CD70

RMAT Designation Follows Positive Proof-of-Concept Data from the ALLO-316 TRAVERSE Trial in Adult Patients with Advanced or Metastatic CD70 Positive Renal Cell Carcinoma (RCC) Who Received Prior Immune Checkpoint Inhibitor and VEGF-Targeting Therapy ALLO-316 Advances Scientific Understanding and Applicability of the Dagger® Technology as the Next-Generation Allogeneic Platform to Maximize the Potential of a Single Infusion of an “Off-the-Shelf” CAR T Product Company to Present Updated Phase 1 Data from the TRAVERSE Trial at the Society for Immunotherapy of Cancer (SITC) Annual Meeting ALLO-316 was Previously Granted Fast Track Designation (FTD) in March 2022 by the U.S. Food and Drug Administration Oct. 29, 2024 -- Allogene Therapeutics, Inc. (Nasdaq: ALLO), a clinical-stage biotechnology company pioneering the development of allogeneic CAR T (AlloCAR T™) products for cancer and autoimmune disease, today announced that the U.S. Food and Drug Administration (FDA) granted Regenerative Medicine Advanced Therapy (RMAT) designation to ALLO-316 for the treatment of adult patients with CD70 positive advanced or metastatic renal cell carcinoma (RCC). The RMAT designation was based on clinical data from the TRAVERSE trial indicating the potential of ALLO-316 to address the unmet need for patients with difficult-to-treat RCC who have failed multiple standard RCC therapies, including an immune checkpoint inhibitor and a VEGF-targeting therapy. The ongoing development of ALLO-316 continues to advance the scientific understanding and applicability of the Dagger® technology as the next-generation allogeneic platform to maximize the potential of a single infusion of “off-the-shelf” CAR T product in solid tumors. “The RMAT designation for ALLO-316 highlights the transformative potential of our AlloCAR T™ platform to offer new hope for heavily pretreated patients with renal cell carcinoma who have exhausted standard treatment options,” said Zachary Roberts, M.D., Ph.D., Executive Vice President of Research & Development and Chief Medical Officer. “This