POLR2A

▎Armstrong2025年美国癌症研究协会年会（AACR）即将于4月25-30日在美国芝加哥举行，最近会议摘要已经公开，中国创新密集亮相。以ADC领域为例，绝大部分的报告来自中国药企，创新ADC接近100款，覆盖各种技术路线和靶点上的创新，真正开始引领ADC的创新前沿。双靶点ADC为ADC领域当前最热门的方向之一，百力司康、百奥赛图、博锐生物、橙帆医药、多禧生物、恒瑞医药、基石药业、金赛药业、康宁杰瑞、康源博创、联进生物、启德医药、石药集团、拓济生物、先声药业、信达生物、映恩生物、亲和力生物等多家企业布局。双毒素ADC也开始走到台前，康弘药业、亲和力生物系统布局双毒素ADC，康弘药业的KH815为全球首款进入临床阶段的双毒素ADC新药。两种payload分别为TOP1i和RAN POL2i，同时抑制RNA合成并诱导DNA双链断裂。康宁杰瑞进一步开发了双靶点双毒素ADC，即EGFR/HER3双毒素ADC新药JSKN021。传统ADC的理念是毒素经抗体结合受体介导内吞后释放，DXd-ADC则证明了旁观者效应的重要作用，宜联生物则进一步开发了非内吞ADC，靶向游离靶标VEGF，通过肿瘤微环境特异性酶来释放毒素，进一步打开了ADC药物的应用空间。维立志博开发了首款TCE的ADC，即DLL3/CD3 ADC新药LBL-058，由DLL3/CD3双抗偶联TOP1i而成，T细胞杀伤与payload细胞毒杀伤效应协同。虽然TCE在少数靶点已经开始突破实体瘤，但TCE-ADC的设计无疑为突破实体瘤提供了一种全新强化设计的思路。总结从此次AACR会议来看，中国ADC无论在数量上，还是在差异化设计上，毫无疑问都在真正引领ADC的创新前沿，新靶点ADC、新靶点组合双靶点ADC、双毒素ADC、PDC、TCE-ADC、非内吞ADC等等，以及AACR会议不涉及的自免ADC（映恩生物已经进入临床阶段）等。未来几年，国产ADC的临床突破和出海交易仍然是值得期待的行业焦点所在。Armstrong技术全梳理系列GPRC5D靶点全梳理；CD40靶点全梳理；CD47靶点全梳理；补体靶向药物技术全梳理；补体药物：眼科治疗的重要方向；Claudin 6靶点全梳理；Claudin 18.2靶点全梳理；靶点冷暖，行业自知；中国大分子新药研发格局；被炮轰的“me too”；佐剂百年史；胰岛素百年传奇；CUSBEA：风雨四十载；中国新药研发的焦虑；中国生物医药企业的研发竞争；中国双抗竞争格局；中国ADC竞争格局；中国双抗技术全梳理；中国ADC技术全梳理；Ambrx技术全梳理；Vir Biotech技术全梳理；Immune-Onc技术全梳理；亘喜生物技术全梳理；康哲药业技术全梳理；科济药业技术全梳理；恺佧生物技术全梳理；同宜医药技术全梳理；百奥赛图技术全梳理；腾盛博药技术全梳理；创胜集团技术全梳理；永泰生物技术全梳理；中国抗体技术全梳理；德琪医药技术全梳理；德琪医药技术全梳理2.0；和铂医药技术全梳理；荣昌生物技术全梳理；再鼎医药技术全梳理；药明生物技术全梳理；恒瑞医药技术全梳理；豪森药业技术全梳理；正大天晴技术全梳理；吉凯基因技术全梳理；基石药业技术全梳理；百济神州技术全梳理；百济神州技术全梳理第2版；信达生物技术全梳理；信达生物技术全梳理第2版；中山康方技术全梳理；复宏汉霖技术全梳理；先声药业技术全梳理；君实生物技术全梳理；嘉和生物技术全梳理；志道生物技术全梳理；道尔生物技术全梳理；尚健生物技术全梳理；康宁杰瑞技术全梳理；科望医药技术全梳理；科望医药技术全梳理2.0；岸迈生物技术全梳理；礼进生物技术全梳理；康桥资本技术全梳理；余国良的抗体药布局；荃信生物技术全梳理；安源医药技术全梳理；三生国健技术全梳理；仁会生物技术全梳理；乐普生物技术全梳理；同润生物技术全梳理；宜明昂科技术全梳理；派格生物技术全梳理；迈威生物技术全梳理；Momenta技术全梳理；NGM技术全梳理；普米斯生物技术全梳理；普米斯生物技术全梳理2.0；三叶草生物技术全梳理；贝达药业抗体药全梳理；泽璟制药抗体药全梳理；恒瑞医药抗体药全梳理；齐鲁制药抗体药全梳理；石药集团抗体药全梳理；豪森药业抗体药全梳理；华海药业抗体药全梳理；科伦药业抗体药全梳理；百奥泰技术全梳理；凡恩世技术全梳理。

摘要:在过去十年中，环状RNA（circRNA）的研究迅速增加，近年来，circRNA作为一种有前景的治疗平台脱颖而出。环状RNA的调控功能，包括其在蛋白质翻译模板化、调控蛋白质和RNA功能中的作用，以及其独特特性，如与mRNA相比更高的稳定性和更有利的免疫学特性，使其成为基于RNA治疗的有吸引力的候选分子。在这里，我们描述了环状RNA的特性、其治疗潜力以及其合成技术。我们还讨论了实现环状RNA作为药物的全部潜力需要克服的前景和挑战。 1.引言近年来，RNA治疗领域因COVID-19 mRNA疫苗的巨大成功而迅速发展（参考文献1）。这项突破性技术使全球健康危机得到了快速有效的应对，凸显了基于RNA的方法在革新医学方面的巨大潜力。因此，研究人员越来越多地探索RNA治疗的新途径，包括将环状RNA（circRNA）作为有前景的候选分子。环状RNA是一类在大多数真核生物中表达丰富的内源性非编码转录本。这些分子的特征是其独特的环状结构，其中5′和3′末端通过共价键连接形成闭环。这种环状构型缺乏自由的5′或3′末端，使得环状RNA比其线性RNA对应物更稳定。内源性环状RNA是通过一种称为反向剪接的替代剪接机制在体内生成的，其中下游剪接供体位点与上游剪接受体位点连接。环状RNA最早于20世纪70年代在植物类病毒中被发现,但其在真核细胞中的存在及其功能相关性直到后来才被认识到。20世纪90年代初，环状RNA在真核细胞中被观察到，被认为是由罕见的错配剪接事件产生的副产物。然而，在过去十年中，随着高通量RNA测序技术和针对环状RNA的生物信息学的进步，环状RNA的真正普遍性变得显而易见。这些进步，加上关于环状RNA功能的开创性研究，现在已导致对这一RNA亚类多样性的全面理解。内源性环状RNA在细胞内被赋予了许多不同的功能——从调控基因表达和作为微RNA（miRNA）和蛋白质的分子“海绵”，到编码独特蛋白质——对多种细胞过程产生影响。除了环状RNA独特构型固有的细胞内稳定性之外，其广泛生理功能的多样性进一步凸显了其作为一种治疗方式的潜力。对内源性环状RNA生物合成途径的深入了解以及体外转录系统的发展，促进了具有精确序列和功能的环状RNA的工程化，从而为定制化治疗策略提供了机会。如今，环状RNA治疗领域正在迅速发展，学术研究团队、行业先锋和多家生物技术初创公司对基于环状RNA的平台表现出高度的兴趣和投资。在这里，我们介绍环状RNA作为一种引人入胜的新治疗方式，部分基于与闭环结构相关的内在特性。我们通过已发表的案例讨论了基于环状RNA治疗的多功能潜力。我们还详细描述了使用体外转录（IVT）或基于载体的设置有效生产环状RNA的合成和设计方法。最后，我们讨论了环状RNA作为各种疾病生物标志物的潜在用途。 2.环状RNA的治疗相关特性环状RNA因其独特的特性而具有巨大的治疗潜力，包括高稳定性和抗降解性。这种固有的稳定性转化为环状RNA比线性RNA具有更长的半衰期，使环状RNA成为持续治疗干预的理想候选分子。此外，与线性mRNA相比，体外转录（IVT）环状RNA的免疫原性降低，这对于某些治疗方式是一个优势。 2.1.细胞内稳定性环状RNA的闭环结构使其在细胞内比其线性RNA对应物（如mRNA）更稳定。这一点已在细胞内表达的环状RNA和外源性递送的环状RNA和得到证实。尽管如此，我们对调节环状RNA内切酶降解以维持稳态水平的主动过程的理解仍然有限。有少数例子表明，内源性环状RNA通过argonaute 2介导的沉默。此外，外泌体复合体外切酶DIS3的内切酶活性已被证明可在体外导致环状RNA的降解，在病毒感染的情况下，RNaseL作为先天免疫反应的一部分，在激活双链RNA激活蛋白激酶R（PKR）时会破坏环状RNA。单个环状RNA的稳定性差异显著，类似于mRNA，文献估计的中位半衰期约为20小时，通过4-硫尿苷标记确定，到超过50小时，通过放线菌素D关闭转录或基于诱导型环状RNA表达系统测量。然而，在所有情况下，环状RNA的稳定性明显超过其相应的mRNA。因此，使用基于载体的表达系统，假设生产速率相近，环状RNA将随着时间的推移积累到比mRNA更高的稳态水平。体外转录（IVT）环状RNA的半衰期经验估计为56到86小时；相比之下，IVT mRNA的半衰期为15到24小时，具体取决于细胞类型。对于编码蛋白质的环状RNA，其较长的半衰期导致更长的表达曲线，并且与基于mRNA的治疗方式相比，具有三到五倍的产量优势，这可能导致治疗效果的增加或通过剂量节省减少毒性。进一步研究环状RNA的周转途径可能有助于设计避免特定内切酶触发因素的序列，从而进一步稳定环状RNA。 2.2.免疫原性体外转录（IVT）环状RNA是否为免疫刺激分子的问题仍然存在争议。IVT环状RNA被证明通过激活核酸传感器视黄酸诱导基因I（RIG-I）来诱导免疫基因的表达。在内源性环状RNA中观察到的N6-甲基腺苷（m6A）修饰，与未修饰的环状RNA相比，降低了其免疫原性，这表明未修饰的环状RNA确实具有内在的免疫原性。