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1.概述 一个健全的生物制药生产过程受几个要素的支配：集成的工艺设计和关键工艺要素；起始材料的质量；以及质量体系，以确认生产过程是可复制的、一致的和稳健的。工艺设计本身在上游和下游都面临一系列挑战。然而，一个上游工艺和一个能够提供最大回收率的高效纯化工艺可以产出高纯度的产品，这是任何生产过程最理想的特征。 由于生物制药具有复杂的化学结构，目前可用的技术无法合成它们。此外，即使能够合成这些大分子，也很难生产出没有固定结构的分子。因此，生物制药的生产依赖于重组系统，其中DNA产生这些分子；包含感兴趣基因的DNA片段相对容易构建，允许它们作为引擎在活体中制造目标分子。因此，生产生物制药的起始材料是表达目标治疗蛋白的基因改造的细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞培养系统。 重组制造技术受到专利的广泛保护，包括关键步骤和方法，如目标基因序列的分离（编码所需蛋白）、其扩增、重组DNA的生成、宿主细胞的转化、筛选以及随后选择表达细胞系。例如，美国专利号4,237,224（Cohen等人）现已过期，详细描述了在微生物如大肠杆菌中进行转化过程以生成重组质粒DNA。该专利还描述了制造第一个转化载体的程序。Cohen的专利现已过期，技术已进入公有领域。 重组表达在多种活体系统中进行，如： 原核生物，如古菌和细菌，是单细胞生物，具有外细胞膜，但没有任何膜结合的细胞成分，包括核或线粒体。因此，转录和翻译过程同时进行，mRNA翻译在成熟的mRNA转录本完全合成之前发生。 真核生物，如动物和植物，是多细胞生物，具有核、线粒体和高尔基体；这些也是。转录和翻译过程顺序发生。转录，即DNA到RNA，发生在核中，翻译，即RNA到蛋白质，发生在细胞质中。翻译后修饰（PTMs），是蛋白质功能所需的化学修饰，在蛋白质合成后在内质网和高尔基体中发生（在不同阶段，例如蛋白质折叠前、定位后等）。最常见的PTMs包括糖基化、磷酸化、乙酰化、蛋白水解、特定构象和寡聚反应。这些PTMs的程度和复杂性在真核生物中有所不同。因此，根据要表达的蛋白质，表达系统的选择也有所不同。例如， 糖基化和磷酸化是在简单真核生物如酵母和真菌中发生的至关重要的PTMs。然而，酵母产生的甘露糖残基已经广泛地N-糖基化，这些残基对人类可能具有高度免疫原性。因此，这种表达生物的选择限制在生产简单蛋白质。 需要高度糖基化或其他PTMs的复杂蛋白质最好使用真核生物如哺乳动物细胞（例如，中国仓鼠卵巢[CHO]、人类细胞等）、昆虫细胞和植物细胞来生产。其中，哺乳动物细胞，特别是CHO细胞，已经成为生产一系列复杂蛋白质（单克隆抗体）最广泛使用的表达系统。超过90%的目前批准的产品，大肠杆菌、CHO细胞和酿酒酵母是最常用的表达系统（宿主）。其他细胞系包括婴儿仓鼠肾（BHK）细胞、小鼠C127、非洲猴肾细胞、激活的淋巴细胞、小鼠骨髓瘤、骨髓瘤NS0和前列腺上皮细胞，除了这些细胞宿主。 表9.1总结了批准的生物治疗蛋白及其用于蛋白质生产的相应宿主细胞系统的例子。 DNA负责生产细胞生存和生理功能所需的蛋白质。重组蛋白表达差异很大——从体内用于结构研究到大规模开发用于生物治疗药物。 转录和翻译分别是基因调控和蛋白质表达的基本机制。遗传密码（DNA）中的信息转录成mRNA。然后，mRNA编码的信息翻译成特定的氨基酸序列，导致形成所需的蛋白质（图9.1）。R DNA是通过一个过程产生的，其中感兴趣的基因首先插入到质粒（例如，病毒）中，然后引入到活细胞（如细菌或哺乳动物细胞）中。质粒修改细胞DNA并迫使它开始产生目标蛋白。 图9.1 重组蛋白表达和生产系统开发流程图 在原核生物中，转录和翻译同时发生，而在真核生物中，这些过程顺序发生，随后是PTMs，进一步改变蛋白质结构或功能，这对于复杂的治疗蛋白至关重要。这些过程是利用活细胞，包括微生物系统、动物细胞和植物细胞，使用重组DNA技术构建所需蛋白质的关键。 根据所需蛋白质的编码构建DNA序列，并插入到宿主系统（也称为生产系统或表达系统）。第3章详细讨论了微生物和哺乳动物表达系统的细胞系开发。 基因插入过程从选择一个宿主质粒开始，该质粒在被指定生产重组蛋白的实体中持有感兴趣的基因（图9.2）。克隆涉及将感兴趣的基因或DNA片段转移到表达载体。 图9.2 pBR322质粒的示意表示，这是最早广泛用作克隆载体的质粒之一 来源：由Ayacop (+Yikrazuul) - 自己的作品，公有领域，commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=11840365 表达载体必须具备以下四个基本关键特征：（i）感兴趣基因盒，（ii）抗生素选择盒，（iii）细菌表达起源（ori），（iv）多个克隆位点链接器，表位标签，蛋白酶识别位点，内质网进入位点和分泌信号。然而，并非所有元素都是必需的。 在图中，箭头表示基因转录的方向。ori表示DNA复制的起源。标记为“amp”和“tet”的区域分别表示抗生素抗性基因氨苄青霉素和四环素。在特定序列（核苷酸）编号处用蓝色标记的区域代表限制酶识别并切割DNA质粒中特定区域的限制位点。 2.表达系统 选择生物体和细胞系类型作为宿主生物是生物治疗生产过程的主要和最重要的方面。制造重组药物的起始材料，也是当今生物制药的主要焦点，是表达目标治疗蛋白产品或感兴趣的单克隆抗体的基因改造的原核生物（细菌）或真核生物（例如，哺乳动物细胞如CHO、酵母、昆虫或细胞）。生物仿制药开发商不必使用与参考产品相同的表达系统，但如果涉及PTMs，则不建议这样做。 系统化的细胞库管理，辅以控制监测和测试，是确保细胞系完整性和生物特征的关键。在声誉良好的存储库或商业细胞系开发商处，可能会有一个受控的环境。在获得新的细胞系时，收集中心通常会对细胞系进行表征，以建立和验证其身份，并确保培养的纯度——对于动物细胞来说，至关重要的是要证明细胞系没有微生物污染和支原体。在细胞系中无意中引入错误（例如，交叉污染、外来病毒污染等）的可能性是无限的，而且相当普遍。因此，在处理所有材料时必须小心，以确保尽可能安全的工作环境。这适用于细胞和处理它们的个人。细胞培养被认为是生物危害，危害程度取决于细胞和实验协议。原代培养有很高的风险携带未检测到的病毒。 生物体的稳健性对生物制造过程的成功至关重要，并决定了商业制造的可扩展性。必须提供生物体的历史证据，从创建的第一阶段开始，到建立用于未来生产的细胞系。鉴于生物制药的高成本，产品滴度、细胞密度甚至产品质量的持续显著改进。例如，在早期，使用哺乳动物培养过程生产的抗体产量相对较低，<0.8-1.0 g/L，而近年来，商业工艺的生产力已提高到>3 g/L。 3.细菌细胞 然而，细菌表达系统（如大肠杆菌、芽孢杆菌、链球菌）能够在没有任何PTMs的情况下进行细胞内和细胞外蛋白表达。使用细菌表达系统生产简单目标药物的关键好处是它们的相对短的倍增时间、易于操作、简化处理、高生产力和成本效益，特别是对于大规模生产。 涉及基因表达、克隆和小规模蛋白生产的蛋白质生产过程，大约需要5-7天才能产生足够的蛋白质（每升从几百毫克到克）。细菌生产系统的营养和通气需求简单，允许在发酵罐中相对直接的放大操作。此外，细菌系统在承受增加操作规模和体积时发生的剪切力方面非常稳健。这些发酵过程可以以批量和分批进料模式运行。自1982年批准Humulin（胰岛素）以来，大肠杆菌是最广泛使用的表达系统，特别是用于小蛋白和肽，最近，它已被用于生产抗体片段和衍生物，如不需要任何PTMs的Fab片段单链可变片段抗体。使用大肠杆菌成功生产的一些重组蛋白包括人生长激素、干扰素α2a和2b、白细胞介素、粒细胞-集落刺激因子、甲状旁腺激素和生长抑素。在欧洲和美国批准的生物制药中，大约39%是使用大肠杆菌制造的。表9.1列出了使用大肠杆菌生产系统生产的蛋白质的例子。 图9.3详细说明了基因表达、克隆和重组细菌细胞生成的过程。 图9.3 细菌表达系统 大肠杆菌表达系统生产非糖基化分子的关键特点包括快速生长速率和基本营养需求，同时不妥协滴度。