CENPF

The biotech industry strives to produce high-quality drugs with targeted structure-activity-relationships. The key to delivering these therapeutics is not only in understanding the active pharmaceutical ingredient (API) itself, but also in understanding process-related residual components that are inevitably present in the final product. Identifying and quantifying these components is not just a regulatory requirement it feeds back to process control mechanisms resulting in improved drug quality.One area where significant developments have recently taken place is in the analysis of Host Cell Proteins (HCPs). These proteins are derived from the host cell expression system and are targeted for removal through the purification process. HCPs should be assessed from early product development in order to show that the downstream purification processes are effectively reducing and removing HCPs.The benefits of including an LC-MS based method Traditionally ELISA, often in kit form, has been the method of choice for HCP analysis but there is an increased regulatory expectation that ELISAs will be complemented by MS-based HCP investigations. This orthogonal approach has now been supported by a new United States Pharmacopoeia (USP) General Chapter 1132.1 (Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals by Mass Spectrometry) which is open for public comment until 31st July 2023. This USP chapter provides an excellent and detailed overview and covers various considerations such as:different MS and chromatographic systems,sample prep,protein databases,data analysis and,methods for quantitation.The principal aim of any HCP assessment is to identify and quantitate proteins down to very low-level abundance and then use this knowledge to determine if and where further purification is required. Mass spectrometric techniques are ideal for this as MS has a wide dynamic range, up to 5 orders of magnitude sensitivity, allowing for the detection of low levels of HCPs among the high concentration of drug products.As with all methods, there are factors that can limit HCP analysis by MS, including:suppression of peptides of interest in the complex mixture,ionization inefficiencies and,interference from the sample matrix.Hence, HCP-MS has not been put forward to replace the more common ELISA-based assessments, but to supplement them.Dr. Christina Morris, Senior Scientist and HCP-MS expert at BioPharmaSpec said, Bringing mass spectrometry to HCP detection can generate meaningful data and enhance the understanding of HCP profiles by providing an orthogonal analysis to extend ELISA-derived information. I often present this table to illustrate the advantages and disadvantages of these two complementary techniques.TechnologyAdvantagesDisadvantagesELISA, GenericGood reproducibility, sensitivity, high throughput, low costNo sensitivity for low-reactive, non-immunogenic HCPsELISA, Process-specificSpecialized for a specific product to increase breadth of HCP coverageLong method development and production time for anti-HCP antibodies, higher costLC-MS/MSHCPs identified de novo and quantitated individually, high