衍生TCE肽引起的免疫效应。此外，这些肽的去免疫原性对应物显示出减弱的DC-T测定反应，表明了这个测定平台的稳健性。另一项研究表明，在PBMC测定的背景下，使用其他T细胞激活标记物，如CD134和CD137，可以特别概述抗原反应性CD4+ T细胞群体。研究人员通过测试14种不同免疫潜力的生物制剂，证明了体外刺激后CD4+ T细胞中CD134+/CD137+群体的比例与临床ADA发生率很好地相关。这些报告强调了进一步协调体外测定的必要性，以更准确地预测TPs的临床免疫原性。 与T细胞增殖测定一起，酶联免疫吸附点（ELISpot）测定也用于可视化抗原特异性T细胞激活。与T细胞激活相关的细胞因子（例如，IL-2，干扰素[IFN]-γ）通常用作ELISpot测定的读数，以检查TPs的Td免疫原性。与酶联免疫吸附测定（ELISA）相比，后者测量大量细胞培养的总细胞因子水平，当需要量化分泌细胞因子（功能性）细胞群体时，ELISpot更为有利。在上述Spindeldreher等人的研究中，通过使用抗原负载的PBMCs挑战的CD4+ T细胞进行IFN-γ ELISpot测定，验证了MAPPs测定中鉴定的ixekizumab衍生肽。PE38是用于构建重组CD22靶向免疫毒素moxetumomab pasudotox的细菌衍生毒素。由于PE38的非人源性，moxetumomab pasudotox在临床上表现出相当高的免疫原性，这促使人们努力发展PE38的去免疫原性版本。Mazor等人使用合成的PE38衍生肽通过ELISpot测定鉴定了PE38的TCEs。随后产生了TCE耗尽的去免疫原性PE38，并通过消除的T细胞免疫反应进行了验证。在治疗肽中引入非天然氨基酸（unAA）已被广泛实施，部分是为了免疫原性管理的兴趣。Azam等人通过将unAA引入模型抗原，流感血凝素（HA）肽HA306-318，进行了概念验证研究。正如ELISpot和体外肽结合测定所证实的那样，修改后的肽显示出受损的T细胞启动能力以及不同程度的减少HLA II结合。 值得注意的是，无论是表位肽还是完整的TPs都可以作为T细胞增殖测定的输入。肽无疑提供了更多以表位为中心的观点，而完整的TPs提供了关于整体免疫原性潜力的更全面的见解。然而，使用完整TPs进行基于细胞的免疫原性分析的主要担忧源于化合物的作用机制。大多数免疫调节治疗剂自然地向T细胞传递刺激性信号，这导致强烈的T细胞激活和增殖，很难区分免疫原性触发的细胞扩增。在这种情况下，DC-T细胞测定可能更可行，因为它避免了被测试代理直接激活T细胞。否则，肽（或重叠肽池）可能作为PBMC测定的输入材料，以突出特定表位的T细胞激活。而不是利用通用程序，应为每个项目计划一种适合目的的方法，通过整合一系列体外测定。Xue等人报告了对ATR-107的系统免疫原性评估，ATR-107是一种高度免疫原性的抗IL-21受体（IL-21 R）mAb。在这项研究中，作者观察到当由ATR-107而不是对照mAb脉冲时，T细胞的增殖更强，并通过MAPPs测定鉴定了位于轻链CDR2（LCDR2）的ATR-107衍生的TCE簇。更重要的是，通过进行内化测定，表明ATR-107的免疫反应部分归因于其与DCs的抗原处理和呈现机制的有效参与，这可以通过药物靶标（IL-21 R）在DCs上的高表达来解释。在另一项研究中，研究人员比较了三种人源化mAbs（即mAb1、mAb2和mAb3）针对同一靶标的T细胞扩增、DCs激活和抗原处理，并通过了MAPPs测定鉴定了TCEs。mAb1引起的更好的T细胞增殖归因于APCs的激活。在90%的患者中表现出免疫原性的mAb3在体外未能促进T细胞增殖，可能由于缺乏DC激活。然而，来自MAPPs数据的合成肽簇引发了强大的CD4+ T细胞反应。