因此，最佳条件包括温度、pH值、溶解氧、通气和搅拌，以及方便的营养进料，是决定发酵生产力的关键参数。 在大肠杆菌中，重组蛋白的表达和生产发生在细胞内（例如，细胞质、周质）和细胞外（细胞外空间）。通常，以细胞质或周质为目标的蛋白表达往往导致称为包涵体的聚集体，其中包含蛋白。这些包涵体在发酵后从其他细胞组分中分离出来，以提取和纯化蛋白。存在于包涵体中的蛋白以非活性状态存在，需要转换为活性状态。这通常通过溶解和重新折叠来实现，以使蛋白进入其天然构象。大肠杆菌表达系统缺乏进行PTMs（如糖基化、二硫键形成和磷酸化等）的能力和机制。因此，通常使用细菌细胞生产不需要任何PTMs的相对简单的蛋白分子。包涵体的形成可以被认为是有利的，特别是在生产的蛋白容易降解或丧失其活性和功能的情况下。产品在其非活性状态下，安全地储存在这些包涵体中。包涵体通常通过离心回收，并用各种化学物质进行额外洗涤，以获得高纯度的包涵体。为了促进二硫键的形成，通常在蛋白重新折叠期间，可以在溶解和/或溶解后添加适当的氧化还原对（例如，GSH/GSSG）或还原剂如二硫苏糖醇或巯基乙醇，以减少任何不希望的分子间和分子内二硫键的形成。在重新折叠过程中，控制产品/蛋白聚集是确保聚集体有限的关键。这通常通过将介质稀释到相对较低的蛋白浓度和控制速率来实现。额外的处理步骤——溶解和重新折叠，尽管在这些步骤中恢复正确的蛋白构象和活性至关重要，但被认为是不利的，增加了液体处理体积（由于在低蛋白浓度下重新折叠）从而增加了总体成本，并可能降低产量。 细菌生产系统经常遇到的另一个重大缺点是细胞-基质杂质的产生/存在，包括内毒素和宿主细胞蛋白（HCPs）。这要求各种过程控制进行监控，以确保内毒素和HCPs在可接受的限度内，并满足剂量中允许量的监管要求。一些可能需要额外过程控制或监控的常见处理步骤包括细胞裂解步骤、体溶解和重新折叠。因此，下游操作必须非常稳健，能够最大限度地减少这些杂质。其他选择，如体外折叠和N端切割，可以作为整体过程改进。尽管存在这些限制，大肠杆菌细胞仍然很受欢迎，是生产简单蛋白分子的首选。 两种最常用的大肠杆菌菌株是K12和B。表9.2详细说明了源自大肠杆菌B菌株和K12菌株的常用菌株。B和K12菌株的生长特性完全不同。因此，这些菌株的特征和特性必须仔细考虑和评估，以确定适当的菌株作为所需蛋白的表达系统的使用。此外，这些菌株在编码蛋白中的二硫键或甚至编码有毒蛋白方面也有所不同。 近年来，各种新菌株有显著改进，被用于生产生物制药（例如，芽孢杆菌、Ralstonia eutropha、Staphylococcus carnosus）。 4.酵母 酿酒酵母（S. cerevisiae）和毕赤酵母（Pichia pastoris）是两种作为表达系统越来越多被使用的酵母种类（表9.3）。它们具有高效率（短倍增时间、高细胞密度、由于单细胞生长形态中更好的营养物质传递而获得的高产量）、低发酵成本。1991年，食品药品监督管理局（FDA）授权Novo公司的人胰岛素作为第一个由酿酒酵母菌株S. cerevisiae制造的产品。此后，这种酵母已被用于表达和合成40多种不同的重组蛋白，如胰岛素肽、人血清白蛋白和肝炎疫苗。S. cerevisiae的完整基因组序列已知，FDA已将其指定为“普遍认为安全”。与细菌不同，酵母细胞可以直接将蛋白质表达或分泌到培养基中，表达的蛋白质可以经历PTMs。 酵母细胞具有特征性的坚硬细胞壁。因为酵母细胞将表达的蛋白质分泌到培养基中，与细菌细胞不同，宿主细胞相关杂质的可能性较小，但在细菌细胞中更为突出。与细菌系统相比，酵母表达系统的纯化过程也相对简单（由于产品分泌），并消除了需要额外处理的需求，如回收包涵体、它们的溶解和重新折叠以实现天然蛋白质折叠。尽管有这些优点，酵母系统的缺点之一是缺乏PTMs和意外的单糖和二糖基化形式的目标蛋白，这些可能很难去除。 虽然S. cerevisiae是最常用的酵母，裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）和脂解酵母（Yarrowia lipolytica）也有使用。使用S. cerevisiae的普及主要归因于其高细胞密度和快速生长特性，这些特性可以在不影响成本和生产时间表的情况下轻松实现。表9.3详细列出了使用S. cerevisiae生产的重组蛋白。 另一种常用于生物制造的酵母菌株是毕赤酵母（Pichia pastoris）。与S. cerevisiae一样，甲型毕赤酵母（Pichia pastoris）可以生长到非常高的细胞密度，并具有严格调控的表达系统。与S. cerevisiae一样，Pichia pastoris菌株能够将重组蛋白分泌到培养基中或在细胞内表达。毕赤酵母是一种甲型微生物，将甲醇作为其主要能源（碳源），这一特性用于准备表达系统。酒精氧化酶基因1（AOX1）启动子用于克隆感兴趣的基因。在发酵过程中添加甲醇以诱导蛋白表达。处理大量甲醇时必须遵循额外的保护措施，因为它是一种挥发性溶剂。在Pichia pastoris中生产的一些重组蛋白包括人血清白蛋白、人胰岛素、激肽释放酶抑制蛋白、干扰素α2b和微纤溶蛋白肝素结合表皮生长因子样生长因子，等等。该系统的N-糖基化模式与高等真核生物不同，这一观察可以推广到其他酵母菌株。P. pastoris的一个主要缺点是蛋白水解降解，这在高细胞密度培养中尤其成问题。这导致产量和生物活性的损失。提出了各种策略，包括添加蛋白酶抑制剂（例如，苯甲基磺酰氟、乙二胺四乙酸、苯甲酰胺和蛋白酶抑制剂混合物）、酵母蛋白胨；优化发酵培养条件（例如，pH值）；使用培养基、进料或补充物中的某些特定成分（例如，胱氨酸；使用其他替代碳源；优化诱导策略，正在评估以克服这一挑战。 酵母被认为是大规模生产重组蛋白的理想选择，这些蛋白大多可以在高度复杂的真核生物中生产，这得益于其高度进化但定义明确的遗传系统、高生产力、快速生长、易于放大、能够支持某些PTMs以及减少制造时间和成本。然而，管理酵母中存在的蛋白酶是具有挑战性的，因为这些酶可以降解重组蛋白。 表达载体是酵母生产系统的核心。由于其有丝分裂稳定性，通常使用能够整合并建立在宿主细胞中的载体进行表达研究。对于某些酵母系统，染色体外载体（在宿主细胞中能够自主复制的非染色体DNA）是基因组整合的替代品。表达载体包括酵母启动子/终止子和可选择标记盒，它们允许克隆基因插入下游的分泌领导者。表达载体的这一能力允许异源蛋白从细胞分泌到培养基中。在酿酒酵母中用于蛋白表达的三种最常见载体是： 酵母整合质粒（YIp）：这是单拷贝质粒，可以整合到宿主基因组中。 酵母着丝粒质粒（YCp）：这是复制的单拷贝质粒，用于互补研究。 酵母染色体外质粒（Yep）：这是复制的多拷贝质粒，用于重组蛋白生产。 图9.4展示了使用S. cerevisiae创建目标蛋白表达系统的过程。 图9.4 酵母蛋白表达系统：酿酒酵母 使用S. cerevisiae创建目标蛋白表达系统的典型过程从识别编码感兴趣蛋白的感兴趣基因开始。然后使用感兴趣基因生成cDNA，克隆到细菌系统（有能力的E. coli细胞）。使用选择标记识别携带修改质粒的阳性克隆，然后分离克隆，将其转化为酵母细胞以整合质粒到酵母染色体，并筛选阳性转化子。最后，选择一个高表达克隆并放大，以创建细胞系以进一步生产感兴趣的蛋白。转化到酵母的常用方法包括原生质体转化、使用醋酸锂的全细胞转化和电穿孔。醋酸锂和聚乙二醇的组合也是一种广泛使用的转化方法，主要用于单链DNA。通常，通过应用可选择标记来选择转化子，以便在筛选阳性克隆时可以检测到它们（图9.4）。 使用优势选择标记，如对G418、甲醛、铜离子或环己酰胺的抗性。 通过互补，其中质粒包含宿主菌株中不存在（突变）的功能基因（例如，trp1、his3和ura3）。 针对提高产量、改变N-糖基化组成和提高亲和标签性能的目标工程化酵母菌株的数量正在增加。 尽管酵母细胞具有快速生长、简单的培养基要求和PTMs等优点，但主要缺点之一是可能发生过度糖基化，这可能会显著影响免疫原性，如前所述；鉴于蛋白质在培养基中表达和分泌，蛋白质降解的可能性仍然是一个主要问题。此外，培养基的低氧化还原电位也常常导致二硫键断裂。 