BAX

p53 是最重要的肿瘤抑制因子。大多数肿瘤中通过肿瘤蛋白 p53 （TP53） 基因突变或关键负调节因子（MDM2）的拷贝数扩增而失活。破坏 MDM2与 p53 相互作用的化合物可恢复 p53 抑癌基因活性，从而促进细胞周期停滞和细胞凋亡。然而，MDM2-p53 蛋白相互作用拮抗剂临床经验表明，靶向药物存在血小板减少症和中性粒细胞减少的剂量限制性毒性，限制了治疗效用。在保持有效暴露的同时降低给药频率，是减轻毒性和改善 MDM2-p53 拮抗剂治疗窗口的方法。为了实现这一目标，需要具有优异效力和理想药代动力学特性的分子。 本文介绍了 brigimadlin （BI 907828） 的发现和表征，这是一种新型的临床在研的 MDM2-p53 拮抗剂。Brigimadlin 在临床前模型中表现出高生物利用度和暴露量，以及剂量线性药代动力学。Brigimadlin 治疗恢复了 p53 活性，并在 TP53 野生型、MDM2 扩增癌症的临床前模型中诱导细胞凋亡。临床1期药代动力学研究 （NCT03449381） 显示口服 brigimadlin 患者有高全身暴露和较长的血浆消除半衰期。这些发现支持 brigimadlin 在 MDM2 扩增癌症（如去分化脂肪肉瘤）患者中的临床评估。 1. 背景介绍 p53 是一种关键的抑癌基因蛋白，是人体细胞抗癌防御机制的支柱。p53 失活促进细胞周期停滞和凋亡的逃避，并且对肿瘤的启动和维持至关重要。在许多癌症中，p53 的功能会因 TP53 基因功能丧失突变或负调节因子水平升高而被破坏，包括原癌基因MDM2。MDM2 抑制 p53 转录活性，诱导 p53 从胞核输出，并作为 p53 泛素连接酶诱导蛋白酶体介导的 p53 降解。 MDM2 扩增发生在大约 3% 的癌症中，在某些肿瘤类型中发生率更高。数据分析显示，94% 的脂肪肉瘤 [LPS;包括去分化脂肪肉瘤 （DDLPS） 和高分化脂肪肉瘤 （WDLPS）]、8% 的膀胱尿路上皮癌和 5% 的胆道腺癌都是野生型肿瘤蛋白 p53 （TP53wt） 和 MDM2 扩增癌。 靶向 MDM2 以恢复 p53 抑癌基因活性是 TP53wt 肿瘤患者的一种有前途的治疗方法。初步临床研究表明，MDM2-p53 拮抗剂显示出抗肿瘤疗效的初步迹象;然而，治疗与血小板减少症和中性粒细胞减少症有关，这可能是由于 p53 激活后巨核细胞生成和巨核细胞分化受到抑制。间歇给药作为一种通过维持抗肿瘤活性同时减轻靶标相关副作用来增加 MDM2-p53 拮抗剂治疗窗的方法。这只能通过出色效力和药代动力学 （PK） 特性的抑制剂来实现。螺环吲哚类代表了一类很有前途的 MDM2-p53 拮抗剂，但一直受到稳定性差的限制，导致差向异构化。在这里，介绍了 brigimadlin （BI 907828） 的发现和特性，这是一种新型且高效的研究性螺氧吲哚 MDM2-p53 拮抗剂，可破坏 MDM2 和 p53 之间的蛋白质-蛋白质相互作用。 2. brigimadlin分子发现 MDM2 的 p53 结合口袋代表了抑制剂设计的挑战，因为三个子口袋的疏水三联体具有独特的方向，即以与其结合的 p53 氨基酸（Leu26、Trp23 和 Phe19 口袋）。化合物需要对整个疏水三元口袋进行最佳填充，才能显示出足够的效力。螺环吲哚类支架已成为 MDM2 结合口袋疏水三联体的理想模型。第一代螺环，spiro[3H-indole-3,3′-pyrrolidin]-2(1H)-one 的 MDM2-p53 拮抗剂容易在溶液中发生retro-Mannich反应在位 2' 和 3' 的碳上发生差向异构化 。 这里通过设计 spiro[3H-indole-3,2′-pyrrolidin]-2(1H)-one 支架解决了第一代螺环吲哚 MDM2-p53 拮抗剂的稳定性问题，其中吡咯烷环的氮移动了一个位置，避免差向异构化。有其他研究组通过将螺环连接到吡咯烷环来解决这个问题，如临床化合物milademetan 和 alrizomadlin 。 化合物 2（图 1A）仅占据 MDM2 的三个亲脂性子口袋（Leu26 和 Trp23 口袋）中的两个，显示出与类似的 spiro[3H-indole-3,3′-pyrrolidin]-2(1H)-one 抑制剂相当的体外效力。通过将环丙基甲基引入吡咯烷环来解决 Phe19 口袋，并通过刚性化进一步进行基于结构的优化，从而产生了 BI-0252（图 1A）。该分子的合成和表征之前已经描述过（PMID: 27775892）。为了进一步提高结合亲和力，作者设计了His96MDM2 的侧链具有 H 键受体而不是 H 键供体（BI-0252 中的 NH）的化合物。在第一批化合物中，用酰胺的羰基取代了 BI-0252 的仲胺。这在细胞测定中产生了更有效的化合物，这些化合物由于不利的 PK 特性而受到限制（PMID: 30458062）。 图 1. brigimadlin 的发现和结构。 第二系列化合物旨在解决　His96MDM2 与五元芳香族杂环的 H 键受体氮的相互作用。这导致了结构上更刚性的 2H-吲唑衍生物 BI-0282（图 1A），与 BI-0252 相比，它显示出更好的效力和 PK 特性 [体外 SJSA-1 （TP53wt） 细胞中的IC50：BI-0252=471 nmol/L;BI-0282=163 nmol/L]。BI-0282 的合成和表征之前已经描述过 （PMID: 36032359）。BI-0282 的 X 射线结构表明，与 His96MDM2 的相互作用可能仍然不是最佳的。进一步的优化形成了高度刚性四环状支架，它在模拟的胃肠道液中表现出低外排但高渗透性和溶解度。最后，将甲基置于羧酸的邻位进一步改善了 PK 性能，从而产生了 brigimadlin（图 1A 和 B）。 brigimadlin 的 X 射线共晶体结构，证实 brigimadlin 与 MDM2 的 p53 口袋结合。吲哚酮基团在 Trp 口袋中结合，吲哚酮-NH 质子与 Leu54 的主链羰基形成氢键。Leu 口袋充满卤代苯基，该苯基也被定位于与 His96 的 pi-pi 相互作用，而 Phe 口袋则由环丙基甲基定位。吲唑基团与 His96 的侧链形成氢键。 3. brigimadlin 的体外活性 Brigimadlin 在体外活力测定中表现出 MDM2 扩增的 SJSA-1 癌细胞系的 AlphaScreen 测定中表现出比 BI-0252 和 BI-0282 更高的效力。Brigimadlin 在具有 TP53wt 的细胞系中表现出比在 TP53突变细胞系中更低的 IC50 值（12 nmol/L vs. 50000 nmol/L）。