DYRK1A

感谢关注转发，欢迎学术交流 回复药渡Cyber，领取文献原文 请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程 快看版 小分子诱导的靶向蛋白质降解是新药发现和开发中一种极具前景的方法。神经退行性病变、肿瘤发生、适应性免疫等生理病理过程均与蛋白激酶DYRK1A和DYRK1B密切相关。亚利桑那大学研究团队通过将ATP竞争性DYRK1抑制剂与E3连接酶配体CRBN结合以诱导DYRK1A和DYRK1B的泛素化和降解，首次开发出了一种新型DYRK1蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）。其中，化合物DYR684在细胞水平能够快速、高效、选择性地降解DYRK1A，DYRK1B无酶促活性的剪接变体（p65）则抵抗降解。与竞争性激酶抑制相比，DYR684对DYRK1的靶向降解作用更好地抑制了下游信号，表明DYRKs是PROTAC开发的可行靶点，DYR684有望成为DYRK1A和DYRK1B的特异性化学探针。 药渡CyberSAR系统提供了对DYRK1抑制剂分子的深入解析。系统通过聚类结构视图和原始结构视图，展示了与靶点相关的活性分子，并以研发阶段时光轴的形式呈现了潜力Hit。此外，CyberSAR还提供了适应症和试验设计的可视化分析，帮助研发人员快速获取靶向结构信息，开拓研究思路。尽管CyberSAR在本案例分子的初步开发中未被使用，但其在解析和优化药物分子方面显示出巨大的应用潜力。 正文版 研究背景 双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A（DYRK1A）是一种高度保守的蛋白激酶，在人体组织中广泛表达，是细胞增殖和分化的主要调节因子，与神经退行性改变、肿瘤进展、炎症、糖尿病、心肌梗死、病毒感染等多种疾病密切相关。DYRK1B的催化域与DYRK1A具有85%的序列同源性，但在细胞表达类型上更为有限，被视为潜在的癌症药物靶点。DYRK1A和DYRK1B（统称为DYRK1）在疾病中的过度活跃促使了DYRK1抑制剂的开发，这些抑制剂多为经典的1型激酶抑制剂，通过占据ATP结合位点来干扰酶活性，且难以对DYRK1A和DYRK1B进行区分。 分子诱导的靶向蛋白质降解是是新药发现和开发中一种极具前景的方法，PROTAC（蛋白水解靶向嵌合体）作为异双功能分子通过募集E3泛素连接酶来诱导目标蛋白的泛素化和降解。然而，DYRK1A对多种降解剂存在抗性。除DYRK PROTACs外，DYRK1A也可被CaNDY和DYR219通过其他机制降解，但这需要长时间的孵育和较高的药物浓度，这在一定程度上限制了CaNDY和DYR219作为化学探针的使用。 本研究通过将ATP竞争性DYRK1抑制剂与E3连接酶配体CRBN结合，首次开发出了DYRK1 PROTAC。其中，化合物DYR684以蛋白酶体依赖性方式诱导了DYRK1A和DYRK1B的有效降解，较传统激酶抑制剂具有更强的DYRK1抑制活性。 结果与讨论 靶蛋白结合配体的确定 DYR530是在对DYR219进行构效关系研究后开发出的高亲和力DYRK1A抑制剂，较DYR219有更好的选择性和药代动力学性质。研究人员通过解析DYRK1A与DYR530的共晶结构确定了连接子附着位点。DYR530与ATP位点的结合符合I型激酶抑制剂特征。DYR530的2-氨基吡啶和咪唑并吡啶环深入ATP结合口袋并与铰链区中的Lys188、Glu203、Asp307、Leu241形成氢键，2-氨基吡啶与Val306、Phe238形成范德华相互作用，咪唑并吡啶环与Phe238、Leu294、Leu241、Met240、Ala186形成范德华相互作用。N-甲基哌嗪与蛋白质接触较少且朝向溶剂区，是理想的连接子附着位点。 DYRK1 PROTAC的设计与结构优化 研究人员将不同长度的PEG连接子连接到DYR530的哌嗪部分，再分别与VHL配体1或CRBN配体泊马度胺相连，得到了DYR617-619、DYR625和DYR622-624。在HEK293细胞中评价这些化合物对DYRK1A和DYRK1B的降解能力，结果表明基于CRBN的PROTAC能显著降低细胞中的DYRK1A水平，而靶向VHL的分子不能有效降解DYRK1A。延长CRBN PROTAC的连接子长度可促进DYRK1的降解，如以4-PEG为连接子的PROTAC（DYR624 - 60% Dmax DYRK1A）的降解作用优于以2-PEG为连接子的PROTAC（DYR622 - 40% Dmax DYRK1A）。 接着，研究人员继续对连接子和CRBN配体部分进行了结构优化。将聚乙二醇胺、哌嗪、氮杂环丁烷与沙利度胺的3位偶联，得到了DYR665、DYR696和DYR697；引入CRBN E3连接酶调节剂CC-220（伊伯多胺）得到了DYR662、DYR666、DYR661和DYR660；引入高亲和力CRBN配体5-氨基硫胺100得到了DYR667、DYR684和DYR685。活性评价结果显示，部分化合物的DYRK1A降解能力显著提高，同时它们对DYRK1B也具有一定的降解作用。其中，DYR684的活性最佳，说明吡啶-哌啶可能为活性必须结构。 DYR684的结构特性 对DYRK1A/DYR684/CRBN三元复合物结构的模拟结果显示，DYR684跨越了DYRK1A ATP口袋和CRBN沙利度胺结合位点，形成了多重蛋白-蛋白相互作用、盐桥相互作用以及氢键相互作用，这与DYR684的功效和选择性密切相关。