RIPK1

引言 程序性细胞死亡主要包括凋亡、程序性坏死、焦亡。凋亡由一系列caspases 蛋白介导，焦亡主要由caspases和gasdermin蛋白介导，而坏死通常发生在caspases被抑制的情况下。因此，不同的程序性细胞死亡具有相同/类似的分子特征。然而这些程序性死亡是否通过相同或类似的机制来启动仍然未知。 肿瘤坏死因子TNF是一种主要的促炎细胞因子，受体互作蛋白激酶RIPK1是TNF通路中的关键节点。RIPK1可以通过其激酶功能诱导凋亡和/或程序性坏死。正常生理情况下，RIPK1激酶活性被多个保护性的“刹车”，即细胞死亡检查点，所抑制，从而避免细胞死亡的发生。这些检查点由一系列复杂的翻译后修饰，主要包括泛素化和磷酸化，共同决定细胞是否发生死亡。任何一个检查点的缺失，都会使得RIPK1被激活，进而导致细胞死亡的发生。多种人类炎症性和自身免疫性疾病都与检查点缺失和RIPK1被激活有关。近年来，领域内已经鉴定出了多个RIPK1的保护性检查点。然而，当这些检查点失活时，RIPK1的激活以及细胞死亡的启动是否需要特定的信号仍不清楚。 2024年10月28日，中国科学院上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心许代超课题组在Molecular Cell杂志在线发表了题为Palmitoylation licenses RIPK1 kinase activity and cytotoxicity in the TNF pathway的研究论文，报道了RIPK1介导细胞死亡的启动机制，揭示了该机制以泛素化依赖的棕榈酰化的形式调控RIPK1的激活和程序性细胞死亡的分子机制。 S-棕榈酰化是一种可逆的脂质修饰，其特点是在棕榈酰基转移酶的催化下，棕榈酸通过硫酯键共价连接到蛋白的半胱氨酸残基。棕榈酰化可赋予蛋白疏水特性，促进蛋白的向膜迁移或影响蛋白互作。该研究发现，在TNF刺激短时间内可诱导RIPK1发生棕榈酰化修饰。修饰位点位于其激酶结构域内一个保守的半胱氨酸残基C257。进一步研究发现DHHC5是介导RIPK1棕榈酰化的主要棕榈酰基转移酶，且DHHC5的功能发挥依赖于RIPK1的K63泛素化对其进行的招募（图1）。 现有的理论认为，RIPK1的激活通过二聚体内的反式自磷酸化进行，这意味着其激酶结构域需要发生同源相互作用。然而，目前还不清楚RIPK1激酶结构域如何实现这种同源互作以促进自身磷酸化激活。该研究结果建立了以下模型详细阐明了当细胞死亡检查点被破坏时，RIPK1介导的细胞死亡如何被启动：①当细胞感应到TNF后，RIPK1被迅速招募到临近细胞膜区域的TNF受体复合物；在该复合物中，RIPK1在E3酶cIAP1/2的作用下发生K63连接的泛素化修饰。②这些K63泛素链会招募定位于细胞膜上的DHHC5，使之靠近RIPK1。③随后，DHHC5催化RIPK1激酶结构域上的棕榈酰化，增加激酶结构域的疏水特性，促进其同源相互作用；④在细胞死亡检查点受阻的情况下，上述过程可以增强RIPK1的反式自激活，最终导致下游的RIPK1介导的细胞死亡，包括凋亡和程序性坏死（图1）。 图1. 当TNF通路中的保护性检查点失活时，K63泛素化依赖的棕榈酰化促进RIPK1激活和启动细胞死亡的分子机制模式图（Credit: Molecular Cell） 该研究进一步表明这种修饰在体内至关重要，因为阻断RIPK1棕榈酰化可以保护小鼠免受TNF诱导的致死性休克。此外，在患有代谢功能障碍相关的脂肪性肝病(MASH)小鼠肝脏中，脂肪酸的累积促进了MASH肝脏中DHHC5的扩增和RIPK1的棕榈酰化，使得RIPK1过度激活导致肝细胞死亡和肝损伤。