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概要:人乳头瘤病毒（HPV）以其致癌特性而闻名，是宫颈癌的主要原因，并且显著地促进了死亡率。它还在全球头颈癌发病率的上升中扮演了相当重要的角色。这些癌症在全球范围内构成了巨大的健康负担。当前在诊断和治疗策略上的局限性，以及在中低收入国家预防性疫苗覆盖不足，阻碍了向世界卫生组织（WHO）为2030年设定的HPV预防和控制目标的进展。为了应对这些挑战，结构病毒学中的广泛研究已经探索了HPV蛋白的性质，为HPV感染机制提供了关键见解，这对于预防和治疗策略的发展非常重要。本综述重点介绍了对HPV蛋白结构理解的最新进展，并讨论了HPV疫苗开发中的成就和未来机会。 1.引言 1.1.与HPV相关的癌症和HPV生命周期 1975年，人乳头瘤病毒（HPV）首次从足底疣中分离出来。由于HPV的L1蛋白高度可变，截至2024年6月，“国际人乳头瘤病毒参考中心”已识别出231种HPV类型。HPV类型根据其致病性和致癌风险被分类为高风险或低风险。高风险HPV负责所有人类癌症的5%，并与宫颈、肛门生殖器（肛门、外阴、阴道和阴茎）以及头颈癌相关。HPV16和HPV18约占全球宫颈癌病例的70%。在2020年，全球估计有604,000例新病例和342,000例死亡。 HPV是一种无包膜的双链DNA病毒，基因组大小约为8 kb（图1A），包含7-9个开放阅读框（ORFs），全部位于同一链上。基因组被划分为三个不同的区域：上游调控区（URR），包括复制起点（Ori），以及早期（E）和晚期（L）基因区域。早期和晚期基因区域的激活发生在病毒生命周期的不同阶段。早期区域编码七个非结构蛋白：E1、E2、E1^E4、E5、E6、E7和E8^E2，而晚期区域编码两个衣壳蛋白：L1和L2。 HPV特别针对皮肤或粘膜鳞状上皮。感染通常通过上皮表面的微小伤口发生，基底细胞的横向扩展促进了进入参与伤口愈合的细胞（图1B）。在HPV16的情况下，病毒最初与细胞表面的肝素硫酸蛋白多糖（HSPG）结合，并与细胞质基质成分相互作用，诱导衣壳构象变化。这种变化暴露了L2 N末端RG-1位点，这些位点可以被Furin/蛋白转化酶（PCs）切割，导致病毒衣壳对HSPG的亲和力降低，最终导致病毒进入。在HPV16感染期间，病毒通过早期内质网体、晚期内质网体/溶酶体、跨高尔基网络、内质网，最终到达细胞核。然而，确切的细节仍然有待讨论。 HPV复制发生在进入后。生命周期可以分为三个不同的阶段：建立、维护和生产扩展。在建立阶段，病毒蛋白E1和E2在放大和调节病毒基因组中发挥重要作用。E4，也称为E1^E4，是一个包含E1前五个氨基酸的剪接转录本。它与E2相互作用并稳定E2，诱导G2/M阻滞，促进E6/E7放大，并维持MAPK激活。E4的丧失导致ERK、JNK和p38 MAPK活性降低。E5蛋白的表达依赖于E4的存在，这两种蛋白协同促进病毒DNA放大。E5的存在对于诱导细胞增殖、使细胞重新进入细胞周期和激活晚期病毒功能至关重要。 图1. HPV生命周期及其基因组组织 (A) HPV基因组的组织。数据来源于 https://pave-niaid-nih-gov.libproxy1.nus.edu.sg。(B) HPV生命周期。该图是根据Moody等人和Aksoy等人的插图改编的。 在维护阶段，主要目标是维持恒定数量的病毒基因组并建立持续感染。E2结合病毒基因组到宿主染色体，并支持在有丝分裂期间将病毒基因组分配到子代细胞。E8^E2，也是一个包含E2的铰链、DNA结合和二聚化结构域的剪接转录本，作为病毒抑制蛋白，限制未分化细胞中的HPV复制。在这个阶段，病毒DNA可能整合到宿主基因组中。这一事件通常破坏E1和E2基因，终止E2驱动的E6和E7的转录抑制，最终导致细胞恶性转化。 随后，HPV从病毒基因组的稳定维护过渡到在分化的上皮细胞中发生的繁殖复制。E6对病毒生命周期中的外泌体基因组维护至关重要，而E7显著影响感染细胞的转录，因为它影响多种转录因子。L1和L2的表达发生在高度分化或终末分化的上皮细胞中，并且总是在E4表达之后。每种HPV类型可能表现出独特的晚期基因表达程序。 2.HPV病毒颗粒的冷冻电镜结构 在HPV分离之前，Finch和Klug使用透射电子显微镜（TEM）分析了具有T = 7对称性的兔乳头瘤病毒的二十面体形态。1991年，Baker等人分析了从人类足底疣中分离出来的HPV1的25 A˚结构。尽管分辨率低，但这一分析有效地证明了HPV具有典型的“完整五聚体”二十面体结构。然而，由于其生命周期依赖于基底细胞分化为角质形成细胞，研究HPV病毒结构仍然具有挑战性。目前，研究中使用两种主要的传染性颗粒：伪病毒颗粒（PsVs）和类病毒颗粒（QsVs）。这两种都由L1和L2病毒衣壳蛋白组成。PsVs包裹各种目标基因，如GFP基因，而QsVs包裹PV基因组。 3.主要衣壳蛋白L1 3.1.L1在HPV进入期间 HPV与肝素硫酸蛋白多糖（HSPGs）之间的相互作用在HPV感染期间起着至关重要的作用。添加HSPG有效地抑制了HPV感染。HSPG是一种在细胞膜和细胞外基质中都存在的糖蛋白，它将高度带负电的寡糖片段结合到病毒表面的多个可访问位点，特别是在五聚体的外围和侧壁。值得注意的是，HPV16和HPV18并不共享完全相同的结合位点。 3.2.L1结构和衣壳组装机制 L1蛋白具有典型的“果冻卷”β三明治结构，每个β片由一个不规则的柔性环区域分隔，包括HI、DE、FG和EF环（图2A）。由于其更长和更灵活的结构，HI环在β桶的表面显著突出。C末端由四个α螺旋组成（在HPV59模型中，第四个α螺旋显示为环区域）。该部分朝向颗粒内部无序定向，并且是最可变区域。 L1蛋白可以自发地在体外组装成五聚体。X. Chen及其团队对五种不同的HPV类型进行了全面分析。L1的环可以有效地锚定到五聚体表面。尽管目前已知的HPV类型，如HPV16、HPV18的五聚体β核心具有类似的结构，但特定环的变化导致HPV的不同免疫原性。 五聚体可以组装成T = 1和T = 7类病毒颗粒（VLPs），它们缺乏病毒基因组，表现出卓越的疫苗安全性，即使没有佐剂也具有强烈的免疫原性。2000年，Bishop等人确定了由十二个五聚体组成的T = 1小VLP（sVLP）的结构。这种组装依赖于两个五聚体的L1的第三螺旋（图2C）。 Cardone等人准备了包含L1和L2的T = 7衣壳，并使用延迟冷冻电子显微镜（cryo-EM）分析研究了颗粒成熟过程。形成C175和C428之间的二硫键对于组装是必需的。Li等人确定了HPV59五聚体结构，他们还构建了一个由72个五聚体组成的T = 7 HPV59 VLP的伪原子模型（图2A）。六个L1蛋白形成非对称单元；每个非对称单元的一个L1形成一个中心五聚体，这也是5倍轴。中心五聚体由五价衣壳蛋白组成，而周围的五聚体是六价衣壳蛋白，位于6倍轴上（图2A）。同样，C末端臂的C429与EF环的C175之间形成的二硫键（图2A）使环区域返回到核心区域，形成一个悬挂的桥接环区域，连接到基座。此外，在六价衣壳蛋白中，一个五聚体的B链与相邻五聚体的F链之间的相互作用可能稳定了五聚体之间的相互作用。同一研究小组设计了一个衣壳杂交VLP（chVLP），通过组装单个C175A和C428A L1突变体，可以容纳各种类型的L1五聚体。一种9型的chVLP疫苗与Gardasil 9具有可比的中和滴度。 图2. 与L1相关的结构 (A) VLPs组装机制（PDB ID：5JB1,24）。L1具有“果冻卷”β三明治结构和五个高度可变环。五个L1单体形成一个五聚体。这些五聚体通过“悬浮桥”区域相互交云，72个五聚体形成一个T=7的VLP。在放大图中，“悬浮桥”区域显示为透明表面模型。关键氨基酸C175和C429以不同颜色显示。(B) HPV L1五聚体和V5抗体（PDB ID：6BT3, Guan J. 等人）或U4抗体（PDB ID：6BSP, Guan J. 等人）复合物的关键抗体结合位点结构。(C) HPV T=1 VLP的冷冻电镜图（PDB ID：1DZL, Chen X.S. 等人）。sVLP的组装主要由h4介导，放大图显示了细节。(D) 与HSPG结合的L1五聚体复合物结构。左图：HPV16与HSPG的复合物（PDB ID：5W1O, Dasgupta J. 等人），右图：HPV18与HSPG的复合物（PDB ID：5W1X, Dasgupta J. 等人）。 L1肽也用作模型多肽，以检查各种HLA-A等位基因对肽的识别偏好。Zhang等人分析了HLA-A2601与两种类型的L1肽的复合结构。结合其他结构数据，他们的分析揭示了HLA-A2601的T细胞反应表型主要偏爱在P1位置含有酸性氨基酸D和E的肽。 3.3.L1抗原-抗体复合物的结构和抗体中和机制 确定L1与中和单克隆抗体之间的相互作用机制是分析L1免疫原性的有效方法，从而指导新型HPV疫苗的设计。Susan Hafenstein团队使用QsVs分析了两个代表性抗体的结合位点。H16.V5代表了HPV疫苗接种者中大多数中和抗体，具有重要的临床意义。这种抗体的Fab结合导致更有序的表面环，加强了C末端“侵入臂”，并促进了基座处更紧密的连接。H16.V5识别L1的FG和HI环，而BC和DE环也参与了这种相互作用，显示出对六价衣壳的优先结合（图2B）。然而，这并不妨碍HPV附着到细胞表面，表明五聚体相互作用可能负责HPV附着。 H16.U4通过空间位阻中和HPV16。U4抗体的结合位点与肝素结合位点部分重叠，表明U4的作用可能与HPV附着有关（图2B）。33此外，对三种报告的抗体—H16.1A、H16.14J和H263—的表位分析表明，DE环是每个表位的核心组成部分，而EF和BC环的贡献较小。 S. Li小组对与抗体结合的PsVs进行了结构分析。对于HPV6，三个抗体特别针对BC、DE和FG表面环，分别结合到五聚体的中心、顶部中心和顶部边缘。5D3和17D5抗体防止PsV附着，这是主要的中和机制。相比之下，15F7允许PsV附着，但阻碍了细胞进入。对HPV58的类似研究发现了三种中和机制：顶部中心结合（5G9和10B11）、顶部边缘结合（2H3和5H2）和边缘结合（A4B4和DE环区域A12A3）。对于HPV59，型特异性抗体28F10结合到FG环区域。此外，S. Li小组确定了与兔单克隆抗体H16.001复合的HPV16 PsV的高分辨率冷冻电镜结构，为HPV颗粒结构提供了详细理解，这是疫苗诱导抗体研究的宝贵资源。 3.4.交叉型嵌合HPV VLPs 1999年，研究人员提出将各种L1类型或其他蛋白的片段嫁接到L1基质上，以实现疫苗设计的交叉保护。这一策略被扩展到在不同HPV类型基础上种植HPV的中和位点，其中型特异性抗体仍然可以结合到这些种植区域。S. Li团队合成并结构表征了HPV58/33嵌合五聚体和三价嵌合五聚体（HPV58/33/52），揭示了不同类型之间的结构排列是相同的，小环在类型之间的运动是由不同基因型的变化序列引起的（图2E）。结构数据证明了嵌合五聚体呈现环区域的天然状态的能力。此外，HPV33特异性抗体4E5结合到HPV33、HPV58/33和HPV58/33/52的VLPs，表明使用这些设计原则用于下一代疫苗的可行性。这种策略也已应用于其他嵌合体，包括HPV51/69/26，HPV39/68/70，和HPV11/6，这些可以诱导多型中和抗体，以相同的免疫剂量实现更广泛的保护范围。 4.次要衣壳蛋白L2 次要衣壳蛋白L2作为一种核蛋白，对病毒颗粒的组装、稳定性和包装起辅助作用。