对DYR684的激酶组选择性进行分析发现，它命中的激酶数量比DYR530更少。这一结果与先前的研究结论相符，即添加连接子和E3招募配体部分可显著减少与1型激酶抑制剂结合的靶激酶数量。 非降解型DYR684类似物的开发 通过对戊二酰亚胺上的氮原子进行甲基化得到DYR813。DYRK1降解曲线显示，DYR813在较高浓度下会使DYRK1A水平适度降低，而在较低浓度（100nM）下，DYR813不影响DYRK1A水平，说明DYR684的DYRK1A降解活性与CRBN招募相关。 DYR684浓度依赖性降解DYRK1 用DYR684处理HEK293细胞24小时发现，DYR684以浓度依赖的方式降低了DYRK1A和DYRK1B的水平，对DYRK1A的DC50值为12.3nM，对DYRK1A的最大降解百分比约为90%，对DYRK1B的最大降解百分比约为50%。传统的1型抑制剂DYR530、L41或CaNDY均无法有效降低DYRK1水平。此外，DYR684不改变衔接蛋白DCAF7的水平。DYR684在高浓度下效力的降低可归因于“钩状效应”，这是依赖三元复合物形成的异双功能配体的典型特征。 时间依赖性评价 用100nM的DYR684处理HEK293细胞，8小时内HEK293细胞中的DYRK1A和DYRK1B几乎达到最大降解程度，随后DYRK1B再次出现，而DYR684对DYRK1A的影响持续了至少48小时，但DYRK1B水平的恢复与基因表达增加无关。最后，研究人员对洗脱后DYR684介导的降解持续时间进行评估发现，洗脱后的48小时内，DYRK1A水平并未恢复，表明DYR684在这些条件下具有持续降解DYRK1A的作用。 DYRK1B剪接变体p65对DYR684诱导的降解具有抗性 在图7和图8中，DYRK1B存在代表p69和p65的双条带，残留的DYRK1B信号主要由迁移更快的p65变体引起，进一步的实验证实了p69变体的选择性减少。DYRK1B-p65在激酶结构域内缺少40个氨基酸，是一种无催化活性的假激酶，对PROTAC存在潜在的抗性。通过生成稳定过表达的带有HiBiT标签的DYRK1B-p65的HEK293细胞系进行分析发现，用1μM DYR684处理后，DYRK1A丰度降低较DYRK1B-p69更为显著，而DYRK1B-p65则对降解完全抵抗，这可能是因为PROTAC不能与变化的催化结构域结合。 DYR684通过CRBN介导的泛素化诱导DYRK1蛋白酶体降解 研究发现，用过量L41或来那度胺预处理HEK293细胞可阻止内源性DYRK1A/B的降解，说明CRBN结合对于DYR684的降解作用而言是必需的。用NEDD8激活酶（NAE）抑制剂MLN4924进行预处理也减弱了DYRK1A/B的降解，这表明DYR684的降解作用涉及泛素连接酶CRL。用p97解折叠酶抑制剂处理可抑制DYRK1A/B的降解，说明p97解折叠对蛋白激酶的降解至关重要。用蛋白酶体抑制剂硼替佐米进行处理证实了DYRK1A/B的降解取决于蛋白酶体活性。过表达实验验证了泛素与DYRK1A的结合。总之，上述结果表明，DYR684招募E3连接酶配体CRBN以诱导DYRK1A/B泛素化，继而发生p97介导的解折叠和蛋白酶体降解。 降解的连续步骤共同影响了PROTAC诱导的靶标降解动力学。为对DYRK1的降解进行实时表征，研究人员对稳定表达GFP-DYRK1A或GFP-DYRK1B融合蛋白的HEK293细胞进行DYR684或非降解类似物DYR813处理，连续6小时监测GFP荧光。结果显示，GFP-DYRK1A被快速有效地降解，初始降解速率约为0.74h⁻¹（t1/2=57min），GFP荧光最大降低98%。GFP-DYRK1B以1.16h⁻¹的速率降解（t1/2=36min），在降解到86%时达到平台期。1μM DYR684对过表达的DYRK1A和DYRK1B的快速降解表明，当内源性DYRK1被100nM的DYR684降解时，蛋白酶体降解所涉及的各个机制步骤都没有饱和，所以这种处理不太可能对细胞蛋白质质量控制系统产生负面影响。 癌细胞系中DYRK1A的降解 DYRK1A和DYRK1B是癌症治疗的潜在药物靶点。用DYR684处理不同人类癌细胞系8小时，结果显示DYR684具有细胞系特异性作用，在SH-SY5Y神经母细胞瘤和A549肺腺癌细胞中，DYRK1A发生完全或实质性降解；在PANC-1胰腺癌细胞中，DYRK1A部分降解；HeLa宫颈癌细胞和OVCAR3卵巢癌细胞对DYR684存在抗性。用DYR684处理SH-SY5Y和A549细胞24小时观察到DYRK1A和DYRK1B的持续耗竭。 DYR684对细胞DYRK1活性的影响 为评估DYR684对DYRK1A/B下游靶点的影响，研究人员对SF3B1的磷酸化情况进行了评估。10nM的DYR684可近乎最大程度地抑制SF3B1磷酸化，SF3B1磷酸化的降低可能是由于DYRK1的活性被直接抑制或是由于PROTAC诱导的降解作用。通过比较DYR684与非降解对照物DYR813的效果发现，DYR813能部分抑制SF3B1磷酸化，表明其能结合DYRK1并阻断ATP结合位点，同时也说明在100nM浓度下DYRK1未被完全占据，说明对于通过“事件驱动”机制起作用的药物，最大程度的靶点结合并非是高效性的必要条件。 DYR684对蛋白质组的影响 为探索DYR684在蛋白质组水平的降解选择性，研究人员进行了无偏倚的定量全局蛋白质组学分析。在HEK293或SH-SY5Y细胞中用100nM的DYR684或溶剂处理24小时后，对6500余种蛋白质进行定量，发现DYRK1A是唯一显著降解的蛋白激酶。