DNase I

摘要：早期的基因治疗研究对于遗传性疾病的治愈抱有巨大希望，但各种基因毒性事件的发生导致临床试验暂停，对进展采取了更加谨慎的态度。遗传工程技术的最新进展重新点燃了人们的兴趣，导致2017年首个针对遗传突变的基因治疗产品获得批准。基因治疗（GT）可以在体内或体外进行。体外基因治疗方法具有优势，因为它允许在患者使用前对基因修饰细胞进行表征，并选择所需的特性。在此过程中还可以使用自体细胞，这消除了免疫排斥的可能性。本综述重点介绍了体外基因治疗的各个阶段、当前研究进展，这些进展提高了这一过程的效率和安全性，以及对人类免疫缺陷病毒（HIV）基因治疗研究的全面总结，其中大多数采用了体外方法。 1.引言 人类基因组的成功测序加深了我们对遗传性疾病和导致慢性及暂时性疾病状况的病理过程的理解。目前有超过5000种基因治疗产品正在针对各种遗传性、慢性和传染性疾病进行试验（https://clinicaltrials.gov/, 访问日期为2023年10月30日）。在开发基因治疗候选药物时，考虑一种有效的递送方法很重要，这将允许感兴趣的基因进行准确处理，在特定作用部位有足够表达，并持续预期的治疗效果，随后降解递送载体而不引起任何不良影响。由于存在引起严重不良反应的潜在危险，如肿瘤形成甚至基因修饰的生殖系传递，开发基因治疗产品（GTP）的过程非常严格，比其他治疗剂需要更长的时间。补充表S1总结了不同监管机构迄今为止批准的基因和细胞产品。最近发表了一篇综述，讨论了其中一些产品的发展。递送感兴趣基因的方法有两种：体内和体外（图1）。体内方法涉及将遗传物质直接递送到患者体内，可以是裸露的基因或封装在颗粒中。另一方面，体外方法涉及从患者或正常供体分离感兴趣的细胞，对它们进行遗传修饰，在某些情况下进行扩增，然后将它们给患者。因此，患者没有直接接触到转移载体。选择，即确保修饰的细胞相对于自然发生的缺陷细胞更优先植入患者体内，可以在给患者施用感兴趣基因之前或之后进行。最近发表了一些综述，强调了基因治疗在各个领域的应用：使用造血干/祖细胞（HSPCs）治疗造血障碍、遗传性皮肤病、神经系统疾病或中枢神经系统遗传性疾病和骨科疾病等。 图1. 体外递送感兴趣基因。使用Biorender.com创建。2.HIV基因治疗的治愈方法 由于存在对当前治疗有抵抗力的潜伏病毒库，因此获得HIV的治愈一直具有挑战性。这些病毒在转录上是不活跃的，但很大一部分具有复制能力。抗逆转录病毒治疗(ART)可能在潜伏病毒藏身的组织中吸收相对较差，如肠相关淋巴组织(GALT)和中枢神经系统(CNS)，这可能有助于这些部位病毒的持续存在。在停止ART后的几周到几个月内观察到病毒反弹。治愈的另一个挑战是HIV对免疫系统的影响：对HIV的体液反应差，中和抗体的产生不足，这通常在感染几个月后才会发生。此外，也有重建HIV特异性CD4+ T细胞的相对失败，这反过来又导致CD8+细胞毒性T细胞功能的降低。 因此，可以合理假设有效的治愈将旨在使潜伏病毒失活或移除，并重建免疫系统。基因修饰的细胞也应该能够抵抗持续的感染，治疗本身不应该引起严重的不良事件。为了重建或增强免疫系统的功能，已经在B细胞和T细胞的遗传工程方面取得了几项进展，包括嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗。图2提供了HIV治愈策略的总结。 国际艾滋病学会的多方利益相关者协商就HIV治愈目标产品的最低标准达成一致。临床疗效定义如下：维持病毒载量低于传播阈值(<200 HIV RNA拷贝/mL)，在研究的20%或更多人群中有效，平均每年复发率低于10%，缓解期超过2年，并且严重不良事件的可能性极小，如果有的话，即研究人群的不到1%。可能的治愈也可能需要结合不同的方法。 图2. HIV治愈策略。CRISPR—成簇规则间隔短回文重复序列；ZFN—锌指核酸酶；TALEN—转录激活因子样效应子核酸酶。使用Biorender创建。 为了实现对HIV的可能治愈，已经采用了四种策略。 第一种方法是干细胞移植，到目前为止已经治愈了六名患者：柏林患者、伦敦患者、纽约患者、“希望之城患者”、杜塞尔多夫患者和日内瓦患者。这些患者接受了造血干细胞移植以治疗恶性肿瘤。除了日内瓦患者外，所有患者都接受了与人类白细胞抗原（HLA）匹配的供体的干细胞移植，这些供体对于CCR5等位基因中的32个碱基对缺失（CCR5∆32）是纯合子。由于治疗的侵袭性、成本、发病率和死亡率，以及缺乏具有CCR5∆32的匹配无关供体，这种方法无法扩大到更广泛的人群，因此作为一种普遍适用的方法是不可行的。 第二种方法旨在从细胞库中移除所有活性潜伏病毒，实现无需ART即可检测到的血浆载量，因此提供一种无菌治愈。这种策略被称为“休克和杀死”方法，并已在早期阶段试验中进行了广泛研究。尽管目前这种治愈方法的形式并未采用基因治疗，但它已被包括在本综述中，以涵盖所有当前的HIV治愈方法。“休克和杀死”旨在使用潜伏期逆转剂激活潜伏病毒库中的病毒，这些逆转剂激活病毒转录，通过使用并行的ART阻止新细胞的感染，然后通过诱导凋亡、CD8+介导的溶解或通过体液免疫反应来根除感染的细胞。嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）细胞也可以被用来增强杀死感染细胞。 第三种策略旨在通过基因编辑根除整合病毒，使用基于核酸酶的工具或工程重组酶。基于核酸酶的工具包括CRISPR（成簇规则间隔短回文重复序列）、TALEN（转录激活因子样效应子核酸酶）和ZFN（锌指核酸酶）。也可以使用这些基于核酸酶的工具针对CCR5，使CD4+细胞对感染产生抵抗力，以及使用短干扰或短发夹RNA（siRNA或shRNA）沉默CCR5。基因编辑也可以通过工程重组酶进行，特别是针对HIV特异性长末端重复序列（LTR）的重组酶酶（TRE）重组酶。这是一种工程形式的Cre重组酶，针对5′LTR内的34个碱基对区域（称为loxLTR），从而在表达这种酶的感染细胞中去除整合的前病毒DNA。 第四种策略是“阻断和锁定”方法，旨在实现功能性治愈，即在不根除潜伏病毒的情况下保持其处于非活动状态，使血浆病毒载量保持在可检测水平以下。这是通过使用潜伏期促进剂永久沉默或编辑潜伏病毒库来实现的，这些潜伏期促进剂通过病毒启动子的抑制性表观遗传修饰“阻断”病毒转录并“锁定”病毒处于潜伏状态。 大多数HIV基因治疗研究使用体外方法。本综述将重点介绍体外基因治疗的各个阶段，并提供当前采用体外或体内基因治疗方法的HIV临床试验的总结。 3.体外基因治疗  在体外基因治疗研究中需要考虑的一个重要因素是将被修改以纠正特定疾病状况或遗传疾病的细胞来源。这些细胞可以是自体的，从患者自身获得，或同种异体的，从匹配的供体获得。自体来源是有利的，因为没有移植物抗宿主病的危险；然而，这可能不适合老年患者或严重疾病状况（例如，HIV，因为细胞可能是新感染的来源）。由于其自我更新和分化成几个谱系的能力，同种异体干细胞来源最近引起了更大的兴趣，尽管它们的使用存在局限性，如排斥、移植物抗宿主病和长期免疫缺陷。在临床前基因治疗研究中，可以从出生组织中获得干细胞，例如脐带血和胎盘。也可以从胚胎组织中获得干细胞，尽管这引发了伦理问题，或从诱导多能干细胞中获得。在临床研究中，可以根据患者的疾病状况从个体患者中获得细胞，或从与患者组织免疫兼容的供体中获得，或从其他细胞来源中获得，这些来源的细胞不太可能引发免疫反应，如由于缺乏或低表达HLA类I和II抗原而具有低免疫原性的胎盘细胞。体外基因治疗的过程包括获得这些感兴趣的细胞，对它们进行修改，并将它们给患者。为了确保修改后的细胞的有效和优先植入，使用各种调节和选择方法。 3.1.造血干细胞的来源 造血干细胞在单基因疾病和免疫系统疾病的基因治疗中很有用。造血干细胞（HSCs）和造血祖细胞（HPCs）负责产生成人血细胞，并以特定标记为特征（图3）。CD34抗原，一种细胞表面粘附跨膜糖蛋白分子，长期以来一直被用作HSCs的标记，以及其他功能，如增强细胞增殖、阻止分化、改善HSCs和HPCs的迁移以及促进淋巴细胞在淋巴组织中与血管内皮的粘附。这些细胞能够分化成各种谱系的功能性血细胞，并且具有自我更新的能力；即，它们可以在不分化的情况下产生女儿HSCs（图1）。 图3. 造血干细胞发展的层级结构。NK-自然杀伤细胞；DC-树突细胞。使用BioRender.com创建。3.1.1.骨髓来源的造血干细胞 基因治疗应用中常用的造血干细胞(HSCs)来源包括骨髓、脐带血、外周血，以及最近的胎盘。在骨髓中，成骨细胞影响造血的平衡。原始人类成骨细胞对骨髓来源的CD34+ HSCs的存活至关重要，因为成骨细胞恒定地表达粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。同样，HSCs调节成骨细胞分泌IL-6、巨噬细胞炎症蛋白-1α和其他因素，以创造有利于造血的环境。基质衍生因子-1(SDF-1)及其受体C-X-C趋化因子受体4(CXCR4)是建立骨髓的重要决定因素。Tie2，一种受体酪氨酸激酶，也被发现在维持成年骨髓中的HSCs方面不可或缺。CD34抗原具有多个磷酸化位点，其中有两处是蛋白激酶C的位点，一处是酪氨酸磷酸化位点。 Panch等人的文章总结了从骨髓、外周血和脐带血中采集HSCs的方法。简而言之，从骨髓中采集HSCs通常在全身麻醉下进行，大约每公斤体重收集20 mL，且不超过1.5 L的骨髓抽吸液，从髂后或髂前缘收集。在进行该程序之前，可能会从患者身上采集血液，以便在抽吸过程中失去的血液可以重新注入。 3.1.2.外周血来源的造血干细胞 从外周血采集造血干细胞的过程需要几天时间。早期动员方案使用了细胞毒性药物，如环磷酰胺、伊达比星、依托泊苷、铂类和表柔比星；然而，这些药物的使用现在仅限于接受移植治疗恶性肿瘤的患者。目前，在移植患者中，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）用于将CD34+细胞动员到外周血中，剂量为5-10 mg/kg/天，持续5至7天，目标是通过白细胞去除术采集至少2×106 CD34+细胞/kg体重。在G-CSF给药期间，血液中HSCs的浓度在3天后增加，大约在第5或6天达到峰值，然后在7天后开始下降。G-CSF的剂量由外周白细胞计数决定，外周CD34+计数是HSCs产量的良好预测指标。产量还取决于年龄、性别、基础条件和G-CSF剂量。G-CSF治疗并非没有挑战，患者可能会经历包括骨痛、头痛、疲劳、肌痛在内的副作用，以及在高风险个体中可能出现心肌梗塞和脑缺血。为了增强G-CSF的动员效果，可以使用AMD3100（Plerixafor，一种可逆的CXCR4拮抗剂）。CXCR4是基质衍生因子1（SDF-1）的受体，具有包括使HSC长期维持静止状态在内的多种功能。Plerixafor以240 µg/kg的剂量给药，在白细胞去除术前4至6小时，发现它可以改善CD34+细胞的采集，尤其是与G-CSF联合使用时。其他HSC动员剂目前正在开发中。 3.1.3.脐带血来源的造血干细胞 从脐带采集细胞涉及切断的脐带静脉穿刺，将血液排入含有抗凝剂的无菌袋中。通常，在过程中收集大约80至160 mL的脐带血（UCB）。CD34+细胞的产量范围为2至7×106/mL UCB，可能受到出生顺序（第一胎>第二胎>第三胎等）、出生体重甚至早期夹闭的影响。这种相对较低的产量限制了它们的应用。 3.1.4.胎盘来源的造血干细胞 人类胎盘最近作为干细胞来源而受到欢迎，因为胎盘干细胞抗原性低，没有伦理限制，并且是多能的。人类胎盘是生殖过程中首先发育的器官，有两个组成部分，胎儿部分（羊膜和绒毛膜）和母体部分（蜕膜）。从受精后6-7天出现到足月的胎盘发育已被详细描述。胎盘的作用是为发育中的胎儿提供营养物质并排除废物，具有各种分泌和免疫调节作用。它可以被划分为以下四个区域：羊膜上皮、羊膜间充质、绒毛间充质和绒毛滋养外胚层。胎盘有多种类型的干细胞，可以分化为造血和间充质组织（脂肪生成、软骨生成、成骨、肝脏、胰腺、肌肉、血管生成和神经生成），表达各种细胞标记，包括OCT4、SOX2和c-KIT等，这些标记也存在于胚胎干细胞中。