important milestone moves us closer to fulfilling the promise of “off-the-shelf” CAR T therapy—delivering faster, more reliable, and widely accessible treatments. We remain optimistic about the future of ALLO-316 and its potential to be an important advancement for patients.” The ongoing Phase 1 TRAVERSE trial is designed to evaluate the safety, tolerability, and activity of ALLO-316 in patients with advanced or metastatic RCC. Initial results from the TRAVERSE trial were presented in an oral presentation at the American Association for Cancer Research (AACR) Annual Meeting in Orlando, Florida, in 2023. The Company will present updated Phase 1 data from the TRAVERSE trial at the Society for Immunotherapy of Cancer (SITC) annual meeting. The RMAT designation is intended to accelerate the development and review of promising investigational products, including cell therapies. To qualify, a product must be designed to treat, modify, reverse, or cure a serious or life-threatening disease, with preliminary clinical evidence suggesting it can address unmet medical needs. The RMAT designation offers several key advantages, including early and frequent interactions with the FDA to discuss potential surrogate or intermediate endpoints, as well as strategies to meet post-approval requirements, potentially streamlining the path to market approval. ALLO-316, an AlloCAR T™ investigational product, targets CD70 which is highly expressed in renal cell carcinoma (RCC). CD70 is also selectively expressed in several cancers, creating the potential for ALLO-316 to be developed across a variety of both hematologic malignancies and solid tumors. ALLO-316 utilizes the Dagger® technology to optimize CAR T cell expansion and persistence to maximize the potential efficacy in solid tumors with a one-time infusion. The ongoing Phase 1 TRAVERSE trial is designed to evaluate the safety, tolerability, and activity of ALLO-316 in patients with advanced or metastatic clear cell RCC. In March 2022, the U.S. Food and Drug Administration (FDA) granted Fast Track Designation (FTD) to