这些发现表明，依赖任何单一平台来估计候选分子的潜在免疫原性风险是不充分的。 3.BCE 映射方法的范围  与可以通过体外测量确定的TCE不同，体液免疫反应是由不同组织中的多种细胞类型完成的，这不能轻易地通过体外或离体系统重现。因此，BCE分析通常是通过使用来自动物或人类研究中获得的ADA样本进行无细胞实验来执行的。已经建立了多样化的策略来表征TPs的BCE谱，如下所述。鉴于ADAs的异质性本质，我们特别讨论了多克隆抗体（pAbs）的表位映射，与mAbs相比，其表征可能更具挑战性。实验方法，如配体结合测定（LBA）、质谱（MS）和结构分析，通过不同原理揭示了抗体-抗原结合界面。本节讨论的每种策略的适应性、费用以及时间消耗都列在表2中。每种技术都提供了独特的优势和限制，强调了需要一个综合策略来明确理解生物治疗药物的表位谱。 3.1.基于LBA的方法 基于LBA的表位映射的基本原理是在抗原的不同片段或突变体中描绘抗体的结合偏好（定性或定量）。许多学术和工业实验室都报告了他们开发的内部表位映射测定，并有许多商业选项可供具有不同研究目标和目标的研究人员使用。通过几个案例研究，我们详细阐述了基于LBA的方法如何帮助揭示域、肽段和残基水平分辨率的表位信息。 3.1.1.域特异性表征 美国食品药品监督管理局建议评估ADA与MDBs相关ADA的不同临床相关域的结合特异性。Gorovits等人提出了一种通用的逐步策略，以满足MDBs相关ADA的域特异性表征的要求。作为ADA域特异性分析的代表性研究，Stubenrauch等人报告了在非人灵长类动物研究中，通过域检测和竞争测定（DDA和DCA）来检查由靶向免疫细胞因子（TIC）诱导的ADA的域特异性的实践。简而言之，TIC的三个基本模块，即抗原结合片段（Fab）、Fc和细胞因子域，分别纯化并用作诱饵（DDA）或竞争者（DCA），以分析ADA结合偏好。根据DDA和DCA结果的一致性，所有12个受试者都表现出针对Fab和/或细胞因子域的ADAs，而只有一个受试者发展出针对Fc的ADAs。另一项典型研究涉及对moxetumomab pasudotox的域特异性分析，这是一种高度免疫原性的CD22靶向免疫毒素，由结合域（BD）和毒素PE38组成。Vainstain等人建立了桥接测定，使用每个域作为抑制剂来测量域特异性ADAs的相对丰度。他们的方法也得到了验证，并应用于临床研究，揭示了36/67和66/67的Nab阳性受试者分别表现出针对BD和PE38的ADAs。 域特异性分析也已经在涉及多特异性抗体的研究中实施，这些抗体包含两个或更多目标结合域。Luong等人开发了一种基于细胞的域特异性Nab测定，以支持PF-07257876的临床开发，这是一种双特异性抗体，共同靶向PD-L1和CD47。值得注意的是，作者提出了一种独特的基于珠子的Nab提取方法，用于测定之前，并观察到从非中和ADAs中显著减少的假阴性。从Nab的域特异性中可以获得更多的见解，以更好地解释有关PK、效力和安全性的临床观察。 与基于终点测量的免疫测定不同，表面等离子共振（SPR）可以监测配体-受体结合的动力学，也可以用来量化ADAs对药物分子的占据。Lewis等人报告了一种基于SPR的策略，用于表征血浆中凝血因子VIII的C2域特异性抗体的存在。然而，域特异性分析代表了表位映射的基本方法，因为它获得的表位分辨率相对较低。应以案例特定方式部署更复杂的测定，以明确指出介导ADA-TP相互作用的BCEs。 3.1.2.肽结合方法 与基于肽的TCE映射类似，可以通过与合成肽库的体外结合测定来研究BCE。肽库的覆盖范围从单个蛋白质到整个蛋白质组，具体取决于研究目的。