versatility for any process changes, high sensitivity Skilled operators for driving instruments and data interpretation. Investment for LC-MS equipment and software2D SDS-PAGETime efficient, low cost, combined with Western blotting can target HCPs of interestComplex data assessment, not strictly quantitative, low sensitivity How does MS measure HCPs?Quantitation of HCPs can be achieved using both labeling and label-free methods like multiple-reaction-monitoring (MRM) or sequential window acquisition of all theoretical mass spectra (SWATH-MS). The SWATH strategy has seen an increase in popularity, benefiting from simple, fast and cost-effective workflows. Through a combination of IDA (Information Dependent Acquisition) and SWATH MS acquisitions of proteolytic digests of product material, HCP identification and quantitation is performed by matching the MS/MS spectra to theoretical masses of equivalent peptide fragments in an HCP-specific sequence database.To make sense of the large and highly complex HCP-MS datasets generated from these workflows, Bioinformatics tools are used for peak-picking and filtering of potentially thousands of HCP identifications. The algorithms that sort through these spectra are critical to the HCP-MS strategy in terms of time-efficiency, but a degree of manual assessment (as is recognized in this new USP chapter) is an important cross-check to look for any HCP misassignments or false positives and is especially important in identifying low-abundance peptides.Should I be considering an HCP-MS orthogonal approach?With the new HCP-MS General Chapter 1132.1 proposal, the USP clearly recognizes the unique role that MS-based HCP analysis can play in the understanding of product impurity profiles. The ability to identify and quantitate HCPs provides a means to understand the product to a greater extent by generating complementary and orthogonal data to the ELISA-derived information and, through protein identification, accumulate useful information for manufacturing process development and ultimately improved product quality.BioPharmaSpecs approach to HCP-MS is flexible and proceeds through clearly defined stages, meaning that you receive data that is useful and applicable at your stage of product development and allows you to meet your specific objectives.A Collaborative HCP-MS Partner, with Extensive ExperienceWhether you want to ensure a robust control strategy, gain better process understanding or compare HCP profiles throughout your process and in the final product, BioPharmaSpecs experienced scientists will help you implement reliable and repeatable LC-MS based HCP methods for your development project. Speak to a scientist today. '