ALLO-316, and in October 2024 the FDA granted Regenerative Medicine Advanced Therapy (RMAT) designation to ALLO-316 based on its potential to address the unmet need for adult patients with CD70 positive advanced or metastatic RCC who have failed standard RCC therapies. Allogene Therapeutics, with headquarters in South San Francisco, is a clinical-stage biotechnology company pioneering the development of allogeneic chimeric antigen receptor T cell (AlloCAR T™) products for cancer and autoimmune disease. Led by a management team with significant experience in cell therapy, Allogene is developing a pipeline of “off-the-shelf” CAR T cell product candidates with the goal of delivering readily available cell therapy on-demand, more reliably, and at greater scale to more patients. For more information, please visit www.allogene.com, and follow @AllogeneTx on X and LinkedIn. 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摘要 抗体-药物偶联物(ADC)兼具单克隆抗体的精准靶向性和药物高效杀伤的优势，显示出巨大的临床治疗价值。ADC药物的有效载荷是决定ADC药物疗效的关键因素，受到了业界的高度重视。理想的ADC有效载荷应具有足够的毒性、低免疫原性、高稳定性、功能基团可修饰等特点。常见的ADC有效载荷包括微管蛋白抑制剂和DNA损伤剂，其中微管蛋白抑制剂占临床开发中的ADC药物的一半以上。但由于传统ADC有效载荷在临床上存在疗效不足、易产生获得性耐药等局限性，因此，靶点多样、副作用小、高效新型有效载荷正在被开发。本文综述了近年来传统和新型 ADC 有效载荷的研究进展，主要集中在构效关系研究、共晶结构和设计策略等方面，并进一步探讨了 ADC 有效载荷的未来研究方向，旨在为开发高效、低毒、稳定、不易产生耐药性的新型 ADC 有效载荷提供有价值的参考和未来发展方向。 1. 背景 尽管免疫疗法和细胞疗法最近取得了进展，但化疗仍然是癌症治疗中最常用的策略。然而，由于治疗指数低，传统化疗药物尽管对癌细胞表现出强大的细胞毒性，但往往对健康组织表现出毒性作用，这大大限制了它们的临床疗效。因此，开发高效、系统毒性有限的癌症治疗药物输送系统可能是解决该问题的有效策略。因此，一个新概念——抗体-药物偶联物 (ADC)已被构想和开发 (图1)。ADC通常由针对肿瘤特异性抗原或相关抗原的抗体和若干个有效载荷通过适当的连接子组成，ADC兼具单克隆抗体(mAb)的高靶向性和有效载荷在肿瘤组织中的高效性。由于ADC副作用较小、治疗应用范围较广、治疗指数较高，近年来已成为肿瘤学领域发展最快的药物之一。 图1. ADC的关键结构和作用机制。 (A) ADC的一般作用机制；(B) DNA抑制剂作为ADC有效载荷的作用机制；(C) 剪接抑制剂作为ADC有效载荷的作用机制；(D) 微管蛋白抑制剂作为ADC有效载荷的作用机制；(E) PROTAC分子作为ADC有效载荷的作用机制；(F) Bcl-xL抑制剂和蛋白酶体抑制剂作为ADC有效载荷的作用机制；(G) NAMPT抑制剂作为ADC有效载荷的作用机制；(H) NIR-PIT ADC的作用机制。 ADC药物的概念最早由德国诺贝尔奖获得者保罗·埃尔利希于1913年提出，但直到1975年，杂交瘤技术的发展开始用于生产单克隆抗体，才真正开启了ADC药物的开发时代。在日益成熟的技术推动下，ADC药物经历了三代创新(图 2)：第一代ADC药物主要以传统化疗药物如甲氨蝶呤、长春花碱、阿霉素等作为细胞毒性有效载荷，但由于对癌细胞的细胞毒性不足、肿瘤选择性不强、靶细胞蓄积率低，这些第一代ADC药物的疗效甚至比其母体有效载荷更差，导致临床失败。