L2由大约470个氨基酸残基组成，在N和C末端都有核定位信号。它在感染期间病毒基因组（vDNA）的细胞内转移中起着至关重要的作用，这一功能主要与L2的RG-1表位有关。vDNA主要结合到L2的富含甘氨酸的N末端跨膜（TM）域；然而，vDNA的穿透依赖于L2的C末端。 Buck等人最初分析了包含假定L2密度的低分辨率PsVs结构。通过减去只包含L1的颗粒的密度来获得假定的L2密度。生化实验还揭示了衣壳内相邻L2分子的N和C末端之间的近距离，每个衣壳可以容纳多达72个L2分子。Guan等人报告了更详细的L2结构信息，也是通过从PsVs中减去已知的L1密度获得的。假定的L2密度从五聚体的内部基座开始，沿着五聚体外部上升到肩部，并在顶部结束。五聚体中的相应密度明显小于六聚体中的密度。作者还观察到在从PsVs中减去L1密度后假定的L2密度，注意到明显的构象变化，并提出L2可能也参与肝素结合。 2021年，Goetschius等人报告了迄今为止分辨率最高的HPV16 QsVs的3.1Å冷冻电镜结构。通过更准确地重建这个颗粒，得到了假定的L2密度及其氨基酸序列，揭示了与L2相互作用的侧面L1残基具有高度的序列保守性。目前，L2蛋白的变异性使得难以估计其化学计量比，其整体结构大部分是无序的。 在最近发表的一项研究中，提出L2由宿主激酶Cdk1和Plk1顺序磷酸化。这个过程调节病毒DNA转移到人类有丝分裂染色质，Jung等人验证了Plk1的polo-box域（PBD）与L2的PBM之间的直接相互作用，并分析了HPV18和HPV4的L2 PBM肽与PIK1的复合结构，这进一步支持了这一结论。此外，在这項研究中，首次报告了L2结构（图2F）。 5.E1和E2蛋白的结构和功能 5.1.E1和E2蛋白的功能 在HPV复制过程中，E1和E2共同调节其他E蛋白的转录。E2对不同结合位点的亲和力可能会影响基因转录的抑制或激活，使E2能够在HPV生命周期的不同阶段发挥多种功能。E2二聚体诱导DNA弯曲，形成类似圆盘的结构。此外，E2招募DNA解旋酶E1，与其他细胞复制因子合作，启动和延长复制。最近的研究还揭示了E1激活核因子κB（NF-kB）途径的能力，表明E1不仅在逃避免疫反应中起关键作用，还在促进复制、持续性和癌症发展中起关键作用。 5.2.E1的DNA结合域 E1蛋白在不同HPV类型中高度保守，可分为三个不同的功能域：（1）N末端域，包含核定位信号（NLS）和核出口信号（NES）；（2）中间域具有DNA结合域（DBD），负责识别长控制区（LCR）中的复制起点；以及（3）C末端域，具有解旋酶/ATPase活性，并在蛋白寡聚化中起作用。Auster等人报告了HPV18 E1-DBD的晶体结构，揭示了HPV18 E1、BPV-1和低风险HPV 11共享的二聚体位点。HPV18 E1-DBD和BPV-1 E1-DBD显示出类似的折叠，中央有五个链的反平行β片，两侧各有四个松散包装的α螺旋和两个紧密包装的螺旋（图3A）。E1以二聚体形式结合DNA，结合位点主要位于E1单体的第三螺旋上。这种相互作用在DNA磷酸骨架上是非特异性的，一个DNA结合环促进序列特异性识别。在E2的招募下，最初的E1二聚体形成一个四聚体E1复合物，最终组装成两个六聚体E1解旋酶。这些具有ATPase活性的解旋酶促进DNA解旋并启动DNA复制。 图3. E1和E2结构 (A) HPV18 E1的晶体结构（PDB ID：1R9W，Auuster A.S. 和 Joshua T.L.）。(B) HPV18 E2与其DNA识别序列的复合物结构（PDB ID：1JJ4，Kim S.S. 等人）。标记了关键的DNA结合残基。(C) HPV16 E2转录激活域（TAD）的二聚体结构（单体PDB ID：1DTO，Antson A.A. 等人）。对二聚体化位点重要的残基着色为棕色。二聚体由相同的单体形成。为了清晰起见，显示了形成相互作用界面的选定残基在上下分子中，但所有标记的氨基酸都存在于一个单体的二聚体表面上。放大图中显示了参与Brd4-TAD（PDB ID：2NNU，Abbate E.A. 等人）结合的残基。 5.3.E2的DNA结合域及其DNA结合机制 HPV E2属于形成二聚体β桶的病毒蛋白家族，并使用表面α螺旋进行DNA相互作用。E2由三个结构域组成：（1）保守的N末端转录激活域；（2）C末端DNA结合/二聚化域；以及（3）连接两个域的富含脯氨酸的铰链区。不同HPV类型的E2 DBDs已被结构表征，包括HPV31、 HPV16、与目标DNA复合物的HPV18 E2的晶体结构、HPV6 E2-DBD、以及HPV6a E2-DBD与两个DNA复合物。E2蛋白的整体构象在不同类型和物种中相对保守。单体由两个大约相等长度的重复序列组成，一侧形成四个β链，另一侧形成两个螺旋。二聚体通过β链之间的相互作用发生，主要由两对色氨酸残基之间的疏水相互作用稳定。此外，二聚体中心形成一个由八条反平行链组成的疏水核心，而两个二聚体的四个螺旋排列在核心的外侧（图3B）。 Bose等人利用结构引导设计修改了HPV16 E2的DBD域，替换了二聚体界面上的保守残基。结果，工程化了一个更稳定的异二聚体，并确定了其晶体结构。修改后的E2 DBD显示出增强的基因靶向抑制。研究人员最初使用BPV-E2-DBD和DNA的复合结构模型来分析DNA蛋白相互作用。 E2通过其第一螺旋与DNA的主沟相互作用，而β2-3环则与次沟或磷酸骨架结合。未结合DNA的E2在此位点上是多变的，并在DNA结合时发生“无序到有序”的转变。随后的研究阐明了HPV E2与特定DNA序列结合时的复杂结构（图3B）。进一步分析揭示了E2对不同DNA序列的不同亲和力与其识别灵活性相关，E2与DNA结合的顺序取决于其对多个位点的亲和力和协同性。E2与DNA结合导致主沟和次沟的压缩，引起DNA扭曲。不同类型的E2在DNA结合时引起不同的构象变化，β4的变化可能解释了异源E1E2复合物之间相互作用较弱的原因。 5.4.E2的铰链区和转录激活域 HPV E2的铰链区将DNA结合域（DBD）与转录激活域（TAD）连接起来，在结构上非常灵活。Dellarole等人分析了HPV16 E2的部分截短的铰链区，鉴定了α区域中两个额外的残基——A327和A328。这些残基的修饰并没有显著影响其生物活性。HPV E2的TAD在促进六聚体形成中起着关键作用，通过与E1的相互作用，对转录和复制的调控至关重要。已知高危和低危HPV类型的TAD的晶体结构，包括HPV18、HPV16和HPV11及其与小分子抑制剂的复合物。 E2-TAD由两个域组成：N1和N2。由残基1-92组成的N1域具有三个长的α螺旋，形成一个扭曲的反平行β片结构。N2域（残基110-201）主要由反平行β片结构组成，而残基93-109形成一个连续的螺旋结构，位于N1和N2域之间并作为支点（图3C）。Harris等人观察到一个连接N2域和N1的螺旋，并确定Ile73是转录激活的关键残基，不影响复制。相比之下，Glu39的作用相反，这对E1和E2的相互作用很重要。 在晶体和溶液NMR结构中，E2-TAD形成二聚体（图3C）。TAD的二聚体化增强了DNA环的稳定性，并促进了结合在远端的转录因子重新定位到HPV的转录起始位点。值得注意的是，在低浓度下，E2 TAD与E1相互作用以增强E1与DNA的结合。相比之下，更高的浓度可能促进同源二聚体的形成并启动复制。Y. Wang和同事报告称，醌类抑制剂阻止了E1和E2之间的相互作用。E2-抑制剂复合物的结构分析揭示了抑制剂结合位点的各种侧链运动，导致N1和N2域之间形成一个深的疏水口袋。E2-TAD与Brd4 CTD的N端20个氨基酸的复合物结构也已报告（图3C）。作者开发了一种Brd4-tat融合蛋白，促进HPV-16或HPV-31 DNA从有丝分裂染色体中转移出来，这可能是开发潜伏抑制剂的一个有希望的方法。 6.E6蛋白的结构和功能 多项研究已证明高危HPV的E6蛋白是导致肿瘤发展的首要致癌基因。E6结合许多参与细胞增殖途径的蛋白质，最终导致它们的降解。PDZ结构域长约80-90个氨基酸，由两个α螺旋和多达六个β链组成，形成一个称为αB-bB沟的结合槽。这些结构域在细胞黏附和极性控制中起着至关重要的作用，通常识别特定四氨基酸肽序列，即PDZ结合基序（PBM），X-T/S-X-V，这些基序经常出现在蛋白质的羧基末端。高危HPV的E6包含一个保守的六肽（R-R/T/N/Q-E-T-Q/E-V/L）在其C末端（图4C）。E6肽配体位于PDZ的“底物”沟内。E6的两个R残基与PDZ之间的额外相互作用为PDZ结构域结合提供了竞争优势，可能使病毒能够破坏含有PDZ的肿瘤抑制因子的调控。E6介导了多个含有PDZ结构域的蛋白质的降解，如与黏附连接（AJ）相关的SAP97/Dlg，调节囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）的细胞内运输和定位的CAL，以及与紧密连接（TJ）相关的MAGI-1、MUPP1和ZO-2。此外，非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPN）3、PTPN13和PTPN4被HPV E6识别，E6与PTPN4之间的相互作用主要通过疏水相互作用和氢键介导。由于PDZ结构域与PBM之间的相互作用的重要性，Gogl等人通过定量片段组学分析了PDZ与PBM之间的亲和力，并确定了PDZ与E6和SNTB1的结构。14-3-3蛋白识别在某些序列基序中丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化的蛋白质伴侣，在细胞凋亡、细胞周期或信号转导等广泛过程中很重要。磷酸化的E6 PBM可以与14-3-3家族蛋白相互作用以发挥其致癌功能（图4C）。E6最出名的是通过E6AP蛋白泛素化诱导p53降解，并将p53封存在细胞质中，从而抑制p53信号通路。这导致p53失去其抑癌功能，促进肿瘤增殖，并抑制感染细胞的凋亡。在高危粘膜HPV（hrm-HPV）引起的上皮肿瘤中，E6与E6AP细胞泛素连接酶的LxxLL基序结合。随后，E6/E6AP异二聚体招募并降解p53，而单独的E6或E6AP都不能招募p53。HPV16 E6、E6AP和p53核心域的三聚体复合物的晶体结构揭示了E6AP的LxxLL基序与E6上的p53形成结合槽（图4A）。E6与P53的结合位点与P53与DNA或其他蛋白的结合位点不同。因此，E6可以结合游离的和复合的P53，而不会与细胞因子竞争。尽管E6AP肽的C末端定位在p53核心附近，但该域与p53没有形成实质性的相互作用。Wang等人使用冷冻电镜确定了E6/E6AP/P53全长蛋白复合物的结构（图4B）。该结构揭示了E6AP相互作用界面的更多详细信息。E6AP通过三个主要结合位点与E6相互作用。该结构还证实了E6AP C末端不参与与p53的相互作用，证实了Martinez-Zapie等人的结论。此外，一个体外选择的肽，特别针对HPV16 E6的LxxLL口袋，可以诱导p53招募到E6，表明其他细胞蛋白，除了E6AP之外，也可能结合到LxxLL口袋，从而增强E6与p53之间的相互作用。为了进一步探索E6AP的机制，Wang等人分析了不同状态下的E6/E6AP复合物的结构。他们观察到E6AP的短α-1螺旋通过构象变化控制其非活性单体和活性二聚体之间的转变。结合E6后，E6AP的短α-1螺旋延伸成更长的螺旋结构。延伸的α-1螺旋对称相交，促进二聚体化并促进泛素转移。此外，HPV16E6和IRF3的复合物结构也已发布，其中IRF3主要通过E6的LxxLL口袋与E6AP相互作用。