相比之下，使用高度纯化的IVT环状RNA进行的类似研究表明，RIG-I途径的激活和免疫基因的表达仅最小化，这表明环状RNA诱导的免疫反应可能部分是由于环状RNA制造过程中的污染物，而不是环状RNA的内在特性。此外，在某些IVT制造方法中，最终环状RNA序列中保留的外源核糖酶衍生序列（称为“疤痕”）可能通过激活PKR增加环状RNA的免疫原性，而环状RNA内的短结构区域已被证明可以结合并抑制PKR的激活。深入了解环状RNA的免疫原性特征对于优化环状RNA治疗的合成路线和指导治疗适应症的选择至关重要，这将增强临床效益，同时简化未来的制造过程。 3.环状RNA的治疗相关功能内源性环状RNA被赋予了多种生理功能，包括作为蛋白质编码模板、锚定和抑制蛋白质和miRNA、核蛋白复合物以及破坏RNA二级结构（图1）。环状RNA治疗的势头日益增强，其在关键治疗领域的潜力在于其在疗效和多功能性方面可能超越mRNA方式，无论是对于IVT还是基于载体的环状RNA。环状RNA的独特特性，包括其更高的稳定性、更长的表达时间和蛋白质编码及非编码功能，使其成为需要持续治疗效果的应用的理想候选分子。因此，目前许多环状RNA的治疗途径正在被探索（表1）。 图 1 | 环状 RNA 的治疗相关功能及潜在应用。环状 RNA（circRNAs）被赋予了多种生理功能，这些功能可以通过适当设计 circRNA 而被重新定向并应用于其他目标。a，环状 RNA 的高稳定性和内部核糖体进入位点（IRES）介导的增强型蛋白质翻译使其与基于 mRNA 的蛋白质表达相比能够产生更多的蛋白质。环状 RNA 的蛋白质生产可用于传染病疫苗、癌症疫苗、嵌合抗原受体（CAR）T 细胞疗法以及遗传性疾病的蛋白质替代疗法。b，环状 RNA 可以以序列依赖的方式有效结合微小 RNA（miRNA）以使其失活（称为 miRNA“海绵”），同时对 miRNA 介导的不稳定具有抵抗力。例如，环状 RNA 可以用于抑制癌症中的促肿瘤 miRNA 的功能。环状 RNA 还可以以序列依赖的方式靶向 mRNA，从而导致翻译抑制（例如病毒 mRNA）或改变剪接（例如通过介导外显子跳跃部分恢复杜氏肌营养不良中的抗肌萎缩蛋白表达）。c，环状 RNA 可能通过竞争性退火比 mRNA 更有效地破坏 RNA 的二级结构，这归因于环状 RNA 在细胞内的高稳定性。从理论上讲，这可以用于破坏致病的异常宿主 RNA 结构或病原性病毒 RNA 结构。d，类似于 miRNA 海绵的机制，环状 RNA 可以持续结合 RNA 结合蛋白（RBPs）以使其在细胞内失活。可以靶向诸如 PKR 或 HNRNPL 等 RBP，以抑制它们与炎症或肿瘤发生相关的疾病功能。e，环状 RNA 可以作为蛋白质支架促进蛋白质之间的功能相互作用 —— 例如，促进蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）与待降解的目标蛋白之间的相互作用 —— 与 mRNA 相比具有更持久和持久的效果。PROTAC 介导的降解可以靶向朊病毒样疾病中的错误折叠蛋白聚集。f，类似于竞争性 RNA 退火（如 c 部分所示），环状 RNA 可以被设计为提高基因编辑效率 —— 通过作为 CRISPR–Cas 或 Prime 编辑的引导 RNA（gRNA）（上图）。环状 RNA 还可以通过形成 RNA 编辑酶（如 RNA 上的腺苷脱氨酶（ADAR））的底物来增强 RNA 编辑，该酶被环状 RNA 与目标 RNA 之间形成的相邻双链片段积极招募（下图）。A，腺苷；G，鸟苷；I，肌苷；ORF，开放阅读框；Ub，泛素。 3.1.蛋白质生产 目前，大多数基于治疗性环状 RNA 的平台都专注于开发编码蛋白质的环状 RNA，利用其高稳定性实现长期蛋白质表达（图 1a）。与 mRNA 不同，环状 RNA 没有 5′ 帽结构，因此必须使用帽独立机制来招募翻译机制并启动翻译。这通常是通过使用内部核糖体进入位点（IRES）来实现的，IRES 常见于小 RNA 病毒科（Picornaviridae）的单链 RNA 病毒家族。对来自国家生物技术信息中心核苷酸数据库的 60 多个小 RNA 病毒属的近 10,000 个完整小 RNA 病毒基因组的分析，导致了大约 8,000 个独特 IRES 的注释，这些 IRES 可能具有广泛的效力和细胞类型特异性。此外，通过系统优化这些天然 IRES 的序列和结构，提高了它们的翻译效率，这突显了根据特定治疗需求调整 IRES 介导翻译特性的潜力。最近，一种帽依赖型环状 RNA 设计被引入——由于这种结构与字母 Q 相似，被称为 Q-RNA——在这种设计中，一个带有 5′ 帽结构的寡核苷酸通过点击化学连接到开放阅读框（ORF）上游核苷酸的底部。研究表明，这种设计能够招募真核起始因子 EIF4E，从而有力地支持翻译的启动。体外转录（IVT）环状 RNA 最有前景的应用之一是开发传染病疫苗。在这方面，与假尿苷修饰的 mRNA 编码的抗原相比，SARS-CoV-2 环状 RNA 编码的抗原显示出增加和延长的表达，从而在小鼠和恒河猴中引发了更强的免疫反应。此外，含有编码狂犬病病毒糖蛋白的 IVT 环状 RNA 的淋巴结靶向脂质纳米颗粒（LNPs），在狂犬病小鼠模型中引发了强大的免疫反应。这些发现可以转化为其他正在开发 mRNA 基方法的传染病疫苗，例如流感病毒、HIV、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒和巨细胞病毒。除了传染病疫苗，针对常见新抗原的癌症疫苗是环状 RNA 技术的另一个有前景的应用方向。在一个使用表达卵清蛋白的黑色素瘤小鼠模型的概念验证研究中，包裹在促炎 LNPs 中的编码卵清蛋白的环状 RNA 被证明具有抗肿瘤效果。IVT 环状 RNA 还有潜力作为表达免疫刺激分子、溶瘤蛋白以及免疫细胞表达嵌合抗原受体（CARs）-和转基因 T 细胞受体（TCRs）的平台。其中最先进的项目之一是 CAR T 细胞治疗的开发，在这种治疗中，编码针对 CD19 的 CAR 构建体的环状 RNA 被包裹在 LNPs 中，用于在免疫细胞中原位产生 CAR。这种方法避免了与体外工程化 CAR T 细胞移植相关的淋巴细胞耗竭需求，并促进了 CAR T 细胞、CAR 自然杀伤细胞和 CAR 巨噬细胞的同时生成。最近，用编码识别巨细胞病毒 pp56 抗原的 TCRs 的 IVT 环状 RNA 转导的原代 T 细胞，实现了对表达 pp56 的肿瘤细胞的特异性和持久性杀伤。这些例子突显了环状 RNA 技术在免疫治疗中的多功能性和潜力。此外，由于环状 RNA 有可能通过实现增加和延长的蛋白质表达来超越传统的 mRNA 和蛋白质替代策略，从而减少频繁再给药的需求，因此其在基因治疗中的应用引起了广泛关注。在再给药不可行或提供次优治疗效果的情况下，单独使用 IVT mRNA 或 IVT 环状 RNA 可能无法作为治疗方式提供足够的持久性。相反，基于载体的表达平台可能为基因治疗提供增加和持续的疗效（在 “治疗性环状 RNA 的生产” 部分有更详细的描述）。目前被认为是基因替代治疗黄金标准的腺相关病毒（AAV）疗法，需要非常高的剂量水平才能实现治疗效果，导致高水平的毒性和高昂的生产成本。通过用更持久的环状 RNA 表达盒替换 AAV 载体中的传统 mRNA 表达盒，从而获得更高的稳态 RNA 水平，可能可以增加每个 AAV 载体的基因治疗输出，从而减少所需的剂量。这种方法可以提高这些疗法的疗效和安全性。 3.2.RNA-RNA 互作 通过隔离来调节 miRNA 是内源性环状 RNA 在基因调控中的一个众所周知的功能（图 1b）。这种 “海绵” 机制可以很容易地通过具有工程化 miRNA 结合位点的人工环状 RNA 重定向到任何 miRNA。由于环状 RNA 对 miRNA 通过外切酶过程介导的靶 RNA 不稳定化具有抵抗力，因此它们是高效的 miRNA 抑制剂。实际上，将细胞内表达的环状 RNA 与线性、结构稳定的硬诱饵 RNA 进行基准测试表明，当在相同浓度下测试时，环状 RNA 作为 miRNA 抑制剂优于硬诱饵 RNA。以 miRNA 靶向环状 RNA 的治疗潜力为例，通过 AAV 载体驱动表达针对促肥大、心脏 miRNA miR-132 和 miR-212 的环状 RNA 海绵，在心脏疾病小鼠模型中减缓了主动脉缩窄的进展。在经过环状 RNA 治疗的小鼠中，肥大性疾病症状得到缓解，心脏功能得以恢复。还通过 IVT 环状 RNA 展示了对 miRNA 的抑制。例如，一个针对 miR-122 的 IVT 环状 RNA 被证明可以阻断细胞培养中已知有助于丙型肝炎病毒（HCV）复制的 HCV 扩增。在另一项研究中，通过聚乙烯亚胺基纳米颗粒递送的含有针对致癌 miRNA miR-21-5p 的四个海绵位点的 IVT 环状 RNA，在异种移植小鼠中抑制了肺腺癌。此外，针对 miR-21 的环状 RNA 海绵在胶质母细胞瘤大鼠模型和胃癌细胞中被证明是抑制肿瘤生长的有效抑制剂，导致凋亡增加以及蛋白质合成全面减少。环状 RNA 的 miRNA 海绵能力特别有希望用于治疗以 miRNA 上调为特征的疾病，这些 miRNA 对疾病病因至关重要。