重组蛋白的过度表达，导致细胞内积累和低产量，是酵母系统的另一个常见问题，常常导致细胞应激增加。正在开发几种新系统，以促进酵母细胞中重组蛋白的轻松表达。为了改进重组生物制药的处理，CRISPR/Cas9已成功用于酵母工程，以插入特定位点的基因或敲除特定不需要的基因。 5.哺乳动物细胞 细胞培养对人类的影响以及在生物学上取得的进步是巨大的。例如，疫苗、新药实体或抗体药物偶联物、双特异性抗体、细胞治疗和基因治疗等生物制药的进步主要依赖于细胞培养。人们越来越倾向于使用哺乳动物系统（人类和非人类[动物细胞系]）进行生产，特别是对于需要PTMs的复杂蛋白。所有细胞类型在其生长特性、最佳条件和营养需求方面都有所不同。 动物细胞的动态代谢需要多种营养物质。因此，胎牛血清，作为乳制品和牛肉行业的副产品，现在广泛用于细胞培养基。最近对传染性海绵状脑病（TSEs）和血液传播感染的担忧，以及对TSEs和牛海绵状脑病（BSEs）严格的监管要求，导致了大量的无血清、无动物产品甚至无蛋白培养基配方的出现。最近，重组胰岛素、转铁蛋白和牛血清白蛋白（由细菌发酵产生），以及由酵母发酵产生的人类血清白蛋白，已经在各种现代细胞培养过程中替代了动物源血清，而没有显著影响过程性能或产品质量。 哺乳动物细胞对培养条件极为敏感，它们经常对温度、pH值、通气和搅拌速度的微小变化反应过度。在对数生长期，动物细胞的增殖速度比细菌细胞慢，倍增时间为15-48小时。 动物细胞自然比微生物细胞更脆弱，因为它们的细胞壁缺乏强度。因此，它们无法耐受微生物细胞能够忍受的大多数发酵条件，需要使用特制的发酵罐。对于动物细胞的培养友好方法，出现了几种新型的“气升”和“发酵罐”设计，用泵代替叶轮。 在搅拌过程中，传统的叶轮破坏悬浮在培养基中的脆弱细胞的风险很大。尽管使用圆刃叶轮（如用于驱动摩托艇的三叶轮）来产生减少的剪切应力，但它们与细胞接触的剪切力可能同样有害。 在动物细胞的生长和培养中，使用强制空气吹扫或其他方法将空气引入混合物。在悬浮培养中，一些动物细胞系通过在液体介质中浮动而增殖，而其他细胞则需要一个固体基质来粘附在滚瓶的内壁、“中空纤维”生物反应器中的气体渗透聚合物管或微载体珠或塑料微载体珠或平板上。 对于动物细胞培养操作，强制空气吹扫是将空气注入生物反应器培养基的一种方式。培养一些动物细胞（附着依赖性）需要一个坚固的基质，这些基质粘附在滚瓶的内壁、“中空纤维”生物反应器中的气体渗透聚合物管或塑料微载体珠或平板上。某些动物细胞系通过在液体介质中悬浮来增殖。 传统上，附着依赖性细胞（主要是原代细胞系）表现出高水平的表达。为了达到高表达水平，如NS0、CHO、人类子宫颈（HeLa）和HEK-293等流线型细胞系已成功用于悬浮培养。相反，悬浮细胞系被证明更有用和有利，特别是对于更大体积的蛋白质生产程序。 至关重要的是要意识到，一些生物反应器培养条件可能导致细胞凋亡（细胞死亡），这种培养条件可以收集不需要的产品和细胞碎片，这将减慢下游过程。 5.1.非人类细胞系 5.1.1.中国仓鼠卵巢细胞 通常在如CHO细胞、HeLa细胞、非洲绿猴肾细胞（COS）、BHK细胞和杂交瘤等哺乳动物细胞中生产单克隆抗体和需要PTMs的复杂真核蛋白。这些哺乳动物细胞被用来生产单克隆抗体和其他经过PTMs的复杂真核蛋白等生物制药。 在大多数情况下，目标蛋白以原始形式产生，并直接分泌到培养基中。建立一个能够生产从每升几毫克到克的蛋白质的小规模过程可能需要大约4-5个月，从基因组装、克隆生成和选择开始。因为蛋白质在培养基中表达，下游处理是直接的。下游程序应该是健全的，能够消除或最小化宿主细胞蛋白（HCPs）、细胞碎片、核酸和其他在发酵过程中通常产生的组分。由于病毒污染的可能性很大，下游处理过程中必须包括病毒灭活和去除的步骤。为了验证病毒清除，必须应用广泛的控制措施（例如，生产结束时的测试，验证病毒的存在）。在N-1或最终纯化阶段之后，通常的做法是通过降低培养基的pH值来加入病毒灭活步骤，并通过过滤来加入病毒消除步骤。 动物细胞比微生物细胞更脆弱，生长非常缓慢，这使它们特别容易受到剪切力的影响；批次或分批进料培养通常用于抗体合成，而其他重组蛋白可以在持续4-8周的培养中产生。动物细胞的生长比微生物细胞慢，其生长特性也更复杂。此外，这些动物细胞的脆弱性使它们极易受到剪切力的影响。最常用的发酵模式是批次或分批进料培养，但最近的进展使连续培养和灌注同样成功，特别是对于高产量。 培养基的营养需求类型使其相对于用于微生物和酵母蛋白表达的培养基来说极其昂贵。这，加上低表达水平，使得整个生产过程成本过高。然而，鉴于复杂蛋白不能在微生物或酵母细胞中表达，哺乳动物细胞比转基因植物或动物更受青睐。 在细胞遗传学研究中，T. Puck在1957年创造了第一个CHO细胞系。Genentech创造的组织型纤溶酶原激活剂Activase最初在1987年使用CHO细胞生产。自从CHO细胞系一直主导着生物制药行业，作为重组蛋白制造的首选系统，所有目前批准的重组产品都是使用CHO细胞系生产的。最初的CHO细胞系已经被亚克隆很多次，产生了大量变体。生物制造中最常用的细胞系是CHO-K1、CHO DG44和CHO-S细胞，它们源自不同的CHO谱系（图9.5）。这幅图展示了几篇发表的论文的插图，记录了今天广泛使用的CHO细胞系的历史和演变。 图9.5 CHO细胞系 CHO-K1是从原始CHO细胞（卵巢组织分离物）的单克隆产生的第一细胞系。后来，这些细胞被修改用于悬浮和无血清培养基的工业用途。使用这个定制的CHO-K1细胞系开发了几种表达系统。它们与谷氨酰胺合成酶（GS）选择策略结合使用，在这种策略中，感兴趣的基因与GS基因的副本一起被引入宿主细胞，这允许稳定的细胞仅在无谷氨酰胺培养基中被选择。此外，使用甲磺酸乙酯对CHO-K1细胞系进行突变，形成了CHO-DXB11（也称为CHO-DUKX）细胞系，该细胞系缺乏二氢叶酸还原酶（DHFR）活性。 原始的CHO细胞通过伽马辐射诱变，导致DHFR等位基因的丢失和DHFR缺陷型CHO-DG44细胞系的出现。嘌呤、胸腺嘧啶和其他氨基酸的从头合成，以及CHO细胞的增殖需要DHFR。因此，CHO-DG44细胞必须在含有甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧啶（GHT）的培养基中生长。这个特性与GS选择系统在胸腺嘧啶或GHT缺乏的培养基中筛选转化体（选择标记）时的方式相同。如果转化的克隆（表达感兴趣基因和替代DHFR基因的重组质粒DNA）有效地吸收了重组质粒DNA，那么它们将在GHT缺乏的培养基中生长。 作为一种筛选转化DHFR缺陷细胞的选择压力，甲氨蝶呤（MTX）被广泛用于筛选转化体。缺乏DHFR的CHO细胞将在MTX处理的细胞中扩增转基因。MTX与DHFR酶的催化位点结合，阻止二氢叶酸转化为活性形式的四氢叶酸，而四氢叶酸是DNA合成所必需的。通过增加转化的DHFR缺陷CHO细胞（编码感兴趣基因、DHFR和载体）的培养基中MTX浓度来诱导选择压力。这导致DHFR和感兴趣基因在基因组中被扩增，使细胞能够产生更多的重组蛋白。然而，MTX介导的基因扩增可能会导致由于染色体异常导致的克隆不稳定，这是生物制造中的一个重要问题。 CHO-S是CHO细胞的一个亚群，可以在没有锚定或粘附表面的情况下作为悬浮生长（源自CHO pro-5细胞系）。CHO细胞在悬浮中生长的能力是颠覆性的，为在搅拌罐式反应器中大规模重组合成铺平了道路。市售的符合cGMP储存条件的CHO-S细胞可用。 CHO细胞的多样性决定了不同的生长条件、选择压力和用于蛋白表达的培养基，以实现包括PTMs和高细胞密度以及过程的特定生产力在内的功能属性。CHO工艺特别感兴趣的是糖链分布，因为糖链模式的变化可能影响产品质量、功能甚至安全性。在很大程度上，PTMs是细胞系选择和过程条件（包括培养基、进料、补充物、温度、pH值和溶解氧）的结合。因此，优化这些参数是生产满足其关键质量属性的所需产品的关键。 CHO细胞通常用于表达重组蛋白并生成稳定细胞系。使用缺乏DHFR酶的CHO细胞进行重组蛋白表达的标准方法是将目标基因和DHFR基因都克隆到单一的哺乳动物表达系统中。然后，重组DNA质粒（携带两个基因）转染到宿主细胞（DHFR缺陷型CHO细胞）。