进行了细胞面板活力筛选 （PRISM），以研究 brigimadlin 在多种肿瘤类型的治疗潜力，并探索其他反应生物标志物 。将全外显子组突变、体细胞拷贝数改变和基因表达谱与细胞系的反应谱相匹配，以探索对 brigimadlin 敏感的生物标志物，90% （198/221） 的brigimadlin敏感细胞系具有 TP53wt 状态，83% （469/563） 的耐药细胞系为 TP53突变状态（图 2A）。高度敏感的 TP53wt 细胞系亚群富集了脂肪肉瘤、肾细胞癌、横纹肌肉瘤和黑色素瘤等肿瘤类型（图 2B）。 图 2. 基于 PRISM 筛选 brigimadlin 的敏感性。 与未扩增的细胞系( U-2 OS 和 SW982 )相比，Brigimadlin 处理导致 MDM2 扩增细胞系( SJSA-1 和 94T778 )中 p53 靶基因的 mRNA 水平增加更大。在 MDM2 扩增和非扩增细胞系中观察到 PUMA （BBC3）、CDKN1A （P21）、MDM2、CD80、BAX 和 BIM mRNA 表达水平的剂量依赖性增加（图 3B）。未观察到 BCL-XL 表达 （抗凋亡标志物） 的一致变化。MDM2、p53 和裂解的 caspase-3/7 蛋白水平在 MDM2 扩增和非扩增细胞系中均显示剂量依赖性上调，在 MDM2 扩增细胞中观察到更大的上调（图 3C） 。在 MDM2 扩增的 SJSA-1 细胞系中，暴露于 brigimadlin 72 小时后，升高的 p53 蛋白水平再次降低。在两种 MDM2 扩增细胞系 SJSA-1 和 94T778 中观察到裂解的 caspase-3 和裂解的 PARP 水平的剂量依赖性增加 （Fig. 3D）。 使用体外人巨核细胞造血祖细胞集落形成试验 （3D CFU-MK） 检查 Brigimadlin 靶向毒性。Brigimadlin 抑制 CFU-MK 的集落形成，IC50 和 IC90 值分别为 25 和 119 nmol/L。Brigimadlin 不会诱导这些非恶性细胞凋亡，而 SJSA-1 肿瘤细胞在暴露于 brigimadlin 后 24 小时开始表现出强烈的 caspase-3/7 激活，并在 52 小时达到峰值。肿瘤细胞和正常细胞之间的明显敏感性差异表明，brigimadlin 可能存在治疗 MDM2 扩增的 TP53wt 肿瘤的治疗窗口。 图 3.MDM2 扩增和非扩增实体瘤细胞系中 p53 靶基因和细胞凋亡的 MDM2 表达和 brigimadlin 剂量依赖性调控。 4. brigimadlin 体内PK-PD、生物标志物分析 在 brigimadlin 的不同临床前物种中观察到高口服生物利用度和剂量线性度，AUC 和最大血浆浓度 （Cmax） 的可变性低（表 1）。在所有测试的物种中，brigimadlin 的血浆蛋白结合非常高 （>99%） ，并且没有表现出对浓度或性别的依赖性。发现人血清白蛋白是人血浆中 brigimadlin 的主要结合蛋白，而 hAGP 结合的重要性可以忽略不计。 表 1.brigimadlin 在不同物种中的血浆药代动力学和剂量线性药代动力学特征。 单次口服 brigimadlin 后 24 小时，可以在 SJSA-1 荷瘤 BALB/c 小鼠的血清样本中检测到 GDF15 蛋白水平的剂量依赖性增加，这是靶向 p53 的生物标志物 （0.25、 2 或 10 mg/kg;图 4A）。血清中 GDF15 的增加与肿瘤样本中观察到的 GDF15 mRNA 诱导程度呈正相关（图 4B 和 C）。支持使用血浆 GDF15 水平作为患者靶标参与的生物标志物。 图 4. brigimadlin 处理的 SJSA-1 荷瘤小鼠的标志物。 根据两种给药方案评估每周给药的 Brigimadlin 疗效 （图 5A）。在单剂量组中，小鼠在第 1 天和第 8 天接受一剂 brigimadlin （1、1.5 或 2 mg/kg）。在分次剂量组中，小鼠在第 1 天和第 8 天接受 brigimadlin 1 mg/kg BID （7 小时间隔）。单剂量方案显示出明显的剂量-反应关系。分次给药组 （1 + 1 mg/kg） 比 2 mg/kg 单剂量组效果不明显且时间短。这些实验表明，brigimadlin 治疗以 1 周的间隔单次给药可产生持久的抗肿瘤活性，支持在临床试验中使用高剂量间歇性方案。 图 5.Brigimadlin 在小鼠模型中的疗效。 brigimadlin 在几种 MDM2 扩增的 TP53wt 肿瘤类型的PDX 模型中证明了抗肿瘤活性。在两剂 brigimadlin （2 mg/kg，第 1 天和第 8 天; 图 5B-D），在 MDM2 扩增的未分化多形性肉瘤 （SA3283） ，鳞状细胞肺癌 （LU0861），鳞状细胞肺癌 （LU6903）。在体内研究中，任何一种给药方案的小鼠中均未观察到毒性（体重无变化）。 5. 临床 PK-PD、生物标志物分析 Brigimadlin 在临床试验中对 27 名接受每 3 周 45 mg 的患者 （Q3W） 的探索性 PK 分析中显示出高全身暴露，这是 NCT03449381 年 Ib 期扩展队列的推荐扩展剂量（ Cmax：2,880 nmol/L;AUC0–∞：173,000 nmol/L × 小时/L）。达到峰值浓度的中位时间 （Tmax） 为 5.0 小时。Brigimadlin 表现出低清除率 （7.34 mL/min） 和较长的血浆消除半衰期 （42 h），分布容积较低 （Vz/F;26.7 L） 。 在 Ib 期研究中入组的 27 名患者的血浆中测量 GDF15 水平。用单次口服剂量的 brigimadlin （45 mg） 治疗诱导 GDF15 相对于基线的强烈绝对变化，给药后至少持续 24 至 72 小时。 临床暴露被转化为小鼠研究，以提高临床前结果的特异性和相关性。作者试图将观察到的临床未结合暴露与临床前未结合暴露相匹配。根据群体 PK 模型，计算出首次 45 mg 剂量后人类未结合的 Cmax 为 5.4 nmol/L，未结合的 AUC0–inf 为 349.8 nmol/L × h。计算出未结合的 Cmax与未结合的 IC50 相比约为 10 倍。 小鼠中，经计算，口服剂量 1.5 mg/kg 将赋予未结合的Cmax为 7.5 nmol/L，未结合的 AUC 0–inf为 127.5 nmol/L × h。在此剂量下，小鼠的未结合 Cmax 超过未结合 IC50 计算为 14 倍。总之，估计小鼠口服剂量为 1.5 至 2 mg/kg 会导致小鼠的未结合血浆暴露接近患者 45 mg 剂量达到的未结合血浆暴露，支持临床前研究中选择的剂量。 总之，与以前的相关化合物 （BI-0252 和 BI-0282） 相比，brigimadlin 表现出更好的药物样特性，显示出高效和良好的 PK 特性。 