除了抑制 miRNA 之外，环状 RNA 还可以被设计成靶向并与其前体 mRNA 和 mRNA 互作，分别调节它们的剪接和阻止它们的翻译。例如，反义环状 RNA 被证明可以成功地介导杜氏肌营养不良相关转录本的外显子跳跃，以恢复抗肌萎缩蛋白的表达。此外，通过 AAV 介导递送反义环状 RNA 纠正了开放阅读框，并在杜氏肌营养不良小鼠模型中恢复了抗肌萎缩蛋白的表达。 针对RNA-RNA相互作用的环状RNA（circRNAs）的广泛概念，为治疗应用提供了广阔范围。RNA在细胞内形成复杂的二级结构，这些结构对于所有生物体的正常功能至关重要，从病毒到人类皆是如此。病原体，如病毒，利用其RNA的二级结构来捕获宿主细胞蛋白以实现复制。类似地，遗传缺陷可能会产生异常的RNA二级结构，这些结构在细胞内捕获蛋白质，从而导致疾病。在此，设计环状RNA来结合并破坏这些病原性或缺陷性RNA的二级结构，可能是一种有前景的治疗概念，以缓解这些疾病状态（图1c）。环状RNA与mRNA的广泛互补性也可以抑制翻译。设计用于靶向并捕获SARS-CoV-2 mRNA的5'非翻译区的反义环状RNA的表达，成功抑制了它们的翻译，与线性反义RNA在细胞培养中实现的抑制效果相比，对病毒增殖的抑制效果更强。 总之，环状RNA的稳定性及其对通常在RNA-RNA相互作用时激活的外切核酸酶降解途径的抗性，使得闭环环状RNA设计成为一种有前景的方法，可通过直接的碱基配对相互作用有效调节RNA功能。 3.3.RNA-蛋白相互作用 除了直接调节RNA功能外，环状RNA还被认为参与调节蛋白活性或蛋白-蛋白相互作用（图1d）。作为概念验证，表达含有CA重复序列的环状RNA，这些重复序列作为剪接因子HNRNPL的结合位点，导致HNRNPL从细胞核重新分布到细胞质，从而消除了其在剪接中的功能。在癌细胞中，环状RNA介导的HNRNPL功能下调可能增强肿瘤抑制蛋白p53的功能，或许通过调节p53抑制因子MDM4的剪接来实现，进而导致癌细胞凋亡增加。此外，环状RNA介导的HNRNPL捕获可能是前列腺癌的一种治疗策略，在前列腺癌中，HNRNPL的过表达与前列腺肿瘤特异性基因（如雄激素受体）的异常剪接有关。HNRNPL的功能抑制还可能通过下调其转录因子的表达来降低免疫检查点分子PD-L1的表达，从而恢复癌细胞对T细胞介导杀伤的敏感性。在另一个例子中，靶向脾脏的双链RNA嵌入环状RNA调节PKR活性，在银屑病小鼠模型中减少了炎症。此外，从AAV载体表达的PKR调节环状RNA在阿尔茨海默病小鼠模型中减少了神经炎症和淀粉样β斑块的形成。 环状核酸适配体可能比其线性对应物具有更大的持久性和效力，这可能允许更低的剂量和减少的非靶向效应。这一特性最初在一项研究中被探索，该研究利用细菌中的环状RNA合成来产生环状链霉亲和素结合适配体。最近，研究表明稳定表达的环状适配体能够结合代谢物S-腺苷甲硫氨酸，可在人类细胞中作为荧光代谢物生物传感器。更广泛地说，这些研究表明环状RNA适配体可用于靶向细胞中的疾病相关蛋白。 通过RNA-蛋白相互作用被动调节蛋白功能存在一定的化学计量挑战。相反，治疗性环状RNA模式最好具有一个主动成分，以允许每个RNA拷贝数调节多个靶标分子。这可以通过环状PROTAC（蛋白降解靶向嵌合体）支架方法实现，通过靶向泛素化后由蛋白酶体介导的蛋白降解，主动诱导环状RNA结合的特定靶标蛋白的衰变。这为环状RNA提供了独特的机会，使其既可以作为蛋白生产的模板（如上所述），也可以作为定向和特异性蛋白衰变的支架（图1e）。PROTACs是治疗朊病毒样疾病的一种有前景的治疗策略，这种疾病以错误折叠蛋白的聚集和传播为特征，其传播方式类似于朊病毒。RNA结合蛋白的聚集，如TAU（也称为MAPT）、TDP43（也称为TARDBP）和FUS，已知与几种神经退行性疾病的发病机制有关。设计环状RNA来结合这些病理性RNA结合蛋白，并将其导向PROTAC介导的衰变，是一种有前景的新策略。 3.4.核酸编辑 使用环状RNA作为CRISPR-Cas系统的向导RNA（gRNAs）是一种新兴策略，旨在提高基因编辑工具的效率和稳定性（图1f）。环状RNA的固有稳定性使其成为线性gRNAs的有吸引力的替代品，后者通常具有较短的半衰期。事实上，CRISPR-Cas9 gRNA的环状化已被证明可以增加其在体外和细菌中的稳定性和DNA编辑效率。使用Tornado（Twister优化的RNA用于持久过表达）系统（见“基于载体的环状RNA表达”部分）生成的环状gRNAs与线性gRNAs相比也具有增加的稳定性，这提高了Cas12a和Cas13d基础的DNA和RNA编辑在体外和体内的效率。值得注意的是，该研究还表明，环状gRNAs增强了基于Cas12a的报告基因转录激活，使用失活的Cas12a与转录激活因子融合，在体内产生了更强和更持久的信号。 Prime编辑需要一个prime编辑向导RNA（pegRNA）——由靶向RNA、引物结合位点（PBS）和逆转录模板（RTT）组成——用于基因组编辑。PBS和RTT成分的环状化增加了基于Cas12a的Prime编辑的效率，与它们的线性对应物相比，这表明RTT-PBS RNA的稳定性和丰度与编辑效率呈正相关。此外，最近的一项研究表明，几个RTT-PBS RNAs可以被纳入到一个单一的环状RNA中，从而同时编辑多达四个基因，尽管效率较低。 除了提高DNA编辑效率外，环状RNA还可以被设计来增强RNA碱基编辑。环状RNA的支架功能可以用来招募编辑酶到它们的靶标RNAs（图1f）。两个独立的报告表明，环状RNA可以招募作用于RNA的腺苷脱氨酶（ADAR）蛋白来编辑靶标mRNAs，其效率比线性gRNAs更高。总之，环状RNA的稳定性和多功能性使其成为一种强大的工具，用于提高DNA和RNA编辑效率，为基因编辑技术提供了有前景的进步。 4.治疗性环状RNA的生产 鉴于上述环状RNA的治疗潜力，人们对其体外和体内合成平台的开发产生了浓厚的研究兴趣。治疗性环状RNA可以分为两个具有不同治疗用途的平台：体外转录（IVT）环状RNA（图2），其需要额外的纯化协议；以及基于载体的环状RNA表达，该方法利用现有的细胞内机制进行环状RNA生产，但需要高效地将环状RNA编码载体递送至细胞内（图3）。 图 2 | 环状 RNA 的体外合成。环状 RNA（circRNAs）的体外合成通常通过酶促连接或核糖酶介导的线性体外转录（IVT）RNA 前体的环化来实现。a，对于酶促 RNA 连接，可以使用三种不同的连接酶，所有这些连接酶都通过所谓的“桥接寡核苷酸”来促进线性 RNA 末端的相互靠近（已在其他地方综述）。T4 DNA 连接酶利用 DNA 桥接寡核苷酸在完美对齐的缺口双链（ds）RNA-DNA 底物中促进 RNA 末端连接，而 T4 RNA 连接酶 2 可以使用 DNA 或 RNA 桥接寡核苷酸进行 RNA 环化。在 dsRNA 的 RNA 桥接寡核苷酸情况下，可以使用内部 RNA 序列作为自身桥接寡核苷酸来模板化反应。T4 RNA 连接酶 1 倾向于连接单链 RNA（ssRNA）底物，并且在没有桥接寡核苷酸的情况下高效环化小 RNA（小于 350 个核苷酸）。然而，对于由 T4 RNA 连接酶 1 介导的较大 circRNA 结构的形成，更倾向于使用 DNA 桥接寡核苷酸或内部 RNA 自身桥接寡核苷酸来使悬垂的 ssRNA 末端相互靠近。b，大多数核糖酶介导的环化方法基于催化性 I 型内含子，这需要添加 GTP 和 Mg²⁺ 作为辅助因子。这种方法通过 I 型内含子的标准自剪接反应实现 circRNA 的生成，涉及在特定剪接位点的两次转酯反应。在剪接过程中，鸟苷酸（G）的 3′ 羟基在 5′ 剪接位点（SS）引发转酯反应，切除 5′ 内含子。这个中间体末端释放的羟基随后参与在 3′ SS 的第二次转酯反应，导致中间区域的环化和 3′ 内含子的切除。已经开发出两种主要类型的 I 型内含子设计。在置换内含子 - 外显子（PIE）系统中，I 型内含子被分成两半，颠倒并放置在要环化的融合 5′ 和 3′ 外显子的上游和下游。在自靶向和剪接（STS）系统中，I 型内含子被放置在环化外显子的上游。在这两种情况下，该过程都涉及一个两步磷酸转移酶反应，首先是在 5′ 外显子 - 内含子连接处附着一个自由的 GTP 残基，随后将释放的 5′ 外显子附着在 3′ 外显子 - 内含子连接处。最终的 circRNA 产物包含外源外显子序列作为“疤痕”。 图 3 | 环状 RNA 的体内合成。a，依赖剪接体的环状 RNA（circRNA）体内生成。基于 RNA 聚合酶 II 的环状 RNA 表达盒的示意图，包含内部核糖体进入位点（IRES）和开放阅读框（ORF），以及特定的内含子序列。通过加入反向重复的 Alu 元件（如图所示），或非重复区域的反向互补序列，或肌肉盲蛋白（Muscleblind）或震颤蛋白（Quaking）的 RNA 结合蛋白位点（未显示），可以增强环状 RNA 的形成。这些元件有助于反向重复元件之间的碱基配对（如图所示），或 RNA 结合蛋白的二聚化（未显示），从而将下游的剪接供体（SD）位点与上游的剪接受体（SA）位点拉近。