基于肽的表位映射的第一个尝试是由Barteling等人报道的，他们将口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1分解为208个合成肽。鉴定了一个七肽区域作为抗体产生的主要表位。Brand和同事开发了一种肽筛选测定，以检查由Fabry病患者产生的ADAs识别的人类α-半乳糖苷酶A（AGAL）上的BCEs，这些患者没有功能性AGAL。如所示，许多患者对AGAL及其同源物α-半乳糖苷酶B共享的肽产生了ADAs，这表明了对ADA交叉反应性的严重关注。 几项研究利用肽筛选来表征对高免疫原性治疗性mAbs（如英夫利昔单抗和阿达木单抗）的ADAs的表位谱。通过筛选覆盖英夫利昔单抗全长序列的15-肽，研究人员鉴定了六个ADA表位，其中四个位于TNF结合界面内，支持了英夫利昔单抗在临床上与免疫原性相关的效力丧失。同一小组在另一项涉及阿达木单抗的研究中后来鉴定了类似分布模式的表位。此外，肽微阵列已被广泛用于明确指出来自病原体和食物过敏原的多克隆BCEs（pBCEs）。 肽也可以在细胞展示系统中呈现，以绕过化学合成过程。Rockberg等人创建了一个细菌展示的人类表皮生长因子受体2（HER2）的随机片段cDNA库，并用它来映射几种抗HER2 pAbs的域特异性。通过对每个pAbs结合的细菌进行测序，作者揭示了每个pAbs池可以靶向的一个到五个域。基于相位展示系统的类似策略也可以建立，以揭示由病原体或毒素诱导的pBCEs。 肽筛选用于表位映射的主要缺点是其无法再现构象和不连续表位。一些化学策略已被提出，旨在模拟肽阵列上的构象表位。Timmerman等人建立了一个通过化学交联在特定位置引入的肽内半胱氨酸的构象肽阵列。这项技术已成功商业化，并用于鉴定利妥昔单抗的构象表位。然而，非线性表位的广泛复杂性使它们极其难以通过任何通用化学策略来重建。 对一系列带有点突变的肽进行二次筛选可以提供残基水平的表位信息。在Geyson等人的研究中，确定了一个单一的6-肽作为高潜力线性表位后，生成了一个深入的库，包含120个六肽，每个六肽都包含一个来自亲本肽的单点突变，并揭示了Leu148和Leu151这两个关键残基决定了抗病毒抗体的结合能力。 尽管存在显著的局限性，但由于分辨率适中、成本相对较低且易于解释，肽筛选的BCE精细映射被广泛采用。整合额外的补充策略可能有助于弥补肽筛选相关的空白。 3.1.3.突变扫描 深度突变扫描（DMS）结合细胞分选，能够高通量地识别完整蛋白质上的功能决定性残基。对于表位映射，特别是需要创建并表达目标蛋白质带有单个氨基酸突变的DNA库。这里的假设是一旦关键的表位残基缺失，抗体就不再与抗原结合。展示负抗体结合信号的细胞群体将被分离并进行深度测序，以随后揭示这些关键残基。如所指出的，DMS有助于发现通过氨基酸到丙氨酸库筛选无法识别的表位。值得注意的是，DMS在最近SARS-CoV-2爆发的相关研究中贡献显著。通过筛选SARS-CoV-2受体结合域（RBD）的酵母展示突变库，Greaney等人鉴定了三个关键的RBD-驻留表位，这些表位被中和pAbs识别。在这些表位区域内发生的突变，以不同程度恢复了病毒的感染，通过减少抗体介导的中和能力。 一种不同的pBCEs映射方式是将pAbs库拆分为mAbs，以单独表征BCE。Onda等人从用免疫毒素PE38免疫的动物中鉴定了总共60个mAbs，并通过相互竞争结合和点突变筛选鉴定了七组表位。随后，该研究小组开发了一系列去除先前工作中识别的BCE的变体，并通过体内研究确认了减少的免疫原性以及持续的效力。在概念验证研究中的成功转化为新免疫毒素LMB-100的开发，这是通过将针对间皮素的Fab与截断的、BCE耗尽的毒素PE24连接而生成的。LMB-100目前正在进行临床试验，用于治疗表达间皮素的肿瘤（例如NCT02798536，NCT02810418）。