7. 总结与讨论 本文描述了 brigimadlin 的发现和表征，brigimadlin 是一种新型 MDM2-p53 拮抗剂，具有高效力和良好的 PK 特性。其高度优化的特性允许间歇给药，这是一种旨在减轻靶向毒性（血小板减少症）的策略，同时保持强大的疗效。 brigimadlin 的临床开发正在进行中（已进入临床三期研究）。Brigimadlin 单药治疗正在 I 期试验 （NCT03449381）、随机 II/III 期 Brightline-1 试验 （NCT05218499） 中研究，该试验评估了 brigimadlin 与阿霉素作为晚期 DDLPS 患者 [FDA 已授予快速通道资格] 的一线治疗，以及 II 期 Brightline-2 研究 （NCT05512377） 评估 brigimadlin 作为 MDM2扩增的实体瘤患者的二线治疗，包括胆道癌和胰腺癌。FDA 已授予 brigimadlin 孤儿药资格认定，用于治疗胆道癌。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

摘要：在生物医药研究、诊断和不同疗法中使用的重组蛋白大多是在制药工业中的中国仓鼠卵巢细胞中生产的。这些生物治疗药物，特别是单克隆抗体，在过去几十年中显示出显著的市场增长。对大量生物制剂日益增长的需求要求不断优化和改进生产技术。研究旨在发现更好的手段和方法以达到更高的体积容量，同时保持稳定的产品质量。越来越多的复杂新型蛋白治疗药物，如病毒抗原、疫苗、双特异性和三特异性单克隆抗体，目前正进入工业生产管线。这些生物分子在许多情况下难以表达，需要针对产品特定的解决方案来改善它们的瞬时或稳定生产。所有这些要求推动了更高效表达优化系统和高通量筛选平台的发展，以促进产品特定的细胞系工程和生产策略的设计。在这篇简评中，我们提供了关于CHO细胞系开发、靶向基因操作技术、选择系统和目前在重组蛋白生产中使用的筛选方法的最新进展的概述。 1.介绍 生物治疗药物和诊断（治疗诊断学）是制药市场中迅速增长的产品。它们包括各种单克隆抗体（mAbs）、疫苗、激素和其他蛋白质，所有这些都有广泛的应用。自2002年以来，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准了300多种生物制药，并且这一数字还在增长，因为生物制剂（蛋白质、核酸、糖及其复合物）正在进入诊断和治疗的越来越多的领域。满足这些产品日益增长的需求仍然是一个挑战，并推动了制造过程中的不断创新。策略旨在优化蛋白质表达，以实现更高的体积生产率，同时保持稳定的产品质量和较低的制造成本，并缩短时间。可用的生物制剂中很大一部分是重组蛋白，其中大多数是在哺乳动物表达平台中生产的。在这篇综述中，我们专注于这个表达系统，尽管还有其他系统可用于生产活性重组蛋白，并正在评估其在制药工业中的潜在应用。哺乳动物细胞倾向于成为工业生物制药生产的主导宿主，主要是因为它们能够产生多样化、正确折叠和糖基化的蛋白质。在过去十年中，翻译后修饰的重要性，特别是糖基化，以及它们如何影响重组蛋白的不同属性的问题，引起了广泛关注。广泛的研究导致发现，为了潜在的治疗用途，大型和复杂的蛋白质需要具有类似人类的翻译后修饰，才能具有功能性和非免疫原性。不同小组的几项研究表明，适当的糖基化轮廓促进生物活性和稳定性，增加半衰期并减少蛋白质治疗药物的免疫原性。 2.用于制药重组蛋白表达的CHO表达平台 基于哺乳动物表达的系统涉及各种不同来源的细胞系，包括仓鼠（CHO, BHK）、人类（HEK293, HT-1080, PER.C6, CAP, HKB-11, Huh-7）和小鼠（NS0, Sp2/0）。然而，70%的生物制剂，几乎所有的单克隆抗体，都是在仓鼠卵巢（CHO）细胞中生产的，作为生物制药蛋白生产的最常用和首选宿主。它们的流行在于它们能够高生产率（批培养中0.1–1 g/L，在补料批培养中1–10 g/L），表现出一致的良好生长表型，适合大规模工业培养，可以轻松适应各种化学定义的培养基，对人类病毒的感染不太敏感，并且能够进行与人类兼容的糖基化。CHO ori细胞系是由Theodore Puck在1956年分离和永生化的。然后通过引入突变或适应不同的培养条件进一步开发亚克隆。与亲本细胞系相比，CHO ori衍生的细胞系具有特定的属性，更有利于高效蛋白质生产或生产者细胞系的建立。CHO DXB11 (dhfr+/), CHO DG44 (dhfr/) 和 CHO-GS-/- (CHO-K1SV)宿主已经生成，通过利用代谢标记，即二氢叶酸还原酶介导的甲氨蝶呤（MTX）基础和谷氨酰胺合成酶介导的甲硫氨酸亚砜胺（MSX）基础选择系统，使克隆选择更容易和更快。同时，MTX选择也作为一种基因扩增系统，允许高产品产量。CHO-S及其衍生细胞系已经适应悬浮培养，目的是通过增加生产者细胞密度来实现更高的体积生产。尽管共享相同的共同祖先，不同的CHO谱系由于广泛的诱变和克隆选择表现出显著的遗传异质性。这些遗传差异，也影响核型和表观遗传变异，解释了最广泛使用的CHO细胞系（主要是CHO-K1, CHO DXB11, CHO-S和CHO DG44）之间的宿主细胞特异性差异。因此，CHO表达平台为宿主细胞选择和蛋白质生产优化提供了广泛的选择。不同小组的比较研究提供了大量关于不同重组CHO细胞系对各种生物制剂的细胞特异性生长和产品形成的数据。在一个代表性例子中，Reinhart等人已经表明，CHO-K1细胞更倾向于细胞特异性生产力（7–16 pg/cell/day），而CHO-S更倾向于生物质生产，但单克隆抗体表达较低（2–6 pg/cell/day），这与CHO DG44细胞相似（在相同的实验设置中为2–4 pg/cell/day）。该小组还研究了CHO宿主对不同培养条件（批培养、补料批培养、半连续灌注培养）和化学定义培养基的偏好。研究得出结论，观察到的表达差异与宿主细胞特异性表型和代谢有关，并与培养方法或细胞培养培养基没有很强的相关性。 3.CHO细胞系优化——历史视角 数十年来，世界各地的研究团队都投入了巨大努力，试图提高生产者CHO细胞系的性能。这些细胞系操作的尝试旨在实现更高的生产力和产品产量，并利用了关于转录、翻译、细胞代谢、信号通路和分泌机制的现有知识。宿主细胞工程的主要策略是基于过表达有利于细胞增殖、长寿、应激和凋亡抵抗、蛋白质生产和分泌的基因。众多研究表明，瞬时或稳定过表达参与细胞代谢、蛋白质生物合成和糖基化的关键基因可分别提高生长速率、生产力，并获得更好的产品质量。通过过表达各种转录因子、抗凋亡（例如BCL2、XIAP、AVEN、MCL1）和促增殖基因，也已证明细胞活力和培养性能得到改善。蛋白质组学的进步也为宿主细胞的合理工程做出了贡献。