这种相互作用促进了反向剪接，这是一个由经典剪接机制介导的过程，其中 SD 位点与 SA 位点共价连接，最终导致环状 RNA 的形成。b，龙卷风核糖酶介导的体内环状 RNA 生成系统。IRES-ORF 环状 RNA 序列被茎环形成序列夹在中间，然后是 5′ 和 3′ 自我切割核糖酶。转录后，这些核糖酶切割初级环状 RNA（红色箭头），在新的 RNA 末端产生 2′,3′-环状磷酸和 5′-羟基。环状 RNA 前体的茎环形成序列随后杂交，并通过内源性 tRNA 连接酶 RTCB 的作用形成环状 RNA，RTCB 在某些 tRNA 的剪接事件中自然连接 tRNA 外显子。 4.1.体外环状RNA合成 类似于mRNA，环状RNA前体通常通过体外转录作为线性、单链RNA分子进行合成。随后RNA末端的分子内连接将这些前体转化为共价闭合环，这一过程可以通过连接酶酶或核糖酶介导（表2和图2）。 例如，通过T4 DNA连接酶、T4 RNA连接酶1或T4 RNA连接酶2（图2a）的酶促连接，催化RNA末端之间形成磷酸二酯键，这一过程以ATP依赖的方式进行。每种连接酶都有其独特的底物偏好性（表2）。相比之下，核糖酶催化的环化利用具有内在RNA介导催化活性的RNA分子；在这方面，I型内含子已成为RNA自我环化的有力工具。已报道了两种基于I型内含子的环状RNA合成设计（图2b）：基于来自念珠藻前tRNA和T4噬菌体胸苷酸合成酶（td）基因的I型内含子的置换内含子-外显子（PIE）构建，以及源自四膜虫前核糖体RNA I型内含子的自我靶向和剪接（STS）构建。最近，念珠藻PIE构建被进一步优化，将最终环状RNA产物中的疤痕从多达180个核苷酸减少到27个核苷酸，从而改善了免疫原性特征。PIE环状RNA中的疤痕大小可以进一步减少到8个核苷酸，尽管其免疫原性需要进一步调查。II型内含子是另一类自我剪接RNA分子，从其也已开发出PIE构建用于有效的环状RNA合成。一般来说，自我剪接核糖酶在RNA环化方面比酶促方法具有优势，因为它们通过消除额外的连接反应和额外的纯化步骤来简化制造过程（表2）。 使用上述任何一种方法制备的生化环状RNA的报道大小范围从大约十个核苷酸到超过5,000个核苷酸。T4连接酶对于连接小于50个核苷酸的小环状RNA非常有效。尽管使用基于念珠藻的PIE系统已经制造出了超过5,000个核苷酸的环状RNA20，但制造非常大的环状RNA仍然是一个挑战。随着环状RNA序列长度的增加，T4 RNA连接酶1和基于念珠藻的PIE构建的环化效率显著下降。此外，较大环状RNA对切口的敏感性可能导致产量进一步降低。 4.2.体外环状 RNA 纯化 在合成后，体外转录的环状 RNA 需要与线性 RNA 对应物及其他杂质分离。这对于确保最终环状 RNA 产品的纯度和完整性至关重要，尤其是如果其用于重复应用。环状 RNA 和线性 RNA 在序列和理化性质上的高度相似性，给常用的纯化技术带来了持续的挑战。RNase R 是一种 3′ 到 5′ 外切酶，因其能够选择性降解线性 RNA 而保留环状 RNA，被广泛用于环状 RNA 纯化。然而，尽管其效率很高，RNase R 并不能完全去除线性 RNA；即使经过严格的 RNase R 处理，环状 RNA 的缺口和剪接外显子仍然存在。RNase R 的消化被结构化的 3′ RNA 末端（缺乏突出端）和 G-四链体 RNA 二级结构所阻断，但这种抑制可以通过聚腺苷酸化和缓冲液优化分别缓解。尽管增加 RNase R 浓度和/或延长孵育时间可以增强反应，但也可能导致环状 RNA 的非特异性降解。因此，需要对 RNase R 反应条件进行实验验证，以在大规模环状 RNA 纯化中实现纯度和产量之间的最佳平衡。除了 RNase R，外切酶 T 和 5′ 到 3′ 核糖核酸外切酶 XRN1 也用于去除线性 RNA。变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳为环状 RNA 的分离提供了最高的分辨率，环状 RNA 的迁移速度明显慢于其线性对应物。此外，商业化的预制 EX 琼脂糖凝胶可以区分 PIE 衍生的环状 RNA 和反应副产物。尽管其分辨率与尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳相比有限。毛细管凝胶电泳也可以用于环状 RNA 分析，但其分离分辨率同样有限。尽管某些凝胶电泳方法在分离环状 RNA 和副产物方面效果良好，但这些方法劳动强度大，产量低。高效液相色谱（HPLC）是一种更具可扩展性的环状 RNA 纯化方法。在尺寸排阻 HPLC 中，环状 RNA 的保留时间比线性 RNA 长。然而，分离通常不完全，环状 RNA 分数与线性 RNA 分数部分重叠。值得注意的是，离子对反相 HPLC 最近被证明在 PIE 衍生和 STS 衍生环状 RNA 的纯化中具有高分辨率。鉴于从环状 RNA 产品中去除杂质的棘手挑战，一种替代策略是使污染物失活。例如，磷酸酶处理水解残留的免疫原性三磷酸盐，从而减少对环状 RNA 的天然免疫反应。 4.3.基于载体的环状 RNA 表达 在哺乳动物中，首次对一个丰富表达的内源性环状 RNA 进行表征，是在小鼠的 Sry 位点，该位点被证明主要产生环状转录本。后来发现，该位点的环状 RNA 产生依赖于 Sry 外显子两侧的长反向重复序列。反向重复序列在依赖剪接体的环状 RNA 形成中的重要性进一步在核提取物中得到证实。此外，还报道了其他内源性环状 RNA 表达的例子；然而，两个主要发展推动了环状 RNA 研究兴趣的增加，即 CDR1as/ciRS-7的鉴定和功能表征，以及利用下一代测序检测环状 RNA 表达的高通量方法的发展。通过一个包含内源性外显子和剪接位点序列的载体，结合大约 800 个核苷酸的侧翼反向重复序列，实现了 CDR1as/ciRS-7 的异位过表达。这种依赖剪接体的载体设计导致了与内源性产物无法区分的环状 RNA 的表达。利用下一代测序对环状 RNA 景观进行广泛表征表明，反向重复序列（通常以 Alu 元件的形式）在反向剪接事件附近高度富集。这些研究表明，反向剪接的作用机制基于侧翼区域的碱基配对和螺旋形成，可能以共转录的方式进行，这被认为将上游受体和下游供体剪接位点定位在一起，以便进行反向剪接。这一模型与观察结果一致，即 ADAR1 介导的螺旋结构编辑和 DHX9 解旋酶活性抑制了 Alu 依赖的环状 RNA 表达。基于这种反向剪接的已建立机制，几种基于不同内源性位点的异位环状 RNA 表达载体系统已经开发出来，例如 POLR2A、ZKSCAN1、HIPK3 和 EPHB4（图 3a）。在所有情况下，用于环状 RNA 表达的内源性位点都由近端反向 Alu 元件侧翼。基于载体的环状 RNA 生物合成进一步优化，主要通过操纵侧翼序列元件和到剪接位点的距离。总体而言，这些研究表明，环状 RNA 生物合成依赖于 Alu 元件，并且表明，即使只有 40 个碱基对的修剪过的 Alu 序列侧翼要环化的外显子，也可以发生有效的环状 RNA 生物合成。与 Alu 依赖载体的发展并行，一个大约 230 个核苷酸的人工反向重复序列被用来构建第一个基于载体的蛋白质编码环状 RNA 表达系统。该构建包含增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的开放阅读框和脑心肌炎病毒的 IRES，导致高水平的 eGFP 产生和积累。由于依赖剪接体的环状 RNA 生物合成的无痕性质，eGFP 开放阅读框被设计为反向剪接接头位于开放阅读框内；一致地，只有在形成反向剪接接头时才观察到功能性蛋白产生，并且通过剪接位点突变被消除。值得注意的是，基于质粒的环状 RNA 表达可能受到非特异性产生外显子串联产物的污染，这些产物可能是线性或环状的，几乎无法通过逆转录 PCR 和基于下一代测序的检测方法与真正的环状 RNA 区分开来。因此，使用 RNase R 介导的耗竭和 Northern 印迹分析来表征载体衍生的产量是谨慎的，并确定侧翼元件的要求，以确保高系统完整性，避免混淆的假象。依赖剪接体和反向重复序列的环状 RNA 生物合成是基于载体的内源性环状 RNA 表达最常用的方法（图 3a）；然而，也描述了使用 Tetrahymena thermophila I 类内含子介导的生物合成、T4 噬菌体 td 基因的自剪接 I 类内含子或龙卷风系统（图 3b）的替代方法，该系统包括核糖酶导向的 RNA 切割，随后由内源性 tRNA 连接酶 RTCB 介导的环化。这些替代系统的优点是它们与 RNA 聚合酶 III 表达兼容，因为它们不依赖剪接体。然而，龙卷风系统最适合于较小环状 RNA（最好少于 500 个核苷酸）的生物合成，并且容易在未修饰的 IRES 和开放阅读框序列中存在的短 U 富集区域提前终止。这一限制限制了龙卷风平台的治疗潜力，尽管最近它被纳入 RNA 聚合酶 II 驱动的表达载体，并被证明可以成功表达较大的蛋白质编码环状 RNA（高达 4,719 个核苷酸）。 4.4.环状 RNA 载体的递送 基于载体的治疗药物在递送、宿主细胞对 dsDNA 的感应和核运输方面面临诸多挑战。