胎盘HSCs缺乏或表达非常低的HLA类I抗原（HLA-A、HLA-B、HLA-C）和没有HLA类II抗原（HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR），这使它们适用于再生医学以及自体和同种异体移植。与骨髓细胞相比，这些细胞的免疫排斥机会较低，对凋亡有抵抗力，具有增强的细胞增殖和伤口愈合特性，并抑制如TGFβ等促纤维化因子。人类胎盘HSCs是胎儿来源（非母体），并且是CD34+和CD45-dim。用AMD3100（Plerixafor）以300 ug/L的浓度灌注人类胎盘，结果在灌注液中采集到的HSCs数量增加了六倍以上，这些细胞具有集落形成特性，缺乏内皮标记。间充质基质细胞是骨髓造血环境的重要组成部分，与HSCs共培养已被发现可以增强HSCs的增殖，特别是原始的CD34+和CD38-。 已使用脐带血和胎盘来源干细胞的混合物进行造血干细胞移植。已开发出各种协议来分离羊膜上皮细胞、间充质基质细胞和造血干细胞。所有协议都必须克服的一个主要障碍是生产大量具有所需细胞群高度纯度的细胞。 3.2.造血干细胞的分离、纯化和富集 为了确保基因校正细胞的优先植入，重要的是要富集具有构建体的细胞群，并对其进行纯化，以避免在培养过程中使用的蛋白质或其他分子的污染。已使用几种方法来富集HSCs。目前最常见的柱分离技术是德国科隆Milteny Biotech的磁激活细胞分选（MACS®）微珠分离技术（https://www.miltenyibiotec.com/ 于2023年6月4日访问）。在这种封闭系统技术中，微珠（超顺磁性氧化铁纳米颗粒）与CD34抗体偶联，用于磁性标记表达CD34+的细胞。将无菌细胞悬浮液装入MACS®（铁磁性）分离柱中，该柱放置在MACS®分离器的磁场中。在正选择技术中，标记的细胞被保留在柱中，而其他细胞则流过。然后可以从柱中洗脱CD34+细胞，一旦它被从由分离器产生的磁场中移除，就可以用于任何下游应用。也有用于分离CD133+细胞群和CD34+和CD38−细胞的微珠。Baldwin及其同事使用免疫磁珠富集CD34+细胞，然后用荧光激活细胞分选（FACS）对其进行分馏，以富集CD34+和CD38−细胞；另一方面，Radtke及其同事使用FACS分离CD34+、CD90+和CD45RA−细胞，发现这组细胞在表型上是HSC基因治疗的最明确目标，因为这些细胞推动了短期和长期的多谱系植入。他们使用GMP（良好生产规范）级流分选协议来分离这些细胞。这大大增加了所需的复杂性、成本和专业知识。在其他体外研究中，Kays及其同事使用MACS对细胞进行排序，这些细胞除了表达CD34+外，还表达CD105，即转化生长因子-β（TGF-β）受体复合体的组成部分，发现这些细胞富集了具有高植入和重聚能力的早期HSCs，即使在慢病毒转导后也是如此。Laje及其同事用信号淋巴细胞激活分子（SLAM）家族受体分子富集了注定要进行慢病毒转导的HSCs，发现这些细胞被有效转导并且与非转导细胞相比是稳定的。 研究表明，培养造血干细胞(HSCs)超过48小时会降低它们长期植入的能力，建议培养时间不应超过36小时，24小时是一个安全的时间段。Chen及其同事的一项研究发现，使用细胞因子（SCF、TPO和Flt3L）进行体外培养会导致线粒体氧化应激，从而导致丧失干细胞特性，并且CD34+/CD133+中的粘附GPCR G1阳性（ADGRG1+）群体可以在体外培养期间的氧化应激下富集功能性HSCs。 还努力减少培养过程中可能的污染源。重组人血清白蛋白（HSA），是从酵母中产生并用作GMP级组织培养基的组分，可能是其他不直接与白蛋白相互作用的蛋白质甚至色素和小分子的污染源。Wilkinson及其同事最近使用体外和体内小鼠模型发现，聚乙烯醇（PVA）可以作为HSA在培养小鼠和人类HSCs中的替代品，因为它支持HSCs的存活和生长，同时保持表型HSCs特征。PVA培养基中分泌因子的浓度较低，衰老相关基因表达较少，尽管PVA用于人类基因治疗的效果还有待评估。 3.3.使用感兴趣基因修饰造血干细胞 在考虑适当的载体进行基因传递时，需要检查要转导的细胞的特性和载体的特性；是否需要短暂或稳定表达基因修饰；以及在传递到组织时可能导致的“脱靶”效应。这些脱靶效应可能包括宿主-免疫反应和载体本身引起的免疫反应。用感兴趣基因修饰目标细胞可能面临各种挑战。例如，腺相关病毒载体由于阻碍核输入、解壳和第二链合成，因此不能有效转导HSCs。用VSV-G包膜伪装的慢病毒载体具有广泛的细胞嗜性，尽管由于缺乏或表达不足的LDLR受体（它通过该受体进入细胞），原始人类静息T细胞和CD34+细胞不能有效转导。另一方面，T细胞的激活提高了转导效率。在体内使用病毒载体进行基因治疗的情况下，对病毒的预先存在的免疫力可能导致基因修饰细胞数量的减少，这反过来又会限制体内重新填充的速率。转导和重新给药基因修饰细胞之间的时间间隔也至关重要，特别是对于可能分化并限制返回目标部位的干细胞。 为了保护它们的基因组结构，真核细胞具有防御机制，导致外来可移动元素或逆转录病毒的沉默，因此存在诱导沉默机制的可能性，这可能由于缺乏表达而使治疗基因失效。 4.通过病毒载体进行HIV基因治疗传递  用于体外基因传递的最常见病毒载体是慢病毒载体，因为它能够转导分裂和不分裂的细胞。最初，γ-逆转录病毒载体被用于基因传递；然而，它们靠近原癌基因整合并引起插入性突变的潜力变得明显。从那时起，已经多次尝试使病毒载体更安全、更有效地进行基因传递。选择病毒载体由要转导的细胞类型、病毒载体特性、感兴趣基因（转基因）的大小和期望的效果决定。下表1总结了不同病毒载体的载货量（插入大小）。 4.1.在HIV基因治疗中使用γ-逆转录病毒载体：并发症和提高安全性的方法 γ-逆转录病毒载体是最早用于有效基因治疗的病毒载体之一。这些载体以依赖细胞周期的方式转导活跃分裂的细胞，因此不转导静止的细胞。逆转录病毒最初是首选的载体，因为它们的使用导致转基因稳定地整合到宿主基因组中。然而，这一好处受到大约10%的患者观察到的一系列基因毒性事件的限制，表现为各种形式的白血病。例如小鼠白血病病毒，γ-逆转录病毒更倾向于靠近强增强子区域、转录起始位点、CpG岛和DNase-I高敏位点整合，并可能在靠近原癌基因时引起插入性突变。这些安全问题导致这些临床试验的暂停，因此，已经尝试提高它们的安全档案。现在已知，在逆转录病毒生命周期中，前整合复合体（PIC）与各种宿主转录因子相互作用，特别是溴结构域和外部末端家族蛋白（BET蛋白）和整合酶，导致整合到宿主基因组中。BET蛋白通过将病毒PIC系在宿主染色质上发挥作用，因此，开发不依赖BET的载体可以改变它们的整合档案。事实上，几个小组已经在细胞系和小鼠模型中证明了这种方法的有效性。另一种方法可能是修改整合酶，使其远离靠近原癌基因的整合。与慢病毒载体相比，创建自失活的RV载体的尝试不太成功，因为它们仍然保留着激活癌基因的能力。 4.2.慢病毒载体用于稳定基因表达：挑战和减轻这些挑战的策略 慢病毒是一类逆转录病毒，除了结构基因env、pol和gag外，还有辅助基因，如vpr、vpu、nef和vif，以及调节基因，如tat和rev。最著名的慢病毒是人类免疫缺陷病毒（HIV）。 工程化的慢病毒被认为是适合基因转移的，因为它们可以稳定地转导分裂和不分裂的细胞。与其他逆转录病毒的不同之处在于，大多数逆转录病毒的PIC需要核膜的破裂（在有丝分裂期间），以便允许进入细胞核，而慢病毒PIC通过核孔蛋白和importins的主动运输进入细胞核。PIC是病毒cDNA的组装，一些来自逆转录复合体的病毒蛋白和宿主细胞蛋白。逆转录后病毒DNA的整合是由整合酶和PIC介导的。一项研究发现，PIC更倾向于靶向靠近核孔的开放染色质区域，排除核内部区域和核纤层的周边区域。核周边的转录活跃基因与核孔复合体（NPC）相关，这影响了HIV-1基因表达。慢病毒更倾向于与积极转录的基因整合，整合模式得到目标细胞转录程序的支持。宿主细胞蛋白，晶状体上皮衍生生长因子（LEDGF/p75）直接与病毒整合酶相互作用，没有它，整合酶无法进入细胞核。现在已知LEDGF/p75将整合酶连接到染色质上。 4.2.1.慢病毒载体的演变 自从作为基因治疗载体被发现以来，慢病毒载体(LVs)经历了几次修改（见图4）。第一代LVs包括转基因构建、包膜构建和一个包含gag、pol和所有调节和辅助基因的包装构建。从HIV env改为VSV-G env或任何其他合适的病毒包膜（称为伪型化），允许有效转导多种细胞，尽管VSV-G导致静息淋巴细胞和HSCs的转导效率低下。第二代LVs包括转基因构建、表达VSV-G的包膜构建，以及包含gag、pol和调节基因tat和rev的包装构建。移除了所有辅助基因。第三代LVs在转基因构建中的病毒启动子中进行了修改，其中U3区域通过删除-418至-18的序列部分进行了修改，仅留下18 bp（移除了400 bp），因此创建了自失活(SIN)载体。因此，5′LTR具有18 bp U3、R和U5区域和一个PolyA尾。这使得载体仍然能够携带转基因盒，同时保持转录不活跃。U3被删除的部分被异源启动子替换，通常是巨细胞病毒（CMV）启动子或细胞启动子，如延伸因子1α（EF1α）。3′ LTR、U3区域也被删除，以防止在转染293T细胞过程中通过同源重组与5′LTR重组成完整病毒。载体构建还包含非编码域cPPT（中央多嘌呤区），这提高了RNA被包装进衣壳的效率，以及WPRE（Woodchuck肝炎病毒转录后调控元件），这增强了转基因的转录后处理。包装构建被分割成gag-pol构建和rev构建，删除了tat，因为它的转录激活环已从5′LTR中移除。因此，第三代系统由四个质粒构建组成，如图4所示。三个单独的包装构建降低了在质粒扩增和病毒载体生产过程中形成复制能力慢病毒的重组机会，并减少了启动子干扰相关问题的机会。第三代慢病毒构建通过修改携带转基因的质粒进一步重新设计，可以被认为是第四代慢病毒载体。在这个系统中，称为LTR1或PBS1（引物结合位点1），5′LTR已被移除，RNA信号（PBS-Y-RRE）被放置在3′LTR的下游。因此，这些信号在载体生产过程中存在，但在逆转录过程中丢失，并且不与转导的转基因一起复制，从而进一步提高了安全性。 图4. 慢病毒载体生成的进步。第一代构建包括转基因构建、伪型包膜（通常是VSV-G）和包含gag、pol和所有调节及辅助基因的包装构建。第二代载体与第一代载体类似，只是去除了辅助基因。第三代载体是自失活慢病毒载体，在U3区域有400 bp的缺失。第四代慢病毒载体去除了5' LTR，并将RNA信号(PBS-Y-RRE)放置在3' LTR的下游。RRE：Rev反应元件；PM：细胞来源或其他启动子；cPPT：中央多嘌呤区；VSV-G：泡状口炎病毒G型；WPRE：Woodchuck肝炎病毒转录后调控元件；Y：包装信号。Ch5'：嵌合5' LTR；PAS：引物激活信号。 4.2.2.优化慢病毒转导 有效的慢病毒转导人类细胞可能受到人类细胞产生的限制因子的限制，这些限制因子限制了慢病毒感染，如三部分基序蛋白5α(TRIM5α)、tetherin和载脂蛋白B信使RNA编辑酶催化多肽样3(APOBEC3)。其中一个被证明导致慢病毒基因传递到静息记忆T细胞效率低下的因素是限制因子SAMHD1（含α motif和组氨酸-天冬氨酸(HD)结构域蛋白1）。SAMHD1是一种细胞脱氧核苷酸三磷酸水解酶，阻止逆转录。HIV-2编码的vpx基因被发现可以抵消SAMHD1的限制能力。事实上，一项研究发现vpx在他们测试的所有条件下都增加了基因治疗传递，但当基因治疗针对逆转录前的步骤时效果最大。 优化体外培养条件是提高基因转移速率的有用方法。使用Polybrene、鱼精蛋白硫酸盐、Retronectin、热带增敏受体增强子、如Lenti-X accelerator的磁珠、Vectofusin-1、LentiBOOST和Staurosporine等试剂已被发现可以增强转导过程。使用胎牛血清(FBS)在用慢病毒载体转导CD34细胞时并不令人满意，因为它导致祖细胞的转导增加，但HSCs的转导减少。此外，由于对其异种成分产生抗体，存在免疫风险的担忧。