DHFR基因作为选择标记，只允许转染的细胞在无胸腺嘧啶的培养基中生长。接下来，使用限制稀释法获得单细胞稳定克隆。然后进一步评估这些克隆的表达水平、产品质量和稳定性，以生成表达感兴趣蛋白的最终细胞系。 5.1.2.CHO表达系统 用于大规模制药加工的其他哺乳动物非人类细胞系包括小鼠骨髓瘤细胞系NS0和Sp2/0、BHK细胞、非洲绿猴的Vero细胞和狗的Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞。Vero和MDCK细胞主要用于疫苗研究，而其他细胞则用于生产重组蛋白。 5.1.3.骨髓瘤细胞 自20世纪70年代以来，骨髓瘤细胞在杂交瘤技术中被使用，已成为抗体开发的主力军，直到最近才被CHO细胞超越用于重组蛋白表达。骨髓瘤细胞的一些优点包括在悬浮培养中生长、使用无血清培养基和易于放大。然而，鉴于骨髓瘤细胞能够产生非人糖型，可能导致免疫原性和不良反应，它们被视为潜在风险。小鼠细胞中内源性逆转录病毒丰富，这使得病毒清除非常繁重。最常用的骨髓瘤细胞系是NS0和Sp2/0，它们已成功用于生产生物制药。例如，Sp2/0细胞系用于生产Remicade（英夫利昔单抗）和Erbitux（西妥昔单抗），NS0用于Zenapax（达克珠单抗）和Soliris（依库珠单抗）以及其他畅销产品。NS0细胞缺乏完整的内源性GS表达，需要在培养基中添加外源胆固醇以促进生长和蛋白生产。使用动物源性成分的风险和合成胆固醇的价格导致了胆固醇独立型NS0克隆的发展。缺乏完全功能的GS被用作识别转染细胞的选择压力。 为了有效使用骨髓瘤细胞，至关重要的是要识别产生这些非人糖结构低水平的克隆。 5.1.4.人类细胞 第一个人类细胞系HeLa于1951年建立。在20世纪60年代，人类二倍体细胞被用于疫苗生产，但当时对肿瘤病毒的担忧阻碍了人类细胞的广泛使用。相反，非人类细胞，即CHO和鼠骨髓瘤细胞系，已成功用于生产批准的重组治疗剂。就人类细胞系而言，HEK293、成纤维肉瘤HT-1080细胞系和Namalwa淋巴瘤细胞已被用于批准的产品。最近，Per.C6和CAP被用于开发中的产品。 HEK293细胞系于1977年建立，自那时以来，它已成为生产重组治疗剂、病毒载体（腺病毒、逆转录病毒和慢病毒）和其他研究用蛋白的多功能系统。HEK细胞可以作为无血清培养基中的悬浮培养。在HEK细胞中生产的四种重组产品（Xigris、Alprolix、Eloctate和Nuwiq）已获批准。 Per.C6于1998年从非肿瘤人类胚胎视网膜母细胞瘤细胞中建立，已被用于腺病毒载体和重组蛋白生产。这个细胞系也可以在无血清培养基中悬浮培养，并能达到高细胞密度。 在重组蛋白生产过程中，哺乳动物细胞通常面临的挑战是低生产力和低过程效率。正在评估稳定和瞬时表达过程，以提高生产力和可扩展性。 6.藻类 绿色微藻，如莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii），已被用于生产全长人类抗体、信号分子如血管内皮生长因子以及具有强二硫键的结构蛋白如纤维连接蛋白。藻类叶绿体与其他真核物种（如酵母）一样具有表达基因的能力。虽然由于基因沉默减少和蛋白积累增加，藻类核基因组也可以转化，但叶绿体基因组在大多数情况下是迄今为止转基因表达的来源。 使用藻类平台生产了100多种抗体、亚单位疫苗、免疫毒素、亚单位口服疫苗和生长因子。 虽然丝状真菌被广泛用于生产酶，但由于产量低和蛋白质产生的变异性或引入的形态缺陷，它们在重组治疗蛋白生产中的有效利用并不广泛。用于制造重组蛋白的常见真菌包括曲霉（Aspergillus nidulans）、黑曲霉（Aspergillus niger）、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）和里氏木霉（Trichoderma reesei）。 7.昆虫细胞 在20世纪90年代，昆虫细胞杆状病毒表达系统被创建为哺乳动物表达系统的替代品。杆状病毒系统迅速获得认可，因为它有潜力将鳞翅目昆虫细胞转化为高水平的表达系统。此外，与酵母和细菌表达系统相比，这些系统具有更好的糖基化能力。昆虫细胞最常见的表达机制是瞬时的。 为了创建表达系统，需要昆虫宿主细胞和病毒载体，例如杆状病毒Autographa californica多重核多角体病毒，简称AcMNPV。杆状病毒是一种在鳞翅目昆虫中经常扩增的裂解性双链DNA病毒。它在脊椎动物中不具传染性，在哺乳动物细胞中的启动子不活跃，这使得它对人类使用是安全的。草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda，Sf9和Sf21）和粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）是最常见的昆虫宿主细胞系。为了学术和工业研究与开发，MultiBac，一种复杂的杆状病毒/昆虫细胞系统，已经被设计和使用，以产生包含以前无法获得的组分的多蛋白复合物。自推出以来，已经生产了许多MultiBac载体衍生物，以表达带有可切割N端信号肽的蛋白。 2009年，FDA批准了GSK的开创性昆虫细胞产品Cervarix，一种人类乳头瘤病毒疫苗。 将编码感兴趣基因的重组DNA质粒表达（与含有形成和繁殖病毒颗粒所需的病毒基因的第二质粒）共转染到宿主昆虫细胞中。感兴趣基因插入到一个强启动子后面，杆状病毒基因组转导到昆虫细胞导致病毒基因和感兴趣基因的表达。然后纯化并扩增重组病毒库。在确定的时间点（感染时间）将病毒库添加到宿主细胞中，每个细胞有特定数量的病毒。蛋白生产一直进行到细胞裂解，通常在感染后48小时。昆虫细胞可以在无血清和无蛋白培养基中作为悬浮细胞或细胞团生长。适宜生长的最佳温度大约为27°C–28°C，但昆虫细胞比哺乳动物细胞更容易受到剪切力的影响。昆虫细胞非常适合生产细胞质和分泌蛋白。 7.1.昆虫细胞表达系统：Sf9和Sf21 与哺乳动物细胞相比，昆虫细胞的整个生产周期更快，尤其是从重组病毒的产生到感兴趣蛋白的纯化结束。这个周期大约需要4周才能完成。由于细胞对剪切应变的脆弱性，发酵只以单批或半连续批次进行。在发酵周期中，昆虫细胞数量在大约一周内增加了近50倍，但只有在单批或半连续批次中，因为它们对剪切力的敏感性。 培养基费用从中等（无血清培养基）到昂贵（细菌和酵母培养基）。由于细胞可以在感染前健康培养，该技术非常适合生产危险细胞产品。尽管如此，由于需要特殊通风和高表达水平所需的质粒感染类型，放大是有问题的。 杆状病毒不感染脊椎动物，因此没有健康危险，而外来病毒的风险仍然未知，需要病毒灭活和主动过滤。宿主细胞的反复死亡和随后的裂解导致细胞内蛋白和核酸释放到培养基中，使下游纯化过程承受极大压力（例如，带有包涵体的细菌细胞）。昆虫细胞具有主要的监管轨迹，但尚未有FDA批准的产品。 与哺乳动物细胞培养相比，昆虫细胞培养在成本较低和更容易培养方面具有优势。通过这种技术实现的异源蛋白表达水平通常变化很大，从1到600 mg/L培养基。在10-40 mg/L的蛋白表达水平下，某些胶原蛋白在昆虫细胞中合成。昆虫细胞的一个问题是它们很少产生重组蛋白，因为它们更倾向于将合成的蛋白保留在细胞质中。这一特性归因于使用的转染方法，这可能使下游处理更加困难。杆状病毒表达载体（对人类不具传染性）通常被用作培养昆虫细胞中异源蛋白的表达系统。多亚单位蛋白复合物的生产、共表达蛋白修饰酶以增加异源蛋白生产以及新的杆状病毒展示技术应用是最近的一些进展。 基于昆虫细胞的表达系统有几个缺点，包括非哺乳动物糖基化模式和低生产力。昆虫细胞无法消化最初作为较大的不活性前体蛋白产生的蛋白质（例如，肽激素、神经肽、生长因子和基质金属蛋白酶）。然而，已经研究了几种解决这个问题的方法。一种方法是在杆状病毒中与感兴趣基因共表达这些酶，另一种方法是将哺乳动物糖基转移酶引入昆虫细胞。 8.比较分析 表9.3比较了商业生产重组产品的工业属性，指出了负面属性（因此，较低的评级更受欢迎）。目标蛋白的类型、PTMs、表达水平、知识产权和制造成本影响表达系统的选择。每个当前的表达系统都有自己的优缺点（表9.4）。