因此，该研究表明DHHC5介导的RIPK1棕榈酰化是治疗炎症性疾病的潜在靶点。 值得注意的是，许代超团队之前的研究发现gasdermin D的棕榈酰化是焦亡启动的必要条件。但棕榈酰化在不同细胞死亡类型中的作用方式有所不同。在焦亡中棕榈酰化促进gasdermin D的剪切激活和上膜成孔，而在凋亡和程序性坏死中，棕榈酰化促进RIPK1的反式自激活。总之，这些系列的研究表明棕榈酰化修饰是一种广谱的程序性细胞死亡启动机制。 参考文献 https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.molcel.2024.10.002 责编|探索君 排版|探索君 来源|BioArt End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

融中财经：伴随这两年市场变化，贵司的技术和产品服务经历哪几次迭代？公司战略有哪些调整？ 劲方医药：劲方成立于2017年，恰逢新药赛道在一级市场蓬勃成长。相对于很多同期成立的企业，我们没有选择模仿/跟随创新（me-too）或产品引进（VIC/license-in）的模式；没有去塑造一个单纯的平台类企业，如抗体、疫苗、小核酸等工程类平台；而是选择了更接近前沿跨国药企的创新模式，开发靶点新颖、全球尚无临床验证的创新疗法。“全球新”的立项理念和管线驱动的开发模式，也源自创始团队对创新药本质的认知、打造自主研发体系的专业能力、以及核心管理层长期的合作经验。 成立七年来，市场从大干快上到寒意阵阵，劲方仍然经历了从早研布局到全球临床、从早期工艺到商业化生产、从立足于自主研发到多元国际化并行的成长。这些年来，我们最大的收获和不变的理念，就是坚持“全球新”战略、坚持自主研发和全球视野。但创新不是一成不变，也非随波逐流，劲方的“全球新”理念以早研创新为起点，主攻全球尚无临床验证的靶点与适应症、力争新药上市速度在国内外均进入第一梯队；然后拓展至临床开发的原创设计包括一线国际方案，还有模式创新的多元化商业合作网络、以全球IP提前布局全球市场。 从2021年起，劲方以聚焦自主研发为起点、达成了多个重磅合作：公司与包括信达生物、德国默克、百济神州等知名企业达成多个大额授权交易或临床合作等协议，实现自我造血，并凝聚合作双方的优势、加速推动劲方管线的优秀产品上市。此外，我们也针对各个疾病的治疗格局和标准疗法，设计具有差异化的临床项目，比如劲方与默克合作的一线非小细胞肺癌联合疗法、与百济神州合作的弥漫性大B细胞淋巴瘤联合疗法。 融中财经：发展过程中，有哪些比较关键的事件？ 劲方医药：成立七年来，公司在8月迎来管线中首个上市的一类新药—— 氟泽雷塞（单药治疗非小细胞肺癌），这是国内首个、全球第三个上市的KRAS G12C抑制剂。该产品的立项、一体化研发到商业合作，全程践行了“全球新”的理念；此外，公司在氟泽雷塞单药疗法之外，开拓了全球首个KRAS G12C抑制剂、EGFR单抗的一线非小细胞肺癌联合疗法研究（欧洲多中心），以及全球首个获批（美国FDA）进入III期临床的G12C抑制剂单药结直肠癌研究。 劲方的商业合作与造血之路，也正是始于氟泽雷塞的国内授权合作。2021年劲方与信达生物达成当时国内总额最高（超过3亿美元）的临床申报阶段产品授权交易，劲方小分子研发生产优势与信达临床、商业化体系的优势互补，实现了快速的临床推进和新药上市。之后劲方持续达成了多个出海授权项目，交易的产品开发阶段从临床拓展至临床前，以多元交易提升企业造血实力。 