已经开发了各种无血清培养基，适用于不同类型干细胞的转导，例如，加拿大温哥华干细胞技术公司的StemSpan无血清扩增培养基(SFEM)。将敲除血清替代品(KSR)培养基添加到StemSpan培养基中，已被发现可以提高原代CD34+细胞和外周血单个核细胞(PBMCs)的转导效率。 4.2.3.慢病毒载体沉默 像γ-逆转录病毒载体一样，尽管程度较轻，慢病毒载体也容易受到转基因沉默和转基因效率变异的影响，这是由于转基因与宿主基因组（染色体位置效应）中其直接基因组邻域的相互作用。一些宿主和载体特征被假设可以引起这种效应，包括DNA甲基化和组蛋白修饰，包括由多梳家族蛋白介导的修饰。可以隔离转基因免受沉默的策略包括使用更强的增强子启动子、脚手架/基质附着区域(S/MARS)，这些可以保护增强子免受DNA甲基化，和染色质域隔离子，这些可以抑制抑制性位置效应。 4.2.4.减少插入性突变的策略 已经尝试了各种方法来减少插入性突变的机会。一种策略是将整合导向远离原癌基因的“安全基因组港湾位点”。Schenkwein等人使用I-PpoI，一种来自黏菌Physarum polycephalum的二聚体18-20 KDa同源性内切核酸酶，将整合导向一个高度保守的位点，28S核糖体RNA。这是通过识别该区域的15 bp位点来实现的。另一种策略是通过改变整合酶核心结构域(D64、D116和E152)的催化三联体来生产非整合慢病毒载体。虽然消除了插入性突变的风险，但这些载体只能用于瞬时基因表达。基因表达也低于整合慢病毒载体。修改LEDGF/p75的功能，其功能是指导慢病毒整合，可以允许整合到更安全的区域或更随机的整合，从而减少靠近原癌基因的整合机会。 4.3.腺相关病毒载体(AAVs)：限制其使用的挑战 重组腺相关病毒是在临床应用中首选的载体，当需要短暂表达转基因（根据感染细胞的周转时间，从几个月到几年不等）时。这些载体不含病毒DNA，而是基于蛋白质的纳米颗粒，被设计为穿越细胞膜并将DNA送入细胞核。这些载体非常稳定，能够承受操作过程中出现的物理或化学挑战。病毒基因组也容易操纵，并且具有良好的安全档案。AAVs可以携带高达4.5 kb的转基因盒。然而，AAVs的主要挑战是它们在自然界中广泛存在，因此抗AAV免疫很高，12种已知血清型的中和抗体的流行率在某些人群中从20%到100%不等。这些载体的给药也可能引发治疗后的体液反应。正在应用各种策略来克服衣壳免疫、补体固定和AAV基因组感知。一种策略是通过合理设计、随机突变和衣壳重组来工程化衣壳，以防止衣壳中和。另一种策略是免疫抑制，即阻断涉及B细胞激活的经典途径，从而抑制体液反应，尽管体外基因治疗的体液反应可能有限。为了减少AAV基因组感知，可以通过耗尽载体基因组中的CpG二核苷酸来阻止TLR信号传导。腺相关载体可以用来转导多种细胞，包括间充质基质细胞、神经细胞等，尽管它们不适合造血细胞。 许多研究小组正在研究使用AAVs将广泛中和抗体送入骨骼肌，以提供针对HIV的持久效果，无论是作为预防还是治疗，或两者兼有。最近一篇综述文章分析了它们在HIV感染中的使用，以及当前挑战和可以采用的策略来克服其有效性的障碍。 4.4.体外细胞选择和扩增 根据转导的细胞类型、载体类型、感染倍增性(MOI)和使用的转导技术，转导的细胞数量通常低于理论上的预期。因此，转导过程不是100%有效。然而，有几种方法可以最大化转导效率。除了第4.2.2节中提供的例子外，使用高MOI可以产生更高的载体拷贝数(VCN)，尽管这增加了异常剪接事件的风险。通过色谱法纯化载体颗粒也可以增加转导效率。转导后，选择携带转基因的细胞并扩增这些细胞以增强它们在体内的植入是有益的。这可以通过细胞表面标记或设计载体表达抗生素抗性基因来实现，然后在应用适当的抗生素时，将允许优先选择携带转基因的细胞。 转导HSC的扩增目标是在保留“干细胞特性”的同时增加数量。通常支持分化为成熟谱系的传统培养基导致自我更新能力的丧失。体外基因治疗的体液反应可能有限。为了限制污染的可能性，最好使用无血清培养基进行HSC扩增。Tajer等人最近的文章总结了添加到培养基中以增强扩增的因素。已经使用了几种细胞因子和生长因子，包括SCF、FLt3配体、TPO（血小板生成素）、IL-3和IL-6，尽管由于IL-3刺激祖细胞的扩增而不是HSCs，它并不包括在某些培养基中。还发现其他化合物也很有用。这些包括前列腺素E2 (PGE2)，它通过改善HSCs的归巢和自我更新能力来增强HSCs的植入，和Stem Regenin 1 (SR1)，一种芳香烃受体拮抗剂，用于扩增人类和小鼠CD34+，尽管它也被发现更有利于多能祖细胞而不是长期重聚干细胞。这与UM171形成对比，UM171是一种嘧啶哌啶衍生物，它支持干细胞的扩增而不是多能祖细胞。因此，它们可以组合使用，以促进两种谱系的扩增。其他使用小鼠模型的研究表明，可以调节调节干细胞归巢和分化的信号通路。这些包括Notch信号通路、Homeobox基因、Wnt等。锌指转录因子Sall4的过表达导致HSCs（CD34+细胞）在体外和小鼠模型中迅速有效扩增（增加50倍）。 5.基因修饰造血干细胞的给药：增强基因修饰细胞的优先植入  HSC输注后造血重建的第一阶段（最多6个月）是由于承诺的祖细胞（短期HSCs），它们具有有限的自我更新能力。大约6个月后，CD34+克隆减少，第一波克隆重建耗尽，长期HSC逐渐接管重建，它们能够自我更新，其效果甚至在基因治疗后3年仍然存在。因此，短期HSC在早期阶段活跃，而长期HSC在这一阶段进入静止状态，并在短期HSC耗尽时激活。 5.1.清空造血干细胞壁龛的调理方案 在用于造血障碍的自体基因治疗中，目标是用宿主细胞替代有特定遗传缺陷的细胞。在HIV基因治疗中，目标是用有抗性的细胞替代易感染的细胞，或能够对抗病毒的细胞。干细胞壁龛允许维持干细胞并调节其功能；HSC壁龛位于骨髓和脾脏的血管周围。清除用于转导HSCs吸收和消除未转导细胞的壁龛的过程，也称为调理，传统上一直使用化疗和放疗进行，这对目标器官没有特异性。进行调理是为了耗尽壁龛中的造血干和祖细胞，以减少同种异体移植的免疫排斥机会，在恶性疾病的病例中治疗任何恶性肿瘤。调理方案可以分为清髓性调理（MAC）、非清髓性调理（NMA）和减低强度调理（RIC）。清髓性方案由烷化剂组成，有或没有全身照射（TBI），导致全血细胞减少症和1-3周内造血耗尽，不允许自体血液学恢复。因此，为了生存，需要干细胞支持。MAC方案与毒性有关，有时甚至死亡，特别是如果植入出现问题。毒性迹象包括器官衰竭、粘膜炎、骨髓抑制、继发性恶性肿瘤、肌肉骨骼疾病和心脏、肺、生殖和内分泌异常。接受MAC治疗的人群的长期死亡率也高于普通人群。 由于这些不希望的副作用，开发了较低强度的方案。较低的强度意味着可逆的骨髓毒性，与MAC诱导的不可逆骨髓毒性相比。这些方案是NMA和RIC。非清髓性方案引起最小的细胞减少症，不需要干细胞支持。另一方面，减量调理涉及将MAC方案的剂量至少减少30%，虽然它不会导致干细胞的消融，但仍然需要干细胞支持才能在临床上实用。这些调理方案的细节已经回顾过。尽管RIC毒性较小，但发现它对基因治疗的效率较低，因为它导致外周血细胞中基因标记较少，这可能是由于壁龛清除效率低下或对转基因的免疫耐受性诱导不充分。在基因治疗中，辐射或化疗药物的剂量由正在治疗的疾病状况和患者特征决定，包括年龄和性别。欧洲骨髓移植组（EMBT）风险评分是一个用于评估癌症患者移植风险的工具，也可以扩展到任何需要移植的患者。它基于五个因素：患者年龄、疾病阶段、诊断到移植的时间间隔、供体类型（就HLA分型而言）和供体-受体性别组合。通常，30岁以后使用MAC方案死亡率增加，50岁以后不推荐使用。如果供体和受体不是同一性别，也有更高的排斥风险。 5.2.基因修正造血干细胞的体内选择 为了改进携带转基因细胞的选择，在动物模型的体内研究中采用了体内化学选择技术。使用药物抗性基因进行体内选择转基因需要药物抗性基因在转导细胞中高度表达，在非转导HSCs中根本不表达或表达水平低；选择药物应该耗尽大多数非转导细胞，对非造血毒性很小，并且在非恶性条件下不具有遗传毒性。在动物模型中用于选择的基因，特别是在小鼠中，包括多药抗性基因(MDR1)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、乙醛脱氢酶(ALDH)、胞嘧啶脱氨酶(CDD)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)。 一项研究使用了O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)的突变体，这是一种DNA烷基化修复酶。突变体MGMTP140K在非人灵长类动物中显示出稳定和有效的HSCs选择，尽管使用(Carmustine-BCNU，例如)的烷基化剂的致癌性质是一个缺点。另一项研究使用短发夹RNA(shRNA)敲除次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)，在这些小鼠模型暴露于6-硫鸟嘌呤(6 TG)时实现HSCs的选择。使用这种方法很有吸引力，因为它允许转导的HSCs自我更新、增殖和分化，该方法用于清除壁龛并使携带转基因的细胞优先植入。诱导药物抗性的shRNA仅长48 bp，用于化学选择的6 TG量低，尽管6 TG可能诱发白血性。该组使用MOI为1，在两轮连续病毒暴露后，未用生长因子预刺激以保持“干细胞特性”，实现了20-30%的慢病毒转导效率。 5.3.清除壁龛的最新发展 提高壁龛清除和促进转导细胞植入的最新发展是使用与能够清除壁龛的药物结合的单克隆抗体。这些方法允许针对性地清除HSC壁龛，因此减少了上述调理方案非特异性相关的副作用，并使携带转基因的细胞优先植入。例如，为了改进HSCs的选择，最初的小鼠研究使用了CD45-抗体药物偶联物(CD45-ADCs)，但很快意识到这些对HSCs并不特定，并导致淋巴细胞耗尽，因为CD45也存在于淋巴细胞和其他白细胞表面。使用CD117-抗体药物偶联物(CD117-ADC)，可以更具体地针对HSCs，在小鼠模型中使内源性HSCs耗尽超过99%。2019年报道这种技术效果的第一组使用链霉亲和素连接子将CD117与毒蛋白连接起来，并测试了其对NOD SCID Gamma(NSG)小鼠和非人灵长类动物的效果。另一组使用了抗人CD117 IgG1单克隆抗体偶联物AMG 191，发现其在非人灵长类动物中有效，目前正在进行1/2期临床试验。另一组将CD117+与鹅膏毒素(MGTA-117)偶联，发现其在患有急性髓细胞性白血病(AML)的小鼠模型中非常有效（耗尽了超过95%的HSPCs）。CD117在AML细胞中高度表达，这种方案被发现可以减少这些小鼠的肿瘤负担。 6.基于体外HIV基因治疗的临床试验  如前所述，HIV的基因治疗努力集中在使免疫系统更擅长履行其功能，或旨在沉默或编辑整合的原病毒，使其复制能力不足或使细胞对感染有抵抗力。已经进行了几项临床试验，旨在检查HIV基因和细胞治疗产品的效用和安全性。 6.1.基于细胞治疗的HIV临床试验 最早的细胞治疗研究之一创建了嵌合T细胞受体：CD4-Zeta基因修饰T细胞。这项早期临床研究（NCT01013415）的结果发现，尽管病毒库在各组之间没有差异，但在接受了基因修饰细胞的组中，HIV负担从基线有所下降，并且复发性病毒血症的患者趋势减少。AGT103-T是一种产品，可以恢复慢性HIV病患者的gag特异性CD4+ T细胞反应。最初的1期临床试验结果（NCT03215004）显示了一些有希望的结果。对参加研究的患者进行了白细胞去除术。一旦细胞被基因修饰并通过了质量控制测试，患者在基因治疗产品输注前一周用环磷酰胺进行了非清髓性调理，剂量为1 g/m2。AGT103-T修饰细胞以每公斤体重2到2100万细胞的剂量输注。即使在基因治疗产品输注后6个月，也可以观察到细胞的基因标记。没有记录到严重不良事件。 SB-728是一种锌指核酸酶(ZFN)介导的，CCR5修饰的，自体CD4+ T细胞产品。这项研究的各种版本发现，即使在重复剂量给药后，也没有发现严重不良事件。