将 DNA 制备成纳米颗粒，包括脂质纳米颗粒、聚合物和其他非病毒递送复合物，可能允许进入靶细胞，但细胞质中 dsDNA 感应途径的激活（在别处有综述）可能会限制异位 DNA 的转基因表达。此外，载体的核运输对于 RNA 转录的发生至关重要。这些挑战可以通过 CpG 减少和/或使用屏蔽纳米颗粒来防止天然免疫激活，以及通过减小尺寸和/或在载体主链中加入 DNA 运输序列来增加核定位来解决。研究表明，像 SV40 增强子和 NF-κB 结合位点这样的运输序列可以刺激 DNA 的主动核输入，从而增强转基因表达。最近，使用融合蛋白脂质载体递送 RNA 和 DNA 货物以绕过内质网摄取的需要被证明对多种组织是安全的，并且可以广泛应用于多种组织和细胞类型，可能使多种组织和细胞类型的重复给药成为可能。或者，可以使用病毒载体在细胞质中保护 DNA 货物，并有效地将其递送到细胞核中。用于 DNA 递送的最常用的病毒载体是 AAV，它已被批准用于罕见遗传病的基因递送临床应用。然而，AAV 基因组的容量有限（小于 4.7 kb），从而阻止了其用于表达许多与治疗相关的蛋白质。此外，尽管与其他病毒载体相比，AAV 通常具有较低的免疫原性，但仍然禁止重复给药。在 C57BL/6 小鼠的眼中，通过玻璃体腔注射 circRNA 编码的 AAV9 载体，观察到来自 HIPK3 衍生和 ZKSCAN1 衍生环状 RNA 盒的 eGFP 成功表达。此外，除了促进蛋白质编码环状 RNA 的表达外，AAV 还被用于表达具有非编码功能的环状 RNA，如 miRNA 捕获和 RNA 结合蛋白的细胞质捕获。慢病毒是另一类整合到基因组中的治疗性病毒载体，主要用于体外转导体细胞，以确保治疗转基因的稳定表达。然而，与 mRNA 表达相比，慢病毒载体的环状 RNA 表达较低。这种差异可能归因于病毒生产细胞中的 RNA 剪接以及在慢病毒复制的逆转录步骤中潜在的二级结构干扰。因此，转座子或 CRISPR 敲入系统可能为稳定的环状 RNA 过表达提供更可靠的选择。最后，基于载体的环状 RNA 表达已被用于开发含有环状 RNA 的非整合病毒样颗粒（VLP），在这种情况下，优化的载体盒被部署在 VLP 生产系统中，以促进环状 RNA 在 VLP 内的包装。与 mRNA 包装的 VLP 相比，VLP 包装的环状 RNA 具有更好的持久性。 5.环状 RNA 作为生物标志物 如上所述，外源性环状 RNA 有望成为治疗多种疾病的有效选择。此外，环状 RNA 的内源性表达景观已被描述为具有组织特异性，并在许多生理和病理过程中发挥重要作用（在别处有综述）。这引发了使用环状 RNA 作为各种多因素疾病生物标志物的巨大兴趣，包括癌症；自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、多发性硬化症、类风湿关节炎和 1 型糖尿病；神经退行性疾病，如帕金森病、阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化；以及心血管和代谢性疾病（在别处有综述）。 大多数关于环状 RNA（circRNA）作为生物标志物的研究都集中在癌症上，因为检测生物液体中的 circRNA 具有很高的兴趣，这归功于它们的高稳定性和在循环细胞外囊泡中的富集。例如，来自 MYBL1 前体 mRNA 的环状 RNA 在腺样囊性癌患者的血浆细胞外囊泡中相对于健康对照组有所增加，且该环状 RNA 的水平与肺转移和预后不良相关。 生物液体中的环状 RNA 对于非侵入性地识别早期疾病可能特别有前景，例如通过检测前列腺癌患者的尿液或血浆中的环状 RNA，以及通过分析血清和胆汁液体活检中的特定环状 RNA 签名来监测胆管癌复发，从而监测疾病进展。此外，在增殖率是预后强指标的情况下，环状 RNA 似乎可以作为预后生物标志物，例如在套细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤中。由于它们的生物合成速度较慢，大多数环状 RNA 在快速增殖的细胞中从未达到稳态水平，而是倾向于在静止和缓慢分裂的细胞中积累，因为它们的性质稳定。因此，环状 RNA 的表达水平与细胞增殖率密切相关。环状 RNA 用于预测治疗反应也很有前景。例如，与肿瘤免疫细胞浸润相关的环状 RNA 表达签名被证明可以预测恶性黑色素瘤患者对免疫疗法的反应，无论患者是单独接受抗 PD1 治疗还是与抗 CTLA4 联合使用。 环状 RNA 的总体水平也可能是自身免疫疾病的一个重要因素。这是因为环状 RNA 倾向于形成 16 - 26 个碱基对的不完美 RNA 双链，因此，它们可能通过结合并抑制 PKR 来抑制先天免疫反应。与之相符的是，在系统性红斑狼疮患者的外周血单核细胞中观察到 PKR 的磷酸化（激活）增加和环状 RNA 水平降低。此外，在患有慢性炎症性皮肤病（如银屑病和特应性皮炎）的人的病变皮肤中，内源性环状 RNA 水平降低。因此，确定环状 RNA 水平是否可以作为诊断生物标志物或用于管理炎症性疾病的重要生物标志物将是很有趣的。 在病理过程中具有不同作用的环状 RNA 也可能转化为具有临床应用价值的生物标志物。在心血管疾病中，INK4 位点的反义非编码环状 RNA 被证明可以调节血管细胞的关键功能，从而预防动脉粥样硬化。随后，许多其他环状 RNA 被证明可以调节心血管疾病的病理生理学。例如，来自 ATM 基因的环状 RNA（cATM）调节其宿主基因 ATM 的表达，导致激活生存途径和促进培养的平滑肌细胞的应激耐受表型。在腹主动脉瘤的人类标本和动脉瘤患者的血清样本中观察到 cATM 表达增加，表明其作为诊断生物标志物的潜力。 最近的研究表明，通过对 190 个人类大脑进行激光捕获显微切割，然后进行超深度全 RNA 测序，发现大脑中环状 RNA 的产生主要来自与帕金森病、阿尔茨海默病和其他神经精神疾病相关的位点。这些数据不仅将有助于理解环状 RNA 在神经病理学中的功能作用，而且如果它们可以在脑脊液或外周血中被检测到，它们也可能推动环状 RNA 作为有前景的诊断生物标志物。事实上，环状 RNA 在许多不同疾病的个体的血浆中差异表达，包括患有妊娠糖尿病的患者。值得注意的是，在妊娠早期测量时，两种环状 RNA 的表达水平的组合显示出对妊娠糖尿病的有前景的鉴别能力。 然而，尽管对环状 RNA 作为生物标志物的潜在使用充满热情，但还没有一个进入临床使用。需要解决几个挑战以推动这一重要的研究领域向前发展。 6.结论与未来方向 体外转录（IVT）和基于载体的环状 RNA 平台作为新一代疗法已崭露头角，适用于多种疾病指征，过去 5 年间，多家专注于治疗性环状 RNA 开发的公司纷纷成立。 体外转录环状 RNA 有望在治疗癌症或病毒感染等动态疾病方面发挥重要作用，这类疾病需要短暂但持续的治疗。相比之下，基于载体的环状 RNA 平台可为慢性疾病提供增强且持久的疗效，例如罕见遗传病、高血压或自身免疫性疾病。此外，使用组织特异性启动子可实现基于载体技术的特定情境表达。鉴于体外转录和基于载体的环状 RNA 的互补特性，在可预见的未来，为多种难以治疗的疾病指征（从急性传染病到慢性致残性疾病）开发多功能治疗方案似乎是可行的。而且，考虑到环状 RNA 基础疗法的现状以及巨大的未开发发展空间，环状 RNA 很可能会超越 mRNA，成为临床开发的首选 RNA 格式。与线性 mRNA 相比，环状 RNA 的稳定性更高，可确保更长或更高的表达水平，这在大多数情况下可带来更高的疗效、更好的安全性以及更低的成本。 最接近临床应用的环状 RNA 基础技术似乎是用于疫苗接种的瞬时蛋白生产，环状 RNA 中疫苗抗原的延长表达可转化为对病原体或癌细胞更强大且持久的免疫反应。然而，要实现这一目标，建立更具可扩展性的环状 RNA 合成和纯化流程至关重要。这一成就还将支持为治疗肝脏相关代谢疾病开发安全的环状 RNA 载体，从而因环状 RNA 的稳态水平增加以及治疗蛋白表达的相应增加，实现更低或更少的给药频率。血友病和尿素循环障碍是肝脏靶向基因治疗的主要目标疾病，因为这些疾病是由酶缺陷引起的，可通过引入功能性基因来纠正，例如血友病 A 的凝血因子Ⅷ基因或血友病 B 的凝血因子Ⅸ基因。 环状 RNA 一个有前景但相对未被充分探索的应用是其作为增强细胞过程的支架的潜力。可以想象环状 RNA 用于通过在纳米尺度上精确排列酶和底物来组装多步骤途径反应。这可能使细胞内按需产生复杂的治疗化合物成为可能。此外，环状 RNA 具有通过受控的碱基配对相互作用的能力，可提供在细胞内创建分子凝聚体的机会，从而作为自然发生过程的生物“工厂”。在相反的应用中，环状 RNA 可能在解决许多疾病特征的蛋白质聚集方面发挥作用。通过 RNA 介导的稳定化，可能抑制未折叠蛋白结构域形成有毒聚集物，为这类疾病提供一种新的治疗选择。 总体而言，环状 RNA 技术对于开发新疗法极具前景。然而，像任何新兴技术一样，环状 RNA 模式也有若干需要解决的局限性，才能实现更广泛的应用。以可扩展且可重复的方式生成体外转录环状 RNA 在技术上可能具有挑战性。此外，开发用于消除污染物的稳健工具对于确保体内低免疫原性和良好的安全性至关重要。