在之前提到的涉及natalizumab的研究中报告了类似的策略。通过研究从两名接受natalizumab治疗的患者中分离出的单克隆Nabs，检查了决定Nab结合的关键CDR定位残基。 然而，虽然这种策略提供了最高水平的表位分辨率，但涉及的相当大的工作量在许多情况下可能不可行。 3.2.基于质谱的方法 质谱策略是另一种广泛使用的方法，用于解析蛋白质复合物的高级结构信息。作为一种具有卓越灵敏度的分析器，质谱已经被用于生物和制药研究数十年，并且已经使用了几代基于质谱的方法来解码关于抗原-抗体识别的结构信息。在这一部分，我们将深入探讨这些方法如何促进映射pBCEs的努力。 3.2.1.蛋白质酶解切除/提取 蛋白质酶解切除/提取（PROTEX）-质谱策略依赖于通过固定化抗原捕获的蛋白质酶解抗原肽的质谱鉴定。根据抗原-抗体复合物形成和酶介导的抗原降解的顺序，这种方法可以分为表位切除（结合先于消化）和表位提取（消化先于结合）。表位切除/提取结合质谱检测为最少的材料输入提供了宝贵的表位信息。一些研究报告了其对pAbs的使用，如Opuni等人的调查。其中，Roth等人通过表位切除-质谱表明，活动性抗中性粒细胞胞浆抗体相关血管炎患者的抗髓过氧化物酶自身抗体与健康受试者相比具有不同的表位特异性。考虑到PROTEX-MS在广泛的实验设置中的众多研究中的应用，将其作为分析ADAs表位的潜在策略是合理的。PROTEX-MS的一个潜在限制是它依赖于蛋白质水解消化来释放适当长度的肽以精确确定表位位置。因此，抗原的内在因素，如大小、序列和在天然构象中的可及性，都会影响酶解后的输出。此外，不连续的表位可能不会被有效回收，特别是当抗原的三维结构不可用时。 3.2.2.蛋白质足迹分析 一种称为蛋白质足迹分析的先进质谱策略已被越来越多地用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。原则上，蛋白质的溶剂暴露区域可以通过特定试剂进行修饰（可逆或不可逆），并通过蛋白质-蛋白质相互作用诱导的修饰轮廓（足迹）可以通过质谱随后进行检查。Liu等人全面回顾了基于质谱的蛋白质足迹分析的方法和应用。 氢-氘交换结合质谱（HDX-MS）广泛用于研究蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质构象变化。目标蛋白质的溶剂暴露区域通过氢到氘的可交换性进行标记。由于HDX效率几乎完全由溶剂中的暴露状态决定，因为每个氨基酸（除脯氨酸外）都有一个单一的背骨氢，HDX-MS通常被认为是一种无偏的足迹分析方法，用于概述高级蛋白质结构。与一些使用纯化的pAbs进行分析的案例研究不同，Stander等人表明，HDX-MS可以利用免疫后产生的非富集pAbs池，进一步扩展了这种策略的稳健性和适应性。 HDX-MS的一个主要技术障碍是由于原子交换过程的可逆性导致氘原子的损失。为了克服这个缺点，通过共价修饰一个或几个首选残基，开发了许多不可抑制的标记方法。快速光化学氧化蛋白质（FPOP）依赖于使用来自KrF激光脉冲的过氧化氢产生的羟基自由基标记蛋白质。Genentech最近的一项概念验证工作涉及基于FPOP的临床候选双特异性抗体的ADA表位映射。据报道，根据FPOP-MS数据，ADAs可以识别两个臂中的重链和轻链的CDRs。有趣的是，在ADAs存在的情况下，两个臂上另外两个区域逐渐暴露，表明ADAs可能作为TPs的变构调节剂。 3.3.结构生物学方法 揭示抗原-抗体复合物的结构提供了BCEs的原子级分辨率。X射线晶体学和核磁共振（NMR）广泛用于获取抗原-mAb复合物的结构，这对理解mAbs的特异性和作用模式具有重要意义。