Arginine

DOI:  10.1002/anie.202422372 靶向共价抑制剂（TCIs）与非共价小分子抑制剂相比，在许多情况下都表现出更高的效力和选择性，并且可以在机体内停留更长的时间，延长药效；在一些情况下，TCIs可以帮助缓解与癌症相关的获得性耐药性问题。 当前，绝大多数TCIs，包括所有的FDA批准的针对蛋白激酶的共价药物，都是基于与暴露的非催化性Cys残基反应而设计的；然而，大多数药物靶蛋白并不存在非催化性Cys，例如500多种蛋白激酶中，超过一半的蛋白激酶没有非催化性Cys残基。因此，拓展TCIs靶向非Cys类的、丰富存在的、不易突变的亲核性氨基酸非常关键。 近日（Jan. 08），新加坡国立大学、中山大学、暨南大学等合作，在Angew. Chem. Int. Ed.上刊载了一篇以乙二醛作为共价弹头，具有细胞活性的、不可逆共价靶向精氨酸残基的研究。这种策略同时适用于激酶类、和非激酶类靶标，具有普遍的适用性。 01 精氨酸靶向共价抑制剂 1.1、精氨酸靶向共价抑制剂开发的潜力 精氨酸（R）类似于赖氨酸（K)，是蛋白质中最丰富的一类氨基酸，其出现频率为5.4%，在蛋白质折叠、活性、蛋白质-蛋白质以及蛋白质-核酸相互作用中发挥重要作用。 精氨酸经常作为抑制剂与靶蛋白的识别位点，通过与带有负电荷的羧酸盐或磷酸盐基序发生静电相互作用或形成氢键；其也是蛋白质相互作用（PPI）“热点”中第二丰富的氨基酸。 药物靶标的溶剂前沿点经常发生突变，转变为精氨酸，包括一些激酶，如TrkA G595R、ALK G1202R等，导致获得性耐药性。解决这种耐药性问题的可行性方案之一既是靶向共价抑制剂。 精氨酸具有作为共价靶向潜力。 除了它比Cys更广泛存在以外还有它自身特性以及有可用“弹头”方面的原因。首先，就精氨酸而言，具有很强的碱性残基。其胍基残基在生理条件下pKa~12，总是完全质子化的，因此具有弱亲核性；再者，多种反应性亲电基团已被用于选择性修饰精氨酸残基蛋白，如各种邻二羰基基团，包括苯乙二醛、甲基乙二醛、1,2-环己二酮、α,β-二酮酰胺等。 1.2、基于α,β-二酮酰胺的精氨酸TCIs 最近也已经有精氨酸TCIs的报道，如下图，2022年，J Am Chem Soc上报道的首个利用α,β-二酮酰胺靶向KRASG12R，设计了不可逆共价抑制剂。 如上图，这个报道首先给优化的亲和元件上安装了α,β-二酮弹头，并将其氧化为α-二羟基的不稳定结构，这种不稳定结构易于与精氨酸胍基团自发性反应成环。然而，比较遗憾的是该化合物不具有细胞活性。 此外，需要在抑制剂（亲和元件）和引入的弹头（α,β-二酮酰胺）之间连接N原子，这可能进一步限制了该“弹头”在其它药物靶点上的应用。 1.3、精氨酸与乙二醛 精氨酸与乙二醛的Maillard反应中的糖基化位点，也经常被用于精氨酸选择性蛋白修饰、和DNA/RNA的共价修饰，如下图A、B。 在亲核性更强的赖氨酸、半胱氨酸都存在的情况下，“携带”有乙二醛“亲电弹头”的共价抑制剂为什么可以化学选择性地靶向亲核性更弱的精氨酸残基呢？ 如上图C，可以合理地解释这种现象发生的原因：这主要是由“热力学因素”致使的，乙二醛与精氨酸首先发生可逆性缩合，进而脱水打破可逆性平衡，产生了高度稳定的五元环加和产物。这一过程比由Lys、Cys残基获得的可逆、或不稳定的加合物更加有利。 因此，带有乙二醛共价弹头的TCIs更容易化学选择性靶向精氨酸。 本文正是利用乙二醛弹头开发靶向精氨酸的TCIs。 02 基于乙二醛弹头的TCIs设计 2.1、基于乙二醛弹头的设计思路 首先，如下图，乙二醛弹头可以从羧基结构（COOH）通过三步适度的变化，经由α-羰基偕二醇转化获得。鉴于偕二醇与乙二醛之间的不平衡转化，可以对于通过偕二醋酸酯进行保护和脱保护。 再者，羧基（COOH，来自药物）和精氨酸（来自蛋白质靶标）之间可以形成一种分子间的氢键、或盐桥作用。据2018年报道的一项基于DrugBank中的统计，~16%药物中包含有羧基基序。 这些包含羧基基序（COOH）已知可逆抑制剂，将是天赐的精氨酸靶向共价抑制剂设计的亲和元件；在通过适度的转化，在羧基原位安装上乙二醛类二羰基共价弹头，进而设计为精氨酸靶向共价抑制剂。 因此，本文的设计思路则是通过转化存在于许多非共价抑制剂的羧基基序为乙二醛弹头，快速便捷地产生具有精氨酸靶向的TCIs，如下图。 因此，上述提到的乙二醛/精氨酸之间的“热力学因素”致使的缩合，将最初设计不当的选择性非共价抑制剂/靶标相互作用，改善为选择性、不可逆共价靶向抑制剂。 2.2、可用结构搜索 研究人员针对已发表的X-射线蛋白/配体复合物的生物信息研究进行统计，如下图，旨在20万多个可用的结构中，有1000多个具有C-COOH基序，其中包含39个FDA批准药物。 在这些候选物中，246个含有靠近靶蛋白的COOH（＜5Å）。进一步靶标结构分析表明，这些“可靶向精氨酸”既存在于激酶中，也包含在非激酶中，既存在于靶标蛋白质内部，也有暴露于溶剂区表面。 