这个结构尚未发表（图4D）。 图4. 与E6和E7相关的结构 (A) E6/E6AP/P53三元复合物（PDB ID：4XR8，Martinez-Zapien D. 等人）。关键残基的侧链在放大图中显示。(B) 具有全长E6AP的E6/E6AP/P53三元复合物（PDB ID：8GCR，Wang J.C.K. 等人）。主要功能位点显示为表面模型，并用灰色箭头标记。(C) HPV E6 PBM与14-3-3 s和PDZ结构域的相互作用。从左至右：14-3-3 s与HPV16 E6 PBM复合物（PDB ID：6TWZ，Gogl G. 等人），CAL PDZ与HPV16 E6 PBM复合物（PDB ID：4JOP，Amacher J.F. 等人），SAP97 PDZ与HPV18 E6 PBM复合物（PDB ID：2I0L，Zhang Y. 等人）。E6序列显示在底部，保守残基着色为橙色。(D) E6/MBP-IRF3复合物（PDB ID：6SJA，Poirson J. 等人）。(E) HPV45 E7 C末端二聚体结构以两种方向显示（PDB ID：2F8B，Ohlenschlager O. 等人）。 7.E7蛋白的结构和功能 HPV E7蛋白是已知的致癌因子，高危HPV的E7被广泛认为是恶性转化的主要驱动因素。HPV E7在各种生物过程中的作用之前已被广泛回顾。E7是一种由大约100个氨基酸组成的酸性磷蛋白，主要定位在细胞核中。在结构上，E7可分为三个域：CR1、CR2和CR3。CR1和CR2都是无序区域，CR2包含LXCXE基序和一个酪氨酸激酶催化位点。CR3包含两个CXXC基序，它们之间由29个氨基酸隔开。 E7主要作为同源二聚体发挥作用，CR3结构域在二聚体化中起着至关重要的作用。Liu等人和Ohlenschlager等人分别报告了HPV1A E7和HPV45 E7中CR3二聚体的晶体结构。E7同源二聚体采用大致球形的形状。E7亚基形成一个扁平结构，具有b1b2a1b3a2的二级结构（图4E）。b1和b2链形成一个反平行扭曲的β折叠，急剧弯曲连接含有四个α螺旋转角的螺旋a1。Ca主链从a1螺旋处直角转弯，形成一个纤细的β链状结构（b3），并以一个短α螺旋结束。CR3中的锌离子结合位点由四个Cys残基配位：两个Cys是b1和b2之间的U型转弯的一部分，另外两个Cys位于a1-a2环和a2螺旋的末端。E7二聚体化是通过b1-b2-a1表面与相应亚基的b2和b3链之间的β折叠之间的相互作用介导的。E7的CR2结构域是无序的。与E7相关的首个结构在1998年被报道：由HPV16E7 CR2结构域的9个氨基酸残基的肽段和视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白（pRB）形成的复合物（图4F）。视网膜母细胞瘤（RB）肿瘤抑制基因对细胞周期的调节至关重要，主要在G1-S转换期间，包括抑制E2F转录因子。E7与pRB的结合位点与CDK2和转录因子TFIIB的结合位点非常接近，表明E7不会直接与E2F竞争pRB以抑制E2Fs。Liu等人提出E7蛋白通过其LXCXE基序和CR3结构域介导pRB从E2F转录因子的解离，其中一个E7 CR3二聚体表面与pRB结合，而另一个对E2Fs结合至关重要的表面破坏了pRB-E2Fs复合物。DREAM复合物是一个高度保守的复合物，包含DP、RB样、E2F和MuvB蛋白。DREAM在G0期与许多人类启动子结合，并且需要抑制E2F靶基因。HPV16 E7蛋白也破坏了由口袋家族蛋白p107形成的DREAM复合物（图4G）。来自HPV16 E7 CR2结构域的9个氨基酸残基的肽段与P107的结合位点与pRB中的相同。这种复合物结构为E7与口袋家族蛋白之间的相互作用提供了进一步的结构和机制见解。E7的C末端结构域独立于pRB诱导肿瘤发展。Yun等人报告了HPV18E7的CR3二聚体与PTPN14的复合物结构，并观察到E7与PTPN14的催化域之间的直接相互作用（图4H）。PTPN14是肿瘤抑制性p53-PTPN14-yes相关蛋白（YAP）轴的一部分。HPV18E7和PTPN14之间的复合物形成是通过HPV18E7的C末端结构域的a1和b1与PTPN14的PTP结构域的b5、b6、b7和a4之间的疏水相互作用介导的。MHC I类“单链三聚体”分子是由MHC重链、β2-微球蛋白和特定肽段组成的单条多肽链，并且在研究中广泛使用。Finton等人描述了HLA单链三聚体设计对不同肽段展示及其稳定性的影响，包括HPV16 E7。他们报告了融合蛋白和与晶体化分子伴侣复合物的结构：重链抗体的可变域（VHHs）。这项研究表明，工程化的MHC I类单链三聚体具有稳定的多肽展示能力，HPV E7作为模型肽的潜力。为了避免冗余，展示了两个结构，一个带有VHH，一个不带VHH（图4I）。 8.HPV的预防和治疗 HPV的预防和治疗需要针对HPV感染和恶性转化阶段的药物。预防性和治疗性疫苗目前是HPV预防和靶向治疗的主要策略。预防性疫苗诱导针对病毒衣壳蛋白L1和L2的抗体。全球有六种HPV预防性疫苗可供商业使用，它们利用VLPs。尽管这些疫苗对有限数量的HPV类型有效，但它们不能保证完全预防与HPV相关的癌症。尽管L2的结构和位置不确定，但其中和表位在皮肤和粘膜病毒类型中显示出高度保守性，为开发广谱疫苗提供了机会。当前临床L2疫苗显示全长L2，RG-1抗体表位（氨基酸17-36）或类似表位。预防性疫苗对已经发展为与HPV相关癌症的个体无效。治疗性HPV疫苗（TxV）旨在通过将HPV早期蛋白传递给抗原呈递细胞（APCs），特别是树突状细胞（DCs），以引发强烈的免疫反应，清除持续的高风险HPV感染或诱导癌前病变的回归。大多数治疗性疫苗目前处于临床I/II阶段，HPV靶向治疗性疫苗的开发仍然是一个重大挑战。从疫苗刺激的T细胞反应的角度来看，包含覆盖T细胞表位的免疫原被认为是最佳的。需要更广泛的抗原靶向策略来治疗HPV阳性癌症和清除持续性癌前感染。除了E6和E7，E1和E2在病毒基因组整合之前的早期感染阶段高度表达。这些早期HPV蛋白的结构揭示了它们的关键功能位点，这对疫苗设计很重要。为了减轻疫苗中包含早期蛋白的安全问题，这些免疫原被修改为失活其致癌功能。例如，Auster等人证明HPV18 E1突变体K237A的DNA结合能力几乎完全被废除，指导相应免疫原的修改。然而，重要的是要认识到E6和E7蛋白显示出较低的序列保守性，导致不同HPV类型的致癌潜力不同。这强调了进一步结构研究的重要性。 9.结束语和未来展望 HPV L1的晚期蛋白对疫苗开发很重要。仍然需要对二级衣壳蛋白L2进行进一步的结构表征。需要对全长早期HPV蛋白E1和E2进行进一步的结构洞察，以更好地了解HPV生命周期的早期阶段。关于E6和E7蛋白，现有的结构信息（表1）不足以完全解释这些癌蛋白的多样化致癌机制。对不同HPV类型的E6和E7癌蛋白进行分析和比较，将更好地理解关键位点和致癌机制。正在进行的研究正在揭示E5蛋白的不同剪接变体的作用以及E1-E4和E2-E8等组合。虽然有效的预防性疫苗是可用的，但迫切需要开发治疗性HPV疫苗。对HPV结构生物学的更深入理解将有助于识别进一步的有前途的表位，以指导未来的疫苗设计。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

OTC2024类器官前沿应用与3D细胞培养论坛圆满落幕，点击图片可查看会后报告，咨询OTC2025类器官论坛请联系：王晨 180 1628 8769 丨猎药人俱乐部研究团队整理 一半火焰，一半海水，小核酸药物以及核酸递送新技术的出现，带给疾病新的破解方式，但仍难逃创新药研发的九死一生定律。根据cortellis统计，迄今为止小核酸领域共有194款药物终止研发、826款药物18个月以上未报告进展，另有十余款药物处于暂停/撤市状态。 目前处在活跃状态的小核酸管线仅占历史所有管线的不足1/4，其中进入临床阶段的管线仅有312个，占所有管线的28.8%。 全球小核酸管线阶段分布 “活跃”筛选条件：cortellis、insight数据库中18个月内有进展的小核酸管线，去掉暂停/停止/未报告进展/非积极的项目 在这真正活跃的312条小核酸管线中，我们能挖掘哪些信息？哪些企业是真正活跃管线的拥有者？又有哪些管线有成为重磅药物的潜力？ 01 全球小核酸活跃管线共计312条，siRNA和ASO各占1/3 全球312条临床阶段小核酸活跃管线中，临床II期以上阶段的管线已占比超过50%，其中有两条管线处于NDA阶段，分别为赛诺菲/Alnylam的治疗血友病的小干扰RNA（siRNA）疗法fitusiran，和Ionis用于降脂的反义寡核苷酸（ASO）疗法olezarsen。 全部active项目中，NDA阶段有2个，Phase 3 阶段有22个，Phase 2 阶段有141个，Phase 1 Clinical有133个，Clinical有14个。 从药物类型来看，siRNA和ASO依然是占比最多的管线，分别有109条（35%）active的siRNA管线和105条（34%）active的ASO管线，且分别有一款药物处于申请上市阶段。 临床阶段活跃小核酸类型分布 siRNA和ASO管线数量相差不大，但是临床阶段分布情况差别较大，ASO大多数临床项目处于临床中后期，而siRNA的管线则主要分布在临床早期。 02 三巨头Active项目数量遥遥领先，中国两家新药企业挤进TOP10 拥有临床阶段小核酸active管线数量TOP10企业分别为Ionis（24条）、Arrowhead（14条）、Alnylam（13条）、罗氏（7条）、再生元（7条）、瑞博生物（6条）、渤健（6条）、礼来（6条）、阿斯利康（5条）、GSK（5条）、舶望制药（5条）。 值得一提的是，瑞博生物和舶望制药两家中国创新药企业挤进了全球小核酸active管线TOP10企业中。 这些小核酸active管线TOP10企业可以大致划分成三种：一类企业拥有丰富的技术积累和管线储备，例如小核酸三巨头Ionis、Arrowhead、Alnylam多年深耕小核酸技术，在Active项目管线储备和技术能力上遥遥领先；此外， 随着MNC小核酸争夺战进入白热化，MNC也挤进这一榜单，小核酸未来的商业化战场少不了大药企的比拼；最后，从我国企业舶望制药的身上，我们看到了年轻的新锐企业也可以凭借优异的执行效率，快速推进多个项目取得active进展。 03 国内小核酸赛道活跃企业35家，一半扎根国内，一半海外申报 全球小核酸active项目所涉及的企业共有255个（包括原研和引进企业），其中：中国企业有35个，美国企业有115个，欧洲有61个，其他有44个。中国企业作为原研的管线数量为41个，其中有一半（53.7%）进行了 海外申报。 国内企业除瑞博生物（6条）和舶望制药（5条）以外，active管线数量较多的企业还包括圣诺医药（3条）、维亚臻生物（3条）、圣因生物（3条）。 04 13款值得关注的小核酸药物 1）预计下半年获批：2款 Ionis：Olezarsen 作用机制:ApoC3抑制剂 适应症:家族性乳糜微粒血症综合征（FCS）2030年销售额预测：3.99亿美元 Olezarsen是一种ASO疗法，能够抑制机体产生ApoC3。ApoC3是一种在肝脏中产生、调节血液中甘油三酯（TG）代谢的蛋白。Balance临床3期试验结果显示，FCS患者每四周接受一次80 mg olezarsen皮下注射治疗，患者的TG水平持续显著降低（经安慰剂调整），治疗6个月降幅为44%；治疗第6个月到第12个月期间降低59%；经安慰剂调整后的apoC3降幅在接受治疗6个月时为74%，在12个月时为81%。