对于基于载体的表达系统，由于内源性因素对转录和环化的双重影响，控制细胞中环状 RNA 的表达量可能具有挑战性。因此，优化环状 RNA 生物合成的特性对于提高产量和减少剪接副产物至关重要。 将环状 RNA 有效地递送至靶细胞和组织仍然是体外转录和基于载体的环状 RNA 的一个重要障碍。针对体外转录环状 RNA 递送的新型非免疫原性递送平台（如脂质纳米颗粒和外泌体）的研究正在进行中。这些平台也在为 DNA 载体开发，但非病毒 DNA 载体在递送至细胞后可能需要核转位，以促进治疗性环状 RNA 的转录和剪接。尽管基于载体的系统可使用病毒载体来靶向递送治疗性环状 RNA，但病毒载体的不利免疫原性特征使其无法进行重复给药。 解决这些局限性需要跨学科的努力以及在环状 RNA 研究和开发中的持续创新。克服这些挑战对于解锁环状 RNA 在临床应用中的全部潜力至关重要。因此，我们预计在未来几年将设计并启动许多环状 RNA 基础的临床试验，同时令人兴奋的新研究将推动环状 RNA 模式可实现的边界。 此外，环状 RNA 作为生物标志物具有潜力，部分原因是其高稳定性以及在人类疾病病理生理学中的独特作用。这可能会推动个性化医疗的进步，并有助于指导患者选择，改善包括肿瘤学、神经学和心血管疾病等不同领域的临床结果。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 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REC-617, a precision designed molecule, demonstrated dose-linear pharmacokinetics (PK) with rapid absorption and robust pharmacodynamic (PD) biomarker modulation, suggesting substantial target engagementConfirmed partial response (PR) observed during monotherapy dose-escalation in a patient with platinum-resistant ovarian cancer, treated with 4 lines of prior therapy in advanced setting, durable response ongoing after more than 6 months of treatmentAdditional 4 patients demonstrated a best response of stable disease (SD) for up to 6 months of treatmentPlans to continue monotherapy dose escalation and initiate combination studies in 1H 2025 SALT LAKE CITY, Dec. 09, 2024 (GLOBE NEWSWIRE) -- Recursion (Nasdaq: RXRX) reported initial monotherapy dose-escalation data from the Phase 1/2 study (ELUCIDATE) of REC-617, a selective CDK7 inhibitor, in advanced solid tumors. These results were presented today after market close at an AACR Special Conference in Cancer Research. The company will also hold a webinar on December 10 at 6:30 AM MT / 8:30 AM ET / 1:30 PM GMT to present the preliminary data broadcast from Recursion’s X (formerly Twitter), LinkedIn, and YouTube accounts with an opportunity to submit questions here. "Cell cycle dysregulation and transcriptional 'addiction' are both hallmarks of many aggressive cancers," said David Hallett, Ph.D., Chief Scientific Officer of Recursion. "By inhibiting CDK7, we have the potential to target both mechanisms while fine tuning the therapeutic index. Using our precision design platform, we created a molecule with rapid oral absorption to reduce GI tissue exposure, a suitable half life to manage side effects, and target engagement covering the IC80 level." ELUCIDATE is an ongoing Phase 1/2 study evaluating the safety, tolerability, pharmacokinetics (PK), pharmacodynamics (PD), and maximum tolerated dose (MTD) of REC-617 in patients with advanced solid tumors. As of the November 15, 2024 data cutoff, preliminary findings include 18 patients with advanced solid tumors who were response evaluable in the monotherapy dose-escalation phase. Doses ranged from 2 mg to 20 mg once daily (QD) and 1 mg twice daily (BID). REC-617 was generally well-tolerated across all dose levels, with no discontinuations due to adverse events (AEs). Adverse events to date were predominately Grade 1-2, on-target, and reversible. An MTD has not yet been reached. While efficacy was not an endpoint in this Phase 1 study, or anticipated in monotherapy, a confirmed durable partial response (PR) by RECIST on REC-617 monotherapy was achieved in a patient with metastatic, platinum-resistant ovarian cancer. The response is on-going after more than 6 months of treatment. This patient had progressed following 4 lines of prior therapy in the advanced setting. In addition, four patients achieved a best response of stable disease (SD) across multiple dose levels for up to 6 months of treatment. "These initial findings for REC-617 represent an exciting step forward in the development of CDK7 inhibitors, with a favorable PK/PD profile and a durable confirmed partial response observed in dose escalation in a highly pre-treated patient population," said Najat Khan, Ph.D., Chief R&D Officer and Chief Commercial