其中，228个属于非激酶类，18个属于激酶类；非激酶类中，103个靶标精氨酸位于溶剂暴露区，125种位于靶标内部；18种激酶中，11种精氨酸位于溶剂暴露区，7种位于靶标内部。 这表明本文中基于乙二醛的TCI设计策略居伊欧潜在的普遍适用性。 如下图，是所有满足本文研究的靶标及其配体。结合可用数据，作者选择性其中的Mcl-1（髓系细胞白血病-1，非激酶类，癌症中的关键生成因子）、AURKA（一种在细胞周期进程中有重要作用的有丝分裂激酶）及其已知配体分子作为研究对象。 上下滚动查看更多 2.3、靶向Mcl-1精氨酸的TCIs Mcl-1是典型的基于PPI的治疗靶点，具有Bcl-2家族蛋白中高度保守的“hotspot”精氨酸残基R263，如下图。 几乎所有报道的Mcl-1抑制剂都含有与R263形成关键有利相互作用的羧基基序。如上图中，Mcl-1非共价抑制剂RM0（R1=COOH）。本文中，根据作者的设计策略，合成了相应的乙二醛基TCI，RM1。 与GSH共孵育12小时，RM1依然能够保持稳定，其对GSH活性几乎可以忽略不记；但RM1却可以与N-Fmoc精氨酸甲酯在不同的缓冲液中反应，如下图。 如下图A，体外IC50检测表明，与非共价的RM0 （IC50 = 2021nM, T = 0h）相比，RM1的效力（IC50 = 5675nM, T = 0h）略有下降。然而，随着孵育时间延长，观察到RM1时间依赖性显著，（IC50=480nM，T=5h），表明其为共价抑制剂。相比之下，RM0没有明显的时间依赖性变化。图B中的蛋白质谱明确证实了RM1与Mcl-1发生共价反应，形成了单修饰内蛋白。 同时发现，使用大量的RM1（RM1:精氨酸Mcl-1=10:1），也没有观察到其它共价加成物形成。与其它Bcl-2家族蛋白相比，这种针对Mcl-1 R263的活性和选择性是独一无二的，所有这些Bcl-2家族蛋白都具有相同的保守精氨酸，图下图C，也包括R263突变的Mcl-1，如下图B底部。 这表明，RM1在生理条件下对Mcl-1结合口袋具有高度选择性共价结合。如下图D，是RM1/Mcl-1的不可逆反应动力学。 通过晶体结构（下图E）可以看出，RM1结合BH3结构域，具有明确的电子密度，从RM1延伸到R263的侧链，并且在R263和RM1之间形成了咪唑酮结构。这种加合物咪唑酮结构与完整蛋白质谱显示的水分子丢失的结果一致。这些结果表明，RM1确实是精氨酸反应性的，以乙二醛为基础的Mcl-1靶向共价抑制剂，并且可以通过选择抑制剂支架和共价化学反应来实现对靶向精氨酸残基Mcl-1的选择性。 如下图F，与R263不同，R233也是独特的，暴露于溶剂区，与RM1的R2部分的的苯环靠近。因此，作者在该苯环上设计了RM2（基于乙二醛）、RM3（基于α,β-二酮酰胺）、和RM4（基于羧基，非共价对照物）。预计RM2、RM3可能共价结合R233；同时，这两种化合物也可用于比较乙二醛和α,β-二酮酰胺的化学反应性。 如上图G，RM2、3显示出相似的增加的抑制活性，在图H蛋白质谱中也观察到了配体与靶标的加合物产物。上图I中，RM1、RM2显示出比R3、R4提高的细胞活性。通过蛋白印迹分析（图J、K），RM0-4都适度抑制内源性Mcl-1介导的MV-4-11细胞线粒体依赖性凋亡通路的激活。 综合考虑，乙二醛可能在开发精氨酸反应性TCIs方面具有潜在的前景。 2.4、靶向AURKA精氨酸的TCIs AURKA（Aurora A）是一种有丝分裂激酶，在细胞周期进程中至关重要，是众所周知的晚期癌症靶点。共价激酶抑制剂（CKIs）是癌症治疗中的重要药物，FDA获批的9种药物中CKIs中，都是靶向激酶ATP活性位点附近的非催化性Cys位点。然而，此前还没有以精氨酸为目标的CKI报道。 如下图，RA0是强效、选择性、可口服生物利用的Aurka抑制剂，在酶促检测中对一个包含295个激酶的激酶组表现出良好的选择性。RA0的COOH基序（R1）与靶标的Arg220靠近，形成氢键，是本文中安装乙二醛的良好位点。 因此，基于同样的设计策略，本文中合成了精氨酸TCI，RA1。 如下图A，RA1相比于前体RA0，显示出减弱但仍然有效的体外靶标抑制活性，同样，RA1也具有时间依赖性、改善的IC50值，表明其参与共价抑制。 上图B-I，类似于Mcl-1精氨酸TCIs的开发，以RA0为起点，展开了针对AURKA精氨酸进行了TCIs研究，也成功设计、合成、证实了精氨酸靶向共价抑制剂RA1，同时其具有细胞活性。 2.5、靶向ALKG1202R精氨酸的TCIs 靶向共价抑制剂的优点之一是它们能够抑制耐药突变体。 受上述早期基于α,β-二酮酰胺靶向KRASG12R突变体的启发，作者也探索了基于乙二醛的化学方法，开发针对溶剂前精氨酸突变的TCIs潜在应用。 ALK多种基因改变与多发性肿瘤的发生有关，超过一半使用了第二代碱性激酶抑制剂（如布加替尼，本文中的RK0）治疗的患者，发现了获得性耐药突变，发生了碱性激酶结构域的突变，其中，最常见的突变体为ALKG1202R,如下图。 