蛋白质组学数据的分析被用来识别基因操作的潜在靶点，以提高产品产量，如谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚单位的报道。与有益基因的强制表达相反，其他细胞系优化方法侧重于通过基因组敲除或通过RNAi介导的基因沉默来消除或抑制“不利”基因。破坏基因功能或消除基因产物有不同方式：i）通过靶向基因组操作部分或完全删除特定基因，ii）通过突变“关闭”基因功能，iii）siRNA介导的基因沉默。微RNA（miRNA），已知在哺乳动物细胞的转录组调控中起着关键作用，在过去十年中也已深入研究其在CHO细胞工程中的潜力。越来越多的证据表明，miRNA对诸如转录、翻译、核糖体生物合成、分泌、细胞周期、代谢和细胞死亡等多个细胞功能有影响。因此，利用miRNA调控系统代表了一种高效分子工具，可用于整个细胞途径的工程。miRNA过表达（例如miR-2861、miR-23、miR-17）或通过抗miRNA、病毒载体、海绵和tough decoy载体（例如miR-7、miR-106b、miR-14等许多其他）敲低，已在CHO细胞系优化中成功使用，以使细胞适应应激环境、温度变化并增强蛋白质生产。最近一项研究报道了使用CRISPR/Cas9基因组编辑系统删除miR-744，目的是提高CHO生物过程性能。操纵miRNA介导的调控也已应用于提高人工设计的难以表达的新生物治疗剂的生产。历史上，基因消减研究针对的是代谢（例如LDHA）、促凋亡（BAX、BAK）和抗增殖基因，以及细胞周期检查点激酶（ATR）。正如预期的那样，这些选定基因的消除或沉默导致培养性能改善、凋亡抵抗增强和产品产量提高。参与染色质重塑（例如HDACs）和糖基化（例如FUT8、SLC35C1）的基因也成为敲除研究的靶点，以更好地了解如何操纵细胞系以表达具有定制翻译后修饰谱的重组蛋白。所有这些宿主细胞工程的成就都被视为成功故事，因为它们导致了CHO宿主衍生物的产生，这些衍生物在生长、应激抵抗和生产力方面超过了它们的亲本细胞系。工程生产细胞系已被证明能够实现创纪录的高3–7 g/L体积生产力。然而，监测工业制造中生产效率的数据表明，在许多情况下，不可能从高滴度生产过程的生物反应器中回收全部产品。由于这个下游处理瓶颈，产品似乎并未从非常高滴度中受益，进一步提高滴度的努力可能带来收益递减。此外，在许多情况下，观察到重组细胞系在长期培养过程中活力和生产力下降，从而使工业界面临进一步挑战。 4.工业细胞系开发的新焦点领域 在2010年之前，许多生物制药公司遵循开发自己的生产细胞系的政策，但过去十年中这种方法发生了变化。现在公司倾向于使用相同的宿主细胞系进行生产和初期临床试验，因为他们意识到这种策略简化了细胞系开发周期，并优化了通往临床的道路。此外，它降低了产品可比性问题的风险，并帮助制造商满足产品质量要求和一致性预期。这些变化的优先事项促成了CHO表达平台创新的新方向。工业细胞系开发的焦点已转向宿主细胞系稳定性问题，以确保稳定的长期生产，使用靶向整合技术进行表达优化，特别是对于复杂的工程重组治疗剂，以及开发选择和筛选系统，以实现更快、更有效的克隆选择（图1）。 图1. 工业细胞系开发中创新研究的当前重点领域。 4.1.CHO细胞系不稳定性 在制药行业中使用的CHO细胞，以良好的适应遗传操作和改变培养条件的能力而著称。这一特点源于这些细胞系本身具有可塑性的基因组，这使得它们适合于大规模工业生产。然而，不利的是，这种细胞可塑性使得CHO细胞更容易发生基因组重排（缺失、易位），并在生物生产过程中成为细胞系不稳定的源头。生产细胞面临着高基因组和代谢需求，可能导致基因组和表观遗传变化，从而导致生产力和产品质量下降。尽管如此，CHO细胞系提供的众多优势使它们成为重组蛋白生产的理想宿主，因此，科学和工业界在近期内不太可能放弃这一表达系统。因此，最近已投入大量努力来理解CHO细胞系不稳定的这一现象。研究重点是寻找解决方案，以克服制造过程中表型不稳定的难题，确保长期稳定的生产、过程一致性，并确保产品质量可接受。与所有其他快速生长的永生化细胞一样，CHO宿主细胞系在基因组上不稳定且克隆内异质，这赋予了系统鲁棒性和灵活性，但导致生产稳定性问题。为了更好地理解CHO细胞的异质性，Borth及其团队在一系列实验中研究了在亚克隆和克隆选择用于生产细胞系生成过程中，异质性是如何传递的。他们发现，亚克隆本身并没有导致亚克隆与原始细胞池相比（无论是宿主细胞系还是重组细胞系）遗传和表型异质性的减少。相反，选择特定的细胞特性导致了核型同质性和染色体稳定性增加。Baik和Lee也研究了CHO细胞系不稳定性、核型变异和生产不稳定之间的联系。他们提出了一个生产不稳定的机制模型，其中随机的染色体重排与生长优势和非生产或低生产克隆相关。同时，针对特定表型/基因型的MTX选择降低了生长速率，但提高了产品产量。在稳定重组细胞系的开发过程中，一个重要的问题是生成和识别高产克隆，这些克隆不会随时间失去表达能力。（克隆性在治疗蛋白生产中被认为是关键的，因为克隆系被认为能提供稳定和一致的产品质量特性。）然后需要在长期培养中评估选定克隆的生产情况，这是一个劳动密集型且耗时的过程。然而，目前在CHO细胞系上迅速积累的转录组数据为功能分析开辟了道路，以识别高生产和克隆稳定性的调节因子和生物标志物。按照这种方法，Ritter及其同事分析了低产和高产CHO克隆的基因表达谱，以寻找细胞工程的潜在目标，使克隆选择更快、更有效。他们发现，大多数稳定的高产克隆都标记为染色体8的端粒区域缺失。建立的实验模型结果证实，与对照CHO-K1细胞相比，CHO-C8DEL细胞（染色体8的端粒区域缺失）表现出更高的体积生产率，并产生了更稳定的生产克隆。进一步地，该团队进行了一系列敲除和敲低研究，并在选定的端粒区域内确定了两个特定目标，Fam60A和C12orf35，它们在创造CHO-C8DEL细胞观察到的表型中起作用。据报道，这些基因的缺失或表达减少与更高的生产率和更快地从选择中恢复相关。 4.2.靶向基因组操作技术 在重组细胞系生成中，最密集的研究方向集中在使用靶向基因组整合技术进行表达优化。对于建立稳定和克隆（同源）生产者细胞系，转基因需要整合到宿主基因组中。传统方法依赖于表达载体的随机整合，随后从具有异质转基因插入的重组细胞池中耗时筛选合适的细胞。这种方法有两个主要缺点：整合效率低和整合位点的位置效应。为克服这些问题，人们做出了不同的尝试。借助不同的转座子系统（Sleeping Beauty、Leap-in、PiggyBac、Tol2），成功提高了整合效率。据报道，使用转座子介导的基因整合仅在2-3周内生成的重组CHO池能够实现异常高的产品滴度（>7 g/L），因此可用于快速生产大量蛋白质。