Officer, Recursion. "Designed using our AI-powered OS platform, REC-617 reflects our focus on enhancing the therapeutic index to deliver more effective and safer treatment options for patients. We are eager to continue this momentum in dose escalation and to initiate the next phase of the program next year." In parallel to the ongoing monotherapy dose escalation (QD and BID), combination studies are expected to initiate for ELUCIDATE in H1, 2025. The company expects to present additional ELUCIDATE as well as preclinical REC-617 data at future medical meetings. Summary of Interim REC-617 Monotherapy Dose Escalation Results Study Design & Demographics Phase 1 monotherapy dose escalation in advanced solid tumorsData cutoff as of November 15, 2024 - 19 patients enrolled (18 response evaluable)Heavily pre-treated population (median of 4 prior lines of therapy in the advanced setting)Antiemetics and anti-diarrheals not mandated prophylaxis for nausea/vomiting/diarrhea PK/PD Summary REC-617 exceeds CDK7 IC80 with rapid absorption (Tmax 0.5–2 hours) with a half-life of 5-6 hoursEarly POLR2A 3-4x modulation suggests ~80–90% target engagementQuick, time-limited target engagement with POLR2A normalization in 24 hoursTwice-daily (BID) dosing under investigation Safety Profile/AE Summary Adverse events (AEs) were predominantly low grade, on-target, and reversible upon treatment cessationEarly data indicates a favorable safety profile – maximum tolerated dose (MTD) not reachedNo treatment discontinuations due to AEs3 treatment related serious adverse events (SAE)s reported in 2/19 patientsEvents resolved and treatment continued after dose reductionAntiemetics and anti-diarrheals not mandated prophylaxis for nausea/vomiting/diarrhea Confirmed Partial Response & Stable Disease Summary One confirmed partial response (PR) by RECIST 1.1 (decrease of more than 30% in the sum of the longest diameters of target lesions + no new lesions + no progression of non target lesions) Partial response (-34%) achieved with reduction of 2 lymph nodes (para-aortic and mesenteric) at Week 16 with normalization of LDHReduction of tumor marker CA125 from 1249 to 694 kU/L (-44%)Reduction of tumor marker TK1 from 174 to 56 DuA (-68%)Response ongoing after more than 6 months of treatmentPatient continues study therapy without need for antiemetics Four additional patients achieved durable (up to 6 months of treatment) response of stable disease (SD) as best response across multiple dose levels All four patients progressed prior to entering the studyThree CRC patients (6L-7L) and one NSCLC patient (4L)One patient on 2mg QD and three patients on 10mg QD About REC-617REC-617 is a potential best-in-class CDK7 inhibitor, precision designed using AI-led approaches, with only 136 novel molecule synthesized from hit to candidate identification in less than 12 months. The molecule is designed to maximize its therapeutic index by enabling the tight control of both the extent and duration of target inhibition. CDK7 inhibition combines many potential benefits such as transcription inhibition, reduction of aberrant kinome activation, cell cycle inhibition, and modulation of estrogen receptor activity. This makes it an attractive target to overcome common resistance pathways associated with CDK4/6 inhibition, which only targets the cell cycle. About ELUCIDATEREC-617 is currently being evaluated as a monotherapy in the ELUCIDATE trial. ELUCIDATE is a multicenter, open-label, two-stage clinical trial to evaluate safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and efficacy of REC-617 in advanced solid tumors, including non-small cell lung cancer (NSCLC), colorectal cancer, breast cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, head and neck cancer. Both the monotherapy and combination therapy dose escalation portion of the trial will enroll patients across multiple dose