晶体结构研究，发现了溶剂前突区域Arg1202靠近RK0的甲氧基苯环基序。因此，本文的精氨酸靶向共价抑制剂设计如下。RK1具有时间依赖性体外靶标抑制活性。 2.6、Pro-TCI设计，提高细胞活性 以上以乙二醛弹头为基础的，针对非激酶类、以及激酶精氨酸靶向共价抑制剂的开发若然都获得了出色的体外靶向抑制，和适度的细胞活性，但与其前提非共价抑制剂相比，它们的细胞活性降低了很多。 这可能是由乙二醛的高亲电性引起的。 比如上述第一个基于精氨酸设计的α,β-二酮酰胺亲电弹头的KRASG12R精氨酸共价靶向抑制剂完全丧失了细胞活性，进一步也支持了以上假设。 此外，乙二醛已知经历各种代谢转化，包括氧化（乙醛）、还原（乙醇醛）、和偶联反应，这些反应会影响其稳定性和药代动力学特征。因此，为了克服乙二醛TCIs固有的高亲电性，以及在参与其自身的靶标之前与其它生物亲核试剂的潜在的非生成性反应，通过pH/酯酶相应的偕二乙酸盐可逆地保护乙二醛弹头，如下图。 作者首先针对RA1开发了pro-TCI，RAAC，如下图A。偕二乙酸盐具有优异的细胞外稳定性，在细胞内会被内源性性酶酯酶迅速解除保护。 如下图B，首先是选择性非共价RAAC/AURKA相互作用，然后是可逆的乙二醛/亲核试剂缩合，“热力学捕获”并最终致使选择性、不可逆地靶向抑制。不同pH条件下的体外稳定性测试证实，RAAC在pH=8.5时被水解，或细胞裂解。 接下来的测试表明，RAAC具有细胞抑制效应，如图C；RAAC对细胞Hek293细胞毒力有轻微改善，而对Hek293细胞毒力在50μM以下无毒性，如图D 03 总结与展望 本文成功开发了一种精氨酸靶向蛋白激酶、和非蛋白激酶不可逆共价抑制剂的研发策略。 1、以靶标已知的带有COOH基序的配体作为起点； 2、结合晶体结构学研究，在溶剂暴露区或者甚至是蛋白质内部，选择与配体COOH紧密接触（晶体结构上靠近）的精氨酸残基作为共价靶向目标； 3、通过COOH原位适度转化为乙二醛，安装上具有精氨酸反应性的亲电弹头，进行小分子药物/候选药物的共价设计。 通过两种类型的靶标（Mcl-1、AURKA，非激酶与激酶类）均在以上策略上获得了更好的验证，成功开发了具有体外出色靶向抑制，适度细胞活性的精氨酸靶向共价抑制剂。 此外，通过突变为精氨酸的ALKG1202R靶标进行同样的验证，也获得了同样的成功！为了提高细胞活性，通过设计偕二酸酯保护的策略，保护乙二醛的前体，使其在细胞外能够保持稳定，细胞内能够被酯酶解除保护，进而发挥亲电弹头的作用，解决了细胞活性低的问题。 总之，本文开发的具有细胞活性的、精氨酸靶向、不可逆共价抑制剂的策略具有普遍的参考意义，值得点赞和借鉴！ 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

聚焦共价 早研早聊 学以致用  侃侃而言 DOI: 10.1016/j.rechem.2024.101615 共价药物具有丰富的历史，一度因为安全性的担忧而被边缘化，而靶向共价抑制剂（TCI）概念的出现又赋予了共价药物新生。 近期，Results in Chemistry刊载了一篇文章，从靶蛋白的角度对当前共价抑制剂研究进行分类分析，包括EGFR、BTK、SARS-CoV-2、KRAS、AChE、CatK等。并讨论了共价药物的优势和存在的局限性 01 靶向共价抑制剂（TCI） 小分子抑制剂通过可逆、或不可逆的方式，在特定情况下抑制功能失调的靶标。其中非共价相互作用主要包括盐桥、疏水相互作用、范德华力、静电相互作、氢键等。而这些非共价键只能在原子靠近时形成，并随着距离的增加相互作用强度降低。可逆性非共价药物依靠着与靶标不断地结合，再结合等发生相互作用；而不可逆共价药物特异性地精准靶向靶标，并永久性地结合发挥调控作用。 不可逆共价抑制剂的概念尽管很理想，但现实中设计共价抑制剂却非常具有挑战性。需要发现可逆性抑制剂作为亲电元件，需要优化亲电弹头，需要鉴定靶标特异性地邻近配体功能性亲核性残基，等，都是在开发共价药物中必需地步骤。    1.1、靶向共价抑制剂（TCI）的概念 靶向共价抑制是一种独特的治疗策略，靶向共价抑制剂（TCIs）被定义为具有可与靶标蛋白质残基非催化性成键的低反应性功能基团的配体（或抑制剂）。 TCIs通过两步机制，实现蛋白质靶标“沉默”，如下图。 第一步：抑制剂（I）与靶标受体或酶（E）非共价结合，产生热力学平衡的非共价抑制复合物，使抑制剂亲电部分靠近靶标蛋白质上亲核性残基的位置。 第二步：当共价分子接近并与特定残基精准对齐时，形成不可逆共价键，发生不可逆抑制。 第二步是共价抑制剂区别于可逆抑制剂的关键。这种药物发现依赖于基于结构的药物设计原则。 共价弹头的插入可显著提高药物分子的亲和力和特异性，但选择和设置共价弹头具有一定挑战性。    1.2、TCIs的共价弹头 可共价靶向的靶标首选在合适的位置需要具有功能性亲核侧链，如半胱氨酸（Cys）、赖氨酸（Lys）、丝氨酸（Ser)、苏氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr)、组氨酸（His）、或天门冬氨酸（Asp）、精氨酸（Arg）等。