融中财经：商业化过程中，我们克服了哪些行业共性难题，如产品成本控制、技术创新等？目前公司业务营收情况如何？ 劲方医药：劲方管线立项的原则是主攻全球尚无临床验证的靶点与相关适应症。针对前沿靶点的机制研究和新药开发，必然会带来许多从零到一的挑战，既有单个流程的路障、更有上下游接力的考验。比如，我们在氟泽雷塞及其他新品研发过程中，完成了很多实验方法学的摸索构建、持续的原料药合成工艺优化、并坚持原创的临床方案设计，从而突破了新药开发中的难点，我们的一体化早研、临床、生产体系也在一次次突破中璞玉初成。 除了产品的创新度与质量，持续地降本增效也是科技企业的使命。新药开发的周期长、成本高，只有适配市场的定价体系，才能提升产品在商业化阶段的可及性和可支付性。仍以氟泽雷塞为例，它的分子结构复杂、合成路线较长，但随着劲方的生产体系不断完善以及工艺路线的持续迭代，氟泽雷塞的原料药合成成本已下降数十倍，为商业化生产奠定基础。 劲方从2021年起开始了多样化的商业合作努力。目前公司已和国内外上市企业达成多个授权合作，获得可观的首付款、并随产品进展不断收获里程碑收入及服务收入，同时随着产品获批上市，我们也将获得销售梯度特许权使用费。但劲方设计商业合作项目的初衷，仍是管线驱动、针对产品特点寻找合适的伙伴，挖掘对方的潜在优势并通过合作转化为长期价值、实现共赢。 融中财经：目前贵司所处行业赛道具备哪些特点？市场竞争格局如何？创业公司是否还有机会？ 劲方医药：新药开发应对的是人类巨大的未满足临床需求，始终是社会刚需的朝阳产业。随着多国老龄人口增加、诊断方式进步，重大疾病、慢性病甚至罕见病的治疗需求会持续增加。同时，国内审评制度从2015年之后不断进化，本土新药人才体系和产业链也逐步成型，我们在过去十年内看到了本土新药管线和上市产品持续放量，过去两年来多种类型的新药出海也逐渐蓄势。 但在产业狂飙过后的盘整期，我们也面临宏观经济、资本市场及产业周期合围的挑战。市场竞争呈现双重倾向：一方面良性竞争通过扫荡低门槛同质内卷，推动可持续的生态布局；另一方面，低水平重复建设、投机搅局式的恶性竞争，则不利于科技发展和患者的临床获益。我们相信以长期主义的角度审视行业，市场必然具备自我净化的能力；而劲方的“全球新”理念恰恰是穿越淘汰赛与决赛的必选项，只有差异化的产品和扎实的自主研发体系，才能为市场、病患、投资人带来具有长期开发价值的创新疗法。 融中财经：中国高科技企业和投资人都在热衷找到解决卡脖子的技术创新，如何守住护城河，同时保持创新性，在市场上进一步开疆拓土？现阶段对技术、市场等方面投入情况？关于未来2～3年或者下一个十年，公司在技术、市场、团队等方面有哪些重点规划？要实现哪些目标和突破？ 劲方医药：目前国内新药的人才体系和产业链已初具规模，不少大分子产品的工程平台，以及各类CRO和CDMO服务平台也不断完善；此外，生命科学的基础研究和临床交流尚不存在技术封锁，因此目前新药技术领域不存在芯片等制造业的典型“卡脖子”现象。但另一方面，企业仍需要建立原始创新和开发效率的“护城河”，且针对市场变化不断开辟新品也是创新的题中之义。 作为管线驱动的公司，劲方始终瞄准前沿靶点并兼顾产品的成药性、市场前景，同时立足于头部产品的开发经验与优势打造深耕赛道。基于首个成功研发的KRAS靶向疗法氟泽雷塞，劲方已深度拓展RAS靶向药的开发矩阵，并与同样深耕此领域的美国上市企业Verastem在2023年达成总额超过6亿美元的授权合作，其中包括劲方原创的一款产品KRAS G12D抑制剂GFH375已经在中国进入I/II期临床试验，而G12D正是占比最大的KRAS突变型；此外，公司开发的、基于“分子胶”机制的泛RAS抑制剂系列分子也已进入临床申报阶段。 