在HEK293细胞中未检测到DYRK1B。与Western blot结果一致，DCAF7水平不受DYR684的影响。极少数的蛋白质在处理后表现出显著变化。 DYR684在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中的细胞毒性作用 由于DYRK1A和DYRK1B是癌症治疗的药物靶点，研究人员对DYR684在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中的作用进行了研究。结果显示，用2μM顺铂、100nM DYR684或两者同时处理细胞会导致中等程度细胞毒性，肉眼观察可发现联合处理的细胞死亡明显增加，表明DYR684降低了神经母细胞瘤细胞的活力，且能与顺铂联合使用。 DYR684的物理化学和药代动力学性质 DYR684在生物相关缓冲液中的溶解度较低，但远高于DC50值。DYR684在肝微粒体和全血中稳定性好。DYR684与蛋白质高度结合，PAMPA数据表明其难以通过血脑屏障。动力学分析显示，DYR684驻留时间长、解离慢。小鼠体内药代动力学参数显示，DYR684腹腔注射后快速吸收，血浆浓度能够在一定时间内维持在DC50值以上，可实现对DYRK1的最大降解。DYR684的高血浆蛋白结合导致其清除率相对较低。 目前尚未对DYR684进行体内代谢物鉴定。推测泊马度胺结构可能是导致其血浆不稳定性的因素，将邻苯二甲酰亚胺-戊二酰亚胺换为苯基戊二酰亚胺可增加血浆稳定性。Xenosite软件预测N-脱烷基化和葡萄糖醛酸化可能是DYR684的主要代谢途径。 总结 本研究基于DYRK1抑制剂DYR530开发出了CRBN招募降解剂DYR684，首次证实了DYRK激酶可被PROTAC降解。DYR684在物理化学和药代动力学特性、效力、靶标选择性、机制验证和非降解对照化合物的可用性方面符合化学探针的关键标准。与传统的1型抑制剂相比，DYR684能持续有效地降低DYRK1A信号，对DYRK1B的不同剪接变体有不同作用。目前，对DYR684的进一步的优化仍在进行，旨在改善药代动力学性质和选择性，以推动DYRK1降解剂的临床转化。 文献来源 10.1021/acs.jmedchem.4c01130 请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程 1.药渡CyberSAR结合药物设计思想，挖掘了文献及专利报道的活性的结构，通过CyberSAR以方便快速获得研发人员兴趣靶向结构，以供开拓思路，就本文靶点之一DYRK1A举例如下： 2.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“聚类结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献和专利具有关于靶点相关实验测试活性的分子以“母核结构聚类”的形式展示。其中“绿色字体高亮的”为文献报道的体外酶、细胞活性测试实验中IC50<1000nM的活性分子结构、具体实验、实验结果及实验来源。 3.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“原始结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献具有关于靶点相关实验测试活性的分子以“研发阶段时光轴”的形式展示。其中绿色高亮展示了潜力Hit。 4.在靶点界面选中“适应症”选项标签，可以可视化直观分析现收集的各类大数据。 登录方式 CyberSAR在电脑浏览器端登录网址： https://cyber.pharmacodia.com/，欢迎猛烈试用。 请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程 如需进一步沟通，请扫码添加微信联系药渡赵博士或药渡CyberSAR沟通群。

全球糖尿病患者人数高达5.37亿，相较于健康人群，糖尿病患者体内的胰岛β细胞数量显著减少，这是导致患者血糖控制困难的主要原因之一。目前的糖尿病治疗手段虽多，却未能从根本上解决β细胞缺失的问题。 然而，研究指出，通过抑制双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A（dual tyrosine-regulated kinase 1A，DYRK1A）或与胰高血糖素样肽-1受体激动剂（GLP1RA）联用，可在体外有效促进人胰岛β细胞的复制，但这一疗法在体内的有效性和安全性，以及它对β细胞存活与胰岛血管化的影响，尚待进一步探究。 前不久，美国希望之城贝克曼研究所Adolfo Garcia-Ocaña研究团队在Sci. Transl. Med.发表了题为“Harmine and exendin-4 combination therapy safely expands human β cell mass in vivo in a mouse xenograft system”的研究性论文。他们采用DYRK1A抑制剂与GLP1RA联合疗法，成功实现了在小鼠异种移植模型中安全地扩大人胰岛β细胞群体，这为糖尿病治疗带来了新的希望。 研究中，利用先进的iDISCO+成像技术，研究人员精确测量了免疫缺陷小鼠体内移植的人胰岛β细胞与α细胞的数量。经过四周的治疗，与对照组和其他单一疗法相比，DYRK1A抑制剂（Harmine）与GLP1RA（Exendin-4）的组合（简称H+E疗法）显著提升了β细胞的体积和增殖速率。 