美国FDA已接受olezarsen用于治疗FCS成人患者的新药申请（NDA）并授予优先审评资格，预计在2024年12月19日前完成审评。Ionis还计划在今年在欧盟和加拿大递交监管申请。根据cortellis预测，Olezarsen 2030年销售额有望达到3.99亿美元。 赛诺菲/Alnylam：Fitusiran 作用机制:抗凝血酶III抑制剂 适应症:血友病A与血友病B2030年销售额预测：2.98亿美元 Fitusiran是一款小干扰RNA（siRNA）疗法，旨在作为体内产生/未产生凝血因子抑制物的血友病A或血友病B患者的预防性治疗。Fitusiran可降低抗凝血酶水平，从而促进凝血酶生成，重新平衡止血功能并预防出血。在两项3期临床研究中，与对照组相比，每月一次皮下注射fitusiran预防治疗组患者的年化出血率降低了90%。Fitusiran注射液的上市申请已于2024年5月获得中国国家药监局（NMPA）受理，并于6月获得美国FDA受理。根据cortellis预测，Fitusiran 2030年销售额有望达到2.98亿美元。 2）销售预测＞10亿美元的潜力重磅药物：5款Arrowhead：ARO-ANG3 作用机制：ANGPTL3抑制剂 适应症：血脂异常、家族性高胆固醇血症（FH）、高甘油三酯血症（HTG） 未来收入预测：销售峰值45亿美元（根据Zacks Investment Research） ARO-ANG3是公司开发的一款靶向血管生成素样蛋白3（ANGPTL3）的RNAi疗法，被开发用于治疗血脂异常、家族性高胆固醇血症（FH）、高甘油三酯血症（HTG）。2024年5月在《新英格兰医学杂志》上发表的一项2期试验评估了zodasiran治疗混合性高脂血症的效果。结果显示Zodasiran在混合型高脂血症患者中显示出显著降低TG、非HDL-C、载脂蛋白B和LDL-C水平的效果。其疗效呈现出剂量依赖性，200 mg剂量组的疗效最为显著。此外，Zodasiran治疗还与肝脏脂肪含量的减少相关。Zodasiran的整体安全性良好，未发现与药物相关的严重不良事件，但需注意在已存在糖尿病的患者中可能出现的糖化血红蛋白水平升高问题。 不过，根据Firece网站的最新报道，在资金流的压力下，Arrowhead Pharmaceuticals正在面临对两款心脏代谢疾病候选药物进行抉择，他们暂时需要放弃zodasiran，以便能全力支持另一个候选药物plzasiran的开发。不过，虽然Arrowhead计划倾全司之力在2025年将plzasiran推向市场，但仍希望能找到一个合作伙伴，来开发已经失去优先地位的zodasiran。 Ionis/诺华：Pelacarsen 作用机制：LP(a)抑制剂 适应症:主动脉瓣狭窄;心血管疾病;高脂蛋白血症2030年销售额预测：25.78亿美元 Pelacarsen是一款反义寡核苷酸（ASO）药物，靶向Apo(a) mRNA，抑制其翻译成脂蛋白(a)的蛋白。其原研是IONIS，2019年和Norvartis达成合作协议共同开发。2023年初，Royalty Pharma买入IONIS持有的Pelacarsen的剩余权益的25%。目前Pelacarsen已完成I期与II期的临床研究。II期研究表明，Pelacarsen 20 mg QW降低Lp(a)最高可达80%，80mg/月的给药剂量可使98%的患者Lp(a)水平降至50 mg/dL以下。 III期试验（NCT04023552）主要观察其对心血管疾病患者的主要心血管事件的影响，该临床试验正在进行中。Pelacarsen将有望成为首个靶向强效降低脂蛋白(a)并带来心血管获益的药物。根据cortellis预测，Pelacarsen2030年销售额有望达到25.78亿美元。 Avidity：Delpacibart etedesiran 作用机制：DMPK抑制剂 适应症:DM1 2030年销售额预测：20.69亿美元 Delpacibart etedesiran（Del-desiran，AOC 1001）是一款anti-TfR1抗体偶联寡核苷酸，含有可以结合TfR1的单抗以及偶联靶向DMPK mRNA的siRNA（siDMPK.19）。TfR1抗体能够有效将AOC 1001递送到骨骼肌和心肌细胞，siRNA成分siDMPK.19则能够降低DMPK mRNA水平，进而减少细胞核中的CUG，释放MBNL，恢复正常的mRNA加工。 AOC1001治疗DM1的I/II期MARINA试验和MARINA-OLE试验最新数据显示，与END-DM1自然疾病历史数据相比，接受delpacibart etedesiran治疗的患者在多个功能指标的疾病进展出现逆转，患者的肌强直、肌肉力量和活动能力都显著改善，且安全性和耐受性良好，超过200次输注总计46.2患者年的暴露量。美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）已授予del-desiran 孤儿药认定，FDA 还授予了del-desiran 快速通道认定和突破性疗法认定。 三期 HARBOR 试验的目的是进一步评估 AOC 1001的疗效，使用的终点包括视频手开合时间(VHOT)、肌肉力量和日常活动能力，三期数据预计在2026年读出。根据cortellis预测，Delpacibart etedesiran 2030年销售额有望达到20.69亿美元。 Ultragenyx：GTX-102 作用机制：UBE3A抑制剂 适应症:天使综合征2030年销售额预测：16.13亿美元 GTX-102是一款鞘内给药的在研反义寡核苷酸新药，旨在靶向和抑制UBE3A反义（UBE3A-AS）转录本的表达，同时激活神经元细胞中父系UBE3A的等位基因表达，产生患者体内所缺失的关键蛋白产物。该药物用于治疗天使综合征，这是由UBE3A基因缺失或突变导致的罕见性神经遗传疾病，患者会出现发育迟缓，平衡障碍、运动障碍以及癫痫发作等情况，大多不会说话。天使综合征经常被误诊为自闭症或脑瘫。目前尚未批准用于该疾病的疗法上市。 4月15日，Ultragenyx Pharmaceutical宣布了其用于治疗天使综合征（Angelman syndrome）的在研疗法GTX-102在1/2期临床试验中取得积极数据：接受GTX-102治疗的扩展队列A和B的患者，在第170天显示出具有临床意义的多领域功能改善。部分剂量递增队列患者在第758天显示出长期和持续的临床益处，远超过自然历史数据。根据cortellis预测，GTX-102在2030年销售额有望达到16.13亿美元。 再生元/Alnylam：Cemdisiran 作用机制：C5抑制剂 适应症:IgA肾病2030年销售额预测：11.67亿美元 Cemdisiran为一款再生元与Alnylam联合开发的C5靶向siRNA疗法。在IgA肾病中，补体系统的异常激活会导致过敏毒素C3a和C5a以及攻膜复合物C5b-9的过量产生，这些物质会损害肾小球结构。Cemdisiran通过精准靶向补体途径的关键成分——C5补体蛋白，有效阻断补体通路的激活，进而降低对肾脏的损害，并显著减少蛋白尿的排泄。 Cemdisiran 治疗IgA肾病的II期试验结果表明其可抑制肝脏中C5的产生，并能显著降低IgA肾病患者的尿蛋白水平。2024年8月13日，III期临床试验（R3918-MG-2018）完成首例给药。根据cortellis预测，cemdisiran2030年销售额有望达到11.67亿美元。 3）其他值得重点关注的重磅「活跃」药物 Arrowhead：plozasiran 作用机制：ApoC3抑制剂 适应症:I型高脂蛋白血症;高甘油三酯血症;脂质代谢紊乱2030年销售额预测：6.67亿美元 Plozasiran（ARO-APOC3）是Arrowhead公司首款研究性RNA干扰(RNAi)治疗药物，是一款靶向APOC3基因的潜在“first-in-class”RNAi疗法。Plozasiran治疗目标是通过下调APOC3降低甘油三酯水平，并将脂质恢复到更正常的水平。在多项临床研究中，plozasiran显示可降低FCS、严重高甘油三酯血症（SHTG）和混合性高脂血症患者的甘油三酯和多种致动脉粥样硬化脂蛋白。 2024年9月，Arrowhead Pharmaceuticals公布plozasiran用于治疗家族性乳糜微粒血症综合征（FCS）患者的3期PALISADE研究结果。分析显示，试验成功达到主要终点和所有关键次要终点，plozasiran使患者的甘油三酯（TG）、载脂蛋白C-III（APOC3）水平显著下降，并使急性胰腺炎（AP）的发病率显著降低。基于该试验积极数据，Arrowhead打算在2024年底前向美国FDA提交plozasiran的新药申请，并计划随后向其他全球监管机构寻求批准。 Wave Life Sciences：WVE-003 作用机制：HTT抑制剂 适应症：亨廷顿病2030年销售额预测：4.52亿美元 亨廷顿病是由于编码亨廷顿蛋白的HTT基因上出现CAG扩增，导致生成的亨廷顿蛋白突变体（mHTT）产生神经毒性。野生型亨廷顿蛋白对正常神经元功能也具有重要作用，因此HTT基因的突变不但增加了mHTT的产生，也降低了正常蛋白的水平，导致神经突触功能失常、细胞死亡和神经退行性病变。WWE-003是一款潜在“first-in-class”等位基因特异性RNAi疗法，它选择性结合表达mHTT的mRNA，在降低突变蛋白表达的同时，不影响野生型蛋白的表达。 6月26日，Wave Life Sciences宣布，在研疗法WVE-003在治疗亨廷顿病（HD）的1b/2a期临床试验SELECT-HD中取得了积极成果。数据显示，WVE-003总体安全性和耐受性良好，没有报告严重不良事件（SAEs），脑室体积与自然历史一致。在28周评估期间观察到WVE-003组患者显著的mHTT蛋白水平降低，支持每季度或更少频率的给药。在28周评估期间，wtHTT蛋白水平得到维持，验证了等位基因选择性沉默。此外，与安慰剂相比，wtHTT蛋白水平显著增加。 Ionis：donidalorsen 作用机制：激肽释放酶（PKK）抑制剂 适应症:遗传性血管性水肿（HAE）2030年销售额预测：3.90亿美元 Donidalorsen是一款潜在“first-in-class”的RNA反义寡核苷酸配体偶联（LICA）药物，旨在精确靶向以沉默前激肽释放酶（PKK）的表达，中断导致遗传性血管性水肿（HAE）发作的通路。PKK在激活与HAE急性发作相关的炎症介质中起重要作用。通过沉默PKK的产生，donidalorsen可能是治疗HAE的有效预防方法。IONIS授权日本大冢制药负责亚太地区和欧洲的特定区域开发、监管备案和商业化。 今年6月，Ionis公布了donidalorsen在治疗遗传性血管性水肿（HAE）的3期临床试验OASIS-HAE和OASISplus中的积极成果：donidalorsen以每月和每两月的给药方案进行治疗，一年后患者的HAE发作频率显著且持续降低超过90%；从其他预防性治疗转换至donidalorsen治疗的患者，其月均HAE发作率相较于基线进一步降低了62%，其中84%的患者更倾向于使用donidalorsen。Ionis 计划今年向美国食品药品管理局（FDA）提交新药申请，如获批准，将在美国独立上市donidalorsen。 Alnylam/罗氏：zilebesiran 作用机制：血管紧张素原配体抑制剂 适应症:高血压2030年销售额预测：3.12亿美元 Zilebesiran（ALN-AGT01）是一种皮下给药、靶向血管紧张素原（AGT）的在研RNAi治疗药物。