其中被开发最多的则是半胱氨酸和丝氨酸。而为了完成蛋白质靶标的共价修饰，必须在抑制剂中加入与靶标活性位点氨基酸残基具有反应性的亲电弹头。而一般这种亲电弹头是弱亲电性官能团。 共价弹头的反应性取决于几个关键因素：如，靶标氨基酸残基；启动初始非共价结合相互作用和靶标选择性的识别基序，即亲和性元件等；共价弹头的方向，影响与蛋白质残基的反应速度。共价弹头的选择、亲电基团的功能、大小、反应性对共价药物的设计都很重要，它们会影响残基的环境及其靶向特定氨基酸的能力。 以下是一些已经用于获批共价药物中的比较流行的几类共价弹头。 1.2.1、α,β-不饱和酰胺 α,β-不饱和酰胺型Micheal受体是TCIs中应用最多的共价弹头，尤其是在癌症治疗中的激酶抑制剂。这是一种软亲电试剂，主要与Cys残基相互作用。而当烯烃上取代基不同时，丙烯酰胺表现出高度可调的硫醇反应性。 一般在α位置引入氟原子，丙烯酰胺的反应性降低；而比较典型的是在β位氨基亚甲基取代，质子化的氨基亚甲基取代基能够增加不包含双键的亲电反应性；而通过α,β-不饱和醛或酯提高反应速率，也可能导致致突变性、皮肤致敏或肝中毒等风险增加。 1.2.2、酰胺、酯、脲、氨基甲酸酯类 如传统共价药物阿司匹林、β-内酰胺抗生素等，通过将蛋白质靶标的氨基酸残基酰化阻断酶活性。其中使用多种具有酰化潜力的共价弹头，包括脲、氨基甲酸酯、酰胺和酯，靶向蛋白质Lys残基、Ser残基等。。 1.2.3、酮、醛、腈类 醛、酮主要作用于丝氨酸、半胱氨酸残基，形成（羟基/硫硫醇）半缩醛或半缩酮的络合物，作为丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶的可逆性共价抑制剂弹头。 1.2.4、硫化合物 硫（VI）氟交换（SuFEx）是一组新型“点击化学”反应，氟硫酸芳基酯可以靶向蛋白质表面，与Ser、Thr、Tyr发生反应，（而Lys相对的亲核性较差）进而可能阻碍蛋白质蛋白质相互作用。氟硫酸芳基酯比芳基磺酰氟反应性更弱，只在蛋白质靶标的结合口袋中表现出反应活性。 1.2.5、硼酸类 另一类可逆共价弹头则是硼酸和硼酸酯，它们主要与丝氨酸、苏氨酸的羟基残基可逆性形成一种四面体中间体。    1.3、共价药物的发展历史 阿司匹林是第一款进入药物市场的共价药物，是20世纪初针对其作用机制研究偶然发现的。 阿司匹林是一种非甾体抗炎药，通过使活性位点附近的丝氨酸529残基乙酰化而共价改变环加氧酶1，从而干扰其底物花生四烯酸产生前列腺素。 青霉素是一类β-内酰胺类抗生素，它与参与细胞壁合成的青霉素结合蛋白相互作用，是活性部位Ser残基酰化，进而使细胞膜破裂。 随后更多的共价药物被批准上市，它们绝大多数的共同特定是，通过机制研究发现其共价作用的模式，而非从头设计而来。 其中，部分药物对靶标的共价修饰需要代谢后激活而表现出来，如阿司匹林、青霉素、奥美拉唑、氯吡格雷，如下图。 据2022年的数据显示，FDA已批准55款共价药物。TCI治疗策略已被广泛用于治疗肥胖症、丙型肝炎、和癌症等适应症。市场上约28%的共价抑制剂用于癌症相关靶点、23%用于中枢神经系统、21%用于抗感染（主要来自β-内酰胺类抗生素）、约11%用于胃肠道疾病。 02 靶向共价药物的复兴 据2022年的数据显示，FDA已批准55款共价药物。TCI治疗策略已被广泛用于治疗肥胖症、丙型肝炎、和癌症等适应症。    2.1、EGFR受体共价抑制剂 对于靶向抑制，当前大多数可用的TCIs均是靶向酶活性位点或变构口袋内的残基。而表皮生长因子受体（EGFR）是共价抑制剂研究最多的靶点之一，一种膜上酪氨酸激酶受体，通过与表皮生长因子结合导致细胞分裂和酪氨酸自磷酸化。EGFR是癌症，如非小细胞肺癌治疗的关键靶点。 图. 各种EGFR抑制剂的化学结构，其中蓝色突出部分为弹头 Gefitinib（吉非替尼）、Erlotinib（厄洛替尼）是一代可逆EGFR抑制剂。然而，一种称之为“看门人突变”的T790M，导致EGFR对ATP结合力增加，而许多可逆的EGFR抑制剂的结合力降低，导致了60%的患者有了新的病情。 为了解决这种突变型耐药性问题，研究人员将丙烯酰胺Michael受体片段安装在可逆配体上，开发了二代抑制剂。这类抑制剂与EGFR半胱氨酸残基反应，使部分恢复了对T790M突变体的活性，表现出延长EGFR抑制的信号，表明他们可能比一代可逆抑制剂更有效。 2013年，FDA批准了新一代EGFR突变转移性非小细胞肺癌的一线治疗药物Afatinib（上图c，阿法替尼），其与突变EGFR结合的分子晶体结构如下图a。 除此之外，还有二代共价抑制剂Netatinib、Dacomitinib分别于2017、2018年获批。用于治疗非小细胞肺癌和HER2+乳腺癌。 三代EGFR共价抑制剂，如WZ4002、Osimertinib、Rociletinib，用嘧啶取代了原来的喹唑啉部分，以增加选择性，同时仍然保留了共价结合所需要的丙烯酰胺弹头。 