经过三个月的治疗后，H+E组β细胞的体积达到了0.75立方毫米，是其他组别的4到7倍，且β细胞增殖率提高了2到3倍，并且几乎没有观察到β细胞的死亡现象。 另一款选择性DYRK1A抑制剂2.2c与Exendin-4的联合使用，也获得了与H+E疗法相似的效果，β细胞体积增加了4到5倍。即便停药一个月，H+E组的β细胞体积增长依然保持稳定，增殖活动回归至初始水平。 H+E疗法不仅增加了β细胞的数量，还提升了它们的功能，改善了葡萄糖耐受性，增强了胰岛素的分泌能力，且未引发低血糖。在长期效果方面，β细胞功能保持正常，展现出优秀的持久性。至于α细胞，H+E疗法对其体积和增殖并未产生显著影响。 图1：harmine-exendin-4增加体内人胰岛β细胞水平 图2：harmine-exendin-4增强人胰岛β细胞功能 安全性评估显示，接受H+E疗法的小鼠行为正常，组织检查未发现任何明显的病理变化或异常增殖。在链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病模型中，H+E疗法显著提升了β细胞体积，血浆人胰岛素水平显著升高，葡萄糖耐受性增强，血糖水平得以持续改善，且α细胞体积未受影响。 值得一提的是，提前一周开始H+E疗法能显著提高早期β细胞的存活率，整个治疗过程中，β细胞体积比对照组高出50%，增殖率上升，死亡率下降，这表明H+E疗法具有早期保护作用。 RNA测序分析揭示，H+E疗法提升了VGF基因的mRNA表达水平，促进了VGF及其衍生肽TLQP-21的分泌，同时还减轻了因缺氧引起的内质网应激导致的β细胞死亡。在H+E疗法处理后的胰岛移植组织中，内皮细胞相关基因PECAM1、ESM1和VWF的表达上调，表明血管化程度增加。PECAM1/CD31免疫染色进一步确认了H+E组的胰岛移植物具有更加丰富的血管网络。 图3：VGF介导体内harmine-exendin-4诱导的人胰岛β细胞的保护和扩增 图4：Harmine-exendin-4增强胰岛移植物血管形成 综上所述，DYRK1A抑制剂与GLP1RA的联合疗法能够显著增加体内人胰岛β细胞数量，通过促进β细胞的增殖、功能和存活来实现，且这一过程由VGF介导。这项研究证实了该联合疗法在糖尿病治疗上的巨大潜力及安全性，预示着其在临床应用上的广阔前景。 参考文献： Rosselot C, Li Y, Wang P, et al. Harmine and exendin-4 combination therapy safely expands human β cell mass in vivo in a mouse xenograft system. Sci Transl Med. 2024;16(755):eadg3456. doi:10.1126/scitranslmed.adg3456 本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！ 点击下方「阅读原文」，前往生物谷官网查询更多生物相关资讯~

侃言 此前多次分享过“小分子大环化”这种分子编辑策略在药物化学中改善候选分子效力、选择性、物化特性、和ADME特性等应用实例和总数观点。 近期，EJMC上也刊载了一篇相关综述，文末“阅读原文”可直达原英文文献地址。 此前分享的JMC上的一篇“小分子大环化”的综述，主要从大环化对分子各种性质的影响以及连接器的应用的角度来讲述。本篇EJMC的综述文章更注重从不同类型的蛋白质靶点出发，讲述近5年，“大环化”分子编辑策略在具体药化实例中的优势和应用。 1 “大环化”的优势 “大环”一般指的是在重原子的基础上，具有12个活更多成员的环状化合物。根据“环”形成的核心化学性质，大环类化合物可以分为环肽类、环内酰胺类、环内酯类、环醚类/胺类等。 从药物化学的角度，根据大环药物成环的化学特征，可将其细分为环肽、和大环。 近些年，化学药物发现领域不断涌现出具有多种创新机制的新药，包括：大环类药物（大环/环肽）、靶向蛋白水解嵌合体（PROTACs）、分子胶、抗体偶联药物（ADC）、共价抑制剂等。其中，“大环化”后的大环类药物，由于能够在部分刚性结构中提供功能多样性和立体化学复杂性，具有几个独特的优势： 为药物研究提供新颖的化学空间和知识产权（IP); 大环刚性结构提供相对开环结构表现出更高的亲和力、选择性。在结合具有挑战性药物靶点，解决小分子药物耐药性的问题上具有优势； 在药物发现过程中，优化药物性质； 因此，小分子大环化在近期的药物研发中，已经成为一种热门分子编辑手段，用来改善药物功效和药物类药性特性。 2 “大环化”在先导化合物优化中的应用 接下来，作者汇总了近5年来，在不同的靶点先导化合物优化的过程中，利用“大环化”改善“小分子”功效和特性的实例，大约近30个实例。 01 ATP柠檬酸裂解酶抑制剂 ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）是一种催化柠檬酸生成乙酰辅酶A的酶，在糖代谢和脂质生物合成中起重要作用。催化过程为一些重要分子（如胆固醇、脂肪酸等）的生物合成提供合成砌块，并在蛋白质乙酰化中起重要作用。 ACLY过表达会导致代谢疾病和恶性肿瘤，因此，这种酶是一种潜在的药物治疗靶标。然而，ACLY抑制剂的研发过程中，低活性、细胞渗透性、毒性、药代动力学特性等，一直是阻碍候选分子进一步进入临床研究的障碍。 