AGT是肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）中最上游的靶点，该级联反应已被证实在血压调节中发挥作用，其抑制具有明确的抗高血压作用。 zilebesiran的KARDIA-2临床研究数据表明：对于高血压控制不佳患者，zilebesiran与标准降压药联用，可带来额外的降压获益，降压效果可维持6个月。KARDIA-3 Ⅱ期研究(NCT06272487)已经启动，将评估zilebesiran对经2~4个标准降压药物治疗后血压仍不能有效控制的高血压患者的有效性和安全性，这些高血压患者同时存在慢性肾功能不全，或心血管疾病高危风险。根据cortellis预测，zilebesiran 2030年销售额有望达到3.1亿美元。 PepGen：PGN-EDO51 作用机制：外显子51跳跃疗法 适应症:DMD2030年销售额预测：2.79亿美元 PGN-ED051专门设计用于跳过外显子51，能够帮助大约13%的DMD患者。PepGen认为与现有药物相比，PGN-ED051的不同之处在于它使用了该公司专有的增强递送寡核苷酸技术，将药物直接递送至肌肉细胞，可以更有效地跳过外显子：与所有已获批准药物和已知开发中的候选药物相比，根据公开的跨研究数据，PGN-EDO51在灵长类动物的骨骼肌和隔膜中实现了最高的第51外显子跳跃水平，并且此效果在安全的剂量范围内获得。 今年8月，PepGen发布了其新式候选药物PGN-EDO51的积极临床数据：5mg/kg剂量的PGN-EDO51在三个月给药后，能使患者的外显子跳跃水平高于类似PMO剂量水平的其他寡核苷酸疗法。同时，此药物在肌肉调整后的肌营养不良蛋白水平上，也表现出较基线的显著增长。该公司计划在今后的试验中继续评估PGN-EDO51的疗效，并将着力于推动其二期试验CONNECT2-EDO51的开展。他们期待在更高剂量（10 mg/kg）中观察到更高水平的肌营养不良蛋白产生。 Idera Pharmaceuticals：Tilsotolimod 作用机制：TLR9激动剂 适应症：黑色素瘤2030年销售额预测：/ 在先天性免疫反应的过程中，TLR9扮演着举足轻重的角色，尤其在向肿瘤组织募集T细胞的过程中发挥着关键作用。这一靶点深藏于细胞内部，这使得TLR9激动剂的开发面临重重挑战，以寡核苷酸为药物形式的TLR9激动剂正逐渐成为研究热点。 Tilsotolimod 是一种在研合成 Toll 样受体 9 (TLR9) 激动剂，由Idera Pharmaceuticals开发，获得了美国FDA的快速通道，联合Ipilimumab用于治疗抗PD-1抗体难治性黑色素瘤，以及孤儿药物资格指定用于治疗IIb-IV期黑色素瘤。在I/II期临床试验中，ORR为22%，疾病控制率为71%，中位总生存期(OS)为21个月。目前处于黑色素瘤的关键3期临床（NCT03445533）阶段。 全球三期以上active小核酸管线 （完整名单欢迎私聊后台免费领取~） 参考资料： 公司官网 insight数据库 cortellis数据库 END 免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 OTC2024类器官前沿应用与3D细胞培养论坛圆满落幕，点击图片可查看会后报告，咨询OTC2025类器官论坛请联系：王晨 180 1628 8769

Second quarter total revenue of $147 million, Crysvita® revenue of $114 million and Dojolvi® revenue of $19 million Increased 2024 expected total revenue guidance to $530 million to $550 million NOVATO, Calif., Aug. 01, 2024 (GLOBE NEWSWIRE) -- Ultragenyx Pharmaceutical Inc. (NASDAQ: RARE), a biopharmaceutical company focused on the development and commercialization of novel therapies for serious rare and ultrarare genetic diseases, today reported its financial results for the quarter ended June 30, 2024. “Our strong financial performance in the second quarter was driven by growing revenue across our commercial therapies from increasing global demand, leading us to raise our total revenue guidance for this year,” said Emil D. Kakkis, M.D., Ph.D., chief executive officer and president of Ultragenyx. “In the quarter, we also reported positive data from our Phase 1/2 study in Angelman syndrome, our Phase 2/3 study in osteogenesis imperfecta, and our Phase 3 study in GSDIa. We are in an excellent position to achieve additional key milestones in the second half of the year including initiating our Phase 3 Angelman study and filing for accelerated approval for UX111 in Sanfilippo syndrome type A.” Second Quarter 2024 Selected Financial Data Tables and Financial Results Revenues (dollars in thousands), (unaudited) Three Months Ended June 30, Six Months Ended June 30, 2024 2023 2024 2023 Crysvita Product sales$40,449 $16,884 $76,690 $38,118 Revenue in Profit-Share Territory 67,045 61,314 107,447 111,220 Royalty revenue in European Territory 6,176 4,816 12,118 9,698 Total Crysvita Revenue 113,670 83,014 196,255 159,036 Dojolvi 19,355 16,491 35,717 30,794 Mepsevii 6,145 8,439 12,756 16,919 Evkeeza 7,856 365 11,131 577 Daiichi Sankyo — — — 1,479 Total revenues$147,026 $108,309 $255,859 $208,805 Total RevenuesUltragenyx reported $147 million in total revenue for the second quarter of 2024, which represents 36% growth compared to the same period in 2023. Second quarter 2024 Crysvita revenue was $114 million, which represents 37% growth compared to the same period in 2023. This includes product sales of $40 million from Latin America and Turkey, which represents 140% growth compared to the same period in 2023. Dojolvi revenue in the second quarter 2024 was $19 million, which represents 17% growth compared to the same period in 2023. Evkeeza revenue in the second quarter 2024 was $8 million, as demand continues to build in the company’s territories outside of the United States. Selected Financial Data (dollars in thousands, except per share amounts), (unaudited) Three Months Ended June 30, Six Months Ended June 30, 2024 2023 2024 2023 Total revenues$147,026 $108,309 $255,859 $208,805 Operating expenses: Cost of sales 21,280 9,914 38,813 22,171 Research and development 161,503 164,949 339,990 330,647 Selling, general and administrative 80,604 81,403 158,764 158,049 Total operating expenses 263,387 256,266 537,567 510,867 Net loss$(131,598) $(159,828) $(302,282) $(323,800)Net loss per share, basic and diluted$(1.52) $(2.25) $(3.54) $(4.58) Operating Expenses Total operating expenses for the second quarter of 2024 were $263 million, including non-cash stock-based compensation of $39 million. In 2024, annual operating expenses are expected to be stable or to decrease as the company continues to manage its costs and focus its investment on advancing multiple Phase 3 programs and executing on commercial product launches. Net Loss For the second quarter of 2024, Ultragenyx reported net loss of $132 million, or $1.52 per share basic and diluted, compared with a net loss for the second quarter of 2023 of $160 million, or $2.25 per share basic and diluted. Net Cash Used in Operations and Cash BalanceFor the three months ended June 30, 2024, net cash used in operations was $77 million and for the six months ended June 30, 2024 it was $268 million. Cash, cash equivalents, and marketable debt securities were $874 million as of June 30, 2024, which includes $381 million of net proceeds from issuance of common stock and pre-funded warrants in connection with an underwritten public offering in June 2024. 