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要 与比较成熟的生物制品比如单克隆抗体相比，一些先进治疗药物产品（ATMPs）遭受病毒污染的风险要高得多。常规方法和手段在降低病毒污染风险方面的能力是有限的，而ATMP上下游工艺中可能引入的一些外源病毒，容易被漏检。二代测序（NGS）技术可以通过其基于检测样本中任何种类核酸的固有能力来检测任何种类的病毒污染，从而规避病毒漏检的风险。它完美地结合了现有检测方法的优点，并弥补了其缺点。它将取代一系列不同的现有检测方法，缩短检测周期，最终降低总体成本。综合这些特点，基于NGS的病毒检测方法将成为降低各种生物制品病毒污染风险的首选方法。 引言 ATMP一般可以分为三类： 基因治疗药物产品（GTMP） 体细胞治疗药物产品（sCTMP） 组织工程医疗产品（TEP） 它们通常来源于病毒和细胞等生物体，和/或通过不同类型的穿梭系统传递和改变遗传信息。例如：病毒载体，溶瘤病毒，来源于人体组织的遗传修饰细胞，以及通过裸露DNA和不同类型的RNA直接递送或通过不同种类的生物囊泡进行递送。 溶瘤病毒、病毒载体和病毒样颗粒通常通过哺乳动物细胞系（如HEK 293或Vero细胞）进行生产，类似于非ATMP重组产品，这些产品通常在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系进行生产。细胞产品来源于原代人体组织，如软骨细胞、角质形成细胞、干细胞或造血系统的细胞。 ATMP病毒污染风险 所有ATMP的共同点是起始材料，产品本身，以及动物/人源关键原材料都极易被病毒污染。这些材料中有许多是人源的，病毒污染与否跟接受ATMP治疗的患者休戚相关。这与以不同种属细胞生产的生物制品不同。例如，大多数治疗性重组蛋白和单克隆抗体在啮齿动物细胞系如CHO细胞中生产。这些细胞也容易受到病毒污染，但它们通常不会感染人类。大多数细胞治疗产品（未经基因修饰的和基因修饰过的）分离自人类供体，人类细胞经常用于ATMP生产。它们含有内源性病毒要么是片段化的（人类内源性逆转录病毒），要么像某些疱疹病毒一样处于潜伏期。这些病毒可以在生产过程中或患者给药后发生激活或重组。 ATMP的生产工艺经常涉及不同生物来源的原材料。重组细胞因子和生长因子是风险可控的材料。但是，在制造过程中还需要一些风险没那么可控的材料，如动物/人类血清、血小板提取物、饲养层细胞或饲养层细胞提取物，甚至病毒（病毒载体或辅助病毒）。 最后，基于人类细胞的生产过程或细胞治疗产品从材料收集开始直到患者给药都涉及大量的人为操作。这些细胞对人类病毒的高度易感性增加了生产工艺或人为操作带来的病毒污染风险。如果易感病毒，细胞基质将成为完美的病毒扩增机器。低病毒颗粒数足以引发活跃的病毒感染和复制。体外或体内系统中的病毒扩增可以比任何PCR系统更高效。总体而言，与重组蛋白和单克隆抗体等传统生物制品相比，各种ATMP的病毒污染风险明显更高。 ATMP风险缓解原则 ICH Q5A指南于1997年发布，最近进行了全面修订，它提供了一种风险缓解策略，以尽量减少病毒污染。这种策略通常被称为“三支柱概念”，但可以进一步扩展（见图1）。图1中，不同的支柱模型对应着不同产品类型的病毒风险缓解原则。 图1. 不同产品类型的安全支柱概念。支柱大小说明了风险缓解手段的效果。粗的支柱代表较好的效果，而较细的支柱代表较差的效果。 （A） 大大降低风险。来自CHO、NS0、SP2/0等成熟细胞系的单克隆抗体等重组药物； （B） 中等风险缓解效果。HEK 293, PER.C6, Sf9生产的AAV等病毒载体； （C）较差的风险缓解效果。如逆转录病毒和腺病毒载体，人供体细胞来源的同种异体细胞治疗产品（外周血单核细胞[PBMCs]、干细胞、诱导多能干细胞[iPSC]）和溶瘤病毒。针对该类产品，需重点强调检测手段，以弥补其他效果较差的风险缓解手段。 CHO源重组药物具有较低的病毒风险，因为根据25年来收集的行业经验，可以有效使用各种措施以降低风险。以此为参照，可以很好地说明不同类型ATMP的风险缓解方案。重要的是，对于许多ATMP来说，通过病毒清除来降低风险通常比较困难。虽然腺相关病毒（AAV）载体仍然可以通过一些病毒去除或灭活步骤来降低风险，但并不适用于其他ATMP如逆转录病毒载体、溶瘤病毒和任何类型的细胞治疗产品。而病毒清除是最有效的病毒风险缓解手段。病毒灭活和去除更多是基于病毒的生物物理特征，较少基于病毒生物学。许多生物物理特征，如脂包膜或非包膜、病毒的大小和病毒的基因组类型，在各种已知甚至未知病毒中都很常见。这使得病毒清除成为一种强大而广泛的病毒风险缓解手段。 起始物料（或原材料）的控制有一定的局限性，因为生产细胞系（HEK293和Vero）对人类病毒的潜在高度易感性，以及人供体细胞（白细胞、干细胞、iPSC）和动物（甚至人类）源头的原材料如血清、病毒或饲养层细胞中已知的不可避免的内源性病毒的存在。一些ATMP，如用于体内的病毒载体（AAV、腺病毒）或作为体外关键原料（逆转录病毒/慢病毒载体），在制造过程中存在产生复制型病毒的固有风险——尽管在过去几年中，通过载体工程，这种风险已大大降低。 生物制品生产的卫生措施通常是完善的，但许多ATMP仍然需要大量的人工操作，这增加了操作员或环境感染病毒的风险。这些因素削弱了许多ATMP病毒风险缓解策略中“来源控制”和“卫生措施”的效果。 最后，与过去25年来单抗等治疗药物所积累的知识/经验相比， ATMP制造中关于病毒安全性的知识和经验要有限的多。 对ATMP来说，从原材料来源控制到卫生措施和病毒清除步骤，以及知识经验积累，这些都是有限的，因此，通过常规过程检测和终产品检测，对起始材料和关键原材料进行全面安全表征是十分重要的。这就需要使用不同的检测方法和最先进的技术来检测包括未知病毒在内的各种病毒。 检测方法 表1列出了一些传统的病毒检测方法。它们可以细分为常规病毒检测（体内法、体外法、TEM）、针对逆转录病毒等特定病毒组的检测，以及针对指定病毒的靶向检测。该表列出了与检测对象相关的不同检测方法的优缺点。事实上，不同检测方法的组合弥补了单个检测的一些缺点。但即使是各种检测方法的组合也会因不同的原因漏检某些污染物。 尽管这些方法在过去25年中得到了成功应用，但在某些情况下，所有方法都无法检测到病毒污染物。昆虫生产细胞系Sf9被认为是不会感染病毒的，直到使用灵敏度更高的技术——下一代测序（NGS）检测到污染。更严重的是，在一款商业化的人类疫苗中，同样用NGS技术检测到了病毒污染。幸运的是，猪病毒污染物（猪圆环病毒）没有感染人类，也没有引起任何疾病。 下一代测序（NGS） 这些发现引起了人们对NGS技术的极大关注。这在当时并不是一项新技术，但它被公认为是一种用于生物制品病毒安全性检测的先进技术。该技术的基本特点是： 靶向样本中的任何类型的核酸（RNA/DNA）。 在一次运行中同时对数百万个片段进行测序。 除了检测，它还会对核酸进行测序，并提供有关核酸种类的信息。 不需要像PCR的方法那样需要预先了解序列信息。 该技术从第一代优化到第三代或第四代。 其适用性取决于目标和应用。 有多篇出版物展示了该技术在病毒安全检测方面的强大功能： 广阔的检测范围 与PCR相当的灵敏度 通过基于转录组的方法区分感染性病毒和非感染性病毒的能力 检测不同变体甚至未知病毒的能力 总体而言，该技术克服了传统检测的缺点，不仅有可能补充传统方法，而且有可能取代这些方法（见表2）。公布的两起污染案例清楚地展现了该技术强大的病毒检测能力（尤其是当既定方法失败时）。 欧洲药典EP 5.2.14建议使用NGS代替体内方法。其他关于疫苗的EP章节，如EP 5.2.3和EP 2.6.16，指出了该技术可作为替代检测方法，这两章都在与ATMP相关的EP 5.14章节得到引用。最近，EDQM发布了第2.6.41章节草案征求意见稿，其中详细描述了该技术在病毒检测方面的应用。重要的是，NGS对于病毒安全性检测的意义在最近发布的最重要的病毒安全性检测指南ICH Q5A（R2）修订版中得到了充分强调。NGS被提及40多次，其中包含一整章关于NGS的内容。尤其建议该技术取代动物试验。