如上图，在观察化合物1与ACLY的共晶结构时发现，其与靶标呈“U”型结构结合，并且处于活性构象时，苯环与酯基结构非常接近。这里出现了关环以稳定其活性构象的切机！ 通过优化，大环化后的分子在保持了相当的功效（IC50、KD)的同时，其代谢稳定性得到了极大的提高：半衰期提高了158倍，人肝微粒体清除率减少了258倍！ 02 CGRP受体拮抗剂 降钙素基因相关肽(CGRP)及其受体(CGRPR)是偏头痛治疗的潜在靶点，当前已有几种口服CGRP拮抗剂上市。 CGRPR由降钙素样受体（CLR)和受体活性修饰蛋白1（RMAP1)的复合物形成，具有宽、浅、溶剂暴漏的结合位点，最适合大环化配体结合。 如上图，在研究化合物3与CGRPR的共晶结构时发现，一个吲唑甲基片段填充了亲脂腔，取代了疏水性热点重叠的“高能水”区。因此，研究人员尝试设计大环化，以稳定化合物3的活性构象。 通过分子对接，发现大环化分子（4a、4b)与无环化化合物3的活性构象刚好吻合。验证也发现，环化后的分子的效力提高了4倍，亲脂效率（LEE)提高了1.3倍。更有趣的是，非对映体5也是针对靶标有效的，并且是完全不同的结合模式，有助于设计新的CGRP受体拮抗剂。 03 CTG重复序列结合物 DNA或RNA靶向也是一个比较快速发展的药物研究领域。例如，肌强直性营养不良是一种遗传性疾病，其蛋白激酶（DMPK）基因的3’-非翻译区含有扩增的d(CTG）重复序列和扩增的r(CUG）重复序列隔离肌盲样（MBNL）家族蛋白，在剪接中起重要作用。 化合物6可以选择性识别d(CTG）和r(CUG），结合常数在次微摩尔级别，然而，其在该浓度范围内也表现出了细胞毒性。 经过分析，化合物6存在如上图中的堆叠构象和非堆叠构象。非堆叠构象，一方面发挥与DNA、RNA的非特异性结合，另一方面因非特异性结合而增加的剂量会导致细胞毒性。因此，通过环化，锁定化合物在堆叠的活性构象，可以增加分子的特异性和效力，进而减少细胞毒性。 正如预期，化合物8a细胞毒性降低了10倍；化合物8b的效力、选择性等都得到了显著提高。 04 因子XIa抑制剂 凝血酶或凝血因子XIa(FXIa)是抗血栓治疗的新靶点。 BMS研发的化合物9是FXIa潜在的抑制剂，具有nM级抑制常数。然而，该化合物具有较大的极性表面积，以及较差的PK属性：仅3%的生物利用度，以及较多的氢键导致极低的渗透性。 通过配体与靶标的共晶结构，发现化合物9咪唑附近的两个苯环彼此邻近，具有大环化的潜力，进而有可能改善分子的效力和选择性。 在后续的优化中，研究人员通过去除四氮唑和酰胺氢，以降低PSA，改善不良的渗透性和口服吸收。环化后的化合物10，虽然与靶标的结合力常数略有升高，但仍保持在有效的范围内。同时，降低了PSA，其药效更强、生物利用度更好，并且增加了靶标特异性。 05 FKBP51抑制剂 FK506结合蛋白（FKBP51）是一种隶属于免疫亲和蛋白家族的肽基脯氨酸异构酶，在调节糖皮质激素受体活性中起重要作用，并作为共同伴侣，参与HSP90蛋白折叠。FKBP51是许多疾病的潜在靶点，包括与压力相关的精神障碍、肥胖引起的糖尿病、和慢性疼痛等。 如上图，化合物11a、11b是首次报道的FKB51选择性配体，具有个位数nM级别的抑制活性。在研究化合物11b与靶标的共晶结构时发现，两个芳环上的醚键彼此靠近，具有环化的潜力，以锁定生物活性构象。 如上图，通过从尝试一系列连接子，含有两个羟基的化合物12相比于非环化前体，药效最强。感觉整体选择性降低了，变泛配体了？ 06 谷氨酰胺酶1抑制剂 谷氨酰胺酶（GLS)是水解谷氨酰胺，获得谷氨酸盐的关键性酶。在一些癌症中，“谷氨酰胺成瘾”，维持癌细胞增殖所需要的能量。人类GLS酶包括两种类型：GLS1，广泛分布于肝外组织的肾型谷氨酰胺酶；GLS2，主要分布于成人肝脏的肝型谷氨酰胺酶。其中，GLS1的活性与肿瘤生长速率相关，是癌症潜在的治疗靶点。 如上图，化合物13是一个临床候选分子。早期研究期待通过环化获得新型的抑制剂，然而效力均不理想。直到在分析化合物13与GLS1的共晶结构时，在结合的生物活性状态观察到了“U”构象。分子处在生物活性构象时，两端的基序彼此靠近，提供了环化的切机。 环化后的化合物14，效力提高了3.6倍，并且稳定性也获得了显著的提高：半衰期提高了2倍、清除率降低了1/3。然而，生物利用度相比于前体13有所降低（9% vs 19%）。 07 异柠檬酸脱氢酶2（IDH2)抑制剂 异柠檬酸脱氢酶（IDH)是一种影响三羧酸循环中异柠檬酸和α-酮戊二酸相互转化代谢途径的酶。 化合物15是一种FDA批准的用于治疗复发性和难治性急性髓性白血病的药物。研究人员尝试通过大环化获得构象限制的新型IDH2抑制剂。通过观察化合物15与IDH2R140Q突变体的共晶结构，发现吡啶N的部分与脂肪侧链非常接近，因此合成了大环化合物16。 环化后的化合物对R140Q突变体抑制性最强，具有个位数nM级抑制活性，而对野生型IDH2无抑制作用。同时，环化后的化合物还具有良好的生物利用度和代谢稳定性。 08 激酶凋亡信号调节激酶1（ASK1）抑制剂 凋亡信号调节激酶1（ASK1)通过调节细胞应激反应，在炎症和凋亡中发挥重要作用。ASK1调节可有治疗神经系统疾病，包括肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、帕金森病、阿尔兹海默病等。 如上图，Selonsertib是表现最好属性的ASK1抑制剂，具有生化和细胞效力以及良好的药代动力学特征。然而，其是P-gp底物，不适合作为中枢神经系统药物。 