未来几年内，劲方更多管线有望进入后期临床开发、并获得临床验证。劲方于2022年与美国上市企业SELLAS达成海外授权合作，GFH009（CDK9抑制剂）目前在中美两地进入多个II期研究，并获得包括快速通道、孤儿药、儿童罕见病疗法等在内的FDA、EMA资格认定。在抗肿瘤疗法之外，劲方首个免疫类疾病治疗产品GFH312，是国内企业开发的首个临床获批的RIPK1抑制剂。此外，劲方自成立起就开始布局大、小分子产品，管线包含公司首个临床获批的单抗产品GFS101A、已进入临床申报阶段的双抗产品GFS202A，而机制新颖、具有全新IP的抗体偶联药物平台FAScon也初具规模。 融中财经：从首次融资到现在，我们接洽资本的考量是什么？对资方的选择有了哪些变化？新一轮融资进展如何？新资金将用于哪些方面？下一阶段的融资计划如何？ 劲方医药：从天使轮至C+轮，优秀投资机构的多轮资本加持，显示了一级市场对公司差异化、可持续创新的长期认可。不同阶段加入的投资人、同行者，都是我们志同道合的支持者；大家的共同理念都是打造以创新为引领、满足市场需求的创新药公司。 公司最新完成的是C+轮融资，新股东包括亚投、华金、泰珑、万汇等优秀产业资本；老股东谢诺资本也在近期加持，显示了对公司发展的信心；最新的融资将用于推进公司核心产品及中后期临床项目开发，同时挖掘更多创新靶点、开拓更多国际化商务合作空间。 经历多年的创业成长，劲方也通过不同类型的投资机构学习了丰富、多元的资本市场经验。我们很清楚一、二级市场的不同诉求，也期待在合适的时机登陆二级市场，在持续发展过程中回馈股东。 融中财经：作为融中Power50优秀的标杆企业代表，如何在科技创新、产业发展战略下发挥“强链、补链”作用，在技术和产品服务方面为社会提供更多社会价值？ 劲方医药：在当前的市场环境中，biotech板块所需的“强链、补链”，并非简单加固基础产业链的瓶颈，而是与优势互补的合作伙伴加速推进产品上市，并与产业界、基础研究和临床医学专家打造契合自身的产、学、研生态圈。氟泽雷塞的研发与上市，正是劲方通过这种“强链、补链”模式推出的产品：我们的原创小分子研发生产能力、原创及一线国际临床设计，与信达在国内的高效临床、商业化体系优势互补，同时我们在国内外都与权威肺癌专家达成研究合作、并充分利用生产服务平台（CDMO）的规模优势；药物上市的同时，我们也提升了自身的可持续研发能力与价值创造空间。 企业的社会价值正是将商业回报与社会责任结合。目前氟泽雷塞上市之后的首批药品已发往全国多地药店，并在一家北京医院开出中国院内首方，在中国市场已惠及来自不同地域和国籍的患者；此外，劲方多个不同临床阶段的产品在国内外试验中达到了相应的预设目标，受试者实现了不同程度的客观缓解、疾病控制甚至完全缓解；作为硬科技领域的新药板块，最大的社会责任莫过于面向高度未满足的临床需求，以终为始、治病救人。 早在成立初期，劲方即获得上海商委颁发“跨国企业研发总部”证书，显示了官方机构认可劲方与跨国企业一致的创新理念；至今，公司还获得了国家级专精特新“小巨人”和高新技术企业等资质认定，以及全国工商联、上海经信委等发布的荣誉奖项；公司多项前沿研究成果也登陆了国际权威学术会议，包括ASCO、AACR、ESMO等年会的口头报告及突破性研究摘要。新药航海需要不断绘制新地图、寻找新大陆，期待劲方能够在未来的星辰大海中乘风破浪，以更多差异化疗法造福市场与病患。 关于劲方医药 劲方医药是一家全球布局的临床阶段创新药物开发企业。