借助转座子系统的基因整合仍然是一个感兴趣领域，并正在评估其在生物医学研究不同领域的潜在用途。过去十年中，几个研究小组也解决了由于随机整合导致的“位置效应”问题。Neville等人综述的普遍染色质开放元件（UCOEs）以及其他在高生产细胞基因组中识别的调控基序已被应用于防止基因沉默并维持高水平表达。细菌人工染色体（BACs）也是一种流行且广泛使用的方法，用于确保整合转基因的位点独立、稳定和高水平表达（例如，在实验室规模的生物反应器中为选定抗体达到0.75 g/L，在摇瓶中达到1.12 g/L）。 靶向基因组操作技术使得重组蛋白编码基因能够敲入到定义良好且转录活跃的基因组位点中。与随机整合相比，这是一种建立生产克隆的更快且更高效的方法。靶向细胞基因组修饰得益于目标特异性基因编辑工具的出现，例如锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）、成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-CRISPR相关蛋白9（Cas9）RNA引导的核酸酶。其中，CRISPR/Cas9系统因其易用性（与ZFNs和TALENs相比）、高编辑效率和低成本而成为最受欢迎的选择。可编程核酸酶产生双链断裂，这些断裂在哺乳动物细胞中通过内源性DNA修复机制解决。这些机制包括不同的途径：i）非同源末端连接（NHEJ），ii）同源定向修复（HR）和iii）微同源介导的末端连接（MMEJ）。靶向基因组编辑工具的主要应用涉及在细胞或生物体的基因组中敲除或敲入感兴趣的基因。 近年来，人们投入了大量努力来识别宿主细胞基因组中的转录“热点”。靶位点的选择基于先前的经验数据、转录组数据分析或借助慢病毒筛选。不同研究小组最近使用的位点包括Fer1L4、Rosa26、Hprt、Hipp11、C12orf35和GS。如今，最先进的技术是整合不仅单个转基因，还有复杂的盒式结构，称为“着陆垫”，以生成主宿主细胞系。着陆垫包含选择标记和重组酶或整合酶的识别位点，允许精确插入任何种类和任何数量的表达盒到已建立的位点。有许多系统已有效用于在哺乳动物细胞中通过位点特异性重组介导表达盒交换，例如Cre-loxP、Flp-FRT、BxB1重组酶、PhiC31整合酶（见表1）。 最近的一项研究报道了多着陆垫DNA整合平台的开发，该平台在不同的基因组热点插入了3-4个着陆垫，用于先进的细胞工程。其他小组生成了替代版本，允许累积整合相同基因的多个拷贝或不同基因。然而，这种构建可能会带来重复介导的基因沉默问题（也影响多顺反子构建和彼此接近的基因），但有各种方法可用（例如使用表观遗传修饰元素，如绝缘子、UCOEs）来防止CHO细胞中转基因的沉默。上述讨论的平台已开发用于促进制药行业中重组生产细胞系的生成。它们也是表达优化新型复杂蛋白治疗药物的有价值且有前景的工具，并且可能应用于合成生物学。 4.3.关于产品质量和数量的难以表达的重组蛋白治疗药物的表达优化 目前，大量经过工程改造的复杂重组蛋白正在填充工业生产管线。尽管使用了先进的CHO细胞表达平台，这些蛋白在许多情况下被证明是“难以表达”的（DTE）。制药行业的一个主要创新研究领域集中在提高这些生物产品的可制造性。最近，不同研究小组进行了多次尝试，试图理解生产瓶颈的原因，并寻求这些问题的解决方案。 首先需要解决的关键问题是转录水平的表达优化，这涉及表达构建设计、基因组整合方法以及与整合位点的基因组环境的相互作用。即使在定义良好的整合位点，重组蛋白的转录水平也受到整合位点与表达盒组件之间相互作用的影响。对这一现象的研究对于可编程细胞工程至关重要，以便能够预测多个组件如何贡献于插入转基因的最终净表达。为解决这一问题，Kildegaard及其同事开发了一个分子工具箱，用于系统评估产品和位点特异性重组基因表达。利用CRISPR/Cas9技术，他们构建了一系列具有针对着陆垫的靶向整合位点的CHO-S模型细胞系，其中重组基因在定义的50近端调控元件下。他们表明，不同的调控元件在定义的整合位点产生了强大的重组基因表达模式，具有广泛的转录输出。Cartwright及其同事报道了开发高通量微型平台用于多并行测试不同遗传组件，并系统评估它们对DTE蛋白生产的影响。该小组旨在优化细胞工程解决方案，用于模型DTE IgG的稳定和瞬时生产。他们得出结论，最佳方法是产品和遗传背景特异性的，并且稳定和瞬时生产之间存在显著差异。Tadauchi等人进行了一项系统调查，旨在了解是什么使得抗体表达困难。他们构建了具有定义基因组整合位点的着陆垫的模型细胞系，其中插入的转基因在（Tet/Dox）诱导型启动子的控制下。该系统使得能够表征可能具有毒性或因任何原因难以表达的蛋白的表达。其他工作集中在转录调控上，例如在miRNA介导（miR-557）的宿主细胞工程中，已被证明有助于增强DTE蛋白表达。 分泌缺陷是复杂治疗药物，特别是DTE单克隆抗体（如英夫利昔单抗）的另一个主要关注领域。针对这一问题，不同研究团队采用了多种方法。在最近的研究中，Hussein等人描述了一种新的蛋白质工程策略，以绕过分泌瓶颈，从而提高DTE蛋白的生产。该团队进行了逐步分析，以了解限制选定重组蛋白TIMP-3和TIMP-4生产的分子机制，并确定翻译后处理阻滞是蛋白表达的限制步骤。为克服这一限制，他们构建了一个融合蛋白，其中包含一个分泌生长因子的短前序列，该序列具有蛋白酶furin的天然切割位点。同时，在同一实验细胞系中过度表达furin。这种策略已成功用于提高原本分泌不佳的TIMP家族两个成员的蛋白生产。在该研究之后，应用计算工具分析TIMP-3编码核苷酸序列，以识别导致分泌不佳的序列特征。根据获得的数据，该团队构建了一个用于DTE重组靶标的蛋白质嵌合体设计模型。Otte及其团队报告了建立一种基于自动化共聚焦显微镜的方法，用于研究细胞内DTE蛋白表达，以探索生产瓶颈的原因。在代表性研究中，Mathias等人追踪了选定重组DTE蛋白在细胞合成过程中的处理，并调查了它们在分泌途径相应细胞器中的分布。他们发现，在选定抗体的情况下，错误折叠是限制速率的步骤，也是阻碍分泌的原因，因为它导致了分子的内质网相关降解。 除了体积生产率外，产品质量对于生物治疗蛋白生产也至关重要，并且一直是工业技术开发努力的焦点。糖蛋白是生物治疗药物中增长最快的类别。正确的翻译后修饰，特别是糖链结构，对于这些生物制剂的效力以及药代动力学和药效学特性的控制至关重要。此外，不仅糖基化（唾液酸化、岩藻糖化）的性质和数量重要，N-糖链的异质性也可能是一个问题。这种异质性，由于N-糖链处理的变异性而产生，可能会损害糖治疗药物的活性和安全性。Yang及其同事描述了如何通过遗传工程改造CHO细胞，以近乎均质的形式生产糖蛋白。