2018年Osimertinib获得了FDA加速批准，作为转移性非细胞肺癌的一线治疗药物。 目前仍有一些三代 EGFR抑制剂在开发中，如PF-06459988、Avitinib。 EGFR三代共价抑制剂的成功，证明了共价药物开发中，通过优化改善最初的可逆配体的效力，进而改变药效学的策略的可行性；二代药物的成功，也证明了通过针对可逆性配体的共价改造，可以提高药效，延长抑制时间。    2.2、BTK受体共价抑制剂 Bruton's酪氨酸激酶（BTK）是非受体蛋白酪氨酸激酶家族的一员，是B细胞系肿瘤的相关靶点；BTK突变会引起遗传性免疫缺陷疾病，如X-连锁无球蛋白血症（XLA)。 2013年，FDA批准Ibrutinib用于治疗巨球蛋白血症、慢性淋巴细胞白血病、和套细胞淋巴瘤，是一种BTK共价抑制剂。然而，该抑制剂与EGFR和其它Tec家族蛋白可以脱靶结合，因此，可能产生出血、腹泻、皮疹、和心房颤动等不良反应。 因此，也开发出了二代BTK抑制剂，如Acalabrutinib、Zanubrutinib，用于解决副作用问题，并分别于2017、2019年获FDA批准上市。 两个二代BTK共价抑制剂相比于一代，均具有更好的效力、口服吸收快、半衰期短、并减少于EGFR获其它Tec家族蛋白大的脱靶结合。 尽管早期人们很担心共价药物可能具有脱靶毒性，事实上也的确如此，但BTK二代成功改善了共价药物的脱靶效应，这表明合理设计共价药物，通过提高亲电配体的亲和力，改造亲电弹头的反应性，可以获得可接受的安全性。    2.3、KRAS共价抑制剂 RAS癌基因属于小GTPases家族，是癌症研究领域中研究最多的基因。过度活跃的RAS信号会导致细胞分裂和生长，从而增加患癌症的风险。人类最常见的致癌基因是三种RAS基因：HRAS、KRAS、NRAS。据统计，约60%的肺癌、34%的直肠癌、60%的胰腺癌都有两种KRAS亚型突变。而KRAS12、13、61的三个残基是经常发生突变的位点。 ARS-853是最早报道的KRASG12C共价抑制剂，具有较强的细胞活性。2021年，FDA加速批准了首个靶向KRASG12C的共价药物Sotorasib，用于成人非小细胞肺癌患者。 随后Adagrasib获得FDA批准，被指定为具有突破性疗法，是KRASG12C突变的非小细胞肺癌患者的潜在治疗选择。 自此，KRAS“不可成药”被打破！然而，最典型的KRAS G12D（尤其是在胰腺癌中最常见）仍未得到解决，目前有几款共价药物处于临床研究阶段，最主要的原因是共价靶向天冬氨酸非常具有挑战性。    2.4、SARS-CoV-2 Mpro共价抑制剂 对比COVID-19的全球快速传播主要是由SARS-CoV-2病毒引起的，开发疫苗和社会控制措施是科学界建议的控制感染的方法。然而，病毒家族突变的速度之快，迫切需要考虑疫苗的长期安全性和有效性。 开发有效的抗SARS-CoV-2治疗方法，其中一种策略则是共价药物分子。SARS-CoV-2是一种单链RNA病毒，具有两种多蛋白（pp1a、pp1ab）多蛋白，以及结构蛋白和辅助蛋白。病毒复制依赖于Mpro（也称3CLpro），一种半胱氨酸蛋白酶，能够将pp1a切割成功能性病毒蛋白。 Nirmatrelvir是一种开发的高强度SARS-CoV-2可逆共价抑制剂，对所有人类冠状病毒都有很强的抑制作用。2021年，FDA紧急批准Paxlovid（利托那韦）上市，是由Nirmatrelvir和Ritonavir的组合，用于治疗成人和某些儿童患者的轻度中度SARS-CoV-2引起的COVID-19。    2.5、AChE共价抑制剂 在大脑中的化学突触中，乙酰胆碱，一种神经递质，激活胆碱能受体，而阿尔兹海默症患者的体内，这些受体较少。对抗这种情况的一种方法是通过阻断控制内源性乙酰胆碱水平的乙酰胆碱酯酶（AChE），来提高乙酰胆碱水平。 最近，Rivastigmine获得批准，这是一种新型乙酰胆碱酯酶抑制剂，通过氨基甲酸酯部分将抑制剂嵌入酶的活性位点，抑制AChE约10小时。另一种共价抑制剂三氟磷酸盐对乙酰胆碱的抑制作用更强，2,2-二氯乙烯基二甲基膦酸（DDVP）与乙酰胆碱酯酶的位点结合，使活性位点的丝氨酸磷酸化。    2.6、CatK共价抑制剂 一类被称为组织蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶负责调节不同的细胞信号通路和溶酶体蛋白水解。人类有11种组织蛋白酶；其中，CatK因其参与骨重塑和骨吸收而引起特别关注。 Balicatib是一种对CatK表现出良好选择性的药物，然而，其在二期临床阶段被停止了，这是因为另一种非溶酶体性共价抑制剂，Odonacatib进入了三期临床。Odonacatib已经显示出减少髋部或锥体骨析和增加骨密度的功效，然而，受试者中心血管事件（包括中风）的增加，三期临床也突然终止。    