考虑到欧盟和美国政府在尽可能减少、改进和取代动物试验（3R原则）方法方面的不同举措，这一点非常重要。ICH Q5A指南还明确提供了补充甚至取代其他检测方法的选项，如体外细胞检测和特异性病毒检测，如MAP/HAP/RAP或基于PCR的检测。本行业正在通过不同的举措支持和推动NGS作为病毒安全检测方法，如先进病毒检测技术兴趣小组（AVDTIG）和监管机构成员，或生物制造中的外源污染物研究联盟（CAACB）。除了这些监管、学术和行业举措之外，还有每两年一次的NGS外源病毒检测会议，用于当面讨论该技术相关更深的进展。 此外，许多单位在IND和BLA申报中已成功使用了该技术，并且此类申报的数量正在增加。 ATMP风险缓解策略 如前所述，由于ATMP起始和/或原材料的病毒污染风险较高，特别是有限的病毒清除步骤，因此，对ATMP来说，检测是一项重要的病毒风险缓解手段。 检测可以在两个不同的阶段进行： 1.细胞库或供体细胞等起始材料以及在生产过程之前使用的原材料(Offline) 2.生产过程中：工艺中间体或原液/制剂(Online) 这两个阶段的检测相关特点明显不同（见表3）。 起始材料和关键原材料可以单独进行全面分析，而不会延误生产过程。对这些关键材料进行的病毒安全性检测越严格，生产过程就越安全。这证明了使用更复杂的技术（如NGS）进行更全面的检测是合理的，而成本可能更高一些，数据分析评估可能需要更长时间，可能需要更多的材料，最重要的是，最终检测周期会更长一些（TAT）。然而，该检测技术通常应用于主细胞库等的生产所需材料，或培养基所需的血清。这不会延误生产过程本身。 生产过程中或终产品放行时的检测需要满足其他要求。检测周期应尽可能短，所需样本应尽可能小（不要浪费太多产品），方法应尽可能简单，以创建清晰的数据——理想情况下，就是一个简单的不需要解释的“是”或“否”的答案。此外，该阶段检测成本应该尽可能低，因为这将是整体生产成本的一部分。 事实上，在生产准备阶段进行的安全分析越全面，在生产和放行期间的检测就可以越少或越简单。这可以显著降低生产周期、成本，并提高安全可靠性。生产放行期间的检测项目将着重解决基于起始材料和关键原材料等综合检测结果的风险评估中确定的残留病毒风险。该逻辑应该应用于整个检测方案，尽管它可能并不总是适用于所有类型的ATMP。 到目前为止，基于NGS的病毒安全检测解决方案通常应用于生产过程之前。成本仍然较高（在GMP环境中），检测周期比任何体内试验都要短，但仍有待改进，其技术复杂，结果可能需要解释甚至后续检测，以验证是假阳性或真正的阳性。然而，NGS的高度安全性使其成为关键起始材料和原材料深度安全表征的正确工具。与传统的检测方法相比，基于NGS的强大的检测能力，其为一些或绝大多数标准检测方法提供了可替换的选择。因此，这将大大降低生产和放行检测项目的总体成本和周期。这一优势对于ATMP也特别重要，因为仍需要对ATMP的终产品进行全面的病毒安全性检测，例如，由PBMCs、干细胞和iPSC等人原代细胞生产的同种异体细胞治疗产品。 幸运的是，NGS技术仍在进一步发展中，它可以使关键材料的全面检测更加高效，并最终满足生产和放行检测要求。扩增子测序或探针捕获测序的靶向NGS解决方案大大减少了数据处理和评估的工作量。可以更快地提供结果。Oxford Nanopore（英国 牛津）或PacBio（美国加利福尼亚州 门洛帕克）使用直接测序，无需事先扩增，并提供长读测序。这也可以显著加快检测周期并降低数据分析的复杂度。 结论 总体而言，适应特定需求的不同NGS解决方案将使其成为一种全面适用的安全检测技术，有潜力取代大多数（如果不是全部）生产放行期间及之前所需的传统检测方法。尽管ATMP通常具有更高的病毒污染风险，但它将显著提高ATMP的病毒安全性。 重要的是，NGS技术可以扩展应用到分析支原体等其他病原体，这只需在数据处理部分添加上所评估病原体相关的额外数据库即可。最后，在某些情况下，病毒检测的测序结果可同时包含其他质量属性相关数据。例如，从病毒载体产品收获液的病毒检测中获得的不可知测序数据，将包括足够的产品数据，这些数据可同时确定载体基因组序列及载体鉴别和纯度。 总之，中期或长期范围内， NGS技术将在生物制品尤其是ATMP的病原体安全检测中占据主导地位。与既定的检测方法相比，NGS的强大的病毒检测能力和优势将使其成为监管机构广泛首选的强制性病原体检测解决方案。随着该技术的进一步发展，包括数据处理的更多自动化，检测成本和周期将大大降低，因此，NGS是一种选择，但更将会是一种标准，一种必须的选择。 原文出处 Horst Ruppach. NGS-Based Viral Safety Testing for ATMPs: Mandatory or Just an Option? Bioprocessing Journal, 2024 April.  Charles River – 符合GMP的NGS解决方案 稳健高效的质量控制检测对于生物制品的开发至关重要，旨在缩短上市时间并改善患者治疗效果，Charles River 与我们合作伙伴PathoQuest合作，可提供GMP和非GMP NGS服务: NGS iDTECT® 转录组分析:可替代体内法外源病毒检测和MAP/HAP/RAP 检测 质粒和病毒载体鉴别 整合位点分析（ISA） Charles River NGS服务优势如下： 丰富的监管知识和符合法规要求的实验室，GLP&GMP认证实验室 有效进行生物制品安全性检测和QC检测 高度一体化且灵活的NGS解决方案，可检测原材料，MCB，WCB，病毒种子库，DS，DP等，加速药品上市进程 专有病毒数据库及资深病毒学和生物信息学专家 与体内外源病毒分析进行了头对头比较（结果已发布） 经验证可替代HAP/MAP/RAP 咨询有礼-有奖调研（中奖率100%） 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是参与雷美替胺肝脏代谢的主要同工酶；口服放射性标记的雷美替胺后，84%的总放射性通过尿液排出，约4%通过粪便排出，平均回收率为88%。少于0.1%的剂量作为母体化合物从尿液和粪便中排出。给药后96小时基本消除。由于雷美替胺的消除半衰期短（平均约1至2.6小时），每天重复服用一次不会导致显着蓄积。 3、临床适用于 用于治疗难以入睡型失眠症 4、上市情况 国内暂无上市企业 国外上市情况：2005年7月，ROZEREM片剂在美国被批准用于治疗“以入睡困难为特征的失眠症”。在日本，它因具有“改善失眠症入睡困难”的功效，于2010年4月作为不属于“精神药物”或“注意：成瘾”类别的药物批准生产和销售。2019年6月公布复审结果，再次确认有用性。 5、国内申报情况 国内有2家企业申请了临床，分别是南京正大天晴制药有限公司和越洋医药开发（广州）有限公司。 6、参比制剂的选择  国家局发布的仿制药参比制剂目录（第三十批），详见如下： 参考以上信息，雷美替胺片的处方工艺开发，可选择日本武田薬品工業株式会社上市的Rozerem作为参比制剂，规格为8mg，参比制剂生产商为武田薬品工業株式会社 くすり相談室，生产地址为〒103-8668 東京都中央区日本橋本町二丁目1番1号。 7、研发进度 阳光诺和拥有雷美替胺原料及制剂的成熟制备工艺，原料中试交接已完成，制剂即将进行中试。 非奈利酮片 1、基本信息 产品名称：非奈利酮片 英文名称：Finerenone Tablets 商品名称：Kerendia（可申达） 原研厂家：Bayer 产品规格：10mg和20mg 注册分类：4类 2、项目优势 非奈利酮片（通用名：Finelenone，以下简称Finelenone）是拜耳公司开发的一种新型非甾体类选择性盐皮质激素受体拮抗剂（MRA）。适用于与2型糖尿病相关的慢性肾脏病成人患者（肾小球滤过率估计值[eGFR]≥25至<75mL/min/1.73m2，伴白蛋白尿），可降低eGFR持续下降、终末期肾病的风险。 非奈利酮是一种非甾体类、选择性盐皮质激素受体（MR）拮抗剂，MR可被醛固酮和皮质醇激活并调节基因转录，MR过度激活会导致纤维化和炎症。