通过研究其与靶标蛋白质在溶剂暴露区和催化赖氨酸结合位点附近的激酶结构域的共晶结构发现，具有大环化的潜力，或许可以解决CNS渗透性问题。 如上图，获得了两种类型的大环化产物：化合物17、18。然而，环化后的产物并没有比母体更具有效力。CNS渗透性可以通过引入适当的官能团来调节。如上图，含氟化合物17表现出低至中等的CNS穿透性，而咪唑类化合物18表现出更优异的脑暴露性。 09 激酶骨形态发生蛋白受体II型（BMPR2) 骨形态发生蛋白受体II型(BMPR2)是一种丝氨酸/苏氨酸受体激酶，属于酪氨酸激酶样(TKL)组，是肺动脉高压、癌症、阿尔兹海默病等疾病的靶点。 如上图，化合物19具有BMPR2靶标次纳摩尔级的结合力以及双位数nM级的抑制活性；然而，其同时抑制468个激酶中的262个，表现出极差的特异性的混杂行为。 通过分析化合物19与VRK1的共晶结构，发现氰基与环丙烷彼此靠近，设计连接子，或许可以提高其选择性。如上图中，环化后的化合物20，其效力虽不如前体，但仍保持在次微摩尔级的有效范围。而其选择性获得了提供。 10 周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）抑制剂 周期蛋白依赖性激酶2（CDK2)是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，与周期蛋白伙伴相互作用。CDK-周期蛋白复合物失调，会导致癌细胞失去周期和转录控制。 其中CDK2抑制剂对CDK4/6抑制剂治疗产生耐药性的患者有益。 研究人员发现化合物21对CDK2参与的PPI作用具有有效的抑制作用。以此为起点，结合AI技术和基于片段的变分自编码器生成模型来识别CDK2抑制剂。通过分析其对CDK2/cyclin E1的共晶结构，发现其呈“U”型结构，吡啶与溶剂暴露的异丙基靠近，具有大环化的潜力。 在一系列的大环化衍生物中，化合物22最具潜力。其针对CDK2/E1的抑制效力提高了21倍，然而，针对CDK1/A2的选择性略有下降。 11 周期蛋白依赖性激酶9（CDK9）抑制剂 髓样细胞白血病-1(Mcl-1)是一种抗凋亡蛋白，在癌细胞存活中起重要作用。Mcl-1在多种癌症的细胞增殖过程中过表达，特别是在EGFR突变的细胞系中，而CDK9抑制可下调Mcl-1。 化合物23是一种有效抑制CDK9的苗头化合物，然而，其同时对其它CDK蛋白具有抑制活性，如CDK2/4/12，具有较差的选择性以及因此而导致的体内毒性。 研究人员试图通过大环化来固定二面角，以抑制柔性旋转。通过优化大环化连接子以及酰胺侧链，如上图，获得化合物24，保持了针对CDK9效力的同时，具有良好的选择性。 12 c-Met激酶抑制剂 c-Met是一种受体酪氨酸激酶（RTK)，是肝细胞生长因子（HGF)/分散因子（SF)的受体。靶向HGF/c-Met信号通路，是非小细胞肺癌的潜在治疗策略。一些小分子已被用于靶向c-Met，包括已上市的药物(克唑替尼、卡马替尼、替波替尼、萨沃替尼和卡博赞替尼等)。 如上图，在基于先导化合物设计新型c-Met抑制剂时，发现了与c-Met共晶结构中存在“U”型结合模式，使用不同的连接子使小分子大环化，能够产生在生化、细胞活性等方面的差异性。 通过大环化，可以使分子维持在折叠的低能构象，以避免结合自由能熵补偿。如上图，大环化后的化合物26，获得了改善的生物活性、选择性。 13 酶双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A/B 双特异性酪氨酸（Y)磷酸化调节激酶1A (DYRK1A) 在神经系统疾病和癌症中都起作用。 如上图，化合物27是一种有效的DYRK1A抑制剂，然而，其是一种泛激酶抑制剂，具有广谱抑制作用。在研究化合物27与DYRK1A的共晶结构时，发现了“U”型结合模式，其中苯环的3-位与吡啶环的5-位非常接近。 因此，研究人员以此合成大环化分子，实现了对靶标的高亲和力和选择性。 14 激酶表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂 表皮生长因子受体(EGFR)携带del19或L858R突变体时，它是一种致癌驱动因子，特别是在肺癌中。 如上图，化合物30是勃林格殷格翰发现的具有潜力的苗头化合物。在详细的构象分析中发现，化合物30具有活性和非活性构象，因此，研究人员决定通过大环化来稳定其活性构象。 如上图，大环化后的产物31，其抗增殖效力得到了极大的提高。 也有研究人员基于Gefitinib的结构尝试大环化，如上图，化合物32针对突变体的抑制效力虽略有不如前体，但也保持了次nM级抑制效力；而其针对野生型的选择性获得了极大的提高。 15 造血祖激酶1（HPK1）抑制剂 造血祖激酶1 (HPK1)是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，调节T细胞、B细胞和树突状细胞的功能，是免疫治疗潜在的治疗靶标，作为肿瘤转移患者潜在的治疗策略。 如上图，化合物33是BMS发现的一种有效的HPK1抑制剂，并且针对GLK具有39倍选择性。研究发现，HPK1与GLK的差别之处在于HPK1具有更宽的入口口袋，因此，这种差别赋予了两个靶标的空间冲突选择性。而研究发现，化合物33的苯基基序的柔韧性可以引起构象变化，符合GLK。若通过大环化来实现构象限制，则有可能进一步提高选择性。 如上图，环化后优化的产物34，其针对HPK1的效力提高了4.6倍；选择性提高了101倍；代谢稳定性提高了3倍；抗hERG活性低于化合物33等。