当使用环磷酰胺进行调理时，植入效果更好。其中一项研究发现，尽管病毒反弹有延迟，并且CD8+ T细胞反应改善了6个月以上，但对潜伏病毒库没有长期影响。另一项研究，NCT03617198，将CAR-T细胞治疗与ZFN CCR5修饰相结合，作为一种双重治疗方法，确保CD4+细胞对感染有抵抗力，并且同时能够检测和清除HIV感染的细胞。最后，NCT04648046使用了编码双特异性抗gp120 CAR分子的慢病毒载体(LVgp120duoCAR-T)来针对表达HIV gp-120的细胞。 6.2.基于通过逆转录病毒载体进行基因传递的临床试验 早期直接针对HIV的研究使用了逆转录病毒载体来传递抗HIV基因。在一项研究中，使用了同种基因T细胞（来自同卵双胞胎），使用逆转录病毒载体传递了细菌基因NeoR（NCT00001353）。这项研究的目的是证明，通过基因转导的同种基因细胞实际上可以通过成熟细胞的分裂，而不是前胸腺干细胞的分裂，持续数周至数月。在涉及双胞胎的一项研究中（NCT00001535），从血清阴性的双胞胎中获得了同种基因CD4+淋巴细胞，并用携带反义TAR或反义Tat/Rev RNA，反式优势Rev蛋白或两者结合的逆转录病毒载体转导。临床前研究表明，所有使用的抗HIV载体都抑制了HIV，反式优势Rev蛋白显示出更大的抑制作用。尚未发布临床试验的结果。涉及双胞胎的所有研究的长期随访（Gemini Study—NCT04799483）目前正在进行中。另一项使用逆转录病毒载体的研究，NCT00002221，从计划进行自体骨髓移植的非霍奇金淋巴瘤HIV阳性患者中获得了外周血CD34+细胞，并将这些细胞分成三个池。一个细胞池用含有两个核糖酶序列“L-TR/Tat-neo”的逆转录病毒载体转导，第二个池用对照载体‘LN’转导，第三个池保持未修饰细胞。然后将这些细胞重新输注回患者体内。尚未发布这项研究的结果。除了逆转录病毒载体观察到的插入性突变风险外，这项后续研究的成功也可能因携带治疗基因的细胞比例低而受到阻碍。 RevM10是HIV-1 Rev基因的优势负性突变体。使用逆转录病毒载体将这个基因转导入CD4+ T细胞，结果抑制了HIV复制，并持续了6个月。尚未发布在造血干细胞中研究RevM10的结果（NCT00003942）。逆转录病毒载体也用于传递MazF，一种Tat依赖性内切核酸酶基因，在1期研究中评估其安全性、耐受性和免疫原性。MazF源自大肠杆菌，选择性地切割mRNA中的ACA序列，这些序列在HIV中很常见。这项研究发现，单次静脉注射用MazF转导的自体CD4+ T细胞导致CD4+和CD8+细胞增加，这种效果至少持续了6个月。 核酸酶是催化RNA分子，可以针对任何具有NUX切割位点的RNA序列，其中N是任何核苷酸，X是A、C或U中的任何一个。在一项概念验证的1期研究中，Rz2，一种针对tat基因起始密码子附近GUA序列的核酸酶，通过逆转录病毒载体传递到同种基因外周血单个核细胞(PBMCs)中，这些细胞是从血清阴性双胞胎的基因修饰细胞中获得的，然后输注到血清阳性双胞胎体内。共有4名患者参加了这项研究，该研究表明基因标记细胞的持续存在，无论是短期（24周）还是长期（44个月），在此期间没有观察到严重副作用。在一项相关的2期基因治疗试验中，通过逆转录病毒载体将一种抗HIV核酸酶转导到自体CD34+细胞中，患者接受了tat–vpr–特异性抗HIV核酸酶（OZ1）或安慰剂。没有与OZ1相关的不良事件。尽管在主要终点（大约48周）时OZ1和安慰剂组之间的病毒载量没有统计学上的显著差异，但在40周时观察到了显著差异，并且直到100周，OZ1组的CD4+ T细胞高于安慰剂组。在长期随访研究中，NCT01177059，最初入组的68人中有18人完成了研究，其中7人有严重不良事件，包括各种类型的肿瘤（例如，基底细胞癌、霍奇金病、卡波西肉瘤、乳头状甲状腺癌、皮肤癌），这些最有可能是由逆转录病毒载体引起的。 6.3.基于慢病毒载体的HIV研究 在VRX496（Lexgenleucel-T）研究中，使用携带针对HIV包膜的抗HIV反义基因的基于HIV的慢病毒载体修饰自体T细胞。安全性和耐受性研究，NCT00295477，发现血液中的植入半衰期为5周。一些患者的基因标记细胞甚至在5年后还存在。这项研究表明，基因修饰细胞可以对HIV施加遗传压力。 另一项使用慢病毒载体传递抗HIV基因的研究结合了针对CCR5的短发夹RNA（shRNA），它阻止病毒进入，人/恒河猴嵌合TRIM5α，一种在进入细胞质时破坏病毒衣壳解壳的天然分子，因此抑制HIV感染，以及转录激活反应（TAR）诱饵，它通过结合病毒Tat并将其隔离，因此阻止其介导前病毒DNA的有效转录。这项临床试验的结果尚未发布。 在一组研究中，接受自体移植治疗淋巴瘤的患者被输注了用含有tat-rev shRNA、TAR诱饵和CCR5核糖酶（LV Rhiv7-shITAR-CCR5RZ）的慢病毒构建体修饰的CD34+造血干细胞。四名患者的早期结果表明，基因修饰细胞在输注后第11天植入，并且即使在24个月时，载体仍然存在，并且在病毒血症后选择基因修饰细胞。尚未发布各个研究的结果。 Cal-1是一种双重抗HIV基因转移慢病毒构建体，它传递一种沉默CCR5的shRNA（sh5），并在不同的启动子下，编码一种小肽抑制剂的序列，这种抑制剂可以防止HIV包膜与宿主CD4+细胞的融合（C46）。已在不同地点对Cal-1进行了几项研究。在NCT01734850中，对13名患者进行了Cal-1治疗，并评估了该治疗的安全性。Cal-1的临床前研究表明，该治疗有效且安全。在临床试验中，使用白消安调理来清除壁龛，以允许基因修饰细胞的植入。在两个接受白消安调理的治疗组中观察到严重和危及生命的不良事件，与单剂量白消安相比，双剂量白消安的副作用更严重。未接受调理的组没有严重不良事件。患者目前正在进行长期随访研究（NCT02390297）。与调理相关的毒性是成功传递基因治疗的常见挑战，因此开发更安全、更有效的方法来清除壁龛，以实现成功和稳定的植入是值得的。 这些临床研究表明，在实现足够植入的足够清除壁龛、使基因修饰细胞的生产和由于调理导致的骨髓毒性之间存在微妙的平衡。 为了帮助推进HIV治愈方法的临床前研究，例如使用si/shRNA的“阻断和锁定”方法的研究报告，解决这些挑战至关重要。这组临床前小鼠研究已经报告了通过si/shRNA成功沉默HIV，尤其是shPromA，它针对病毒启动子中的串联NF-KB转录因子位点，以诱导下游病毒基因表达的转录基因沉默和抑制性表观遗传修饰（见图2）。结合含有CCR5 shRNA的Cal-1载体，目前正在研究针对启动子的si/shRNA PromA，以开发针对宿主CCR5和病毒启动子靶标的组合HIV基因治疗。 7.基于体内传递的HIV基因治疗临床试验  采用体内方法治疗HIV的研究主要处于临床前阶段。体内方法涉及直接将基因治疗产品通过病毒载体（如腺病毒载体、腺相关病毒载体或非整合慢病毒载体）或非病毒方法（如纳米粒子）引入患者体内。体内方法可能无法提供持久的治愈，因为没有转基因与宿主遗传物质的稳定整合，并且需要优化特定细胞的传递，以减少脱靶效应的机会。通过重组酶或核酸酶系统的基因编辑，或使用RNA干扰或可能的CRISPR干扰的沉默机制，可以使用体内方法。 目前的临床试验包括使用leronlimab的研究，leronlimab是一种抗CCR5人源化IgG4抗体，通过与CCR5相同的附着位点（细胞外环2和N-末端结构域）结合，竞争性地抑制HIV env附着到CCR5。这种药物通过皮下给药，该组目前正在使用合成AAV载体进行传递。这项研究的几个版本—NCT00642707、NCT02175680、NCT02355184、NCT02483078、NCT02990858、NCT03902522、NCT02859961和NCT05271370—证明了产品的安全性和有效性，患者大多经历了轻微的副作用，并且在较高剂量的525 mg和700 mg时观察到效果。 CRISPR-Cas9技术用于HIV治愈 CRISPR及其CRISPR相关核酸酶9（Cas9）系统是一种基因编辑系统，通过导向RNA介导的基因组区域的双链断裂，然后通过非同源末端连接途径进行修复。最近发表了几篇描述HIV临床前研究的综述文章[222,223]。最近使用CRISPR-Cas9治疗HIV的临床试验是NCT03164135，该试验使用这项技术在进行异体干细胞移植治疗血液恶性肿瘤的患者中敲除HSCs中的CCR5基因。一名急性淋巴细胞性白血病患者的初步结果显示，完全供体嵌合体的缓解，并且敲除CCR5的供体细胞持续了19个月，没有基因编辑不良事件。然而，携带修改的淋巴细胞的百分比仅为5%，团队正在研究如何使过程更有效。另一种基于CRISPR-Cas9的HIV基因治疗产品是EBT-101（NCT05144386）。这种基因治疗作为单次静脉注射给药，并通过使用两个导向RNA靶向整合原病毒的三个位置的AAV传递。最近有三名患者参加了1期临床试验，该公司（Excision Bio Therapeutics, San Francisco, CA, USA）在2023年10月的欧洲基因和细胞治疗年会上提出的初步结果显示，没有剂量限制毒性或严重不良事件。 CRISPR-Cas 9可以用来靶向HIV-5′LTR，这是启动子区域，因此可以阻止潜伏病毒的复制或激活；CCR5或CXCR4区域，使细胞对感染有抵抗力；或促进HIV复制的限制因子，阻断它们的活性。虽然目前还没有CRISPR-Cas9基因治疗被批准作为HIV治愈方法，但FDA最近批准了第一种用于镰状细胞病的基于CRISPR-Cas9的细胞基因治疗方法，Casgevy（https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-first-gene-therapies-treat-patients-sickle-cell-disease, 访问日期为2024年1月27日），突显了基因治疗的创新进步和CRISPR-Cas9作为HIV治愈方法的潜力。 8.结论  长期或永久表达抗HIV基因和修改CD4+和CD34+细胞以使它们对感染有抵抗力或允许破坏HIV生命周期是实现HIV治愈的重要策略。尽管联合抗逆转录病毒治疗的出现大大改善了患者的治疗结果和HIV感染者的生活质量，但治愈是可取的，特别是对于已经对当前方案产生耐药性的患者。至少提供功能性治愈的产品可能需要多重治疗剂与不同作用模式的组合，以最小化耐药性的机会，并且是长效的，或理想情况下需要单次给药。因此，至关重要的是要利用当前生物技术的进步来增强基因治疗方法，并使基因治疗产品更安全、更经济、更持久。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