非奈利酮是MR的强效和选择性拮抗剂，可阻断上皮（如肾脏）和非上皮（如心脏和血管）组织中MR介导的钠重吸收和MR过度激活，对雄激素、孕激素、雌激素和糖皮质激素受体无亲和力。 3、临床适用于 降低2型糖尿病相关的终末期肾病的风险 4、上市情况 国内目前仅参比上市，持证商拜尔，规格10mg、20mg。 5、国内申报情况 暂无企业申请上市。 6、市场情况 7、参比制剂的选择  NMPA发布的参比制剂目录信息： 综上所述，选择Bayer上市的原研药品，商品名：Kerendia（可申达），作为参比制剂。 8、专利情况 化合物专利CN101641352B，保护期至2028年2月19日CN106795155A，原研api合成路线，保护期至2035年 9、研发进度 非奈利酮片预BE已完成，项目经验成熟。 对乙酰氨基酚布洛芬片 1、基本信息 产品名称：对乙酰氨基酚布洛芬片 英文名称：Ibuprofen，Acetaminophen tablet 商品名称：Advil Dual Action With Acetaminophen 原研厂家：GlaxoSmithKline Consumer Healthcare 产品规格：对乙酰氨基酚250mg，布洛芬125mg 注册分类：3类 2、项目优势 对乙酰氨基酚是一种常用的苯胺类解热镇痛药，患者服用后不会产生过敏反应和积累中毒，临床上多用于治疗头痛、发烧及缓解轻度至中毒疼痛，也适用于治疗由普通感冒和病毒感染所引起的头痛、发烧及全身不适，还可作为有效的止痛药。维生素C具有增强机体对传染病的抵抗力，促进抗体形成，增加白细胞吞噬功能以及抗炎抗过敏作用，并能增加机体对病毒的抵抗力和对毒物的分解能力。 布洛芬是一种常用的解热镇痛消炎药，临床上主要用于解热及因为高热引起的关节疼痛、神经痛、痛经及其它疾病所引起的疼痛。布洛芬是由Stewart Adams博士和其导的团队、化学家John Nichokson博士共同发现的。其是在开发治疗类风湿关节炎的“超级阿司匹林”过程中长期研究的产物。将布洛芬誉为“超级阿司匹林”，意味着与当时的其他药物相比，疗效相同，但更具安全性。 3、临床适用于 解热镇痛消炎。 4、国内、外上市情况 目前国内有一家企业（广州南新）上市复方布洛芬片，每片含布洛芬400mg,对乙酰氨基酚325mg。 5、国内申报情况 目前国内有2家企业申报，山东朗诺和长春澜江，申报的规格均为对乙酰氨基酚250mg，布洛芬125mg。 6、市场销售情况 对乙酰氨基酚布洛芬片在国内还未上市，暂无销售数据。布洛芬片为OTC，以下为我公司数据库部分样本医院数据： 7、参比制剂的选择 NMPA发布的参比制剂目录信息 综上所述，按现行管理法规要求，选用GlaxoSmithKline Consumer Healthcare在美国上市的原研药品，商品名为Advil Dual Action With Acetaminophen，规格：对乙酰氨基酚250mg，布洛芬125mg，作为参比制剂。 8、专利情况 无专利限制。 9、研发进度 处方工艺开发中。 布洛芬盐酸去氧肾上腺素片 1、基本信息 产品名称：布洛芬盐酸去氧肾上腺素片 英文名称：Ibuprofen and Phenylephrine Hydrochloride Tablets 商品名称：Advil Congestion Relief 原研厂家：GlaxoSmithKline Consumer He 产品规格：布洛芬200mg，盐酸去氧肾上腺素10mg 注册分类：3类 2、项目优势 抗感冒药是一个庞大的家族，是最大类别的药品，依据抗感冒药所含血管收缩药的不同种类，可将抗感冒药分为三代：第一代苯丙醇胺类抗感冒药：2000年以前，国内外的抗感冒药以苯丙醇胺（去甲麻黄碱、PPA）类为主。第二代伪麻黄碱类抗感冒药：自2000年开始停用含苯丙醇胺的抗感冒药后，各国相继采用伪麻黄碱组成新的抗感冒药。第三代去氧肾上腺素类抗感冒药：美国的研究证实了口服去氧肾上腺素收缩血管、消除闭塞的作用，确定了其在抗感冒药中的地位。布洛肾素片的原研产品于2010年5月获得FDA批准上市销售，由美国Pfizer INC开发成功。目前该产品由GSK作为持证商在对外销售，是OTC产品。 3、上市情况 国内暂无上市企业 4、国内申报情况 国内仅阳光诺和申请临床试验 5、参比制剂的选择 国家局发布的仿制药参比制剂目录（第二十九批），详见如下： 参考以上信息，布洛芬盐酸去氧肾上腺素片的处方工艺开发，可选择美国GlaxoSmithKline Consumer Healthcare上市的Advil Congestion Relief作为参比制剂，规格为布洛芬200mg,盐酸去氧肾上腺素10mg。 6、研发进度 阳光诺和拥有布洛芬盐酸去氧肾上腺素片的成熟制备工艺，目前正在准备进行临床试验。 阿加曲班注射液 1、基本信息 产品名称：阿加曲班注射液 英文名称：Argatroban Injection 商品名称：NOVASTAN(诺保思泰) 原研厂家：田边三菱制药株式会社 产品规格：2mL:10mg 注册分类：4类 2、项目优势 阿加曲班是由日本三菱制药工场株式会社研制合成的抗血栓药，于1990年2月最先上市，首先被应用于临床治疗周围动脉闭塞性疾病，然后开始将其用于治疗急性脑血栓形成，以及心肌梗死溶栓的辅助治疗，并用于在抗凝血酶(AT)缺乏患者进行血透时的抗凝处理。美国食品与药品管理局（FDA）在2000年批准了史克必成和得克萨斯生物技术公司的可注射抗血栓小分子药物阿加曲班应用于治疗和预防血栓形成及肝素诱导的免疫性疾病－血小板减少症（HIT），以及用于对需要进行经皮冠脉介入术（PCI）病人的治疗。阿加曲班2001年在韩国上市。2002年12月，三菱制药公司正式在中国上市，规格：2ml：10mg，商品名：诺保思泰。 3、上市情况 目前国内26家上市，其中1家参比，23家过评。本品已经集采。部分上市情况如下： 4、国内申报情况 目前国内7家企业申请上市，湖南恒生、浙江华海、华夏生生等。 5、市场情况 6、参比制剂的选择 NMPA发布的参比制剂目录信息： 综上所述，选择田边三菱制药株式会社在国内上市的原研药品，商品名：NOVASTAN(诺保思泰)，作为参比制剂。 7、专利情况 无专利限制。 8、研发进度 阳光诺和拥有阿加曲班注射液的成熟制备工艺，现已拿到生产批件，可以对外转让。 度他雄胺软胶囊 1、基本信息 产品名称：度他雄胺软胶囊 英文名称：Dutasteride Soft Capsules 商品名称：Avodart(安福达) 原研厂家：GlaxoSmithKline (Ireland) Ltd. 产品规格：0.5mg 注册分类：4类 专利情况：无专利限制 2、项目优势 度他雄胺（Avodart，葛兰素史克）是第2代5α-还原酶抑制药，是目前第一种也是唯一一种同时抑制I型和II型5α-还原酶的药物，2001年由美国食品与药品管理局（FDA）批准在美国上市，用于治疗良性前列腺增生症。长时间服用能减小前列腺体积，因此目前被FDA批准用于降低急性尿潴留和相关手术风险。在欧洲市场的商品名为Avolvet。 国家食品药品监督管理局于2011年4月11日批准了法国Laboratoire GlaxoSmithKline公司的度他雄胺软胶囊（商品名为安福达/Avodart、规格为0.5mg）进口上市申请，进口注册证号为H20110205。 3、临床适用于 治疗良性前列腺增生症。 4、上市情况 目前国内6家企业上市，1家参比、5家过评。本品已集采。 5、国内申报情况 目前无最新申报企业。 6、参比制剂的选择 NMPA发布的参比制剂目录信息： 综上所述，选择GlaxoSmithKline (Ireland) Ltd.在国内上市的原研药品，商品名：Avodart(安福达)，作为参比制剂。 7、研发进度 阳光诺和拥有度他雄胺软胶囊的成熟制备工艺，现已拿到生产批件，可以对外转让。 盐酸多西环素片 1、基本信息 产品名称：盐酸多西环素片 英文名称：Doxycycline Hyclate Tablets 商品名称：Vibramycin 原研厂家：Pfizer Japan Inc 产品规格：0.1g 注册分类：3类 2、项目优势 多西环素是一种四环素类抗生素，通常用于治疗各种感染。它是一种广谱抗生素和抑菌剂。