Cassotta等人展示了纳他利珠单抗-单克隆ADA复合物的晶体结构，但据我们所知，尚无研究报告成功实施任一技术捕获抗原-pAbs结构。 电子显微镜（EM）目前是实现大尺寸和异质性大分子复合物结构可视化的最可行方法，这些是NMR和X射线晶体学的瓶颈。2018年首次报告了使用EM多克隆表位映射（EMPEM）进行pBCE可视化。在这项研究中，从接种HIV包膜（Env）疫苗的家兔血清中纯化的IgG被消化以释放Fab，随后与Env孵育形成Env-pAbs复合物，然后进行负染色EMPEM（nsEMPEM）。作者通过检查不同时间点样本的染色模式，观察了免疫过程中pAbs多样性的时间变化。此外，在低频率下还鉴定了一个未报告的抗体类别，它位于Env叶片之间结合。类似的实验流程后来用于其他类型病毒和疫苗的表位映射研究。迄今为止，尚无研究报告使用nsEMPEM可视化TP-ADA复合物。尽管如此，我们仍然对EMPEM在未来免疫原性评估中的实施持乐观态度，考虑到这项技术的日益普及。 4.计算表位预测  药物开发者对预测与生物治疗药物相关的免疫原性风险有着浓厚的兴趣。考虑到为候选筛选生成的大量mAb候选物，再加上实验方法的技术障碍和高成本，依靠实验策略在早期开发阶段进行免疫原性评估是不切实际的。然而，随着免疫信息学的快速发展，许多计算平台已经出现，以加速基于TCE和BCE预测的免疫原性评估。所有开发者都应认识到，抗药物免疫反应是一个多因素过程，其中许多与化合物相关（例如，配方、聚集）和与患者相关（例如，免疫状态、遗传背景）的属性起着关键作用。因此，应谨慎应用基于序列的计算免疫原性分析的见解以进行决策。当前TCE和BCE预测工具的可用性和性能如下。 4.1.T细胞表位预测 体外T细胞预测通常由抗体开发者执行，以便在早期阶段提供快速和高通量的免疫原性评估。由于CD4+ T细胞反应在触发抗药物免疫反应中发挥决定性作用，因此已经做出了广泛努力，以推进MHC（HLA）II呈现的肽表位的计算预测。HLA II类基因由三个位点编码，即DR、DP和DQ，它们在人类群体中都表现出极端的多态性。尽管HLA II具有广泛的变异性，但源自抗原的肽总是使用9-mer核心区域与MHC II分子的结合槽相互作用，尽管结合槽外的侧翼残基似乎对结合有所贡献。P1、P4、P6和P9的侧链面向MHC II结合口袋，使这四个位置成为决定肽-MHC II相互作用选择性和亲和力的关键“锚定残基”。每个不同的MHC II分子都呈现其独特的9-mer肽核心偏好，特别是四个锚定位点。肽-MHC结合的高度限制模式使基于序列的预测成为免疫原性风险评估的可行方法。 免疫表位数据库（IEDB，http://www.iedb.org）已经积累了超过44,000个MHC II配体结合亲和力数据，以实现算法开发的模型训练。已经开发了多种定量矩阵驱动（例如，SMMalign）和机器学习驱动平台（例如，NNalign），用于预测针对已知序列的HLA II等位基因的TCE（请参阅Doneva等人的综述，了解TCE预测方法的全面收集）。Nielsen等人在NN-align的基础上开发了Ethician，以实现更准确的泛特异性HLA-II表位预测，以克服只有有限数量的HLA等位基因已经实验研究了它们的表位特异性的障碍。这种方法通过包含来自MAPPs测定的肽洗脱数据进一步改进。截至2023年9月，Ethician 4.1已根据IEDB的自动基准测试结果被指定为最推荐的方法。 算法区分免疫原性与非免疫原性肽的能力通常通过曲线下面积（AUC）反映，其范围从0.5（随机预测）到1.0（完全准确预测）。迄今为止，许多MHC II表位预测方法可以实现AUC>0.8，这通常是令人满意的。