随后，新型高细胞毒性化合物引起了人们的浓厚兴趣，这些化合物的药效比第一代 ADC中使用的传统化疗药物高出 100-1000 倍。当它们作为单一药物用于杀死肿瘤时，它们往往具有难以忍受的副作用。例如，微管蛋白抑制剂美登素对肿瘤细胞表现出极强的抗增殖活性。然而，它的毒副作用，如神经毒性和胃肠道反应，也很严重。因此，它未被批准作为单一药物用于癌症治疗。有趣的是，这些高细胞毒性化合物是 ADC 的理想有效载荷。细胞骨架的主要成分由α-和β-微管蛋白组成，微管蛋白抑制剂可以通过破坏细胞骨架结构和干扰有丝分裂来杀死肿瘤细胞。因此，与正常细胞相比，分裂速度更快的肿瘤细胞对微管蛋白抑制剂更敏感。大多数第二代 ADC 使用明显更有效的微管蛋白抑制剂作为有效载荷。不幸的是，虽然微管蛋白抑制剂对活跃分裂的肿瘤细胞非常有效，但对静止的癌细胞效果要差得多。为了潜在地克服这一限制，大多数第三代 ADC 选择了可以靶向整个细胞周期的 DNA 损伤剂作为细胞毒性载荷，DNA 损伤剂可以通过双链断裂、烷基化、嵌合和交联来破坏 DNA 结构，从而杀死肿瘤细胞，代表性的 DNA 损伤载荷包括烯二炔、拓扑异构酶 I 抑制剂和吡咯并苯二氮卓类 (PBD)。目前，已有 15 种 ADC药物获批，大量 ADC 药物正在临床试验中(表1)，其有效载荷主要来源于天然物质，其中微管蛋白抑制剂占一半以上。 图 2. ADC 有效载荷开发过程中的里程碑。 尽管 ADC 已经历经三代，但当前的有效载荷仍然存在临床局限性，例如严重的副作用和耐药性的产生。开发更有效的 ADC 有效载荷(最好具有更好的治疗指数)的医疗需求仍然强烈未得到满足，因此，正在设计其他新型 ADC有效载荷，包括 RNA 抑制剂、Bcl-xL 抑制剂、NAMPT 抑制剂和卡马菲星(carmaphycins)。此外，使用免疫调节剂作为有效载荷的免疫 ADC 因其在肿瘤免疫治疗中的关键作用而引起了广泛关注。除了使用单个简单分子作为有效载荷外，还出现了几种使用更复杂有效载荷设计 ADC 的新策略，例如，PROTAC 或光敏剂已被用作 ADC 有效载荷，并且还开发了将多个有效载荷(每个有效载荷具有不同的靶标)整合到单个抗体中的方法，这些突破性的策略可以带来下一代 ADC。 本文从 ADC 有效载荷的重要性和主要特性出发，从晶体结构、ADC 有效载荷与靶标之间的结构-活性关系(structureeactivity relationships, SAR)等方面，综述了各种传统 ADC 有效载荷的发现和主要结构改造。此外，本文还将总结各种基于新药物靶标和创新设计策略的新型 ADC 有效载荷。最后，针对当前有效载荷的局限性，讨论了未来 ADC 有效载荷的主要研究方向，以期为未来设计具有理想特性的新型 ADC 有效载荷提供参考。 2. ADC有效载荷的重要性和特点 ADC药物进入血液循环后，与肿瘤细胞表面的靶抗原受体结合，新形成的ADC-抗原复合物内化后被溶酶体降解，释放出有效载荷，诱导肿瘤细胞死亡(图1)。因此，有效载荷是ADC设计的重要组成部分，有效载荷的活性和理化性质对ADC药物的抗肿瘤疗效有直接的影响，有效载荷的作用机制是决定ADC性能的重要因素(如不良反应)。此外，ADC有效载荷的其他一些特性，如细胞毒性、免疫原性、制备和流通过程中的储存稳定性、水溶性、可改性性等也很重要。 理想的有效载荷应具备以下特点： 第一，它们应该具有足够高的细胞毒性。肿瘤特异性抗原非常有限，尤其是在实体肿瘤中。此外，由于单克隆抗体的渗透性低、内化活性差，能够通过抗体抗原结合内吞到肿瘤细胞中的 ADC 有效载荷数量非常少； 第二，ADC药物要具有足够低的免疫原性。蛋白质药物存在诱导免疫原性的风险，这可能会对ADC疗效产生负面影响，甚至导致接受治疗的患者死亡。虽然目前ADC多采用人源或人源化单克隆抗体和小分子药物，但与治疗性单克隆抗体相比，仍有可能增加免疫原性的风险。为了解决这个问题，一些毒性很大的药物是从植物、动物或微生物中提取的，确保药物在人体内的免疫原性小到可以忽略不计，使用分子较小的药物也是降低免疫原性风险的一种方法； 第三，ADC药物要具有较高的稳定性。由于抗体在循环中的半衰期较长，ADC 应在血液循环中保持稳定，避免释放或分解。有效载荷还应在细胞质和溶酶体中保持稳定，在低 pH 条件下不会发生明显降解； 第四，ADC 有效载荷应具有可修改的功能基团，而不会显著影响其效力。有效载荷必须具有可修改的功能基团或可与单克隆抗体结合的位点，必须仔细选择修改的位点以保留母体药物的效力。更重要的是，当使用不可切割的连接子时，即使在抗体降解后，有效载荷也必须保持其效力； 第五，ADC 有效载荷应具有旁观者杀伤效应。一些 ADC 药物被内化并释放出小的、不带电的、可渗透的膜疏水性分子，这些分子通过细胞膜扩散并杀死邻近抗原表达阴性的肿瘤细胞。这一过程被称为“旁观者杀伤效应”，对抗原表达不均匀的肿瘤细胞具有重要意义。