他们对CHO糖基转移酶进行了敲除筛选，以识别控制N-连接糖基化关键步骤的关键基因，并表明CHO细胞能够耐受糖工程改造而不会发生补偿性变化。根据他们的结果，他们提供了一种在模型细胞系中重建更均质糖基化能力的策略。 4.4.高通量筛选和选择系统的最新进展 选择系统在几十年间已经标准化，然而，不同选择系统的优缺点仍然是一个争论的话题，特别是在MTX选择系统的情况下。几项研究表明，由MTX选择导致的基因扩增是重组细胞系生产不稳定性的一个主要原因。此外，多轮MTX选择需要更长的时间来生成细胞系。最近，Yeo等人也发表了一项大规模的比较研究，探讨不同类型的标记基因如何影响不同CHO细胞系的生产稳定性。他们的结果表明，需要针对不同类型的CHO细胞优化选择标记基因的表达，以提高对最佳生产者克隆的选择严格性。 随着市场对生物治疗产品需求的增长，时间和成本成为了制造过程中的重要因素。在过程设计和优化中，更多地关注如何减少新生物产品重组细胞系生成所需的时间和成本。这推动了高通量克隆筛选和表征的新方法和技术的发展。许多改进工作集中在单克隆上，因为这是生产者细胞系建立过程中最耗时的环节。现在已有几种新技术可用于更有效地分离单细胞，取代传统的“限制稀释”方法。现代克隆方法使用专门的仪器来确保单个细胞被播种到微量滴定板孔中。荧光激活细胞分选（FACS）已成功用于根据特定细胞属性（表明高生产性）对单细胞进行分选。Solentim开发的VIPS（原位验证板播种）以及Cytena单细胞打印机仪器结合了细胞播种与显微镜成像，以确保单细胞沉积，从而保证衍生克隆的单细胞起源。Berkeley Lights的Beacon平台利用微流体和光电子定位技术，通过软件控制操作，在单芯片上并行培养、操纵和表征数千个细胞。ClonePX FL提供了一种基于表达的方法，在半固体培养基上，用于高效高生产者克隆/菌落的选择和分离。 许多这些技术发展和现代仪器为高通量自动化过程提供了可能，已经在制药行业成功引入，并现在应用于工业重组蛋白生产。 4.5.“组学”技术——系统生物学方法 自2010年代以来，“组学”方法和“组学”技术的出现促进了对细胞特征和身份特征的深入理解，这些特征表明了最佳生产状态。在基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、脂质组学和糖组学领域，现在有大量的数据（并且每天都在增加），这些数据提供了对特定时刻细胞状态和特征的系统级洞察。Stolfa等人发表了关于CHO的可用资源和数据库的全面总结。与此同时，生物信息学中计算方法和算法的不断发展使得这些“组学”数据能够被转化为与细胞机制和功能相关的生物学信息。这些信息与计算建模一起被用于CHO研究的所有领域：用于预测细胞行为，探索重组细胞系中不同生产效率背后的转录组水平克隆变异，或识别操纵生产者细胞系应激反应和敏感性的新靶点。在最近的一项研究中，Kol等人进行了多重分泌组分析，以研究宿主细胞蛋白对重组蛋白生产的影响。通过系统的计算机（计算筛选）和体外分析，Nguyen等人从CHO细胞中识别出内源性启动子和增强子元素，这些元素可用于转基因表达优化的潜在用途。Brown及其同事进行了基于转录组的分析，以识别用于qPCR数据标准化的最佳参考CHO基因。该研究结果已适应于制药行业常规用于生产者细胞系稳定性表征。随着“组学”技术的进步，糖基化谱的系统分析为CHO细胞的糖基化网络提供了新的见解，并有助于开发新的糖工程策略，旨在产生更有效的疗法，减少副作用——正如Tejwani等人在一篇全面的综述中总结的那样。Stach等人描述了一种将系统级动力学模型与合成生物学相结合的方法，以研究N-糖基化的本质，并测试遗传扰动对产生IgG的半乳糖化行为的协同作用。 5.未来展望 系统生物学方法为增强基于CHO的生物生产开辟了新的维度。“组学”技术提供了更好地表征和理解复杂细胞功能的新机会，从而为机制驱动的细胞系优化创造了基础，而不是操纵几个关键基因。然而，一个主要问题是这些现代技术需要特殊的仪器、材料和先进的信息技术设施，因此它们仍然过于复杂和昂贵，无法在工业制造中常规使用。另一方面，迄今为止不同“组学”技术提供的数据还无法整合到一个通用的数学模型中，这将有助于在实验过程设计中转移和应用这些信息。如何将这些知识适应并整合到关于重组蛋白生产的工业生物过程优化和开发中仍然是一个挑战，需要在未来解决。 识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 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蛋白–蛋白相互作用（PPIs）在众多生化和生物学过程中扮演着至关重要的角色。尽管已有多种基于结构的分子生成模型问世，PPI界面及其靶向化合物相较于传统的结合位点和小分子药物却表现出独特的物理化学性质。因此，针对PPI界面，特别是考虑PPI复合物或界面热点残基设计有效的靶向化合物，依然是一项重大挑战。 2024年12月20日发表在Journal of Cheminformatics的研究论文《Interface-aware molecular generative framework for protein–protein interaction modulators》提出了一种全新的基于结构的分子生成框架，专门用于靶向PPI界面的分子设计。 这项研究中，研究人员构建了一个涵盖活性和非活性化合物与PPI界面数据对的综合数据集。基于此数据集，提出了面向PPI界面的分子生成框架，命名为GENiPPI。研究结果显示，GENiPPI能够捕捉PPI界面与活性分子之间的潜在关系，并生成新颖且能够靶向这些界面的化合物。同时，GENiPPI在有限的PPI界面调节剂条件下，依然能够生成结构多样性丰富的化合物。值得注意的是，这是首个专注于PPI界面的基于结构的分子生成模型，其设计思路有望显著推动PPI调节剂的研发。这一基于PPI界面的分子生成框架不仅拓宽了现有基于结构（结合位点/界面）分子生成模型，也为靶向PPI界面的药物开发提供了新思路。 基因之间通过蛋白-蛋白相互作用（PPIs）构成了一个庞大的网络，这些相互作用是几乎所有生物过程中不可或缺的组成部分，广泛存在于各种生物体和生物路径中。调控PPIs不仅扩大了药物靶点的范围，还在药物研发中展现了巨大潜力。在人类中，交互体的规模估计在几十万到几百万对二元PPIs之间。尽管付出了巨大努力，开发针对PPI靶点，尤其是PPI界面的调节剂仍面临巨大挑战。 基于结构的理性设计在识别药物发现中的先导化合物方面起着至关重要的作用。然而，传统药物靶点与PPI靶点在生化特性上表现出显著差异，常规药物与PPI调节剂在物理化学和类药性质上也存在显著不同(表1)。鉴于这些差异，为不同药物靶点开发适配的分子生成模型成为设计针对不同靶点药物的关键。 