全球畅销且快速增长的抗体、蛋白类药物等生物药由相应工程细胞生产。生物制品药物生产过程中的宿主内源性蛋白，被称为宿主细胞蛋白（host cell proteins, HCPs）会随着不同工艺流程而部分残留在药物中。残留的HCPs作为外源蛋白可能会在不同程度上引发机体的免疫应答，导致过敏反应或其它不良反应。另外还有一些残留HCPs具有蛋白酶或脂酶的活性，可能导致蛋白药物或辅料的降解，进而增加药物产品的质量和疗效的不稳定性。基于此，对药物中HCPs的定性与定量检测就显得尤为重要。全球各国药典如美国药典，欧洲药典以及中国药典等都对HCPs检测提出了具体要求和标准。ELISA方法在HCPs的分析方法中，ELISA方法是广泛应用的，并作为QC日常放行检测的主要手段。ELISA方法相对简单、精度良好，方便设定控制范围和建立技术规范，适用于产品开发和过程控制；但ELISA方法检测依靠抗原抗体特异性结合，因此用存在于生物制品中的HCPs作为免疫原生产出的抗体质量至关重要。无论是商品化ELISA试剂盒，还是自制的多克隆抗体，如果抗体的特异性和适用性不够高，都有可能带来HCPs漏检的风险，从而对生物制品质量安全带来风险。除此之外，ELISA检测HCPs使用多克隆抗体，无法针对性的提供高风险HCPs残留蛋白真实存在情况。LC-MS方法高分辨液相质谱（LC-MS）采用母离子的精确质量和碎片离子的信息来确定肽段序列，并通过蛋白质序列数据库比对确定HCPs具体信息，可以精准分析单个HCP的存在情况，特别是对高风险蛋白的精准分析就非常重要。USP <1132.1>2023年5月1日，USP在最新一期的药典论坛PF49(3)中发布了通则<1132.1> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals by Mass Spectrometry（质谱法测定生物药中残留宿主细胞蛋白）。作为最新的HCPs检测相关技术通则，通则<1132.1>主要介绍了LC-MS技术在HCPs检测中的应用，从样品制备、质谱测试条件的建立、数据的分析、质谱方法验证等多个方面，详细阐述了质谱技术在HCPs中应用的优势与注意事项。作为一种先进的分析技术平台，质谱技术在HCPs分析中的应用，以及与ELISA方法和其他分析方法结合使用，有助于生产企业在产品的整个生命周期中更好地理解和建立HCPs的检测和清除，保证产品质量的稳定。虽然，<1132.1>介绍了LC-MS技术在HCPs检测中的优势，但作为生物制品HCPs检测的新趋势，仍需要考虑以下几点：● 稳定性：需要HCPs LC-MS检测流程进行验证，全流程都需要有严格的QC控制，确保检测结果的一致性和稳定性。● 可重复性：不同类型生物制品中HCPs提取效率不同，不同人员操作存在差异，需要在上机前通过不同方法评估HCPs的提取效率，避免人为因素造成结果重复性差。● 准确度：方法开发与验证阶段，如何设立内标与定量算法，通过内标响应回算得到HCPs的含量，确保定量结果的准确性。● 抗干扰能力：高丰度蛋白和特殊基质会对质谱检测产生影响，需要通过前处理手段对高丰度蛋白或特殊的基质进行去除，以减少其对HCPs肽段在质谱检测时的影响。● 真实性：样品中除HCPs以外的物质在质谱分析中同样会产生质谱信号，如何去除复杂的背景噪音避免假阳性和假阴性的出现，需要建立合理标准的生信分析流程。分析流程建立过程中同样需要建立严格的质控QC标准，并通过后期不同方法进行验证，确定其标准的真实性。湖州申科参考通则<1132.1>阐述的内容，同时凭借深耕生物制品质量控制领域10多年的经验，针对LC-MS检测HCPs方法进行了评价与优化。同时通过对LC-MS检测HCPs整体流程建立完整的质控，建立起一套抗干扰能力强、稳定性好、准确度高、结果真实可靠的LC-MS检测HCPs标准方法。据此，HZSKBio® LC-MS HCPs检测技术平台分成样品制备、质谱检测、数据生信分析及质谱结果方法验证四部分进行质控体系的建立（见图1）。图1 HZSKBio®HCPs覆盖率分析技术特点样品制备针对不同生物制品生产所用的宿主多样性，湖州申科开发了对应合适的前处理流程，包括特殊基质样品和高丰度蛋白样品中的HCPs富集提取。同时自主开发蛋白提取，酶切后的定量节点和内标，对样品的提取回收率进行质控，保证前处理流程稳定性，实现前处理的全流程质控和方法验证。HZSKBio® IMBS™抗体亲和平台，可特异性高效结合不同工艺流程样品中残留的HCPs，结合HZSKBio® LC-MS平台，可实现对不同工艺阶段的样品抗体覆盖率的准确评价。目前已经使用HZSKBio® IMBS™ & LC-MS平台完成293T、不同工艺E.coli、CHO、Vero、MDCK、Sf9等不同工程细胞HCPs抗体覆盖率的检测分析。蛋白质谱湖州申科开发了一套适应QC实验体系，包括单蛋白酶解样品、复杂体系酶解样品等的质控标准品；对液相保留时间，仪器响应做相应的性能评价，控制仪器带来的结果偏差；以及在不同批次进样中间，掺入QC样品，监控进样前、或进样过程中液相质谱稳定性。生信分析湖州申科专业的生信团队对质谱数据进行生信分析，同样建立了完整的QC体系；结合蛋白数据库与HZSKBio® LC-MS平台完成293T、不同工艺E.coli 、CHO、Vero、MDCK、Sf9等不同工程细胞在不同工艺阶段所出现的HCPs表征数据，建立不同宿主不同工艺阶段的蛋白数据库，用于质谱后的生信库比对；还建立了CHO等细胞的高风险蛋白数据库。湖州申科建立了上述工程细胞质谱一级与二级质谱图库。针对高风险的HCP，建立靶向的蛋白数据库，根据不同采集模式的特点与优势，开发基于DDA和DIA采集模式的非靶向蛋白定量方法，以及PRM的靶向蛋白定量方法。由于数据分析依赖于DDA的谱图库，而DIA数据采集模式获得的数据稳定性更高，重现性更好，湖州申科建立了自有的蛋白质组数据库，采用DIA定量流程，保证质谱方法的稳定性和重现性，满足GMP要求。质谱结果验证湖州申科对质谱的结果验证分方法学验证和多平台验证，方法学验证主要包括检测下限、准确度、精密度、特异性。◼︎ 检测下限：通过蛋白质组学数据分析软件对结果进行定性分析，将能够鉴定到的含量最低的内标的量作为本方法的检测下限。◼︎ 准确度：LC-MS方法开发阶段，通过加入内标，对定量分析方法进行定量准确度的验证，准确度的范围要求在100±20%以内。◼︎ 精密度：精密度描述为本定量方法重复测定的接近程度，通过内标对精密度进行验证，定义为测量值的相对标准差（变异系数），变异系数CV<15%。◼︎ 特异性：由于检测的样品中加入了其他来源的蛋白，这些蛋白中也可能存在HCP蛋白，可能会对检测产生干扰，通过考察检测到的肽段的特异性，保证数据结果可靠。同时也作为选择内标蛋白的标准之一。多平台验证湖州申科与通则<1132.1>中提到的与ELISA方法和其他分析方法（West Blotting）结合使用，对检测的结果进行多方验证。公司自主研发的HCPs系列ELISA检测试剂盒包括CHO、293T、不同工艺E.coli、Vero、MDCK、Sf9等宿主工程细胞为LC-MS结果准确与真实性验证提供了强力的支持，也为助力生产企业在产品的整个生命周期中更好地检测HCP的清除过程提供支持。综上所述，HZSKBio®高分辨质谱平台依照通则<1132.1>提到的LC-MS相关信息建立的特色归纳如下：图2 HZSKBio®LC-MS HCPs检测流程湖州申科推出了基于高分辨质谱的HCPs鉴定和定量分析定制化服务：参考文献：[1] Vanderlaan M, Sandoval W, Liu P, Nishihara J., Tsui G, Lin M, Gunawan F, Parker S, Wong RM, Low J, Wang X, Yang J, Veeravalli K, McKay P, Yu C, O’Connell LO, Tran B, Vij R, Fong C, Francissen K, Zhu-Shimoni J, Quarmby V, Krawitz D. Hamster Phospholipase B-Like 2 (PLBL2), a host cell protein impurity in CHO-derived therapeutic monoclonal antibodies. BioProcess International2015; 12(4): 18-29.