所有当前的MHC II表位预测工具都基于计算算法计算的肽-MHC II结合亲和力，这通常会导致免疫原性的过度预测。根据抗原的摄取和处理，理论上可以与MHC II结合的表位可能不会由细胞机制功能性地呈现。一些方法已经提出通过检查N-和C-末端基序来识别目标蛋白的蛋白酶裂解位点，但这些方法未能显著改善MHC II限制性表位预测。与MHC I表位预测相比，这远不理想，后者从纳入像NetChop这样的蛋白酶体处理分析工具中大大受益。 T细胞表位的一个子集被调节性T细胞识别，称为Tregitopes，对效应CD4+辅助T细胞的免疫耐受起到抑制作用。Tregitopes最初在IgG的Fc区域被识别，后来扩展到更多非IgG蛋白。据报道，通过在MHC II结合预测的背景下包括Tregitope校正，整体免疫原性预测性能得到了提升。因此，结合Tregitopes以诱导Treg介导的免疫耐受代表了TP去免疫原性的替代策略。 对于基于抗体的治疗药物，由于mAbs的新表位通常位于定义mAbs结合亲和力和特异性的CDRs中，因此通常使用计算TCE预测进行候选筛选，而不是蛋白质工程。然而，计算TCE识别在药物优化中的价值已经在其他模式中得到体现。由Eli Lilly开发的一种抗糖尿病治疗药物度拉糖肽，是通过将人类IgG4的Fc结构域与胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物肽融合而制成的。通过点突变R36G消除了靠近母体肽C末端的一个强表位，从而创造了去免疫原性的GLP-1类似物。涉及FVIII去免疫原性的案例研究也代表了展示由计算平台驱动的免疫原性风险降低的例子。 应该适当评估MHC II表位预测的计算范式的稳健性，以指导决策过程。已经报告了计算评估与临床观察之间的相关关系，但随着样本量的增加，结论是否会受到挑战仍然值得怀疑。虽然许多赞助商倾向于在早期阶段利用计算数据支持开发行动（前瞻性），但只有少数人用它来理解在临床观察到的与免疫原性相关的事件（回顾性）。计算分析可以与体外测定相结合，以支持早期阶段的候选选择（如Xue等人所示例）。还应注意，当前算法仅基于氨基酸序列设计和优化。现有的方法无法评估翻译后或化学修饰等非蛋白质元素的影响。 4.2.B细胞表位预测 与TCE类似，通过建立在各种算法基础上的一系列方法可以实现BCE预测。基于序列的平台，如BepiPred，审查氨基酸的化学和物理性质（包括疏水性、极性和灵活性等因素），以描绘目标抗原内潜在的线性表位。构象表位约占所有BCEs的90%，可以通过DiscoTope和ElliPro等方法预测，这些方法基于已知的抗体结合区域进行训练。深度学习工具的最新进展使高阶蛋白质结构的准确预测成为可能。在DiscoTope的最新版本（3.0）中，结构预测的强大功能被嵌入到之前建立的训练模型中，使得在没有解决结构的情况下对广泛的抗原进行基于结构的BCE预测成为可能。 最近发表了许多具有先进预测稳健性的增强计算方法，其中一些在性能上优于IEDB概述的方法。然而，它们在现实世界案例研究中的表现仍然不尽人意。Cia等人提出了一个独立且严谨的BCE预测方法的基准研究，并使用SARS-CoV-2刺突蛋白作为示例来评估这些方法的性能。由于用于模型训练的表征抗原-抗体共结构的数量不足，没有一种方法达到了期望的性能。此外，当前的结构收集在很大程度上偏向于病原体和药物靶标，这些并不很好地代表自然存在的抗原，特别是对于TPs。在Lin等人的工作中，他们试图去免疫原化VHH支架，Ellipro和BepiPred都未能区分多个VHH变体的免疫原性潜力。的确，鉴于对抗体-BCE相互作用的内在性质缺乏深入理解，大多数BCE预测平台提供的AUC低于0.6，与TCE分析相比远远不够理想。