一般而言，促进癌细胞旁观者杀伤效应的有效载荷更适合于靶抗原表达较低或异质性的癌症。要构建具有旁观者效应的ADC药物，其结构必须满足连接子可被切割，以及有效载荷可穿透细胞膜的条件。膜穿透性好的疏水性分子具有很强的旁观者杀伤效应，但这也可能使得药物容易被健康组织吸收，导致严重的全身毒性。因此，两者之间的平衡对于ADC的研发非常重要； 第六，ADC有效载荷应具有适当的水溶性。有效载荷必须具有适当的水溶性以有利于与抗体偶联，并确保偶联物在生理条件下具有足够的溶解性。当过多的疏水性有效载荷与抗体结合时，产生的 ADC 往往会聚集并变得不稳定。此外，有效载荷的亲水性会影响母体 ADC 或其代谢物的细胞膜通透性，从而影响其旁观者杀伤活性。 第七，有效载荷的靶点应该是细胞内的，因为大多数 ADC 需要进入肿瘤细胞才能释放其有效载荷。许多来自微生物、植物和动物的有效载荷具有膜靶向性，例如那些主要通过阻断离子通道或破坏凝血起作用的神经元上的有效载荷，不适合用作 ADC 有效载荷的亲水性会影响亲本 ADC 或其代谢物的细胞膜通透性，从而影响其旁观者杀伤活性。 上述 7 种 ADC 有效载荷特性中，高效力、低免疫原性、药物制剂和血液循环中的稳定性、可修饰的功能基团是 ADC 有效载荷选择时必须考虑的重要因素，而适当的水溶性或旁观者杀伤效应等特性虽然一般不是那么重要，但对 ADC 的有效性也有着重要影响。基于这些特性，总结了现有 ADC有效载荷的有效性，包括靶向微管蛋白/DNA/RNA 的有效载荷、免疫 ADC 有效载荷、新型的潜在 ADC 有效载荷以及在各种新策略指导下用于 ADC 药物设计有效载荷。通过分析各种有效载荷与蛋白的结合方式及其相应的 SAR，希望阐明结构如何决定其生物活性和特性，并为未来产生更多新型ADC有效载荷提供有价值的参考。 3. ADC 的各种有效载荷 3.1. 微管靶向有效载荷 微管是真核细胞中细胞骨架的重要组成部分，是由平行于圆柱轴的α、β微管蛋白异二聚体组成的动态极性聚合物。微管在维持细胞形态、信号转导、细胞器运输、细胞运动、细胞分裂、有丝分裂等多种细胞功能中起着重要作用，是肿瘤治疗的重要靶点。微管蛋白是微管的组成成分，微管蛋白抑制剂通过与微管蛋白结合，干扰微管的动态结合，使细胞停滞在细胞周期的G2/M期，最终导致细胞凋亡。由于微管蛋白抑制剂能破坏有丝分裂纺锤体，起到抗有丝分裂的作用，因此对快速分裂的癌细胞的毒性比大多数生长缓慢的正常细胞更强，成为广受欢迎的 ADC 有效载荷。其中，微管蛋白聚合促进剂，如奥瑞他汀化合物 MMAE 和MMAF，作用于α、β蛋白的β亚基微管蛋白二聚体不能与微管蛋白聚合酶结合，导致微管生长不受调控。而微管蛋白聚合抑制剂，如美登素化合物DM1和DM4，则通过抑制成熟微管的形成，阻止微管蛋白二聚体的聚合，该类微管蛋白抑制剂是目前临床上许多ADC药物中最为常见的第二代有效载荷，并已被多个团队作为先导化合物进行结构改造，进一步改善该类ADC有效载荷的理化性质，使其更适合ADC药物的开发。 3.1.1. 美登素类化合物(Maytansinoids) 美登素(Maytansine) (1) (图 3A)最初从非洲灌木Maytenus ovatus的树皮中分离得到，是一类苯并安息香酸内酯类抗生素，能与微管蛋白结合，抑制微管的组装。在体外细胞活性测定中，其IC50落入皮摩尔(pM)范围，显示出其强大的抑制肿瘤细胞增殖能力，在其他实验中也表现出良好的稳定性和溶解性。但由于其治疗窗口较窄，且由于缺乏选择性而产生神经毒性和胃肠道反应等毒副作用，临床上已禁止直接用于人类治疗。然而，美登素的高细胞毒性完全符合 ADC 有效载荷的要求，使美登素成为 ADC 有效载荷的有力候选者。由于美登素没有反应性官能团，因此它不能与抗体结合。美登素类化合物的结构-活性研究已确定 C3 N-酰基-N-甲基-l-丙氨酰酯侧链、C4–C5 环氧部分、C9 甲醇官能团以及共轭 C11 和 C13 双键的位置是活性的关键要素，这使得苯环和N-酰基成为可化学修饰的实体。用3-甲基二硫丙基取代美登素中的N-乙酰基，可以得到含二硫键的美登素衍生物DM1 (2)(图3A)。DM4 (3)是在DM1二硫键周围加两个甲基得到的。衍生的 DM1 和 DM4带有甲硫基丙酰基，可以通过二硫键与连接子偶联。DM1 和 DM4 是临床实际应用中最常用的两种美登素类 ADC 有效载荷，例如Trastuzumab-SMCC-DM1 就是第一个获批上市的基于美登素衍生物的 ADC 药物。目前，20% 在开发的 ADC 使用美登素衍生物作为有效载荷。 图 3. 美登木素化合物的设计和 SAR 分析。 (A) 美登木素化合物1- 5的化学结构；(B) 美登木素 (1) 与微管蛋白复合的结合模式；(C) 化合物5与微管蛋白复合的结合模式。 