2.7、其它激酶共价抑制剂 除了EGFR和BTK，共价抑制剂也可以用于特异性靶向在ATP结合位点附近具有非保守Cys残基的激酶。非受体酪氨酸激酶Janus激酶3（JAK3）就是其一，主要出现在白细胞，参与细胞因子信号传导。 Ritlecitinib是一款JAK3共价抑制剂，在二期临床，对类风湿性关节炎具有积极的效果。 成纤维细胞生长因子受体（FGFR）激酶对于细胞分裂和增殖至关重要，被认为与肝细胞癌、肺癌、结肠癌和肾癌有关。Fisogatinib是一种FGFR4选择性共价抑制剂，正在二期临床试验。 03 共价药物的优势和缺陷    3.1、共价药物的优势 共价抑制剂与目标蛋白的化学结合能力在很多方面都是有利的。与可逆性药物相比，共价药物在药理学上有许多积极的方面，如增强的效力、选择性和延长的作用时间等。    3.2、共价药物的缺陷 早些年，蛋白质共价结合一直被认为是药物毒性的一种机制。尽管当前共价药物的进展，在安全性和有效性方面做了不少的改善，但在共价药物开发过程中，这仍是一个不可忽视的缺陷。 共价药物脱靶会产生一系列潜在的不良反应，对此，一般选用低反应活性的共价弹头，提高非共价核心的亲和力和选择性（保持低剂量），减少获杜绝反应性代谢物生成，等，来降低共价药物的毒性风险。 往期相关精彩回顾 JMC：西安交通大学发表一种靶向赖氨酸残基的共价抑制剂发现策略，原位氢键作用升级为共价键 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DOI: 10.1016/j.rechem.2024.101615 共价药物具有丰富的历史，一度因为安全性的担忧而被边缘化，而靶向共价抑制剂（TCI）概念的出现又赋予了共价药物新生。 近期，Results in Chemistry刊载了一篇文章，从靶蛋白的角度对当前共价抑制剂研究进行分类分析，包括EGFR、BTK、SARS-CoV-2、KRAS、AChE、CatK等。并讨论了共价药物的优势和存在的局限性 01 靶向共价抑制剂（TCI） 小分子抑制剂通过可逆、或不可逆的方式，在特定情况下抑制功能失调的靶标。其中非共价相互作用主要包括盐桥、疏水相互作用、范德华力、静电相互作、氢键等。而这些非共价键只能在原子靠近时形成，并随着距离的增加相互作用强度降低。可逆性非共价药物依靠着与靶标不断地结合，再结合等发生相互作用；而不可逆共价药物特异性地精准靶向靶标，并永久性地结合发挥调控作用。 不可逆共价抑制剂的概念尽管很理想，但现实中设计共价抑制剂却非常具有挑战性。需要发现可逆性抑制剂作为亲电元件，需要优化亲电弹头，需要鉴定靶标特异性地邻近配体功能性亲核性残基，等，都是在开发共价药物中必需地步骤。    1.1、靶向共价抑制剂（TCI）的概念 靶向共价抑制是一种独特的治疗策略，靶向共价抑制剂（TCIs）被定义为具有可与靶标蛋白质残基非催化性成键的低反应性功能基团的配体（或抑制剂）。 TCIs通过两步机制，实现蛋白质靶标“沉默”，如下图。 第一步：抑制剂（I）与靶标受体或酶（E）非共价结合，产生热力学平衡的非共价抑制复合物，使抑制剂亲电部分靠近靶标蛋白质上亲核性残基的位置。 第二步：当共价分子接近并与特定残基精准对齐时，形成不可逆共价键，发生不可逆抑制。 第二步是共价抑制剂区别于可逆抑制剂的关键。这种药物发现依赖于基于结构的药物设计原则。 共价弹头的插入可显著提高药物分子的亲和力和特异性，但选择和设置共价弹头具有一定挑战性。    1.2、TCIs的共价弹头 可共价靶向的靶标首选在合适的位置需要具有功能性亲核侧链，如半胱氨酸（Cys）、赖氨酸（Lys）、丝氨酸（Ser)、苏氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr)、组氨酸（His）、或天门冬氨酸（Asp）、精氨酸（Arg）等。其中被开发最多的则是半胱氨酸和丝氨酸。而为了完成蛋白质靶标的共价修饰，必须在抑制剂中加入与靶标活性位点氨基酸残基具有反应性的亲电弹头。而一般这种亲电弹头是弱亲电性官能团。 共价弹头的反应性取决于几个关键因素：如，靶标氨基酸残基；启动初始非共价结合相互作用和靶标选择性的识别基序，即亲和性元件等；共价弹头的方向，影响与蛋白质残基的反应速度。共价弹头的选择、亲电基团的功能、大小、反应性对共价药物的设计都很重要，它们会影响残基的环境及其靶向特定氨基酸的能力。 以下是一些已经用于获批共价药物中的比较流行的几类共价弹头。 1.2.1、α,β-不饱和酰胺 α,β-不饱和酰胺型Micheal受体是TCIs中应用最多的共价弹头，尤其是在癌症治疗中的激酶抑制剂。这是一种软亲电试剂，主要与Cys残基相互作用。而当烯烃上取代基不同时，丙烯酰胺表现出高度可调的硫醇反应性。 一般在α位置引入氟原子，丙烯酰胺的反应性降低；而比较典型的是在β位氨基亚甲基取代，质子化的氨基亚甲基取代基能够增加不包含双键的亲电反应性；而通过α,β-不饱和醛或酯提高反应速率，也可能导致致突变性、皮肤致敏或肝中毒等风险增加。 