诺奖团队揭示CRISPR基因编辑效率奥秘，成果发表于Cell子刊
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近日，《Molecular Cell》期刊发表了一项由诺贝尔奖得主詹妮弗·杜德娜教授领衔的最新研究，该研究深入探讨了CRISPR-Cas9技术在基因组编辑中的效率差异性问题，并揭示了其背后的重要机制。研究团队提出了一种新的理论，指出高效的RNA引导基因组编辑依赖于一个优化的两步靶标捕获过程，具体为选择性但低亲和力的PAM结合优先于快速的DNA解旋。这一发现不仅解密了CRISPR-Cas9基因编辑效率的关键，还为设计更有效的基因组编辑工具奠定了理论基础，也为如何平衡CRISPR-Cas9基因编辑的效率和广谱性之间的争议提供了答案。
CRISPR-Cas9通过两个基本步骤精准定位DNA靶点。首先，Cas9通过识别PAM序列（如NGG）锁定目标区域；随后，它通过解旋DNA让gRNA与靶序列配对，形成R-loop结构进而切割DNA双链。研究发现，野生型Cas9通过一种“点到即止”的策略来实现这一过程：它可以快速扫描并释放大量非目标位点，一旦找到正确靶点则高效展开解旋。
为了扩大Cas9的靶向编辑范围，科学家们开发了新型Cas9变体SpRY。然而，这种变体存在显著的缺陷。其弱结合力让其在错误位点反复停留，而解旋效率仅为野生型的三分之一。此外，SpRY在有非目标DNA存在时效率暴跌200倍，而野生型Cas9几乎不受影响。通过单分子追踪技术，研究团队首次捕捉到SpRY在靶点处反复尝试解旋但失败而野生型Cas9则“一气呵成”的动态过程。这种现象源于SpRY过强的初始结合力，导致能量屏障升高。
基于以上研究结果，研究团队提出了一套基因编辑器的优化设计思路：首先，需弱化工具酶与非特异性位点的结合力。其次，加快靶点处的解旋速度，通过对Cas9进行突变设计来降低解旋所需能量。最后，应在PAM识别与解旋速度之间找到最佳的平衡点。研究表明，通过在靶点附近引入“DNA气泡”，可以削弱双螺旋稳定性，从而提高SpRY的效率至野生型水平，这验证了能量屏障理论的准确性。
展望未来，这项研究颠覆了“PAM越宽松越好”的传统观念，指明特异性和效率的精准平衡才是CRISPR技术的核心。在此基础上，科学家们能够重新设计Cas9变体，开发出“智能扫描”工具，在扩展靶点范围的同时维持高速搜索能力。这不仅能优化源自古细菌的新型编辑器IscB/TnpB等，还能为遗传病治疗、作物改良等应用提供更安全高效的基因编辑方案。
研究团队指出，这项研究提示我们不应盲目地去PAM化，未来的基因编辑工具需要构建一个多样化的“PAM工具箱”，以适应不同的临床和科研需求，而不是依赖单一的万能工具。
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