宿主细胞蛋白（Host cell proteins,HCPs）是生物制品中一种重要的工艺杂质之一，由于其潜在的诸多危害，往往作为关键质量属性之一进行质量控制。目前按照中国药典、美国药典和欧洲药典等各国药典和ICH Q6B等法规要求，可采用高检测灵敏度和良好特异性的双抗体夹心法进行快速检测，包括酶联免疫吸附法，化学发光免疫法等多种形式，此处统称HCPs免疫检测法——目前该方法是HCPs残留检测定量分析的常用方法，广泛用于生物制品早期工艺开发，后期工艺验证和日常批放行检。HCPs是一种多蛋白质混合物，其蛋白种类和丰度，蛋白翻译修饰（PTM）等变异度大，因此检测方法的开发难度较大。由于HCP的复杂性，各国监管机构实际也没有对其规定统一的标准，需要按照实际产品进行分别控制。在实际的操作过程中，我们发现不同生产商的商业化通用型试剂盒之间的检测结果往往存在差异，通用型和企业自备的工艺特异型之间也存在较大的差异，本文从HCPs免疫检测法开发角度，尝试对其原因进行简单的分析，供大家参考。检测三要素从双抗体夹心免疫检测方法的原理考虑，获得一个性能优异的检测方法最重要的是把握三个要素：校准品抗体检测体系HCPs校准品的制备HCPs免疫检测法作为一种外标定量分析方法，样品中HCPs的检测值是通过校准品进行校准和计算的，因此校准品的选择和制备无疑是第一步，也是不同试剂盒之间比较的基础之一。HCPs校准品往往也同时作为抗体制备的免疫原，因此校准品是方法开发的首要决定因素，需要进行充分研究和表征分析。HCPs校准品来源及制备方法生物制品生产工艺比较复杂，如图1所示，典型的工艺流程包括上游培养发酵工艺和下游多步纯化工艺，其中HCPs主要在下游工艺中逐步进行去除，如单抗药类产品在proteinA纯化步骤的清除率可达到90%以上。大量研究发现，不同的细胞基质，不同培养工艺，不同纯化工艺，不同产品蛋白等因素均会引起HCPs蛋白谱的差异。如图1所示，不同工艺阶段获取的HCPs种类差异大，适合不同的检测需求。图1 HCPs校准品的选择按照美国药典1132章节的要求，HCPs校准品需满足代表性要求，即能覆盖实际工艺产品生产中的HCPs[1]。从HCPs免疫检测方法使用目的和预期风险管理要求考虑，满足工艺开发和验证，同时为了应对下游工艺中潜在的异常工艺失效，或工艺变更需求（图2），建议采用上游发酵工艺末端，如澄清处理后工艺点的样本作为HCPs的来源[2]。在实际制备中，可采用空细胞或空载细胞在模拟实际工艺的预定条件进行采集，通过二维电泳或高分辨率质谱等蛋白质组学方法进行模拟工艺和实际工艺下HCPs的代表性表征分析。越靠近下游HCPs蛋白种类越少，也越接近DS中HCPs，但是其可能无法满足工艺开发和验证需求，也无法保证工艺的潜在风险，往往不推荐使用，或仅作为上游工艺HCPs免疫检测法的辅助使用。图2 HCPs检测监控目标[2]赋值方法及溯源除了上述HCPs来源不同，即标准品的HCPs谱的差异，导致试剂盒检测结果差异之外，HCPs校准品的赋值方法和溯源的统一也是不同试剂盒存在差异的主要原因之一。目前对于HCPs校准品的赋值和溯源方面没有统一的规定。美国药典1132章节中规定可以采用总蛋白检测的法规方法进行赋值，如BCA法、Bradford法、lowry法和紫外-可见分光光分度法等。由于HCPs来源中往往同时存在核酸，胞膜脂类，培养基中的氨基酸等非HCPs成分会干扰总蛋白的检测准确性，需要在检测之前进行纯化前处理，同时对总蛋白检测方法进行方法学确认。HCPs是一种多蛋白质的混合物，总蛋白定量方法之间检测结果会存在一定程度的差异，这也是导致HCPs免疫检测方法结果差异的原因之一。若HCPs蛋白定量方法间检测结果差异较大，一般同时采用2种以上经过确认的方法检测，最后取均值。总蛋白检测方法的定量限一般只能达到μg/mL水平,但是HCPs检测试剂盒的产品校准品在ng/mL水平。从HCPs高浓度原液稀释到低浓度产品校准品中存在稀释误差，需要对产品校准品进行重新标定赋值。