2024 Full Year Financial Guidance Total revenue guidance increased to be in the range of $530 million to $550 million (previously $500 million to $530 million)Crysvita revenue expected to be towards the upper end of the range of $375 million to $400 million. This includes all regions where Ultragenyx will recognize revenue: product sales in Latin America and Turkey, royalties in Europe, which have been ongoing, and royalties in North America, which began in April 2023.Dojolvi revenue in the range of $75 million to $80 millionNet Cash Used in Operations less than $400 million Recent Updates and Clinical Milestones UX143 (setrusumab) monoclonal antibody for Osteogenesis Imperfecta (OI): 14-month data resulted in a large, sustained 67% reduction in annualized fracture rate and persistent median annualized fracture rate of 0.00 (p=0.0014)Positive 14-month results from the Phase 2 portion of the ongoing Phase 2/3 Orbit study demonstrated that, as of the May 24, 2024 data cut-off date, treatment with setrusumab continued to significantly reduce incidence of fractures in patients with OI. Treatment with setrusumab also resulted in ongoing and meaningful improvements in lumbar spine bone mineral density (BMD) at month 12 without evidence of plateau. The median annualized rate of radiologically confirmed fractures across all 24 patients in the 2 years prior to treatment was 0.72. Following a mean treatment duration period of 16 months, the median annualized fracture rate was reduced 67% to 0.00 (p=0.0014; n=24). The reduction in annualized fracture rates was associated with continued, clinically meaningful increases in BMD. Treatment with setrusumab at 12-month demonstrated a mean increase in lumbar spine BMD from baseline of 22% (p<0.0001, n=19) and an improvement of mean baseline lumbar spine BMD Z-score from -1.73 to -0.49 at 12 months. The improvements in BMD and Z-scores were significant and consistent across all OI sub-types studied. As of the data cut-off, there were no treatment-related serious adverse events observed in the study and there were no reported hypersensitivity reactions related to setrusumab. More detailed 14-month data will be presented at a future scientific meeting. GTX-102 antisense oligonucleotide for Angelman syndrome: Successful End-of-Phase 2 (EOP2) meeting with Food and Drug Administration (FDA); on track to initiate Phase 3 by the end of the yearIn July 2024, Ultragenyx completed a successful EOP2 meeting with the FDA supporting the pivotal Phase 3 Aspire study design, which will be a global, randomized, double-blind, sham-controlled trial and will include a 48-week primary efficacy analysis period enrolling approximately 120 patients with Angelman syndrome with a genetically confirmed diagnosis of full maternal UBE3A gene deletion. The primary endpoint will be improvement in cognition assessed by Bayley-4 cognitive raw score. The key secondary endpoint will be the Multi-domain Responder Index (MDRI) across all five domains of cognition, receptive communication, behavior, gross motor function, and sleep. Individual secondary endpoints were also discussed and aligned on with the FDA for the domains of communication, behavior, motor function and sleep. Additionally, the company plans to initiate Aurora, an open-label clinical study, to evaluate the safety and efficacy of GTX-102 for the treatment of patients with other Angelman syndrome genotypes and in other age groups. The company has also participated in a PRIME meeting with the European Medicines Agency, receiving acceptance of the overall Phase 3 study design, dosing and evaluations and has met with Japan’s Pharmaceuticals and Medical Devices Agency to inform and discuss its Phase 3 study design. The company expects the pivotal Phase 3 Aspire study to start by the end of 2024 and the Aurora study to start in 2025. UX701 AAV gene therapy for Wilson disease: Last patient in Cohort 3 dosed; expect interim Stage 1 data in the second half of 2024All patients in the three dose-escalation cohorts of Stage 1 have been dosed. During Stage 1, the safety and efficacy of UX701 will be evaluated and a dose will be selected for further evaluation in Stage 2, which is the