强力霉素具有抗原生动物特性，是体内MMPs（基质金属蛋白酶）的有效抑制剂。强力霉素经常用于治疗莱姆病，慢性前列腺炎，鼻窦炎，盆腔炎痤疮，酒渣鼻和立克次体感染和预防治疗炭疽（由炭疽芽孢杆菌引起）。对鼠疫菌也有效。治疗与强力霉素抑制胶原合成。 3、临床适用于 浅表性皮肤感染、深表性皮肤感染、淋巴管淋巴结炎、慢性脓皮病、外伤烧伤及手术创等二次感染、乳腺炎、骨髓炎、喉咽喉炎、扁桃体炎、急性支气管炎、肺炎等引起的感染。 4、上市情况 目前国内有61家上市，仅江苏联环1家通过一致性。部分上市情况如下： 5、国内申报情况 目前国内2家申报，特一药业申请一致性，浙江赛默申请上市。 6、市场情况 7、参比制剂的选择 NMPA发布的参比制剂目录信息： 综上所述，选择Pfizer Japan Inc在日本上市的原研药品，商品名：Vibramycin，作为参比制剂。 8、专利情况 无专利限制。 9、研发进度 阿达帕林过氧苯甲酰凝胶正在进行中试生产，项目经验成熟。 苹果酸奈诺沙星胶囊 1、基本信息 产品名称：苹果酸奈诺沙星胶囊 英文名称：Nemonoxacin Malate Capsules 商品名称：太捷信 原研厂家：浙江医药股份有限公司新昌制药厂 产品规格：0.25g 注册分类：4类 2、项目优势 奈诺沙星（nemonoxacin，TG-873870）具有广谱的抗革兰阳性菌、革兰阴性菌和非典型病原体的体外抗菌活性，包括耐青霉素、耐喹诺酮类的肺炎链球菌并且对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)、耐万古霉素金黄色葡萄球菌和多重耐药病原菌有效。奈诺沙星C-8位点比沿用的喹诺酮类多一个甲基基团，使得与拓扑异构酶Ⅳ和Ⅱ均能结合，从而抗菌谱更广，诱导耐药减少。 奈诺沙星是由台湾太景（TaiGen）生物科技公司从宝洁(P&G)制药获得许可研发的一种新型C-6位无氟喹诺酮类药物，并由该公司授权予浙江医药股份有限公司在中国大陆生产与销售。现应用者为苹果酸奈诺沙星（nemonoxacin malate），与沿用的喹诺酮类抗菌药物相比，奈诺沙星对革兰阳性球菌具有更高的抗菌活性。 3、临床适用于 抗细菌感染 4、上市情况 目前国内苹果酸奈诺沙星胶囊仅1家企业上市，浙江医药股份有限公司新昌制药厂（原研），规格：0.25g(以C20H25N3O4计)。上市情况如下： 5、国内申报情况 暂无企业申报仿制上市。 23年1月，浙江医药股份有限公司新昌制药厂（原研）申请临床。 23年6月，治疗单纯性尿路感染III期临床进行中。 6、市场情况 苹果酸奈诺沙星胶囊的销售数据如下： 7、参比制剂的选择 NMPA发布的参比制剂目录信息： 综上所述，可以选择原研药品（持证商：浙江医药股份有限公司新昌制药厂；商品名：太捷信）在国内上市的苹果酸奈诺沙星胶囊，作为参比制剂。 8、专利情况 9、研发进度 阳光诺和目前正在进行实验室处方工艺研究。 阿达帕林过氧苯甲酰凝胶 1、基本信息 产品名称：阿达帕林过氧苯甲酰凝胶 英文名称：Adapalene and Benzoyl Peroxide Gel 商品名称：Epiduo 原研厂家：Laboratoires Galderma S.A. 产品规格：0.1%,2.5%（15g） 注册分类：3→4类 2、项目优势 阿达帕林属第三代维A酸，是一种萘甲酸衍生物，它与维A酸核受体有特殊的亲和力，与第一代的维A酸和异维A酸不同，它不与胞腺维A酸蛋白相结合，比原有的维A酸制剂对皮肤的刺激更低。而且其稳定性好，避免了维A酸仅限于晚上使用（维A酸光不稳定，需避光）。过氧化苯甲酰为苯甲酸衍化物，具有广谱抗菌作用，尤其抗厌氧菌性感染，对痤疮丙酸杆菌（痤疮丙酸杆菌）和表皮葡萄球菌（表皮葡萄球菌）具有抗菌活性，且有去角质作用。其最大特点是不会耐药。根据CN101541320B原研专利研究结果可知，BPO可增强阿达帕林的作用，在保持同样的皮肤耐受性的同时，联合应用或组合使用阿达帕林和BPO的治疗方法可以成功地减少痤疮的皮损数量并改善病人的临床症状，疗效显著优于以单独应用阿达帕林或单独应用BPO为基础的治疗方法。 3、临床适用于 寻常性痤疮的局部治疗 4、上市情况 国内暂无阿达帕林过氧苯甲酰凝胶上市。有阿达帕林凝胶单方和过氧苯甲酰凝胶单方上市，上市情况如下： 5、国内申报情况  目前国内有2家申请上市：原研Galderma、苏州高迈。 23年1月，原研Galderma申请上市，预计24年底或25年初获批。 6、市场情况 由于国内阿达帕林过氧苯甲酰凝胶还未上市，所以暂无复方的销售数据。 阿达帕林凝胶单方和过氧苯甲酰凝胶单方的销售数据如下： 7、参比制剂的选择 NMPA发布的参比制剂目录信息： 综上所述，选择Laboratoires Galderma S.A.上市的原研药品，商品名：Epiduo。 8、专利情况 无专利限制。 9、研发进度 阿达帕林过氧苯甲酰凝胶正在进行中试生产，项目经验成熟。 多替诺雷片 1、基本信息 产品名称：多替诺雷/多替诺德片 英文名称：Dotinurad Tablets 商品名称：URECE 原研厂家：Fuji Yakuhin Co., Ltd. 产品规格：0.5mg、1mg、2mg 注册分类：3类 2、项目优势 多替诺雷片（通用名：ドチヌラド）是一种具有选择性URAT1抑制作用的药物，并且致力于减少肝脏毒性（如线粒体毒性）和CYP2C9抑制引起的药物相互作用，由富士药品公司研发，是一种选择性尿酸再吸收抑制药（Selective Urate Reabsorption Inhibitor：SURI）。 多替诺雷片的开发从2009年开始，针对痛风和高尿酸血症患者的临床试验由富士药品公司进行，第Ⅲ期试验则由富士药品公司与持田制药公司共同进行。由于确认了多替诺雷片的有效性和安全性，最终申请了“痛风、高尿酸血症”作为适应症，并于2020年1月23日获得了生产销售许可，商品名为URECE，规格为0.5mg、1mg和2mg。高尿酸血症如果持续存在，会引发痛风关节炎（痛风），并导致生活质量下降。此外，高尿酸血症不仅与痛风相关，还可能与肾脏损伤和心血管事件的发生有关。因此，降低痛风和高尿酸血症患者的血清尿酸值是非常重要的。在治疗痛风和高尿酸血症时，生活习惯的调整是基本原则，药物治疗也同样重要。 3、临床适用于 痛风、高尿酸血症 4、上市情况 目前国内暂无上市企业 5、国内申报情况 原研中国临床3期完成，即将上市（临床做的规格是1和2mg）。 6、市场情况 国内暂无上市，所以暂无销售数据。 7、参比制剂的选择  NMPA发布的参比制剂目录信息： 综上所述，选择Fuji Yakuhin Co., Ltd.在日本上市的原研药品，商品名：URECE，作为参比制剂。 8、专利情况 9、研发进度 多替诺雷原料准备中试，制剂正在做实验室研究。 注射用盐酸兰地洛尔 1、项目优势 注射用盐酸兰地洛尔是由日本小野制药开发的一款用于治疗快速性心律失常的注射药物制剂，是一种新型的超短效肾上腺素β受体阻滞药。肾上腺素β受体阻滞药是一类作用广泛、重要的心血管治疗药物，超短效肾上腺素β受体阻滞药由于起效快、代谢快、停药后β受体阻滞作用消失快，发生的快速性心律失常的治疗中发挥重要且不可替代的作用。 2、临床适用于 1）手术过程中发生的下列快速性心律失常的紧急治疗：心房纤颤、心房扑动、窦性心动过速； 2）手术后循环系统动态监护时发生的快速性心律失常的紧急治疗：心房纤颤、心房扑动、窦性心动过速； 3）心功能不全患者发生下列快速性心律失常的治疗：心房纤颤、心房扑动； 国内无原研产品上市，仅一家仿制药上市 3、项目进度 阳光诺和兰地洛尔原料药工艺验证完成，制剂即将工艺验证。 对以上项目感兴趣，欢迎扫描下方二维码，与阳光诺和直接对接 -动脉网供需对接平台覆盖：出海、供应链、市场/渠道、成果转化、招商入驻等板块 -通过平台上传供应或需求资源内容，可精准触达目标意向合作伙伴 -高效对接MNC、初创企业、政府园区、投资机构等实体 下载动脉网APP，自主发布，高效对接 近 期 推 荐 声明：动脉网所刊载内容之知识产权为动脉网及相关权利人专属所有或持有。未经许可，禁止进行转载、摘编、复制及建立镜像等任何使用。 动脉网，未来医疗服务平台