在这篇综述中，总结了未来实现长期缓解甚至治愈自身免疫性疾病的治疗策略。 尽管过去二十年在治疗自身免疫性疾病方面取得了重大进展，但大多数疗法不能治愈相关疾病，并且可能通过广泛抑制免疫系统而增加感染风险。然而，对自身免疫性疾病病因了解的进展以及嵌合抗原受体 T 细胞疗法等新型治疗方式的临床数据提供了证据，表明有可能重新建立免疫稳态，并有可能延长缓解甚至治愈自身免疫性疾病。在这里，提出了一个用于免疫系统调节的“序贯免疫疗法”框架，以帮助实现这一雄心勃勃的目标。该框架包括三个步骤： 具体来说，第 1 步是通过靶向免疫抑制控制炎症，第 2 步是通过消除致病性免疫记忆细胞来重置免疫系统，第 3 步是通过免疫调节剂和组织修复促进免疫稳态（图 1）。 图 1：免疫调节的序贯免疫治疗框架。   前言   自身免疫性疾病的治疗现状 自身免疫性疾病的特点是针对正常宿主成分的慢性异常免疫反应。目前针对这些免疫反应方面的自身免疫性疾病治疗（图1）可以使某些患者得到改善甚至缓解，但治疗停止后通常会出现疾病复发或发作。 然而，实验表明，长期缓解甚至治愈是可以实现的。例如，在患有多发性硬化症或类风湿性关节炎的患者中，有时会在怀孕期间分别观察到疾病复发的减少和疾病活动的改善，但随后经常会在产后期间出现症状。这些观察结果表明，即使自身抗原负荷没有变化，也可以在生理上诱导自身抗原耐受状态。第二个支持性观察证据是，对于患有恶性肿瘤引发的自身抗体介导的疾病（例如副肿瘤性皮肌炎、副肿瘤性天疱疮和副肿瘤性肌无力综合征）的患者，在手术切除或治疗潜在恶性肿瘤后，自身免疫表现通常会改善并消退。 自体造血干细胞移植（aHSCT）中观察到的持续治疗益处也为治疗潜力提供了支持。例如，在多发性硬化症患者的病例系列以及 II 期和 III 期研究中，aHSCT 导致疾病活动性和磁共振成像上新病变的形成显著而持续地减少。同样，在系统性硬化症患者中，aHSCT 优于环磷酰胺，可改善皮肤评分、降低肺动脉高压发生率并改善无事件生存。尽管对难治性狼疮的系统研究较少，但报告也表明 aHSCT 对这些患者具有潜在的长期益处。 免疫系统持久重置潜力的进一步证据来自器官移植领域，其中诱导免疫耐受仍然是保护同种异体移植物的“圣杯” 。肝脏移植尤其显示出免疫调节作用，同种异体肝脏移植通常比其他器官表现出较低的免疫抑制需求；部分个体可以实现完全的免疫抑制戒断。有趣的是，免疫抑制戒断似乎在长期同种异体移植的患者中最成功，这表明免疫耐受可以随着时间的推移而发展。 基于这些观察，我们相信自身免疫性疾病患者有可能实现长期缓解和治愈。尽管为了便于分类，实现这一目标的三步框架在下面以离散的顺序方式呈现，但治疗干预措施可能会并行发生，并且一些新的目标或治疗可能在多个步骤中相关。   01   第一步：控制炎症 第一步是控制炎症，从而治疗活动性疾病患者的症状。这一类别包括大多数已批准的自身免疫性疾病疗法，包括皮质类固醇，它们对免疫系统具有广泛的抑制作用，并且在大约 75 年里一直是主要治疗方法。大多数较新的疗法也主要通过抑制免疫功能来控制炎症，尽管它们可能更具选择性。例如针对特定细胞因子的单克隆抗体，如TNF。其中一些疗法会减少特定的免疫细胞群，例如可以消耗 B 细胞的单克隆抗体。 尽管有许多已获批准的控制炎症的疗法，但仍有机会针对新兴的生物学领域来开发临床差异化疗法。在这里重点介绍了一些的成熟的例子。1.1  针对致病细胞和途径 第一步中新型免疫抑制机制的一个关键考虑因素是仅针对病理途径，同时保留保护机制，从而避免广泛的免疫抑制。IL-17 和IL-23 抗体等药物治疗银屑病的临床经验表明，其疗效和广泛免疫功能的相对保留是可能的。重要的是，人类遗传数据还表明，抑制性较小但有效的免疫调节是可能的。例如，抑制TYK2（I 型干扰素和 IL-23 等细胞因子下游的细胞内信号分子）提供了一个典型案例。TYK2 抑制剂 deucravacitinib 对中重度斑块状银屑病患者有效，并获得美国食品和药物管理局 (FDA) 批准。最近，deucravacitinib 在治疗银屑病关节炎和 SLE 的 II 期研究中也证明了疗效，但没有证据表明机会性感染增加。 除了参与细胞因子信号传导和产生的个体细胞因子或激酶外，增加对疾病病理生理学中涉及的细胞和分子途径的理解将有助于发现新的靶点。一个例子是: 调节 CD40 和 CD40L 之间的相互作用，这对于 T 细胞介导的 B 细胞激活、类别转换和生发中心形成至关重要。最近，缺乏Fc 活性的抗 CD40 或修饰的抗 CD40L 分子在临床上取得了进展，并继续在 SLE、干燥病和格雷夫斯病中进行研究。 尽管补体级联历来被视为对病原体先天反应的关键参与者，但现在人们认为补体级联在免疫监视、组织稳态、适应性反应调节等方面发挥着更广泛的作用。当补体系统失调时，它会导致有害的炎症和组织损伤，几种有前景的抑制补体的方法正在开发中。例如，级联中的 C5 和 C3 抑制剂（如eculizumab 和 pegcetacoplan）已被批准用于治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿和非典型溶血性尿毒综合征等疾病。也可能进一步提供更安全、更有效的治疗的其他方法包括局部调节补体，仅在炎症部位进行抑制，而不进行全身抑制。 1.2  针对患者子集 尽管第一步中的靶标药物可用于治疗各种自身免疫性疾病和炎症性疾病，但并非所有患者都能平等受益，这可能反映了疾病生物学的异质性。有鉴于此，至关重要的是，不仅要确定基于因果人类生物学的目标，还要确定最有可能从这些目标的调节中受益的患者亚群。最近的药物批准和临床试验数据表明，患者分层以及预后生物标志物的开发和实施确实是可能的。例如，哮喘和慢性阻塞性肺病（COPD）已被认为是异质性疾病，新的治疗方法一直难以。在一些患者中，通过嗜酸性粒细胞计数增加来确定的 2 型炎症可能会导致疾病持续存在或恶化。 事实上，IL-4 受体 α 亚基 (IL-4Rα) 阻断单克隆抗体 dupilumab 对中度至重度慢性阻塞性肺病或嗜酸性粒细胞表型哮喘患者有效。它现已被批准用于治疗嗜酸性粒细胞水平高的中度至重度哮喘患者，并且正在接受监管审查，专门针对具有嗜酸性粒细胞表型的中度至重度慢性阻塞性肺病患者。 除了临床特征、实验室值和循环血液生物标志物之外，遗传分析也越来越多地被用来揭示通路相关性并识别患者亚群。 如上所述，先天免疫在自身炎症和自身免疫性疾病中也发挥着关键作用。在这方面，针对 I 型干扰素产生和信号传导的各种成分（例如cGAS-STING途径）可能有益于 SLE 等疾病，并且适合精准医疗。例如，一些 SLE 患者的血清或凋亡衍生微泡中的 2',3'-环状 GMP-AMP（cGAS 激活时产生的第二信使）水平升高，这表明抑制 cGAS/STING 可能特别有益在细分人群中 。 1.3  合理组合治疗 与银屑病治疗的进展相反，其中个体细胞因子（例如 IL-17 和 IL-23）的阻断已显示出显著的疗效和免疫功能的相对保留。这一假设在临床研究中得到了验证，其中 戈利木单抗（golimumab，抗 TNF）和古塞奇尤单抗（guselkumab，抗 IL-23）的组合比单独使用任一疗法表现出更高的疗效。   02   第二步：重置免疫系统 免疫系统的一个核心特征是它能够在随后暴露于相同抗原时产生保护性免疫力。这种免疫记忆可以防止相同病原体的再次感染，也是疫苗功效和控制适应不良状态（包括癌症）的基础；然而，它也可能产生有害影响。事实上，当中枢和外周耐受机制无法阻止对自身抗原或无害抗原的免疫反应时，免疫记忆在炎症持续存在中发挥着关键作用，并为过敏和自身免疫的长期缓解和治愈带来障碍。操纵免疫记忆以消除自身抗原的病理反应和记忆，同时保持有益的初级和记忆免疫反应的治疗方法是重置免疫系统过程中尚未满足的关键需求。 适应性免疫记忆存在于 B 细胞和 T 细胞亚群中，它们在自身免疫性疾病的病理生理学中发挥着独特但有时重叠甚至连续的作用。因此，重置免疫系统的方法根据这些细胞类型而有所不同。 2.1  靶向 B 细胞 自身抗体是各种自身免疫性疾病病理生理学的核心；因此，删除其来源有望获得治疗。 免疫记忆是由长寿命浆细胞的形成。为了应对感染和其他触发因素，B 细胞激活最终分化为抗体分泌细胞，在某些情况下可以提供持久甚至终身的免疫力。然而，并非所有 B 细胞反应都会导致长寿命记忆浆细胞的形成或抗体产生的维持。例如，因感染腮腺炎病毒或接种疫苗，个体体内可检测到抗腮腺炎病毒免疫球蛋白G（IgG）长达20年；相反，约 40% 从无症状或轻至中度 COVID-19 疾病中恢复的个体会失去 SARS-CoV-2 抗体。从这个角度来看，体液自身免疫中自身抗体的来源和抗体产生细胞的生命周期具有治疗意义。 鉴于 B 细胞激活和分化的复杂性，针对不同自身免疫环境的最佳 B 细胞记忆群体可能会有所不同。这一概念得到了自身免疫性疾病中各种 B 细胞耗竭或调节方法的临床经验的验证。人们对利妥昔单抗在治疗自身免疫性疾病中的潜力产生了热情，利妥昔单抗是一种抗 CD20 泛 B 细胞消耗抗体，对类风湿性关节炎有效，并且对 SLE 具有改善作用。具有改进的 B 细胞耗竭机制的替代抗 CD20 耗竭抗体，例如 ocrelizumab、obinutuzumab 和 ofatumumab，在临床试验中取得了进展，其中 ocrelizumab 和 ofatumumab 被批准用于多发性硬化症 。抑制选择性 B 细胞亚群的非耗竭方法，例如抗 CD19（obexelimab）和抗 CD22（epratuzumab）抗体，并未达到 SLE 研究中的主要终点，但有可能实现，对其他适应症或可能对患者亚群有效。 这些相互矛盾的数据表明，在 SLE 等疾病中，可能需要更深入的 B 细胞耗竭，包括各种组织区室（例如淋巴结和异位淋巴滤泡）或特定 B 细胞亚群，才能获得更广泛的疗效和 B 细胞免疫重置。值得注意的是，利妥昔单抗可以有效地消除外周血中的 B 细胞，但淋巴组织中的 B 细胞则较少。最近的研究表明，使用靶向 CD19 的嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞消除 B 细胞可以导致难治性 SLE 患者（包括复发患者）长期缓解（停止所有免疫抑制，包括全身类固醇）并减少自身抗体其他 B 细胞耗竭治疗后）以及对其他几种自身免疫性疾病的潜在益处，都证实了 B 细胞记忆重置可能导致长期缓解的观点。重要的是，SLE 中的 CD19-CAR T 细胞治疗导致新兴 B 细胞的表型和重链使用发生显着变化，再次表明 B 细胞库的潜在重置。虽然还处于早期阶段，但这些令人兴奋的数据支持了针对多种适应症的 B 细胞耗竭细胞治疗方法的临床研究，并取得了有希望的结果。对于这种新的治疗方式，确定长期风险和益处非常重要，包括潜在的神经毒性和细胞因子释放综合征（CRS），迄今为止正在进行的临床研究似乎可以控制这些风险和益处(图2)。 图 2：CAR T 细胞重置体液免疫的方法。 a，自体嵌CART 细胞。b，iPSC 的同种异体 CAR T 细胞。c，T细胞被设计为表达自身抗原CAR，以识别并结合在自身反应性B细胞上表达为B细胞受体（BCR）的自身抗体。d，在体内CAR T细胞。  “B 细胞重置”的早期证据是否是由于 CAR T 细胞相对于其他传统清除方法实现的更深程度的清除，还是由于致病性 CD19 + B 细胞群的特异性清除仍然是一个关键问题。在这方面，重要的是要考虑 B 细胞靶标的选择和效应器消耗机制。如，CD20 和 CD19 等靶标可识别不同的 B 细胞群，这些 B 细胞群可能与不同的自身免疫性疾病有不同的参与。事实上，CD19-CAR T 细胞治疗的早期数据表明，SLE 和重症肌无力中的自身反应性抗体产生细胞可能驻留在 CD19 + B 细胞和浆母细胞群体中，而不是长寿的浆细胞中CD19 阴性。T 细胞接合剂已进入 SLE、类风湿关节炎和其他自身免疫适应症的早期临床研究。相反，工程化 CAR T 细胞是细胞治疗方法中的效应器。 因此，任何这些消除方法诱导 B 细胞重置的潜力都取决于 B 细胞靶标和效应细胞的定位、频率、功能以及在所有相关区室中运输和杀死靶标 B 细胞的能力。 通过调节阶段特异性生存因子或信号通路来靶向 B 细胞也是一个积极研究的领域。BAFF 是一种通过 BCMA 发出信号的生存因子，是单克隆抗体贝利尤单抗 (belimumab) 的靶标，该抗体已被批准用于治疗 SLE 和狼疮性肾炎，并且正在开发用于其他自身抗体驱动的药物疾病。最后，BTK 的小分子抑制剂（除其他功能外，在 B 细胞发育、分化和激活过程中向 B 细胞受体 (BCR) 下游传递信号）已在多发性硬化症、免疫性血小板减少症 (ITP) 等自身免疫适应症中显示出前景。2.2  靶向浆细胞 B 细胞耗竭和多种自身免疫适应症调节的临床经验有助于产生新的数据驱动的治疗假设。例如，发现 CD20 耗竭和 BTK 抑制导致 SLE 中各种 B 细胞亚群减少，自身抗体减少不完全，且疗效令人失望，这表明这些方法未耗竭的浆母细胞和/或长寿命记忆浆细胞亚群可能至关重要用于 SLE 中的自身抗体生产。这些观察导致研究浆细胞靶向作为自身抗体介导的疾病的一种新策略，以消耗抗 CD20 或其他 B 细胞消耗方法未靶向的浆母细胞和浆细胞，并通过更快地降低自身抗体滴度来促进更快的缓解。 长寿命浆细胞如何以及在何处获得生存因子（例如 BCMA 配体 APRIL 和 BAFF）尚不完全清楚。