公司聚焦肿瘤、免疫类疾病领域高度未满足的临床需求，以疾病生物学机理和临床转化医学为核心，构建并发挥自主化、一体化研发体系优势，主攻尚无临床验证的创新靶点与适应症，并拥有全球自主知识产权。 自2017年成立以来，劲方医药已建立包含十余个自主研发的“全球新”大、小分子项目，多个产品在中国（含台湾地区）、欧洲、美国、澳大利亚进入全球多中心临床试验，包括多项后期或关键性临床研究。达伯特®（氟泽雷塞）为劲方管线中首个国内上市获批产品，也是国内首个、全球第三个上市的KRAS G12C抑制剂，曾获得国家药品监督管理局优先审评及两项突破性疗法资格认定；氟泽雷塞、西妥昔单抗的一线联合疗法也在欧洲进入II期研究，为全球首个KRAS、EGFR抑制剂一线非小细胞肺癌联用治疗方案。 目前，公司已形成RAS靶向疗法的一体化深耕矩阵，并积极拓展其他“全球新”靶向药及新类型疗法管线开发。同时，公司近年来不断深化商业合作网络，已与多个境内外上市公司达成战略授权协议、或开展“全球新”临床合作并已取得积极进展。预计未来三到五年，更多自主与合作开发项目进入后期临床研究的同时，公司也将迈入产业化和商业化阶段。  联系我们 电话：021-68821388 邮箱：pr@genfleet.com; bd@genfleet.com 官网：www.genfleet.com        地址：上海市浦东新区张江路1206号A座 邮编：201203

靶向蛋白降解（TPD）已成为药物发现中的革命性方法，利用细胞的内在机制选择性地降解与疾病相关的蛋白质。纳米荧光素酶 (nLuc) 融合蛋白和 NanoBiT 技术提供了两个强大而灵敏的筛选平台，用于监测 TPD 分子引起的蛋白质丰度的细微变化。尽管有这些优点，但由于标记系统上存在赖氨酸残基，人们对标记系统引入的潜在降解伪影产生了担忧，从而促进了替代工具的开发。 贝勒医学院的研究人员通过引入了 HiBiT-RR 和 nLuc K0 （不含赖氨酸残基的变体）来减轻此类伪影，且 HiBiT-RR 与原始 HiBiT 保持相似的灵敏度和结合亲和力。 纳米荧光素酶 (nLuc) 是一种 19 kDa、高度稳定、不依赖于 ATP 的生物发光蛋白，由原始深海虾荧光素酶（Oplophorus-荧光素 2-单加氧酶）改造而成，已用于开发强大的超高灵敏度筛选系统。作为降解剂功效高通量评估中常用的化学生物学工具，nLuc融合蛋白产生的强生物发光信号可以灵敏地反映活细胞或粗细胞裂解液中的实时融合蛋白水平，从而能够降解剂处理后蛋白质降解事件的动力学监测。为了进一步最小化标签尺寸，采用了 NanoBiT 技术，该方法涉及一个互补系统，其中将 11 个氨基酸肽 (HiBiT) 标记到目标蛋白质上，从而能够与 18 kDa 多肽 (LgBiT) 相互作用。这种相互作用导致活性荧光素酶的形成，该酶能够在与其发光底物(呋马嗪或其稳定形式恩度拉嗪)反应时产生光。   E2 酶与底物赖氨酸的有效泛素化对于促进泛素化反应至关重要。因此，赖氨酸残基的可及性和定位在确定其对泛素化的敏感性方面起着关键作用。据报道，位于 E3 连接酶机制泛素可及带上的目标蛋白的赖氨酸残基对降解的贡献更大。因此，最近人们越来越担心标签蛋白或肽上引入的赖氨酸残基可能会导致降解伪影。一个典型的例子是 XY-4-88 成功降解了 GFP-KRAS G12C ，但不能降解内源性 KRASG12C (10.1016/j.chembiol.2019.12.006)。对于那些表面只有少量赖氨酸残基的目标蛋白，标签上人为引入的赖氨酸甚至可能会误导研究人员PROTAC分子。 