pivotal, randomized, placebo-controlled stage of the study. Data from Stage 1 are expected in the second half of 2024, which will be followed by dose selection and initiation of Stage 2. UX111 AAV gene therapy for Sanfilippo syndrome type A (MPS IIIA): Agreement reached with FDA that cerebral spinal fluid (CSF) heparan sulfate (HS) can be used as a reasonable surrogate endpoint for accelerated approvalIn June 2024, Ultragenyx announced a successful meeting with the FDA during which the company reached agreement with the FDA that CSF HS is a reasonable surrogate endpoint that could support submission of a biologics license application, or BLA, seeking accelerated approval for UX111. As discussed with the FDA, the BLA filing will be based on the available data including from the ongoing pivotal Transpher A study evaluating the safety and efficacy of UX111 in children with MPS IIIA. The details of a BLA will be finalized with the FDA in a pre-BLA meeting that is expected to happen in the second half of 2024, with the intent to file the application late this year or early next year. DTX401 AAV gene therapy for Glycogen Storage Disease Type Ia (GSDIa): Positive top-line results from Phase 3 Study resulted in a statistically significant reduction in daily cornstarch intake at Week 48 (p<0.0001) with maintenance of glucose control In May 2024, Ultragenyx announced positive topline results from the Phase 3 GlucoGene study for the treatment of patients aged eight years and older. The study achieved its primary endpoint, demonstrating that treatment with DTX401 resulted in a statistically significant and clinically meaningful reduction in daily cornstarch intake compared with placebo at Week 48. The mean percent reduction was 41.3% in the DTX401 group (n=20) compared with 10.3% in the placebo group (n=24) at Week 48 (p<0.0001). Across patients treated with DTX401, the mean reduction in cornstarch continued to decline over the 48-week period. In the treatment group, all patients achieved a reduction in cornstarch, with 68% achieving ≥30% reduction and 37% achieving ≥50% reduction compared to the placebo group, which achieved the same reductions in 13% and 4% of patients, respectively, at Week 48. The study also successfully met key secondary endpoints of reduction in the number of cornstarch doses per day and maintenance of glucose control at Week 48. Full 48 Week data from the Phase 3 study will be presented at a scientific conference later this year. These results will be discussed with regulatory authorities to support a marketing application in 2025. DTX301 AAV gene therapy for Ornithine Transcarbamylase (OTC) Deficiency: Phase 3 study dosing patients; expect enrollment to be completed in the second half of 2024Ultragenyx is randomizing and dosing patients in the ongoing Phase 3 study. The pivotal, 64-week study will include approximately 50 patients, randomized 1:1 to DTX301 or placebo. The primary endpoints are response as measured by removal of ammonia-scavenger medications and protein-restricted diet and change in 24-hour ammonia levels. Enrollment is currently expected to be completed in the second half of 2024. Conference Call and Webcast Information Ultragenyx will host a conference call today, Thursday, August 1, 2024, at 2 p.m. PT/5 p.m. ET to discuss the second quarter 2024 financial results and provide a corporate update. The live and replayed webcast of the call will be available through the company’s website at https://ir.ultragenyx.com/events-presentations. The replay of the call will be available for one year. About Ultragenyx Ultragenyx is a biopharmaceutical company committed to bringing novel therapies to patients for the treatment of serious rare and ultrarare genetic diseases. The company has built a diverse portfolio of approved medicines and treatment candidates aimed at addressing diseases with high unmet medical need and clear biology, for which there are typically no approved therapies treating the underlying disease. The company is led by a management team experienced in the development and commercialization of rare disease therapeutics. Ultragenyx’s strategy is predicated upon time- and cost-efficient drug development, with the goal of delivering safe and effective therapies to patients with the utmost urgency. For more information on Ultragenyx, please visit the company's website at: www.ultragenyx.com. Forward-Looking Statements and Use of Digital Media Except for the historical information contained herein, the matters set forth in this press release, including statements related to Ultragenyx's expectations and projections regarding its future operating results and financial performance, anticipated cost or expense reductions, the timing, progress and plans for its clinical programs and clinical studies, future regulatory interactions, and the components and timing of regulatory submissions are forward-looking