1.2.2、酰胺、酯、脲、氨基甲酸酯类 如传统共价药物阿司匹林、β-内酰胺抗生素等，通过将蛋白质靶标的氨基酸残基酰化阻断酶活性。其中使用多种具有酰化潜力的共价弹头，包括脲、氨基甲酸酯、酰胺和酯，靶向蛋白质Lys残基、Ser残基等。。 1.2.3、酮、醛、腈类 醛、酮主要作用于丝氨酸、半胱氨酸残基，形成（羟基/硫硫醇）半缩醛或半缩酮的络合物，作为丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶的可逆性共价抑制剂弹头。 1.2.4、硫化合物 硫（VI）氟交换（SuFEx）是一组新型“点击化学”反应，氟硫酸芳基酯可以靶向蛋白质表面，与Ser、Thr、Tyr发生反应，（而Lys相对的亲核性较差）进而可能阻碍蛋白质蛋白质相互作用。氟硫酸芳基酯比芳基磺酰氟反应性更弱，只在蛋白质靶标的结合口袋中表现出反应活性。 1.2.5、硼酸类 另一类可逆共价弹头则是硼酸和硼酸酯，它们主要与丝氨酸、苏氨酸的羟基残基可逆性形成一种四面体中间体。    1.3、共价药物的发展历史 阿司匹林是第一款进入药物市场的共价药物，是20世纪初针对其作用机制研究偶然发现的。 阿司匹林是一种非甾体抗炎药，通过使活性位点附近的丝氨酸529残基乙酰化而共价改变环加氧酶1，从而干扰其底物花生四烯酸产生前列腺素。 青霉素是一类β-内酰胺类抗生素，它与参与细胞壁合成的青霉素结合蛋白相互作用，是活性部位Ser残基酰化，进而使细胞膜破裂。 随后更多的共价药物被批准上市，它们绝大多数的共同特定是，通过机制研究发现其共价作用的模式，而非从头设计而来。 其中，部分药物对靶标的共价修饰需要代谢后激活而表现出来，如阿司匹林、青霉素、奥美拉唑、氯吡格雷，如下图。 据2022年的数据显示，FDA已批准55款共价药物。TCI治疗策略已被广泛用于治疗肥胖症、丙型肝炎、和癌症等适应症。市场上约28%的共价抑制剂用于癌症相关靶点、23%用于中枢神经系统、21%用于抗感染（主要来自β-内酰胺类抗生素）、约11%用于胃肠道疾病。 02 靶向共价药物的复兴 据2022年的数据显示，FDA已批准55款共价药物。TCI治疗策略已被广泛用于治疗肥胖症、丙型肝炎、和癌症等适应症。    2.1、EGFR受体共价抑制剂 对于靶向抑制，当前大多数可用的TCIs均是靶向酶活性位点或变构口袋内的残基。而表皮生长因子受体（EGFR）是共价抑制剂研究最多的靶点之一，一种膜上酪氨酸激酶受体，通过与表皮生长因子结合导致细胞分裂和酪氨酸自磷酸化。EGFR是癌症，如非小细胞肺癌治疗的关键靶点。 图. 各种EGFR抑制剂的化学结构，其中蓝色突出部分为弹头 Gefitinib（吉非替尼）、Erlotinib（厄洛替尼）是一代可逆EGFR抑制剂。然而，一种称之为“看门人突变”的T790M，导致EGFR对ATP结合力增加，而许多可逆的EGFR抑制剂的结合力降低，导致了60%的患者有了新的病情。 为了解决这种突变型耐药性问题，研究人员将丙烯酰胺Michael受体片段安装在可逆配体上，开发了二代抑制剂。这类抑制剂与EGFR半胱氨酸残基反应，使部分恢复了对T790M突变体的活性，表现出延长EGFR抑制的信号，表明他们可能比一代可逆抑制剂更有效。 2013年，FDA批准了新一代EGFR突变转移性非小细胞肺癌的一线治疗药物Afatinib（上图c，阿法替尼），其与突变EGFR结合的分子晶体结构如下图a。 除此之外，还有二代共价抑制剂Netatinib、Dacomitinib分别于2017、2018年获批。用于治疗非小细胞肺癌和HER2+乳腺癌。 三代EGFR共价抑制剂，如WZ4002、Osimertinib、Rociletinib，用嘧啶取代了原来的喹唑啉部分，以增加选择性，同时仍然保留了共价结合所需要的丙烯酰胺弹头。 2018年Osimertinib获得了FDA加速批准，作为转移性非细胞肺癌的一线治疗药物。 目前仍有一些三代 EGFR抑制剂在开发中，如PF-06459988、Avitinib。 EGFR三代共价抑制剂的成功，证明了共价药物开发中，通过优化改善最初的可逆配体的效力，进而改变药效学的策略的可行性；二代药物的成功，也证明了通过针对可逆性配体的共价改造，可以提高药效，延长抑制时间。    2.2、BTK受体共价抑制剂 Bruton's酪氨酸激酶（BTK）是非受体蛋白酪氨酸激酶家族的一员，是B细胞系肿瘤的相关靶点；BTK突变会引起遗传性免疫缺陷疾病，如X-连锁无球蛋白血症（XLA)。 2013年，FDA批准Ibrutinib用于治疗巨球蛋白血症、慢性淋巴细胞白血病、和套细胞淋巴瘤，是一种BTK共价抑制剂。然而，该抑制剂与EGFR和其它Tec家族蛋白可以脱靶结合，因此，可能产生出血、腹泻、皮疹、和心房颤动等不良反应。 因此，也开发出了二代BTK抑制剂，如Acalabrutinib、Zanubrutinib，用于解决副作用问题，并分别于2017、2019年获FDA批准上市。 两个二代BTK共价抑制剂相比于一代，均具有更好的效力、口服吸收快、半衰期短、并减少于EGFR获其它Tec家族蛋白大的脱靶结合。 