生成式人工智能（AI）能够模拟训练样本的分布，并生成具有新颖性的样本。在药物发现领域，生成式AI通过生成具有理想特性的分子，加速了药物研发的进程。药物设计中的分子生成模型大致分为三类：基于配体的分子生成模型（LBMG）、基于结构的分子生成模型（SBMG，聚焦于结合口袋或结合位点）和基于片段的分子生成模型（FBMG）。其中，SBMG模型因其针对性的特点受到了广泛关注。然而，尽管基于结构的分子生成模型已有许多研究，但针对PPI结构或界面的分子生成模型仍鲜有报道。 在本研究中，研究人员开发了GENiPPI，一种基于结构的条件分子生成框架，用于生成靶向蛋白-蛋白相互作用界面的调节剂。该框架首先利用图注意力网络（GATs）捕捉蛋白复合物界面中微妙的原子级相互作用特征；然后，通过卷积神经网络（CNNs）提取化合物在体素和电子密度空间中的表示。接着，条件Wasserstein生成对抗网络（cWGAN）将这些特征整合，用于训练能够生成靶向PPI界面化合物表示的模型。最后，CNN模块与LSTM网络将分子嵌入解码为SMILES字符串。该框架旨在捕捉PPI界面与活性/非活性化合物之间的关系，从而训练出特定于PPI界面的条件分子生成模型。条件模型的评估结果显示，GENiPPI框架能够有效捕捉PPI界面与活性化合物之间的隐含关系，生成具有类药性质且与特定PPI靶点活性化合物相似的化合物。在性能方面，GENiPPI在生成分子的创新性、多样性和有效性上均优于其他生成模型。此外，在少样本分子生成实验中，GENiPPI成功生成了靶向Hsp90-Cdc37相互作用的化合物，其化学特性与已知的干扰剂相似，即使在有限的标注数据条件下依然表现出色。总之，GENiPPI为基于结构的PPI调节剂设计提供了有效的解决方案。 图1. 靶向PPI界面的分子生成框架GENiPPI 结果和讨论 靶向PPI界面的分子生成 本研究提出了GENiPPI，一种模块化深度学习框架，用于基于结构的PPI调节剂设计（图1）。GENiPPI包含四个主要模块： 图注意力网络(Graph Attention Networks, GATs)模块：用于对蛋白复合物界面进行表示学习，生成条件向量； 卷积神经网络(Convolutional Neural Networks, CNNs)模块：用于捕捉调节剂的分子特征，作为主要输入； 条件Wasserstein生成对抗网络(Conditional Wasserstein GAN, cWGAN)模块：利用条件向量和主要输入进行条件分子生成； 分子字幕网络模块：将分子嵌入解码为SMILES字符串。 框架的分子生成流程包括以下四个步骤： 1.PPI界面特征提取：GATs模块从蛋白复合物界面区域提取原子级相互作用特征，精准捕捉交互中至关重要的细微结构特性。 2.分子特征编码：CNN模块在三维空间中对分子特征进行编码，结合体素和电子密度信息，确保分子结构的表示能够满足生成任务的需求。 3.条件生成：cWGAN模块通过调控输入的蛋白复合物界面特征生成靶向PPI界面的化合物。cWGAN模块由三个核心部分组成：生成器：接受高斯随机噪声向量和蛋白复合物界面特征，生成分子嵌入空间中的向量；判别器：判断生成的分子嵌入是否对应于真实分子或生成分子；条件网络：评估分子嵌入是否与蛋白复合物界面特征相匹配。 4.分子解码：分子字幕网络将分子嵌入解码为SMILES字符串。该网络包含一个处理分子嵌入的3D CNN和一个逐步解码嵌入为有效分子结构的LSTM（长短时记忆网络）。该步骤确保生成的分子设计可应用于后续药物设计研究中。 GENiPPI通过模块化设计，不仅能够生成靶向PPI界面的新型分子，还能提高分子生成的有效性和多样性，为PPI调节剂的药物开发提供了强有力的工具支持。 条件评估 为全面评估条件输入在面向蛋白复合物界面的条件分子生成模型中的有效性，我们对三个具有代表性的PPI靶点进行了详细分析：MDM2/p53、Bcl-2/Bax以及BAZ2B/H4。这些靶点因其高质量的标注数据以及在癌症生物学中的重要性而被选中。 对于每个PPI靶点，研究人员利用GENiPPI框架生成了10,000个有效分子，并计算了生成化合物的关键类药性指标，包括QED、QEPPI和Fsp³。这些指标分别是评估类药性、靶向PPI的类药性和分子复杂性的重要标准。分析的目标是确定生成分子与已知活性化合物的类药性特征匹配程度，并评估条件输入对生成过程的影响。 随后，研究人员比较了针对MDM2/p53、Bcl-2/Bax和BAZ2B/H4的活性化合物与生成化合物的QED、QEPPI和Fsp³分布（图2）。结果表明，生成化合物的类药性分布与所有三个PPI界面靶点的活性化合物高度相似。这表明源自PPI界面特征的条件输入在引导生成过程向生物学相关化合物方向发展方面起到了关键作用。 图2. 条件评估结果 有趣的是，不同PPI靶点生成化合物的类药性分布表现出了差异。例如，MDM2/p53和Bcl-2/Bax在界面结构和结合热点上存在显著差异，这可能导致生成化合物在QEPPI和Fsp³特征上的不同分布。这些结果强调了条件生成框架的特异性，它能够根据目标PPI界面的独特特征调整分子生成过程，确保生成的分子与各个PPI靶点的独特特征相匹配。 通过独立t检验，研究人员比较了每个PPI靶点的活性化合物与生成化合物在QED、QEPPI和Fsp³指标上的均值差异（图3）。结果显示，在不同指标上，活性化合物与生成化合物之间存在统计学显著性差异。例如，对于MDM2/p53和Bcl-2/Bax，在QED和QEPPI指标上观察到显著差异，表明活性化合物在类药性和靶向PPI的类药性方面更优，而Fsp³分布则较为相似。然而，在BAZ2B/H4的案例中，活性化合物和生成化合物在QED和QEPPI值上表现出相似性，仅在Fsp³指标上存在显著差异。这些结果表明，尽管生成化合物在类药性指标（尤其是QED和QEPPI）上能够接近活性化合物，但分子复杂性（Fsp³）可能因PPI靶点的不同而有所变化。 图3. 在三个PPI靶点上，生成化合物和活性化合物的QED、QEPP和Fsp³值的独立t检验比较 此外，与训练数据集相比，生成化合物的类药性特征发生了显著的分布变化，表明GENiPPI框架不仅仅是复制已知分子的分布，而是生成了在保持类药性的同时探索新化学空间的化合物。这种在已知类药性特性范围内创新的能力是成功生成模型的重要特征，能够为发现潜在更有效或更优化的PPI调节剂提供可能性。 化学空间探索 为了更全面地评估模型生成分子与训练数据集中活性化合物在化学空间中的分布，研究人员通过计算MACCS指纹的t-SNE图对生成化合物的化学类药性空间进行了分析。t-SNE是一种常用的降维方法，通过将高维数据映射到低维空间来可视化数据点分布。该方法能够聚类相似化合物，从而清晰展示生成化合物与已知活性化合物在化学空间中的占据情况。 