levels to determine the optimal biological dose (OBD). The dose expansion phase of the trial will commence upon identification of the OBD. The primary efficacy endpoint of the expansion phase is objective response rate (ORR). About RecursionRecursion (NASDAQ: RXRX) is a clinical stage TechBio company leading the space by decoding biology to radically improve lives. Enabling its mission is the Recursion OS, a platform built across diverse technologies that continuously generate one of the world’s largest proprietary biological and chemical datasets. Recursion leverages sophisticated machine-learning algorithms to distill from its dataset a collection of trillions of searchable relationships across biology and chemistry unconstrained by human bias. By commanding massive experimental scale — up to millions of wet lab experiments weekly — and massive computational scale — owning and operating one of the most powerful supercomputers in the world, Recursion is uniting technology, biology and chemistry to advance the future of medicine. Recursion is headquartered in Salt Lake City, where it is a founding member of BioHive, the Utah life sciences industry collective. Recursion also has offices in Toronto, Montréal, New York, London, Oxford area, and the San Francisco Bay area. Learn more at www.Recursion.com, or connect on X (formerly Twitter) and LinkedIn. Media ContactMedia@Recursion.com Investor ContactInvestor@Recursion.com Forward-Looking Statements This document contains information that includes or is based upon “forward-looking statements” within the meaning of the Securities Litigation Reform Act of 1995, including, without limitation, those regarding the potential efficacy of REC-617; timing of the Phase 1/2 clinical trial of REC-617; early and late stage discovery, preclinical, and clinical programs; licenses and collaborations; prospective products and their potential future indications and market opportunities; Recursion OS and other technologies; business and financial plans and performance; and all other statements that are not historical facts. Forward-looking statements may or may not include identifying words such as “plan,” “will,” “expect,” “anticipate,” “intend,” “believe,” “potential,” “continue,” and similar terms. These statements are subject to known or unknown risks and uncertainties that could cause actual results to differ materially from those expressed or implied in such statements, including but not limited to: challenges inherent in pharmaceutical research and development, including the timing and results of preclinical and clinical programs, where the risk of failure is high and failure can occur at any stage prior to or after regulatory approval due to lack of sufficient efficacy, safety considerations, or other factors; our ability to leverage and enhance our drug discovery platform; our ability to obtain financing for development activities and other corporate purposes; the success of our collaboration activities; our ability to obtain regulatory approval of, and ultimately commercialize, drug candidates; our ability to obtain, maintain, and enforce intellectual property protections; cyberattacks or other disruptions to our technology systems; our ability to attract, motivate, and retain key employees and manage our growth; inflation and other macroeconomic issues; and other risks and uncertainties such as those described under the heading “Risk Factors” in our filings with the U.S. Securities and Exchange Commission, including our Annual Report on Form 10-K and Quarterly Reports on Form 10-Q. All forward-looking statements are based on management’s current estimates, projections, and assumptions, and Recursion undertakes no obligation to correct or update any such statements, whether as a result of new information, future developments, or otherwise, except to the extent required by applicable law.