此外，其还获得了中等的渗透性，无外排倾向，对CYP3A4无明显抑制作用。 16 Janus激酶2（JAK2）抑制剂 Janus激酶2（JAK2）是一种细胞内非受体酪氨酸激酶，属于Janus激酶家族（JAK1、JAK2、JAK3、Tyk2），可以作为骨髓增生性肿瘤、类风湿性关节炎、以及炎症性肠病的治疗靶点。 如上图，研究人员以Fedratinib为起点，探索基于深度学习的JAK2大环化抑制剂设计。Fedratinib已批准于治疗骨髓纤维化，但其激酶选择性较差。 研究人员在两个芳环之间设计连接子，并鉴于结构分析去除磺酰胺，通过分子对接，从产生的218个大环化分子中选择最具潜力的分子进行合成、验证，其中化合物35与Pacritinib非常相似。其效力略不如前体，然而其仅抑制17种野生型激酶，相比于前体的34种，选择性得到了很大的提高。同时，PK属性获得了提高。 17 激酶Pim-1抑制剂 Pim-1编码基因具有致癌潜力，Pim-1激酶是前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤的信号蛋白。 如上图，化合物36是一种μM级的Pim-1抑制剂，通过配体竞争饱和方法进一步优化，获得更高效的抑制剂37，以及选择性靶向Pim-2、Pim-3。然而，其细胞渗透性差。 分析化合物36、37与Pim-1的共晶结构，发现芳环上的氯原子与侧链N原子旁边的碳原子非常接近，具有大环化的潜力。通过设计不同的大环化连接子，最终确定了最有效的化合物38，保存了化合物37相当的效力，同时具有μM级细胞活性。 18 脾酪氨酸激酶（SYK）抑制剂 脾酪氨酸激酶（SYK）是一种主要在造血干细胞种表达的非受体酪氨酸激酶，也是B细胞受体（BCR)信号的调节因子，是治疗自身免疫性疾病和血液病的潜在治疗靶点。 如上图，化合物39是阿斯利康发现的一种有效的、选择性SYK抑制剂。然而，其具有不良的药代动力学（PK）特性。因此，研究者尝试用大环化的分子编辑手段进行进一步优化。 首先，基于溶液态NMR数据，观察到化合物39主要以“U”型构象存在，发现了大环化的切机。在众多大环化分子中，化合物40最具有潜力。尽管其效力和细胞活性略有降低，其在大鼠肝清除和人肝微粒体清除研究中更加稳定。同时，其没有hERG抑制活性，提高了激酶选择性。此外，其渗透性由于羟基极性的引入而降低，这或许需要用前药的方法来进一步解决。 19 原肌球蛋白受体激酶（TRK）抑制剂 原肌球蛋白受体激酶（TRK）是一种跨膜受体酪氨酸激酶，有三种亚型（TRKA、TRKB、TRKC）组成，分别由神经营养受体酪氨酸激酶1、2、3基因编辑。TRKs调控哺乳动物中枢和周围神经系统的生理功能，是NTRK融合阳性癌症的潜在治疗靶点。 如上图，Larotrectinib是一种FDA获批的TRK抑制剂，并且在临床上通过将二氟苯和吡咯烷基序连在一起，产生了两种新型药物Selitrectinib、Repotrectinib。 此外，也有研究通过Schrodinger软件，以Larotrectinib为起点生成TRKAG595R突变体的对接，实现大环化。在分析了结合模式后，通过环化3-羟基吡啶部分和二氟苯的溶剂暴露区域，合成了3种类型的大环化化合物，共23个。其中，化合物41是比前体更具有效力的。 丁克教授也在该项目上做了大量工作，如上图。他们首先确定了苗头化合物42，具有TRKA、TRKB、TRKC抑制活性。 以苗头化合物42为起点，新的设计首先采用了骨架跃迁的策略，获得先导化合物43，其在针对野生型TRKA、TRKC、以及突变体TRKAG667C等生化试验中显示有效活性。 通过对43的结合模式进行预测分析，发现了该化合物以II型结合模式与TRKC的APT结合口袋结合，因此，在此基础上计划将苯环和胺基序环化以获得刚性结构。 环化后的化合物44表现出比先导化合物更有效的生化活性、和细胞活性、以及更高的激酶选择性。对连接子和侧链进一步优化，获得化合物45，其效力、细胞活性、选择性进一步获得了提高。 20 TYK2激酶抑制剂 TYK2也隶属于前面提到了Janus激酶家族一员，是治疗自身免疫性疾病的潜在靶点。 如上图，化合物46是一种有效的Tyk2抑制剂，通过共晶结构分析，在氧杂吡咯烷酮与吡啶基序之间的溶剂暴露区发现了大环化的切机。环化后的化合物47尽管效力没有改善，其针对JAK1、JAK3的选择性得到了极大的提高。 21 髓过氧化合物酶(MPO)抑制剂 髓过氧化物酶(MPO)是一种人类含血红素过氧化物酶，是中性粒细胞初级颗粒的主要成分。其过表达和氧化产物的形成与炎症性疾病，特别是动脉粥样硬化有关。适当调节这种酶，对预防心血管疾病很重要。 如上图，化合物48是一种有效的MPO抑制剂，针对TPO的选择性约25倍，而化合物49具有相当的MPO抑制活性。通过将结合了MPO活性位点的48、49的晶体结构于同一位置的三唑并吡啶环重叠，发现化合物48的茚环与化合物49的苯环距离很近，几乎重叠。因此，研究人员设计融合两个化合物的构象特点，通过设计大环化来提高分子的效力和选择性。 优化后，获得的化合物50，其MPO抑制效力提高了约10倍，选择性提高了1580倍！ 22 NS3/4A蛋白酶激动剂 Asunaprevir是获批NS3/4A蛋白酶药物，然而却常常诱导R155K和D168N突变而产生耐药性。这种耐药性机制可能是配体结合诱导Arg155与P2*杂环接触，Arg155与Asp168结合而稳定。因此任何一个位点的突变，都会破坏配体与NS3/4A蛋白酶结合。 