浆细胞被认为会迁移到骨髓和肠道中的浆细胞生存位，在那里它们保持获得这些生存因子的机会。消耗长寿命浆细胞的一种潜在方法是调节其生存环境和获取生存因子。然而，由于已知多种细胞类型（包括破骨细胞和骨髓细胞）会分泌 APRIL，因此该假定生态位的细胞组织和关键成分尚未明确定义。此外，APRIL 和 BAFF 在 B 细胞激活和浆细胞存活中发挥作用。因此，目前尚不清楚阻断 APRIL 和 BAFF 是否会直接或间接导致浆细胞减少。在这种情况下，结合并中和 APRIL 和 BAFF 的 TACI-Fc 融合蛋白 telitacicept 在 SLE 的 II 期研究中显示出令人鼓舞的功效。CXCL12 及其受体 CXCR4 是促进浆细胞迁移到骨髓的关键趋化轴的一部分，并且可能是它们的生存生态位。事实上，CXCR4 拮抗剂 plerixafor 减少了骨髓中的长寿浆细胞，并延长了狼疮小鼠模型的生存。这一发现表明，调节浆细胞生态位中生存因子的获取可能是减少产生自身抗体的长寿命浆细胞的可行治疗方法。 治疗多发性骨髓瘤的方法已经了解了自身免疫性疾病中浆细胞耗竭的概念。批准的蛋白酶体抑制剂硼替佐米导致错误折叠的蛋白质在内质网中积累，导致内质网应激和细胞外蛋白质产量高的细胞死亡，例如浆细胞。在系统性红斑狼疮、自身免疫性溶血性贫血和其他自身抗体介导的疾病的病例报告、病例系列和小型临床试验中，硼替佐米证明了治疗效果，血液和骨髓浆母细胞和浆细胞显着减少，自身抗体迅速减少滴度。Daratumumab 是另一种被批准用于多发性骨髓瘤的药物，它与 CD38 结合，并通过抗体依赖性细胞毒性和补体依赖性细胞毒性诱导表达 CD38 的细胞消除。Daratumumab在两名对其他治疗无效的 SLE 患者以及抗磷脂综合征的案例研究中显示出自身抗体的快速减少和临床疗效 。 鉴于 BCMA 定向耗竭疗法在多发性骨髓瘤中取得的成功，那这些方法是否也可以增加对抗抗体介导的自身免疫的武器。事实上，BCMA 导向的 CAR T 细胞目前正在研究用于治疗全身性重症肌无力。鉴于 BCMA 在浆母细胞和长寿命浆细胞上的表达有限，并且记忆 B 细胞群上缺乏或有限的表达，与 CD19 的更广泛表达相反，针对 BCMA 阳性群体可能对于记忆 B 细胞有助于形成抗体分泌细胞的疾病，不会导致完全的免疫重置。鉴于 CD19 的 CAR T 细胞疗法在 SLE、特发性炎性肌炎和系统性硬化症中取得的早期成功，BCMA 介导的耗竭在记忆 B 细胞和浆母细胞驱动的疾病中可能不是必需的，并且可能会引入其他风险因素，例如疫苗记忆减少。由 CD19 阴性长寿命浆细胞驱动的适应症（例如轻链淀粉样变性）可能对 BCMA 介导的耗竭反应更好，而不是 CD19 介导的耗竭。 在前面提到的浆细胞耗竭示例中，硼替佐米和达雷妥尤单抗导致自身抗体迅速减少，停药后似乎会增加。这种增加可能是抗原驱动的自身反应性 B 细胞重新激活的结果，这些方法可能无法有效消除这些细胞。因此，在自身抗体介导的疾病中实现快速和长期的缓解可能需要清除浆细胞，然后进行自身反应性 B 细胞调节以防止复发，或者使用针对更广泛的 B 细胞群的方式（例如，双重治疗）进行更完整的 B 细胞和浆细胞重置。尽管很诱人，但这种方法也可能导致不良的免疫抑制风险。有鉴于此，有必要采取更精确的方法来消除自身反应性 B 细胞。2.3  靶向自身反应性 B 细胞 重置免疫系统的一个重大进步是选择性地消耗自身抗原特异性细胞，同时保留其他免疫细胞。这对于消除自身抗体产生细胞来说可能是可以达到的。当自身抗体识别的抗原已知时，原则上可以利用自身抗体也在 B 细胞表面表达为 BCR，以此设计识别自身反应性 B 细胞的诱饵。在寻常型天疱疮小鼠模型中，输入经工程改造以表达桥粒芯糖蛋白 3 (DSG3) 作为嵌合自身抗体受体的 T 细胞，可选择性杀死 DSG3 自身反应性 B 细胞，并改善自身抗体引起的棘层松解症和水泡形成。类似的方法正在临床前研究 MuSK 重症肌无力和 NMDAR 脑炎，以及临床研究 MuSK 自身抗体阳性重症肌无力。 一种选择性消耗或调节自身反应性 B 细胞的新兴策略是从抗体药物偶联物演变而来的。在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中用与地塞米松与已知自身抗原耦合物处理(autoantigen conjugated with dexamethasone)可改善临床评分。 B 细胞靶向和浆细胞靶向方式的临床数据表明，虽然许多方法在自身免疫适应症中表现出一定的功效，但并非所有方法都能实现真正的 B 细胞记忆免疫重置。除了抗体生成之外，B 细胞还通过细胞因子产生和抗原呈递参与免疫反应，重置B 细胞不足以清除免疫记忆。2.4  靶向 T 细胞耐受性和记忆 多样化的记忆 T 细胞群在防御感染和癌症以及自身免疫性疾病的慢性化方面发挥着重要作用。然而，这些功能的一个重要推论是，现有的治疗似乎并不能完全改变组织自身免疫记忆，从而导致治疗停止时疾病复发。例如，对白癜风治疗的反应，白癜风是一种色素脱失性疾病，其特征是免疫介导的皮肤黑素细胞破坏。尽管用 JAK 抑制剂或局部钙调神经磷酸酶抑制剂治疗可有效阻止白癜风，但临床研究表明，停止治疗后白癜风会迅速复发。JAK 抑制剂在白癜风小鼠模型中也同样有效。然而，它们并没有降低受影响皮肤中组织驻留记忆 T 细胞（TRM 细胞）的频率。在银屑病中也有类似的观察结果。因此，尽管单独靶向驱动炎症的效应T细胞可能会导致短期反应，但长期的疾病改变和治愈可能需要编辑或控制组织驻留的自身免疫记忆反应。 几种改变 T 细胞记忆的方法已进入临床研究，包括通过细胞表面标记物清除，以及利用分化和存活因子以及转录程序。2.4.1  耗尽记忆 T 细胞 在自身免疫小鼠模型中，包括 IBD 和白癜风，TRM 细胞的特异性删除可有效预防或逆转疾病，这表明 T RM 细胞耗竭可能有效地实现自身免疫性疾病的改变。记忆子集的选择性耗尽需要识别细胞表面标记、转录因子或其他记忆特异性特征。CD2 阻断性 LFA3-IgG 融合蛋白 alefacept 是选择性调节记忆 T 细胞群潜力的早期迹象，该蛋白于 2003 年被 FDA 批准用于治疗银屑病。CD2 是 T 细胞和其他淋巴细胞亚群中的共刺激蛋白，在某些记忆 T 细胞亚群中表达上调。在临床研究中，alefacept 优先耗尽效应 TRM 细胞，同时保留中枢记忆 T 细胞，并且不会大幅减少初始 T 细胞数量。大多数治疗后痊愈或几乎痊愈的银屑病患者也表现出疾病的长期缓解。值得注意的是，随着更广泛有效的治疗方法的出现，alefacept于 2011 年退出市场。另一个例子是 mogamulizumab，一种 CCR4 耗竭抗体，可耗竭中枢 T RM 细胞，尽管其开发目的是耗竭表达 CCR4 的调节性 T 细胞（T reg 细胞）。 其他记忆 T 细胞表面标记物已被描述，例如 TRM 细胞上的 CD103（αE整合素），它与 β7 整合素结合，结合上皮细胞表达的 E-钙粘蛋白，可能在皮肤和肠道中的滞留中发挥作用。因此，CD103介导的耗竭是重置组织驻留记忆的潜在方法（图3a）。在胰岛同种异体移植排斥的小鼠模型中， CD103 抗体耦合的saporin 或McMMAF 毒素（ADC）导致 T RM 细胞耗竭和胰岛同种异体移植物存活。这些方法的局限性是可能缺乏选择性，因为这些细胞表面标记物也是其他细胞类型表达的。 图 3a：重置 T 细胞记忆和恢复体内平衡的方法。 2.4.2. 抑制记忆 T 细胞分化和维持 记忆 T 细胞表达 IL-7Rα 和 IL-15Rα，并依赖 IL-7 和 IL-15 信号传导来维持和存活。在 1 型糖尿病 (T1D) 患者中，抗 IL-7Rα 阻断抗体减少了 TRM 细胞，并在较小程度上减少了幼稚 T 细胞计数，但相对不影响 Treg 细胞，与其低 IL-7Rα 表达一致。尽管这种方法很有趣并且可能会导致 T 细胞记忆重置，但 IL-7 信号传导在淋巴细胞发育和稳态中发挥着重要作用，并且广泛阻断该途径可能会导致严重的免疫抑制。 一种相关的方法是 IL-15Rα 阻断，因为 IL-15 对于 T RM 细胞分化是必需的，并且可能由角质形成细胞和其他细胞反式呈递以维持 T RM 细胞。在白癜风小鼠模型中，IL-15 信号传导抑制会减少 T RM 细胞，并导致持久的皮肤重新色素沉着。此外，缺乏 IL-15 的小鼠的幼稚 T 细胞数量有所减少，但并未消除，而缺乏 IL-7 的动物则存在严重的免疫缺陷。因此，对于某些记忆T细胞群来说，阻断IL-15反式呈递可能是比阻断IL-7更具选择性的方法（图3a）。这种方法需要注意的是，IL-15 与人体组织中 T RM 细胞维持的相关性尚未得到证实，至少一项针对乳糜泻患者的抗 IL-15 疗法的临床研究未能实现主要目标。白癜风 IL-15 阻断抗体的临床研究正在进行。 记忆 T 细胞群表达独特的转录程序以进行分化和维持。例如，TRM 细胞依赖转录因子 Hobit 和 BLIMP1 进行发育和组织保留。因此，利用蛋白水解靶向嵌合体或其他工具选择性抑制或降解保留因子可能会导致组织免疫记忆的重置（图3a）。然而，即使这种方法也可能导致多种细胞类型的减少，因为其他组织归巢的先天细胞也可能使用这些转录和迁移网络。因此，需要对选择性细胞表面标记和转录程序有更全面的了解，以开发针对记忆 T 细胞群的更具选择性的消除方法。2.4  靶向抗原特异性 T 细胞 尽管根据之前描述的方法，T 细胞记忆重置似乎是可行的，但未经选择和完全的 T 细胞记忆耗竭可能会导致感染或恶性肿瘤的风险增加。例如，在IL-7Rα阻断抗体的临床研究中观察到Epstein-Barr病毒重新激活的病例（包括有症状的活动性感染）。此外，较高剂量的抗 IL-7Rα 阻断抗体降低了对破伤风类毒素疫苗的回忆反应，凸显了对先前遇到的病原体和疫苗接种的免疫力丧失的可能性。因此，需要更多选择性地耗尽或调节自身反应性记忆T细胞。 乍一看，抗原特异性 T 细胞的耗竭似乎是可能的，就像前面描述的抗原特异性 B 细胞耗竭一样。然而，T细胞抗原识别的模式对这种方法提出了挑战。B 细胞受体直接识别抗原，而 T 细胞则识别其他细胞表达的主要组织相容性复合体 (MHC) 中呈递的肽抗原。CD4 + 辅助 T 细胞识别肽 MHC (pMHC) II 类复合物，而 CD8 + 细胞毒性 T 细胞识别 pMHC I 类复合物。MHC也是多基因和高度多态性的，不同的抗原表位在不同的个体中可能具有免疫优势。MHC 等位基因多样性和 pMHC 复杂性使得生产选择性消除自身抗原特异性 T 细胞的试剂变得更加困难，因为可能需要多个 pMHC 来识别和清除所有抗原特异性 T 细胞，并且这些 pMHC 库可能需要在不同的环境中有所不同。 在递送毒素的有效负载(ADC)或在 CAR T 细胞上表达的 pMHC 的鉴定和生产方面已经取得了进展，这尽管具有挑战性，但抗原特异性 T 细胞耗竭在临床环境中是可行的（图 3b）。一种可能更可行的方法可能是消耗富含自身反应细胞的特定 T 细胞亚群。例如，TRBV9+ T 细胞的耗竭（其亚群在强直性脊柱炎患者中扩增）已在案例研究中与临床反应相关，目前正在进行临床研究。与 B 细胞记忆重置一样，实现长期且安全的 T 细胞记忆重置的最佳方法仍有待阐明。 图 3b：重置 T 细胞记忆和恢复体内平衡的方法。 2.5  促进外周耐受性 自我耐受的显著特征在 T 细胞发育和成熟的各个阶段受到控制。中枢耐受(central tolerance)是指潜在自身反应性 T 细胞在胸腺中发育和成熟时的阴性选择（缺失）。这个过程并不是万无一失的，识别自身抗原的 T 细胞可以而且确实迁移到外周。既然即使是单个 T 细胞在遇到抗原时也能被激活并迅速扩增，为什么自身免疫没有更常见呢？除了中枢调节外，多个检查点和控制（T 细胞内在和 T 细胞外在机制）可以抑制外周自身反应性 T 细胞的命运。只有当中枢耐受性和外周耐受性都失败时，才会发生自身免疫。尽管关于这些检查点还有很多需要了解的地方，但新兴的生物学表明重置外周耐受性是潜在干预领域。 从胸腺中产生的 T 细胞最初的表型是幼稚的。似乎降低自身反应潜力的一种机制是保持静息状态，这是一种在没有炎症信号的情况下遇到抗原（包括自身抗原）时限制激活和扩张的过程。