statements within the meaning of the "safe harbor" provisions of the Private Securities Litigation Reform Act of 1995. Such forward-looking statements involve substantial risks and uncertainties that could cause our clinical development programs, collaboration with third parties, future results, performance or achievements to differ significantly from those expressed or implied by the forward-looking statements. Such risks and uncertainties include, among others, the uncertainty of clinical drug development and unpredictability and lengthy process for obtaining regulatory approvals, risks related to serious or undesirable side effects of our product candidates, the company’s ability to achieve its projected development goals in its expected timeframes, risks related to reliance on third party partners to conduct certain activities on the company’s behalf, our limited experience in generating revenue from product sales, risks related to product liability lawsuits, our dependence on Kyowa Kirin for the commercial supply of Crysvita, fluctuations in buying or distribution patterns from distributors and specialty pharmacies, the transition back to Kyowa Kirin of our exclusive rights to promote Crysvita in the United States and Canada and unexpected costs, delays, difficulties or adverse impact to revenue related to such transition, smaller than anticipated market opportunities for the company’s products and product candidates, manufacturing risks, competition from other therapies or products, and other matters that could affect sufficiency of existing cash, cash equivalents and short-term investments to fund operations, the company’s future operating results and financial performance, the timing of clinical trial activities and reporting results from same, and the availability or commercial potential of Ultragenyx’s products and drug candidates. Ultragenyx undertakes no obligation to update or revise any forward-looking statements. For a further description of the risks and uncertainties that could cause actual results to differ from those expressed in these forward-looking statements, as well as risks relating to the business of Ultragenyx in general, see Ultragenyx's Quarterly Report on Form 10-Q filed with the Securities and Exchange Commission (SEC) on May 3, 2024, and its subsequent periodic reports filed with the SEC. In addition to its SEC filings, press releases and public conference calls, Ultragenyx uses its investor relations website and social media outlets to publish important information about the company, including information that may be deemed material to investors, and to comply with its disclosure obligations under Regulation FD. Financial and other information about Ultragenyx is routinely posted and is accessible on Ultragenyx’s Investor Relations website (https://ir.ultragenyx.com/) and LinkedIn website (https://www.linkedin.com/company/ultragenyx-pharmaceutical-inc-/mycompany/). Contacts Ultragenyx Pharmaceutical Inc.InvestorsJoshua Higair@ultragenyx.com Ultragenyx Pharmaceutical Inc.Selected Statement of Operations Financial Data(in thousands, except share and per share amounts)(unaudited) Three Months Ended June 30, Six Months Ended June 30, 2024 2023 2024 2023 Statement of Operations Data: Revenues: Product sales$73,805 $42,179 $136,294 $86,408 Royalty revenue 73,221 46,331 119,565 51,213 Collaboration and license — 19,799 — 71,184 Total revenues 147,026 108,309 255,859 208,805 Operating expenses: Cost of sales 21,280 9,914 38,813 22,171 Research and development 161,503 164,949 339,990 330,647 Selling, general and administrative 80,604 81,403 158,764 158,049 Total operating expenses 263,387 256,266 537,567 510,867 Loss from operations (116,361) (147,957) (281,708) (302,062)Change in fair value of equity investments (3,991) 261 (245) (73)Non-cash interest expense on liabilities for sales of future royalties (15,960) (15,375) (31,807) (31,011)Other income, net 5,572 3,975 12,791 10,573 Loss before income taxes (130,740) (159,096) (300,969) (322,573)Provision for income taxes (858) (732) (1,313) (1,227)Net loss$(131,598) $(159,828) $(302,282) $(323,800)Net loss per share, basic and diluted$(1.52) $(2.25) $(3.54) $(4.58)Shares used in computing net loss per share, basic and diluted 86,580,516 70,897,991 85,433,443 70,639,015 Ultragenyx Pharmaceutical Inc.Selected Activity included in Operating Expenses(in thousands)(unaudited) Three Months Ended June 30, Six Months Ended June 30, 2024 2023 2024 2023 Non-cash stock-based compensation$39,363 $34,653 $76,297 $66,592 UX143 clinical milestone — $9,000 — $9,000 Ultragenyx Pharmaceutical Inc.Selected Balance Sheet Financial Data(in thousands)(unaudited) June 30, December 31, 2024 2023 Balance Sheet Data: Cash, cash equivalents, and marketable debt securities $874,490 $777,110 Working capital 691,774 451,747 Total assets 1,618,437 1,491,013 Total stockholders' equity 432,418 275,414