因此，BMS试图通过环化P1、P3来稳定结合的活性构象，以避免耐药性突变的发生。通过优化后，获得的大环化化合物51，其激动剂活性针对所有的基因型均获得了改善。同时，除了食蟹猴以外，大鼠和狗的生物利用度也获得了很大的提高。 23 PI3K δ抑制剂 磷酸肌醇3-激酶δ（PI3K δ）可催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2)磷酸化为磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PIP3)，在细胞生长、增殖、存活和迁移相关信号通路中起重要作用，主要在白细胞中表达，是慢性阻塞性肺疾病（COPD）的靶点。 如上图，化合物52是一个临床候选化合物发现的起点。通过其与PI3Kδ共晶结构分析发现，磺酰胺基团的甲基与酰胺键的羰基之间靠近，具有大环化的机会。 对比环化前体，环化后的产物其针对PI3Kδ抑制效力和结合力显著提高，配体效力（LE)略微改善、体内/体外的清除率明显降低。 24 PI3K/m-TOR抑制剂 PI3K/AKT/m-TOR信号通路的激活与乳腺、结肠、肺、血液等恶性肿瘤的发生发展有关。 如上图，Omipalisib是已知的PI3Kα、m-TOR抑制剂，以此为起点，通过对其共晶结构的分析、以及分子对接的了解，研究人员通过环化两个溶剂前沿区域的靠近基序，获得的产物55，其PI3Kα抑制活性得到了改善，m-TOR抑制效力降低，p-AKT激动活力提高了3倍以上等。 25 PI3K/m-TOR/PIM抑制剂 PIM激酶通过参与PI3K/m-TOR/PIM通路参与癌症的发展。 如上图，环化产物57比非环化前体56更具有效力和选择性，且具有泛PIM抑制活性。 26 纤溶酶抑制剂 纤溶蛋白是一种类似胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶，在生理条件下参与纤维蛋白凝块的降解，控制循环中纤溶和凝血的平衡。纤溶酶活性增强的情况，如心脏手术合并体外循环、和器官移植，会增加出血性疾病的风险。 如上图，化合物58是一种非特异性抑制剂，具有次nM级抑制力活性。在分子模拟研究中发现，P2、P3侧链与美表面或溶剂暴漏区的方向相同；而且，除了纤溶酶外，其它蛋白酶的“发卡”结构会与P2、和P3形成的大环产生空间冲突，因此，这为大环化后提供了潜在的选择性。 通过优化后，获得大环后产物59，其抑制效力保持，而且选择性获得了极大的提高。 27 RORC2反向激动剂 视黄酸受体相关孤儿受体C2(RORC2, RORγt)是一种与IL-17A和IL-17F表达相关的核激素受体。因此，一种合适的调节RORC2受体的小分子，特别是作为一种逆激动剂，可能抑制体外IL-17A的产生，并对牛皮癣、类风湿性关节炎(RA)、炎症性肠病和多发性硬化症的体内模型有效。 如上图，化合物60是辉瑞发现的一个低分子量的先导化合物，进一步的改善获得化合物61，其表现出合理的RORC2反向激动作用和IL-17A抑制性，但理化特性没有得到改善。 通过共晶结构分析发现，化合物61具有“U”型活性构象，因此，将两个靠近的基序进行连接、大环化，获得产物62，其活性略有降低，然而其物化特性获得了极大的改善。 28 突变呼吸道合胞病毒融合(RSV F)蛋白 呼吸道合胞病毒（RSV）是一种传染性病毒，可引起下呼吸道感染，特别是婴幼儿和患有其它疾病的老人。 如上图，Presatrovir是目前正在临床阶段的很有前景的RSV F蛋白抑制剂。然而，已经观察到耐药性突变，这是一个非常严重的问题。 研究Presatrovir和野生型A2 RSV F蛋白分子模型发现，磺胺的氢和吡唑环的氮相互作用。将分子模型数据与单晶结构进行比较，结果很吻合。为了稳定这种构象，尝试基于先导化合物63进行大环化，来靶向野生型和D486N突变型RSV F。 其中各项最平衡的产物是化合物64，其针对野生型的活性降低，但针对突变体活性获得了极大的提高。然而，NMR分析，其具有拓扑异构混合物的存在。进一步优化，扩展环获得化合物65，其针对野生型、突变体的活性都获得了极大的提高，没有拓扑异构混杂的现象。捅死，在10μM环境下，仍没有CYP3A抑制活性。 29 干扰素基因刺激剂（STING) 干扰素基因刺激剂（STING)是一种衔接蛋白，在免疫应答相关的信号通路中发挥重要作用。因此，STING激动剂用于感染性疾病和癌症免疫治疗；而STING抑制剂用于自身免疫性疾病和炎症的治疗。 如上图，环化后的产物比前体具有更高的亲和力以及活性。 3 总结   在药物发现中，越来越多的证据表明，大环提供了一种新颖的化学类别，它占据小分子和生物制剂之间独特的化学空间。基于独特的构象特征，大环的药物特性使它们能够靶向其它化学类别不易接近的细胞外和细胞内的位点。 基于大环的药物设计或小分子“大环化”的分子编辑策略，在药物法中具有潜在的优势。 大环可以为靶蛋白提供更大的相互作用表面，从而在结合强度和特异性方面增强了结合亲和力； 大环的复杂性和三维特性增加了可能有助于提高靶蛋白的选择性，从而减少脱靶效应，增加治疗的安全性和选择性； 线性化合物的“大环化”通常提供更好的细胞渗透性，从而提高生物利用度； 大环的约束构象和刚性结构还可以提高稳定性，增加抵抗酶降解的能力，进而延长药物在体内的半衰期； 大环提供独特的化学支架，扩大化学空间的多样性； 大环能够更好的平衡亲脂性、亲水性、和分子量等性质，获得最佳的类药性； 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