最近公认的幼稚 T 细胞静止的驱动因素是含有 V 型免疫球蛋白结构域的 T 细胞激活抑制因子 (VISTA)，其激动作用导致 T 细胞缺失和耐受。这些结果表明，VISTA 或其他静止调节剂的调节可能是维持或重建外周耐受性的有希望的干预点。 T 细胞受体 (TCR) 介导的激活后，额外的检查点控制 T 细胞的命运。例如，如果初始 TCR 刺激发生在没有共刺激信号的情况下，幼稚 T 细胞可能会变得无功能。临床上已经开发的一个关键共刺激途径是 CD28 途径。抗原呈递细胞 (APC) 将 MHC 背景下的肽呈递给 T 细胞表面的 TCR，然后激活的 APC 同时通过 CD80 和 CD86 提供共刺激，CD80 和 CD86 与 T 细胞上表达的 CD28 结合。鉴于 CTLA4 对共刺激配体的亲和力较高，开发了 CTLA4-免疫球蛋白融合蛋白来防止 T 细胞激活并促进无反应性。两种 CTLA4-免疫球蛋白生物制剂已投入临床使用：阿巴西普 (abatacept)，被批准用于类风湿关节炎、银屑病关节炎和多关节型幼年特发性关节炎；和belatacept，被批准用于预防肾移植排斥。虽然共刺激阻断的主要机制是防止 T 细胞活化和扩增，但无反应性诱导可能也发挥了作用。此外，CD28 阻断还被用来促进离体供体 T 细胞的无反应性，以降低无关供体骨髓移植后发生移植物抗宿主病 (GVHD) 的风险。对有类风湿性关节炎风险的个体（瓜氨酸肽抗原（ACPA）抗体呈阳性，磁共振成像显示有炎症证据，但没有明显的关节炎）短期使用abatacept试验的新数据表明，类风湿性关节炎的发展可能通过共刺激阻断和无反应性诱导来减少或至少延迟，从而表明重置免疫系统以实现长期缓解的潜力。 如果外周 T 细胞成功激活并扩增，耗竭和克隆删除等机制可能会进一步限制反应。T 细胞耗竭是一种与持续抗原暴露相关的功能障碍状态，首先在慢性病毒感染中观察到，但在免疫肿瘤学背景下最好理解，检查点阻断可逆转 T 细胞功能障碍并增强抗肿瘤作用免疫。多种证据表明 T 细胞耗竭是限制自身免疫的一条活跃途径。免疫检查点治疗与免疫不良事件有关，例如白癜风、皮炎和结肠炎。CD8 + T 细胞耗竭特征还与自身免疫性疾病（如 SLE、抗中性粒细胞胞浆抗体相关血管炎和 IBD）的良好预后（例如较少发作）相关。在 T1D 患者中，与没有此特征的患者相比，胰岛特异性 T 细胞中 T 细胞耗竭的证据具有进展较慢的表型。此外，CD3 抗体 teplizumab 可有效预防或延缓高危患者的 T1D 发展，并在具有临床反应的患者中诱导 T 细胞耗竭样表型。这些观察结果表明，检查点激动剂（至少部分通过诱导衰竭表型）可能有助于重置外周耐受性。事实上，一些通常与 T 细胞耗竭相关的 T 细胞免疫检查点激动剂，例如 PD1、BTLA 以及LAG3，目前正处于临床前或临床开发阶段，并取得了令人鼓舞的结果处于早期研究。 在胸腺分化过程中，髓质胸腺上皮细胞表达外周组织抗原，导致高反应性 T 细胞受体的克隆清除（阴性选择导致中枢耐受），自身免疫调节因子是负责这种表达的转录因子。克隆清除在外周也可能很重要；例如，树突状细胞可能通过 Fas 和 Fas 配体 (FasL) 相互作用促进效应 T 细胞凋亡。事实上，耐受性树突状细胞——可能是固有耐受性的（称为天然耐受性树突状细胞）或由特定环境（例如在没有炎症的情况下暴露于凋亡碎片）诱导的——可能采用各种机制来增强外周耐受（图3c）。如前所述，耐受性树突状细胞（和其他耐受性 APC）可能会消耗 T 细胞，但也会促进 T 细胞无反应性，并通过检查点激动剂和抗炎细胞因子（如 IL-10）的表达主动诱导衰竭或抑制。此外，耐受性APC可介导效应T细胞向外周Treg 细胞的转化，进一步增强抗原特异性耐受。例如，肠道淋巴结中的 RORγt + 细胞群最近被鉴定并描述为耐受性 APC，可促进外周 Treg 细胞的分化和扩增，在耐受性中发挥重要作用。尽管 Treg 细胞显然在外周耐受中发挥作用，但在序贯免疫治疗方法的第 3 步中更全面地讨论了它们的治疗潜力。 图 3c：重置 T 细胞记忆和恢复体内平衡的方法。 致耐受性树突状细胞用于记忆耐受性的多种机制已被用于治疗目的，例如 CTLA4-免疫球蛋白和检查点激动剂。随着对致耐受性 APC 的了解越来越深入，对树突状细胞或其他 APC 进行操作和重编程以促进耐受性成为可能。在 EAE 小鼠模型中，使用含有髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 (MOG) mRNA 的纳米颗粒的非炎症疫苗导致脾树突状细胞表达 MOG 抗原，从而引发耐受性，具体表现为临床症状改善、抗原特异性效应 T 细胞减少、剩余抗原特异性 T 细胞中耗竭标志物的增加、与 EAE 相关的效应 T 细胞反应的抑制。已经开发出几种以耐受性方式递送肽的方法，并在临床前模型中实现了概念验证，其中一些已进入临床测试。2.6  通过操纵自身抗原实现耐受 T 细胞记忆和 B 细胞记忆维持自身免疫反应的长期性。这些记忆群体依赖于持续暴露于自身抗原来激活和分化。那么是否有可能通过减少抗原负荷来规避这种慢性激活和记忆形成？在类风湿性关节炎中，患者会产生针对翻译后修饰蛋白（尤其是瓜氨酸蛋白）的自身抗体，并且 ACPA 的出现可能先于明显的炎症性关节炎的发作。翻译后瓜氨酸化由肽基精氨酸脱亚胺酶 (PAD) 家族介导，其中 PAD2 和 PAD4 主要参与类风湿性关节炎的发病机制，包括遗传、细胞和翻译证据。此外，一些糜烂性类风湿性关节炎患者会产生激活性抗 PAD4 抗体。类风湿性关节炎前期或早期类风湿性关节炎中瓜氨酸新抗原的减少可以限制自身反应性T细胞和B细胞记忆以及翻译后修饰蛋白抗体的形成，并延迟或预防类风湿性关节炎。事实上，PAD 抑制在类风湿性关节炎小鼠模型中显示出功效。这种调节抗原的方法是否适用于其他自身免疫性疾病尚不清楚，但对翻译后修饰的新抗原具有特异性的 T 细胞反应性或自身抗体已在 SLE、T1D 和其他自身免疫性疾病中得到描述。 抗双链 DNA 抗体和 DNA 降解能力受损是 SLE 患者的特征。事实上，一些 DNAse 的缺陷，如 DNAse1、DNAse1L3、DNase II 和 TREX1，已与单基因狼疮相关，并且 DNAse1L3 的自身抗体和含有游离 DNA (cfDNA) 的微粒负载与一些散发性 SLE 患者的疾病活动度相关。cfDNA 的来源之一是由活化的中性粒细胞排出的解压缩染色质的中性粒细胞胞外陷阱 (NET)。NET 形成失调 (NETosis) 与多种自身免疫性疾病有关，包括 SLE。因此，减少 cfDNA 可能是限制自身抗原负荷的有效方法。值得注意的是，NETosis 是通过 PAD4 酶对组蛋白进行瓜氨酸化来调节的，这表明 PAD 抑制可能通过减少新抗原以及减少 NETosis 和 cfDNA 来减少抗原负荷。   03   第三步：体内平衡和组织修复 序贯免疫治疗方法的第三步也是最后一步是促进和维持体内平衡和组织修复。这是实现持久反应的重要一步，因为患有自身免疫性疾病的患者可能会增加易患自身免疫性疾病的危险因素。一旦活动性疾病得到控制并且免疫记忆被重置，是否有可能防止新的自身反应细胞的出现？3.1  靶向调节性 Treg 细胞 Treg 细胞是免疫耐受和体内平衡的关键驱动因素，T reg 细胞表达的 FOXP3 基因突变的患者会出现免疫失调、多内分泌病、肠病、X连锁（IPEX ) 综合征。此外，T reg 细胞减少和/或功能障碍对自身免疫病理生理学的影响是一个活跃的研究领域。在小鼠模型中，过继性 T reg 细胞转移可预防自身免疫和移植排斥，表明 T reg 细胞操作可用于治疗。事实上，体外 T reg 细胞扩增和转移已经在 GVHD 预防的多项临床研究中进行了测试，并取得了一些令人鼓舞的结果。 尽管 T reg 细胞功能可能符合序贯免疫治疗范例的步骤 1 和 2，但我们相信 Treg 细胞的扩增和激活将通过产生耐受性来促进长期免疫稳态，因此，它是第 3 步中的关键支柱。尽管 T reg 细胞调节的最佳干预措施仍有待确定，但临床上正在研究以下几种方法。3.1.1.  IL-2R激动剂 IL-2 是所有 T 细胞的关键生长因子，并且是已批准的黑色素瘤和肾细胞癌治疗方法。高剂量时，IL-2 可以扩增常规 T 细胞并产生抗肿瘤反应。Treg 细胞比传统 T 细胞表达更高水平的 IL-2Rα 亚基，因此在较低的 IL-2 浓度下被激活和扩增。这一观察结果得出了这样的假设：低剂量的 IL-2 可用于使 T 细胞向 T reg 细胞的扩增。在小型早期临床研究中，低剂量 IL-2 可以扩增 Treg 细胞，并在多种自身免疫性疾病（例如 GVHD 和 SLE ）中显示出临床疗效。 尽管令人兴奋，但这种低剂量 IL-2 方法受到细胞因子短半衰期的限制。正在开发基于 IL-2 的修饰剂，其具有改进的药代动力学和易于给药以及对 T reg 细胞的更高的选择性。其中几种方法改变了药物对 IL-2R 亚基的亲和力，以进一步增强 T reg 细胞中的 IL-2R 激动作用，包括半衰期延长和 IL-2Rβ 结合减少的聚乙二醇化 IL-2 分子以及与 Fc 或其他载体融合的 IL-2 突变蛋白，可减少与 IL-2Rβ 的结合，同时延长半衰期。这些方法目前正在接受临床评估。IL-2R 结合修饰的另一种选择是通过优化药代动力学来提高 T reg 细胞 IL-2R 激动选择性。一种长寿命的 IL-2-CD25 融合无活性二聚体蛋白被证明可以缓慢解离成活性单体，并导致选择性 T reg 细胞扩增，并在自身免疫动物模型（包括 SLE）中发挥功效，该药物也正在进行临床测试。 尽管这些新型偏向性 IL-2R 激动剂在改善 T reg 细胞选择性方面令人鼓舞，但在野生型 IL-2 和修饰型 IL-2 中均观察到嗜酸性粒细胞增加的证据（可能通过 ILC2 间接实现） -介导的 IL-5 产生）。迄今为止所见的嗜酸性粒细胞增加似乎并未限制。除了 ILC2 之外，自然杀伤细胞的子集（CD56 bright 自然杀伤细胞）也会被低剂量 IL-2 激活，这也被描述用于一些偏向 IL-2R 的方法。未来的研究将确定当前的 IL-2R 激动剂是否具有足够的选择性，或者是否可以开发新的、更具选择性的 IL-2R 介导的方法。 尽管低剂量 IL-2 的早期数据令人鼓舞，但最近对该方法的热情有所下降，因为多项临床研究未能显示对多种适应症的益处。尽管 T reg 细胞扩增强劲，但临床疗效却乏善可陈，一个假设是，即使有偏向的 IL-2R 信号激动剂也可能激活除 T reg 细胞之外的炎症细胞亚群。或者，T reg 细胞激活可能不足以控制炎症，但只有在炎症损伤减弱后才可能促进体内平衡和组织愈合。在这种情况下，我们预测，正如我们的序贯免疫治疗方法所表明的那样，作为序贯治疗的一部分控制炎症后，T reg 细胞扩增将有效预防复发。3.1.2.   T reg 细胞的替代靶标 其他 T reg 细胞靶标也在研究中，例如 TNF 受体 2 (TNFR2) 激动作用。TNF 通过与两种不同的受体 TNFR1 和 TNFR2 结合来介导其多效性功能。TNFR1 主要介导跨多种细胞类型的 TNF 信号传导的促炎作用，而 TNFR2 与免疫调节活性相关，并且具有更严格的表达模式，包括在 T reg 细胞中的表达。TNFR2 选择性激动可促进 GVHD 和实验性关节炎模型中的 Treg 细胞扩增。此外，TNFR2 激动型抗体在体外扩增了人类 Treg 细胞群。 尽管这些数据令人鼓舞，但 TNFR2 在多种细胞类型中表达，包括效应 T 细胞和骨髓细胞，跨细胞类型的选择性刺激的效果仍有待了解。T reg 细胞表达的其他受体已成为目标，例如 ST2，一种警报素细胞因子 IL-33 的受体，可促进组织中 T reg 细胞的增殖。肿瘤浸润的Treg细胞中ST2表达增加，表明 ST2 + T reg 细胞具有有效的抑制作用。3.2  Treg 细胞疗法 初步证据表明，离体扩增的多克隆 Treg 细胞过继转移对于自身免疫适应症具有治疗潜力。