在本研究中，研究人员提出了两种替代工具 HiBiT-RR 和 nLuc K0 ，其中所有赖氨酸残基均已替换为原始序列中的精氨酸残基，以避免降解伪影的潜在风险。结果表明，HiBiT-RR 对 LgBiT 的结合亲和力与原始 HiBiT 肽相当，且不牺牲发光强度。HiBiT-RR 标签在检测和定量药物诱导的蛋白质降解方面与 HiBiT 一样灵敏。另一方面，通过比较 nLuc WT和 nLuc K0构建体，本文中测试的一些 PROTAC 分子可以比 nLuc K0对应物触发 nLuc WT融合蛋白更强的降解。这一发现表明，源自标记系统的降解伪影可能比目前所理解的更为广泛。它还强调了选择正确的标记系统的重要性，以帮助最大限度地减少研究蛋白质降解过程中的潜在干扰或伪影，从而提高实验结果的可靠性和有效性。 1. LgBiT 蛋白与 HiBiT-KK 或 HiBiT-RR 作用相似 由于赖氨酸是接受 E2 酶泛素转移的最常见残基。对Promega 公司HiBiT 标签原始版本 (VSGWRLF KK IS)（HiBiT-KK）中两个赖氨酸残基的影响目标蛋白的潜在降解问题，设计了无赖氨酸版本的HiBiT (VSGWRLF RR IS)（ HiBiT-RR）的酶学特性，用类似的精氨酸取代赖氨酸（图 1 A）。 首先表征了 LgBiT 蛋白与 HiBiT-KK 或 HiBiT-RR 之间的结合。固定 LgBiT 的量后，滴定了 KK 和 RR 变体的一系列 HiBiT 浓度。无论使用自制的 His-LgBiT 蛋白还是 Promega 公司 的 LgBiT 蛋白，HiBiT-KK 和 HiBiT-RR 均表现出较低的 nM EC 50值和相当的发光信号强度（图 1 B-C）。根据 nLuc 结构（PDB：7SNT ），KK 到 RR 突变位点远离荧光素酶催化袋，因此发光信号水平与预期相当。然而，从 LgBiT-HiBiT 相互作用中获得的 EC 50值比之前报道的 700 pM 弱约 10 倍。因此，将不同浓度的 LgBiT 蛋白反向滴定到固定量的 HiBiT 变体中。在没有任何 HiBiT 肽的情况下减去 LgBiT 本身的信号后，HiBiT-KK 或 RR 仍然显示出与正向滴定中相似的 EC 50水平（图 1 D-E）。   图 1. HiBiT-RR 显示出与原始 HiBiT-KK 相当的 LgBiT 蛋白结合亲和力和相似的发光输出。  使用光栅耦合干涉测量法 (GCI) 在没有酶底物的情况下测定了它们的亲和力和结合动力学。与 HiBiT-KK 相比，HiBiT-RR 表现出稍微优越的性能，在高和低浓度 LgBiT 的条件下都表现出较慢的解离速率 ( koff )（图 2）。 图 2. HiBiT-KK 和 RR 的光栅耦合干涉测量显示了可比较的 LgBiT 蛋白结合动力学。 2. HiBiT-RR 系统验证PROTAC分子 进一步，表征了不同机制的四种 BTK PROTAC（RC-1、NX-2127、 NRX-0492、和 DD-03-171 ）的降解效率（ RC-1 表示可逆共价 PROTAC，其他表示可逆 PROTAC），使用用 HiBiT-KK 或 RR 标记的 BTK 激酶结构域（残基 382-659，BTK KD ）（图 3 ）。结果表明，HiBiT-RR 构建体（图 3 B、D）能够重现传统 HiBiT-KK 构建体（图 3 A、C）中观察到的 PROTAC 特征参数，例如 DC 50 、 D max和强在高剂量的 RC-1 中观察到钩状效应。 图 3. HEK293T 细胞系中 HiBiT-KK 或 HiBiT-RR 标记的 BTK 激酶结构域的 PROTAC 降解效力比较。 