这些不理想的做法促使需要结合实验和计算方法来全面分析pBCEs。目前，药物开发者对BCE预测的价值尚无共识。此外，关于BCE的存在是否仅由蛋白质固有特性决定的问题仍然存在争议。换句话说，值得质疑的是，蛋白质的某些区域，特别是TPs，在BCE识别方面是否是免疫显性的。的确，在利用BCE预测信息进行决策时需要谨慎。 5.结论和未来展望  预计TP开发者将根据监管当局的指导对其TP产品的免疫原性风险因素进行评估。在所有风险因素中，已经意识到免疫原性概况，特别是TCE和BCE景观，在决定基于抗体的治疗药物的开发能力方面具有根本的重要性。在这篇综述中，我们介绍了一个表位驱动的免疫原性评估路线图，介绍了当前的实验和计算方法的集合，用于TCE和BCE鉴定，这个工具箱在基因组和蛋白质组分析的基础上不断扩展。由于每种研究工具都有独特的优势和局限性，我们在此在图3中展示了一个推荐的时间表，指示在药物开发生命周期中何时应用不同的免疫原性评估策略。 图3. 推荐的TPs免疫原性评估行动时间表。不同的计算和实验策略可以执行，以支持从早期发现到市场阶段的免疫原性调查。注意：由于缺乏确凿证据证明其在候选评估中的价值，计算BCE分析以虚线标示。 证据表明，药物开发从表位分析中受益，尤其是以TCE为重点的研究（实验和计算）。通过识别和去除TCE，可以构建具有降低免疫原性风险的先进治疗药物，正如我们讨论的许多例子所显示的。迄今为止，TCE表征已被认为是非临床和临床免疫原性评估的标准程序，因为：1) TCE在决定TPs的免疫原性倾向中起决定性作用，2) 方法更易获得且成熟，能够产生可靠的结果。另一方面，B细胞研究通常在开发的后期进行，因为ADA样本的可用性。尽管如此，BCE与药物学和毒理学结果的联系更紧密，因为它介导了TPs和ADAs之间的物理相互作用。因此，不应低估BCE表征在药物开发中的重要性和益处。总的来说，基于TCE去除的主动免疫原性降低策略自早期开发阶段以来已被成功使用，因为它们更容易识别、操作和验证。相比之下，BCE探测在实验和计算上似乎都更加复杂。BCE信息不直接指导药物优化，而更多地用于监测和表征临床中的免疫原性相关不良效应。尽管如此，目前在TP开发中缺乏共识的计算和体外免疫原性风险评估策略。每个评估中的计划都需要一个针对具体情况、基于风险的工作流程。 尽管上述常规实施的方法，创新平台的出现提供了替代策略，允许研究人员在早期阶段评估TPs的潜在免疫原性。利用微流控芯片系统上的类器官培养，Goyal等人通过共培养原代人血T和B淋巴细胞，重新组装了适应性免疫形成的关键器官——淋巴滤泡。利用这个系统，作者观察到在流感疫苗挑战后成功产生了抗体。然而，适应性免疫的整个过程很难通过体外组织培养来再现。鉴于基于动物的免疫原性研究的转化性差，这在很大程度上归因于不同的免疫库，人们已经努力开发HLA人源化或免疫重建的小鼠模型，以预测非临床阶段的免疫原性。研究表明，使用HLA转基因小鼠可以识别CD4 TCEs，但发现限于特定等位基因。另一方面，免疫重建的小鼠可以通过向免疫缺陷的小鼠注入来自个体供体的免疫细胞来模拟个性化的免疫反应，但需要现实世界的证据来证明这种模型的可行性和可靠性，导致赞助商面临投资回报的担忧。 总之，免疫原性研究领域在近几十年中经历了快速发展。创新技术不断被开发、验证和商业化，这些技术建立在对治疗诱导的免疫原性的先进理解基础上。根据风险因素、样本可及性、预算和时间表，开发者可能会考虑适当的策略来阐明治疗分子的免疫原性潜力，以创造安全有效的药物。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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