尽管早期人们很担心共价药物可能具有脱靶毒性，事实上也的确如此，但BTK二代成功改善了共价药物的脱靶效应，这表明合理设计共价药物，通过提高亲电配体的亲和力，改造亲电弹头的反应性，可以获得可接受的安全性。    2.3、KRAS共价抑制剂 RAS癌基因属于小GTPases家族，是癌症研究领域中研究最多的基因。过度活跃的RAS信号会导致细胞分裂和生长，从而增加患癌症的风险。人类最常见的致癌基因是三种RAS基因：HRAS、KRAS、NRAS。据统计，约60%的肺癌、34%的直肠癌、60%的胰腺癌都有两种KRAS亚型突变。而KRAS12、13、61的三个残基是经常发生突变的位点。 ARS-853是最早报道的KRASG12C共价抑制剂，具有较强的细胞活性。2021年，FDA加速批准了首个靶向KRASG12C的共价药物Sotorasib，用于成人非小细胞肺癌患者。 随后Adagrasib获得FDA批准，被指定为具有突破性疗法，是KRASG12C突变的非小细胞肺癌患者的潜在治疗选择。 自此，KRAS“不可成药”被打破！然而，最典型的KRAS G12D（尤其是在胰腺癌中最常见）仍未得到解决，目前有几款共价药物处于临床研究阶段，最主要的原因是共价靶向天冬氨酸非常具有挑战性。    2.4、SARS-CoV-2 Mpro共价抑制剂 对比COVID-19的全球快速传播主要是由SARS-CoV-2病毒引起的，开发疫苗和社会控制措施是科学界建议的控制感染的方法。然而，病毒家族突变的速度之快，迫切需要考虑疫苗的长期安全性和有效性。 开发有效的抗SARS-CoV-2治疗方法，其中一种策略则是共价药物分子。SARS-CoV-2是一种单链RNA病毒，具有两种多蛋白（pp1a、pp1ab）多蛋白，以及结构蛋白和辅助蛋白。病毒复制依赖于Mpro（也称3CLpro），一种半胱氨酸蛋白酶，能够将pp1a切割成功能性病毒蛋白。 Nirmatrelvir是一种开发的高强度SARS-CoV-2可逆共价抑制剂，对所有人类冠状病毒都有很强的抑制作用。2021年，FDA紧急批准Paxlovid（利托那韦）上市，是由Nirmatrelvir和Ritonavir的组合，用于治疗成人和某些儿童患者的轻度中度SARS-CoV-2引起的COVID-19。    2.5、AChE共价抑制剂 在大脑中的化学突触中，乙酰胆碱，一种神经递质，激活胆碱能受体，而阿尔兹海默症患者的体内，这些受体较少。对抗这种情况的一种方法是通过阻断控制内源性乙酰胆碱水平的乙酰胆碱酯酶（AChE），来提高乙酰胆碱水平。 最近，Rivastigmine获得批准，这是一种新型乙酰胆碱酯酶抑制剂，通过氨基甲酸酯部分将抑制剂嵌入酶的活性位点，抑制AChE约10小时。另一种共价抑制剂三氟磷酸盐对乙酰胆碱的抑制作用更强，2,2-二氯乙烯基二甲基膦酸（DDVP）与乙酰胆碱酯酶的位点结合，使活性位点的丝氨酸磷酸化。    2.6、CatK共价抑制剂 一类被称为组织蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶负责调节不同的细胞信号通路和溶酶体蛋白水解。人类有11种组织蛋白酶；其中，CatK因其参与骨重塑和骨吸收而引起特别关注。 Balicatib是一种对CatK表现出良好选择性的药物，然而，其在二期临床阶段被停止了，这是因为另一种非溶酶体性共价抑制剂，Odonacatib进入了三期临床。Odonacatib已经显示出减少髋部或锥体骨析和增加骨密度的功效，然而，受试者中心血管事件（包括中风）的增加，三期临床也突然终止。    2.7、其它激酶共价抑制剂 除了EGFR和BTK，共价抑制剂也可以用于特异性靶向在ATP结合位点附近具有非保守Cys残基的激酶。非受体酪氨酸激酶Janus激酶3（JAK3）就是其一，主要出现在白细胞，参与细胞因子信号传导。 Ritlecitinib是一款JAK3共价抑制剂，在二期临床，对类风湿性关节炎具有积极的效果。 成纤维细胞生长因子受体（FGFR）激酶对于细胞分裂和增殖至关重要，被认为与肝细胞癌、肺癌、结肠癌和肾癌有关。Fisogatinib是一种FGFR4选择性共价抑制剂，正在二期临床试验。 03 共价药物的优势和缺陷    3.1、共价药物的优势 共价抑制剂与目标蛋白的化学结合能力在很多方面都是有利的。与可逆性药物相比，共价药物在药理学上有许多积极的方面，如增强的效力、选择性和延长的作用时间等。    3.2、共价药物的缺陷 早些年，蛋白质共价结合一直被认为是药物毒性的一种机制。尽管当前共价药物的进展，在安全性和有效性方面做了不少的改善，但在共价药物开发过程中，这仍是一个不可忽视的缺陷。 共价药物脱靶会产生一系列潜在的不良反应，对此，一般选用低反应活性的共价弹头，提高非共价核心的亲和力和选择性（保持低剂量），减少获杜绝反应性代谢物生成，等，来降低共价药物的毒性风险。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