进一步将 HiBiT 敲入细胞系中测试了这两个系统。通过 CRISPR 敲入 HEK293 细胞中 BRD4 N 末端的 HiBiT-KK 或 -RR，MZ1 和 dBET6（两种 BRD4 PROTAC）进一步用于表征 HiBiT-KK 中降解效力的差异或-RR 敲入细胞。同样，MZ1 降解 HiBiT-BRD4 时没有观察到显着的 DC 50或D max差异（图 4 A-D）。对于 dBET6，观察到一个边际差异，即 HiBiT-RR BRD4 在高浓度 dBET6 处理中比 HiBiT-KK 经历更慢的降解动力学，尽管观察到类似的D max ，并且达到平台时的降解效力显示小于 2 - 倍差异（图 4 E-H）。总而言之，表明 HiBiT-RR 在基因组敲入系统中也与原始 HiBiT-KK 一样有效。 图 4. 将 HEK293 细胞系中的 HiBiT-KK CRISPR 敲入 BRD4 与使用 dBET6 (A–D) 和 MZ1 (EH) 的 HiBiT-RR 敲入进行比较。  3. nLuc (nLuc K0) 优化 综上，已经验证 HiBiT-RR 作为蛋白质丰度监测的可行工具，其灵敏度与 HiBiT-KK 相当，但消除了降解伪影的潜在缺陷。然而，单独使用 HiBiT 标签蛋白并不能在时间过程研究中连续监测蛋白水平的变化，除非 LgBiT 也被同步优化。然而，潜在的泛素化仍然可能发生在野生型 LgBiT 的赖氨酸残基上。因此，验证了无赖氨酸版本的 nLuc (nLuc K0 ) ，其中原始 nLuc 序列中的所有赖氨酸都突变为精氨酸（图 5 A）。 通过将 nLuc WT 或 K0 融合到 RIPK1 激酶结构域 (RIPK1 KD ) 的 N 末端并在 HEK293T 细胞中表达，将测试一系列 RIPK1 降解剂（表 S1 ）的降解能力，并与这些构建体进行了头对头比较（图 5B 、C）。对于大多数化合物，nLuc WT 和 K0 构建体均显示相似的最大降解 ( D max ) 和 DC 50值，而阴性对照化合物 4172NC 在两种构建体中均未显示降解。但对于化合物 5037，当使用 nLuc K0构建体时，观察到 DC 50降低了 3 倍（nLuc WT 47 nM 对比 nLuc K0 147 nM）。在化合物 5077（一种基于 CRBN 的 RIPK1 PROTAC）中也观察到类似的效力降低（nLuc WT = 10 nM 对比 nLuc K0 = 39 nM）。这种效力降低可能是由于 nLuc 表面上可泛素化的赖氨酸残基被去除，突出了 nLuc 蛋白上发生泛素化时潜在的降解假象。过渡到 K0 构建体可以避免 nLuc 部分的此类降解伪影。此外，免疫印迹证实了两种 nLuc-RIPK1 KD融合蛋白的降解（图 5D ）。 图 5. 转染的 HEK293T 细胞系中 nLuc WT和 nLuc K0标记的 RIPK1 激酶结构域降解效力的比较。  总体而言，该研究强调了选择适当的标记系统（例如 HiBiT-RR 和 nLuc K0）的重要性，以尽量减少研究蛋白质降解过程中的潜在干扰和伪影。通过提高实验结果的可靠性和有效性，这些工具有助于推进利用 TPD 分子的药物发现工作，最终实现更有效的治疗干预。 References:　https://pubs-acs-org.libproxy1.nus.edu.sg/doi/10.1021/acsmedchemlett.4c00271 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