目前在国内可参考中检院李加等老师发表的文章“首批Vero细胞蛋白质标准品的研制”来建立量值溯源体系[3]，该课题获得国家药典委疫苗制品专家委员会确认通过。图3举例湖州申科HCPs ELISA试剂盒产品，按照文章的要求建立的溯源路径，制备二级校准品，高浓度的一级校准品通过总蛋白检测方法溯源至国标牛血白蛋白，试剂盒内的产品校准品通过一级校准品和湖州申科大肠杆菌ELISA检测体系进行赋值，保证结果的稳定性。图3 湖州申科大肠杆菌HCPs校准品量值溯源HCP抗体的质量评估HCPs抗体覆盖率的影响抗体是良好免疫检测方法的另一重要因素，由于HCPs的多蛋白混合物的特性，对HCPs抗体除了基本的特异性和亲和力要求外，还需要评价HCPs抗体能够识别HCPs蛋白种类的能力，即覆盖率（Coverage Rate）评价。(具体方法可参考文章《基于持续改进的宿主细胞蛋白覆盖率评估方法浅析》和线上课程《HCP抗体覆盖率分析方法分享》）抗体覆盖率低，对样本中HCPs的识别越少，导致不同试剂盒的检测结果差异，会造成漏检风险，可能影响后续临床试验的顺利进行。抗体纯化方式的影响对于HCPs抗体的纯化方法，目前美国药典1132章节推荐有两种方式，包括proteinA或proteinG亲和柱层析法和HCPs抗原亲和柱层析法。两种方法各有优缺点，均符合监管的要求。表1 HCPs抗体纯化方法[2] 在实际使用过程中，这对不同产品可能会导致检测结果的差异。两者方法得到的抗体主要区别是HCPs抗体有效含量的占比。HCPs抗原亲和柱层析法显然占比高，但是也存在某些HCPs抗体丢失的情况，这也会导致针对某些样本的检测结果比前者偏低，需要企业在实际方法建立时进行充分的评估。HCPs抗原亲和柱层析法对纯化工艺要求更高，为保证抗体批间一致性，需要重点考察HCPs抗原柱制备工艺，柱子的使用寿命，再制备的一致性等问题。板式的酶联免疫吸附法是将有限的HCPs抗体包被在96微孔板上作为捕获抗体，因此proteinA或proteinG亲和纯化抗体的实际有效HCPs包被抗体量会十分有限，跟HCPs抗原亲和纯化相比，可能存在对较高浓度HCPs校准品识别是不充分的，导致校准曲线的差异。同时，对HCPs含量丰富的中间品的检测往往存在偏低的现象，虽然可以得到样本线性稀释度范围，但是如图4情况所示，在相同或相近稀释度下，proteinG纯化抗体由于有效抗体含量少，对某些HCPs的抗体量不足，实际HCPs识别的程度是有区别的，导致样本检测信号差异，最终导致检测值的差异。各家企业制备的抗血清的质量应该是首要关键点，高效价和高覆盖率，高含量HCPs的抗体下采用proteinG方式在某些情况下也可以满足要求。图4 HCPs免疫检测中抗原过量模型[4]HCPs免疫学检测方法间的差异来源于HCPs校准品，HCPs抗体等关键组分的制备和表征。这些关键组分本身的变异度比较大，导致各家试剂盒的检测结果的差异较大。因此，在使用该试剂盒之前，需要结合企业自身的产品进行对比分析，选择最合适的试剂盒。参考文献:[1] USP <1132> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals.[2] Pilely K , Johansen M R , Lund R R , et al. Monitoring process-related impurities in biologics–host cell protein analysis[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2022, 414(2):747-758.[3] 李加, 石磊泰, 王玲,等. 首批Vero细胞蛋白质标准品的研制[J]. 中国生物制品学杂志, 2020, 33(9):6.[4] Zhu-Shimoni J , Yu C , Nishihara J , et al. Host Cell Protein Testing by ELISAs and the Use of Orthogonal Methods.一键查看