尽管这些结果令人鼓舞，至少在该方法的可行性、安全性和耐受性方面，但疗效仍有待在大型、对照良好的研究中进行评估。同时，动物模型还证明，与多克隆 Treg 群体相比，抗原特异性 T reg 细胞控制自身免疫的能力，部分原因是特异性归巢到相关受影响组织。这些临床前数据激发了人们对开发抗原特异性 Treg 疗法的兴趣。尽管令人兴奋，但这种方法受到循环中这些细胞的稀有性的限制，这需要复杂的分离和扩增方法。 或者，已经开发了抗原特异性工程化 T reg 细胞以促进生产和利用（图 3d）。一种方法是生成 CAR Treg 细胞，例如识别 HLA-A2 的细胞，用于预防 HLA-A2+ 器官移植排斥。Treg 细胞也可以用具有已知特异性的 TCR 或对疾病相关 pMHC 具有特异性的 CAR 来生成，例如用于治疗多发性硬化症或 T1D。工程化 Treg 细胞技术的一个关键问题是 Treg 细胞表型的耐久性和稳定性。为了解决这些问题，如通过强制 FOXP3 表达和通过可调节的细胞因子受体表达来支持细胞因子。 图 3d：重置 T 细胞记忆和恢复体内平衡的方法。 3.3  附加机制 在皮肤和肠道等上皮组织中，损伤后屏障破坏或无法修复可能会引发炎症和耐受性破坏。如丝聚蛋白基因；这种表皮蛋白突变的个体不仅患特应性皮炎的风险增加，而且患哮喘、食物和其他环境过敏的风险也增加。同样，SPINK5（在角质形成细胞中编码丝氨酸蛋白酶抑制剂 LEKTI）具有功能丧失突变的个体会表现出异常的皮肤屏障，导致 Netherton 综合征。在 IBD 患者中，确定了与上皮修复相关的肠道潜在缺陷，例如 PTGER4、ERRFI1 和 HNF4A 风险等位基因，它们可能通过丧失对管腔内容物的耐受性来发挥作用。这些位于上皮缺陷下游的复杂特征表明屏障生物学在自身免疫和炎症性疾病的病理生理学中的重要作用。一旦炎症得到控制并重置自身免疫，维持体内平衡可能需要恢复和保存屏障；因此，上皮生物学可能已经成熟，可以识别促进上皮完整性的新靶点。 除了上皮-免疫相互作用之外，过度活化的基质细胞（例如成纤维细胞）是免疫介导的炎症性疾病的基本特征。纤维化已被确定为 IBD 的并发症，特别是克罗恩病，纤维化可导致狭窄，可能需要手术干预。间充质细胞，尤其是肌成纤维细胞，在促进炎症和纤维化方面发挥致病作用。针对自身免疫性疾病纤维化的疗法，例如通过 ALK5 抑制调节转化生长因子-β (TGFβ) 途径，目前正在进行临床研究。 几种炎症性疾病的发病机制也可能与胞吞作用（吞噬细胞清除凋亡细胞）的缺陷有关，表明该过程可能是一个治疗靶点。胞吞作用对于体内平衡过程中的组织修复、炎症消退和免疫平衡调节非常重要，其缺陷会导致凋亡细胞积聚，随后导致坏死、细胞溶解和引发组织损伤的细胞内成分的产生。cAMP 和DEL1已被证明可以刺激巨噬细胞胞吞作用，数据还表明 DEL1 在炎症环境中促进体内平衡功能。Treg 细胞还可以通过分泌 IL-13 并随后刺激巨噬细胞中 IL-10 的产生来诱导巨噬细胞胞吞作用。 除了凋亡细胞清除的缺陷外，坏死性凋亡（由 TNF 引发的一种非凋亡和促炎性细胞死亡形式）还通过诱导不受控制的炎症反应与疾病慢性化和组织损伤有关。然而，通过抑制 RIPK1 来阻断坏死性凋亡在类风湿性关节炎和银屑病的临床试验中取得了不同程度的成功，这表明坏死性凋亡作为炎症靶点仍需要进一步探索。 最后，神经系统与免疫系统的相互作用参与自身免疫性疾病和神经炎症性疾病。新的证据表明，神经免疫相互作用（即先天性和适应性免疫系统与神经元之间的相互作用）对于有效免疫、组织稳态和组织修复至关重要。这些神经免疫相互作用的一个关键例子是特应性皮炎的瘙痒放大和慢性化，这也可能有助于解释临床环境中 IL-4Rα 和下游信号传导抑制所带来的瘙痒的快速缓解。另一个例子是心理压力和 IBD 症状之间有充分记录的联系，这似乎是由肠神经系统介导的。然而，这些神经免疫相互作用可以促进或抑制免疫力，具体取决于组织微环境和免疫反应介质。例如，在肠道中，源自肠神经元的血管活性肠多肽会刺激 IL-22 的产生，IL-22 会影响上皮细胞等非淋巴细胞，对于维持肠道屏障的稳态至关重要。   结论   我们相信，在治疗自身免疫性和炎症性疾病方面实现长期缓解和治愈的可能性是指日可待的。这一雄心勃勃的目标得到了针对 SLE 等疾病的 CD19 靶向 CAR T 细胞疗法的有希望的新兴临床数据的支持，抗 IL-23 和抗 TNF 疗法等药物的合理组合正在突破 IBD 治疗的疗效上限、以及基于精准的方法的出现，例如针对 COPD 和 2 型炎症患者的抗 IL-4Rα 疗法。 这里提出的序贯免疫治疗框架正在指导我们的药物发现组合。该方法还基于人类生物学因果关系的靶标识别，并通过将模式与机制相匹配的新技术来促进，使我们能够解决以前无法针对的疾病驱动因素。结合特定临床或分子患者亚群的识别以及通过转化生物标志物、临床试验和监管进展建立临床概念证明的途径，序贯免疫疗法有望改变免疫性疾病的治疗方法。 参考文献:/10.1038/s41573-024-00959-8   近期活动推荐   【现场参会】 报名通道；审核制 ▼ 共建Biomedical创新生态圈！ 如何加入BiG会员？

压力大的时候，人们往往会经历一系列身体和心理上的反应，比如：过大的压力会影响记忆、认知、行为，以及全身稳态（包括心血管、胃肠道和免疫系统），导致人们更加容易生病。此外，生病会使得患者压力倍增，从而加重疾病，如此一直恶性循环下去。 在癌症治疗中，慢性压力与患者预后不良和转移风险增加有关，但其根本机制仍不清楚。近日，约翰霍普金斯大学研究团队在Cancer cell杂志发表研究成果，揭示了慢性压力促进弥漫性癌症细胞的肺转移的途径，并确定中性粒细胞及其细胞外陷阱（NET）是这一过程中的关键介质。 一、研究内容与思路 1、慢性压力促进肿瘤转移 作者给予乳腺癌小鼠慢性约束压力，发现慢性约束压力使肿瘤大小增加一倍，肿瘤转移率增加2至4倍。此外，原发性肿瘤的免疫微环境显示，T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和活化巨噬细胞的浸润减少，而中性粒细胞的浸润增加。进一步，作者采用了慢性不可预测的轻度压力（CUMS）模型来模拟癌症患者所经历的不可预测的压力，结果发现，暴露于CUMS的小鼠肺转移率增加了一倍。 当小鼠受到压力的时候，血浆皮质酮水平升高。对此，作者检测了皮质酮是否会促进肿瘤转移。结果发现，原发肿瘤切除后，与安慰剂颗粒相比，植入缓释皮质酮颗粒可增加转移病灶的数量和总转移负荷，但敲除肿瘤细胞糖皮质激素受体（GR）对肿瘤转移无影响。也就是说，慢性压力会促进肿瘤转移，但不依赖于GR。 研究思路1：在日常生活中，研究者发现压力会导致肿瘤患者病情加重；对此，开展了研究探讨压力与肿瘤增大及转移的关系。首先，将慢性约束压力小鼠模型与肿瘤小鼠模型结合起来，探讨肿瘤小鼠受到慢性约束压力的影响，进一步换了另外一种压力模型来佐证，最终表明压力会促进肿瘤转移，且不依赖GR。 2、慢性压力诱发促癌转移的微环境 GR在慢性压力诱导的癌转移中没有发挥作用，是不是因为微环境发生了改变导致的癌转移增加？对此，作者通过RNA-seq分析了慢性压力小鼠的肺部组织后发现，慢性压力显著上调了与细胞外基质（ECM）组织相关的基因的表达，同时下调了参与T细胞活化和适应性免疫反应的基因。 同样，与GO分析一致，慢性压力小鼠或用皮质酮或地塞米松治疗的小鼠肺部的纤连蛋白沉积明显增加，慢性压力小鼠肺部的T细胞浸润减少，中性粒细胞浸润和介导中性粒细胞募集的趋化因子（Cxcl2和Cxcl5）表达升高。 接着，作者将T细胞与中性粒细胞一起培养，发现中性粒细胞能够激活CD8+ T细胞；但在用GR激动剂或地塞米松处理后，中性粒细胞失去激活T细胞的功能。此外，在中性粒细胞缺失的乳腺癌小鼠模型中，慢性压力诱导不能促进肿瘤转移。 以上数据表明，慢性压力会诱发促转移的肺微环境；中性粒细胞在协调压力诱导的转移中起着关键作用。 研究思路2：在第一部分研究中发现，肿瘤小鼠在慢性约束压力下，GR及免疫微环境发生了改变；此外，进一步的研究显示，GR对肿瘤转移没有影响，所以作者探讨了免疫微环境在肿瘤小鼠收到慢性约束压力中发挥的作用。这一环节中，作者从基因角度入手，通过测序发现了发生变化的基因，之后结合免疫反应一步一步分析锁定T细胞和中性粒细胞。 3、压力改变中性粒细胞昼夜衰老，并通过GR信号传导诱导NET形成 为了研究压力如何影响中性粒细胞从而促进肿瘤转移，作者分析了从压力小鼠肺部分离的中性粒细胞的基因表达变化。结果显示，压力小鼠许多上调基因与用地塞米松或GR激动剂处理的精神压力小鼠中性粒细胞中部分上调的基因重叠，提示精神压力小鼠中性粒细胞基因表达变化主要由GCs引起。 进一步分析发现，在精神压力小鼠中，中性粒细胞GR的激活，能够上调中性粒细胞中与昼夜节律以及氧化压力反应相关的基因（低Cxcr2和高Cxcr4），引起中性粒细胞出现异常的昼夜变化，表现出异常的衰老表型，并且中性粒细胞ROS生成增加，诱导中性粒细胞细胞外陷阱（NET）形成。 与对照组相比，在中性粒细胞条件敲除GR的小鼠中，精神压力不能引起NET形成的增加，并且皮质酮、地塞米松和GR激动剂也不能诱导小鼠中性粒细胞形成NET。通过分离中性粒细胞并进行体外刺激，作者发现糖皮质激素（GCs）在中性粒细胞中诱导ROS生成，导致细胞周期蛋白D3上调和p38 MAPK磷酸化，同时增加细胞周期蛋白依赖性激酶4/6的活性，最终形成NET。 研究思路3：锁定中性粒细胞后，慢性压力对于中性粒细胞的影响是什么？作者依然从源头出发，靶向基因，探讨基因变化，结果发现中性粒细胞基因变化是由于GCs引起的，这时候将第一环节的GCs联系起来了。进一步挖掘探讨中性粒细胞是如果发生的变化，以及对于后续产生什么影响。 4、靶向压力诱导的NET可挽救转移瘤 作者检测了衰老标记物的表达，发现GR沉默小鼠的中性粒细胞与正常小鼠的中性粒细胞一样，没有经历压力诱导的异常昼夜衰老。此外，慢性压力不会诱导GR沉默或中性粒细胞耗竭野生型小鼠肺部的纤维粘连蛋白沉积。然而，中性粒细胞中的GR缺失消除了慢性压力诱导的乳腺DCC肺转移。 考虑NET的促转移作用以及在慢性压力小鼠中观察到的GR依赖性NET水平升高，作者采用DNase I消耗NET，测试了压力诱导的转移是否需要NET。结果显示，压力诱导的纤连蛋白沉积需要NET——在自发播散模型中，使用手术切除时肿瘤大小相当的小鼠，DNase I介导的NET消化减少了压力诱导的肺转移——与压力对照小鼠肺部的高度增殖转移相比，DNase I处理的压力小鼠肺部的DCCs基本上没有增殖，DNase I导致压力诱导的转移显著减少。 研究思路4：发现中性粒细胞通过昼夜节律以及NET发挥作用后，作者进一步挖掘并验证NET是否在这一环节中有着重要作用。对此，给予处理消耗NET后探讨相关指标，结果表明NET在肿瘤转移环节发挥重要作用。 小结 综上所述，作者的数据揭示：慢性压力暴露通过释放GCs推动转移，而这些GCs通过诱导中性粒细胞形成NET，来建立一个有利于转移的微环境。 该研究团队发现，慢性压力使小鼠癌细胞转移率增加2-4倍。慢性压力会显著改变肺微环境，包括纤连蛋白积累、T细胞浸润减少和中性粒细胞浸润增加。消耗中性粒细胞可消除压力诱导的转移。同时，慢性压力会改变中性粒细胞的正常昼夜节律，并通过GCs释放导致NET形成增加；但在特异性GR缺失的小鼠中，慢性压力不能增加NET和转移。此外，用DNase I消化NET可防止慢性压力诱导的转移。 参考文献： [1] He XY, Gao Y, Ng D, et al. Chronic stress increases metastasis via neutrophil-mediated changes to the microenvironment. Cancer Cell. 2024;42(3):474-486.e12. doi:10.1016/j.ccell.2024.01.013 撰写 | MIE 编辑 | 小饼干 来源 | 梅斯学术 本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！