通过t-SNE可视化生成化合物与活性化合物在化学类药性空间中的分布，研究发现生成的类药性化合物不仅与活性化合物共享化学空间，还在二维空间中均匀分布（图4）。这表明，GENiPPI框架能够生成占据与已知活性调节剂相同类药性空间的分子，进一步验证了模型生成可行药物候选物的能力。此外，在二维拓扑指纹下，生成化合物展现出与活性化合物类似的化学类药性空间，表明生成模型能够有效捕捉分子关键的拓扑特征，这些特征对类药性至关重要。 然而，仅依赖二维表示可能不足以全面评估类药性，尤其是对于PPI调节剂而言，往往需要更复杂的三维特征来实现有效结合。为此，研究人员对生成化合物进行了主惯性矩（PMI）形状分析，并与DrugBank和iPPI-DB中的类药性化合物进行比较（图4d）。分析结果显示，许多已批准的化合物呈现出棒状或盘状形状，而生成的类药性化合物在三维形状分布上与已知化合物相似。这些形状特征通常对靶向PPI界面的空间互补性至关重要。此外，PMI形状分析表明，模型能够生成具有合理三维特征的化合物，这些特征与已知类药性分子的形状一致，进一步验证了生成过程的稳健性。 研究人员还评估了生成化合物的最佳拟合平面（PBF）得分，这一参数描述了分子骨架偏离平面的程度。生成库的PBF分布范围为0~2 Å（图4e），表明许多生成的类药性化合物源于相对平面的分子骨架。 图4. 化学空间探索 此外，研究人员通过化学空间图评估了模型生成PPI靶点特异性化合物的能力。利用Tree MAP（TMAP）生成二维投影（图4f），其中每个点表示一个化合物，不同颜色对应不同靶点标签，深色和浅色分别代表生成化合物和活性化合物。结果显示，GENiPPI模型不仅能生成与训练集中活性化合物相似的分子，还能引入新颖结构。总体而言，该框架丰富并扩展了PPI靶向类药性化合物的化学空间。 小样本分子生成 由于数据采集成本高昂，生物医学领域通常仅能获得少量标注数据，这对药物设计与优化带来了挑战。数据稀缺往往会削弱深度学习框架在药物设计中的实际表现，因此解决有限标注数据下的分子生成问题成为少样本生成研究的重点。少样本学习旨在通过少量样本进行模型训练，同时能够有效泛化到新任务，这在新PPI靶点的药物发现中尤为重要，因为实验验证的分子数量通常有限。 GENiPPI框架被用于生成靶向Hsp90-Cdc37相互作用界面的虚拟化合物库。以Hsp90-Cdc37的PPI结构（PDB ID: 1US7）为基础，并使用7种已知破坏剂的数据对模型进行训练，成功生成了500个有效化合物。通过t-SNE投影图可视化Hsp90-Cdc37活性破坏剂与生成化合物的化学空间相似性，发现生成分子主要聚集在活性破坏剂的化学空间周围。这表明，即使在有限的训练数据下，少样本学习能够有效探索靶向化学空间，并生成与已知活性破坏剂结构相似的分子。 为了进一步评估生成化合物的化学相关性，研究人员以一种新型三嗪衍生物DCZ3112为基础进行基于药效团的匹配分析。结果显示，生成的前5个化合物在药效团和形状特征上与DCZ3112相似，表明模型成功学习了破坏Hsp90-Cdc37相互作用所需的关键特征，即使输入数据有限。 随后，通过分子对接进一步验证模型性能。参考已有研究中识别的PPI界面关键热点残基（PDB ID: 1US7），对DCZ3112与Hsp90-Cdc37复合物的结合位点进行了分子对接模拟，并分析了氢键、盐桥等关键蛋白-配体相互作用模式。对GENiPPI生成化合物的对接结果显示，这些化合物不仅获得了比活性化合物更高的对接评分，还再现了与关键残基的核心相互作用。此外，生成分子还形成了额外的卤键、盐桥和π-阳离子相互作用，这些新型相互作用可能进一步增强了与目标PPI界面的结合亲和力。 图5. 小样本分子生成分析 结论 本研究中，研究人员开发了GENiPPI框架，该框架结合PPI界面特征与条件分子生成模型，生成了靶向PPI界面的新型调节剂。通过广泛的条件评估实验，研究人员验证了GENiPPI框架学习PPI界面与活性分子之间隐含关系的能力，并展示了其生成化学多样性高且具有生物学相关性的分子的能力。GENiPPI的核心创新之一在于利用图注意力网络（GATs）从PPI界面中提取细粒度的原子级相互作用特征，使模型能够聚焦于传统药物设计方法难以靶向的关键“热点”区域。此外，通过引入条件Wasserstein生成对抗网络，模型能够在分子生成中施加特定约束，确保生成的分子不仅具有结构新颖性，还符合PPI靶点的类药性要求。研究人员的对比基准测试和多种实验表明，GENiPPI在合理设计PPI药物方面具有实际应用潜力。 尽管结果令人鼓舞，但该框架仍存在一些限制，需要加以改进以提升其性能和适用性： 1.泛化能力的测试不足：模型尚未在大量PPI受体-配体对中进行广泛测试，这可能限制其泛化能力。这一局限性源于与传统药物靶点数据集相比，药物-PPI靶点复合物数据较为稀缺。 2.缺乏3D结构信息：当前框架未充分纳入配体-受体相互作用的三维结构信息。 3.表示学习与生成多样性：在表示学习、平衡训练速度和提升生成分子多样性方面仍有改进空间。 潜在改进方向 为了进一步改进GENiPPI及其在PPI靶向药物发现中的应用，可以从以下几个方向展开： 1.数据质量与多样性：收集和清洗更多高质量的PPI受体-配体复合物数据对，提高数据的多样性和准确性，从而增强模型对新靶点的泛化能力。 2.结合化学语言模型：整合分子化学语言模型和蛋白-蛋白结构特征的预训练模型，对PPI受体-配体数据集进行微调，从而提升模型生成分子的创新性与多样性。 3.整合三维结构信息：将基于片段的分子生成模型与三维结构信息相结合，以增强对PPI界面复杂三维特征的捕捉能力。 4.深度强化学习优化：通过修改模型架构或结合深度强化学习优化生成分子。定义如最大化结合亲和力或改善药代动力学特性等具体目标，让强化学习代理逐步优化生成分子以实现更理想的药物特性。 未来，研究人员将聚焦于将先进的表示学习方法与深度生成模型相结合，进一步增强GENiPPI框架的性能和适用性。 参考资料 Wang, J., Mao, J., Li, C. et al. Interface-aware molecular generative framework for protein–protein interaction modulators. J Cheminform 16, 142 (2024).  https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1186/s13321-024-00930-0 --------- End --------- 感兴趣的读者，可以添加小邦微信加入读者实名讨论微信群。添加时请主动注明姓名-企业-职位/岗位 或  姓名-学校-职务/研究方向。