2014年，Michel O. Steinmetz 团队研究了美登素及其与微管的作用，发现在β-微管蛋白上，美登素类与微管蛋白有三个关键的相互作用点(图 3B)，包括美登素 1 位羰基与β -微管蛋白残基Asn102 和 Lys105 之间的氢键；1 位羟基/羰基氧与β -微管蛋白 Val181 之间的氢键；以及配体 6a 位甲基与β -微管蛋白残基 Asn101、Asn102、Val182、Phe404 和 Tyr408 形成的口袋之间的疏水相互作用-微管蛋白，这些保守的微管蛋白相互作用点构成了共同的药效团。美登素是最常用的ADC有效载荷，但其合成、中间非对映体产物的分离纯化都很困难。同时，它是多药耐药蛋白1(MDR1)的底物，MDR1是一种转运蛋白，可以降低一些抗体-美登素样偶联物的效力。因此杨金良团队探索了L-DM1-SMe(C3位甲基-L构型DM1)、D-DM1-SMe(C3位甲基-D构型DM1)和β微管蛋白，发现L-DM1-SMe酯基中的羰基氧原子和C3侧链尾部的硫甲基分别与9位羟基和苯环形成较强的分子内相互作用，有助于结合亲和力的增强；而D-DM1-SMe的C3侧链则向相反方向摆动，无法形成分子内相互作用，解释了C3位甲基手性影响抗癌活性的详细机制。该研究为设计下一代具有新型骨架的美登素结合位点抑制剂，改善合成策略，降低MDR1介导的耐药性提供了基础。 美登醇(4)(图3A)最初是通过化学去除疣状Putterlickia verrucose提取物C3位置羟基上的酰基得到的。其对微管蛋白聚合的抑制活性弱于美坦辛，说明美坦辛和美坦素的C3位酯部分对生物活性和细胞通透性起重要作用。酯部分的羰基氧原子与9位的羟基形成强烈的分子内相互作用，固定了生物活性构象。美丹辛醇被认为是一种有价值的先导化合物，通过C3位羟基的酰化，可以很容易地制备出具有不同酯侧链的各种天然和半合成的美坦素类化合物。Daniele Passarella研究组通过对美登醇(4) 进行酰化反应，得到了一个新的美登素化合物5，该化合物具有较强的抑制微管组装能力，对A549 细胞的 IC50为 0.07-1.2 nmol/L，晶体结构 (图 3C) 表明美登素的结合对微管蛋白的整体构象没有影响，美登素化合物在 C1–O 和 Val181 的主链氮原子之间以及 C24-O 和 Lys105 和 Asn102 的侧链之间形成氢键。此外，美登素化合物5通过它们的C9-OH基团与Gly100的主链羰基形成氢键。在所研究的美登木素类化合物中，在 C3 位置引入的所有修饰都指向溶剂，不会干扰美登木素位点的封闭环境。因此，酰化增强了美登木素的全部生物活性，并且在 C3 位置引入的修饰不会干扰化合物与微管蛋白二聚体的结合状态、亲和力或有效性。Regeneron 的团队通过改变环上侧链的长度以及由一级胺和二级胺连接的连接子，研究了N -甲基丙氨酸中氮取代的影响，使用美登素化合物6作为有效载荷获得了 EGFRvIII 靶向 ADC，IC50对于 HEK293、U251 和 MMT 细胞系，浓度为 0.3-0.4 nmol/L，在 U251/EGFRvIII 和 MMT/EGFRvIII 小鼠模型中实现肿瘤消退。 3.1.2. 奥瑞他汀(Auristatin) 多拉司他汀10 (Dolastatin 10) (7) 于1987 年从Dolabella auricularia中分离得到，对多种癌细胞有较强的抗增殖活性，能强烈抑制微管组装，导致细胞周期停滞和细胞凋亡，是一种很有前途的抗癌药物(图 4-1A)。其水溶性合成类似物称为奥瑞他汀，其中应用最广泛的是单甲基奥瑞他汀E(MMAE)(8)和单甲基奥瑞他汀F(MMAF)(9)。它们各自含有一个功能性手柄，能够进行后续结合，进一步提高体内疗效。MMAE由4种氨基酸组成：单甲基缬氨酸(MeVal)、缬氨酸(Val)、多拉索林(Dil)和多拉普罗林(Dap)，以及羧基端胺基去甲麻黄碱。在MMAF中，单甲基缬氨酸的C端被苯丙氨酸取代，其细胞活性显著降低。Andrea E. Prota团队发现与 MMAE 相比，MMAF 对游离微管蛋白的结合亲和力增加了近 5 倍，这主要是由于β1 微管蛋白亚基上的关键 Arg278 残基通过有序水分子暴露于 MMAF。研究还表明，将长春花结构域延伸到肽位的详细结构相互作用不仅在功能上因抑制核苷酸交换而不同，而且还表明肽位抗有丝分裂剂如何比长春花生物碱具有更高的效力，该分析可能为 MMAF 的细胞活性降低的原因提供结构解释。 图 4-1.奥瑞他汀类似物的设计和 SAR 分析。 ( A)奥瑞他汀类似物  7-10、21-24 的化学结构；( B )化合物10与微管蛋白的复合物结合模式。 杨金良团队通过对长春花结构域中MMAE与微管蛋白结合域的结构研究，定义了一个必需的药效基团，该药效基团由两个疏水区I和II以及两个与Asp179β和Asn329α相互作用的氢键区域组成，为合理设计高特异性、强亲和力、高效的ADC有效载荷奠定了基础。2020年，Christopher J. O Donnell 团队设计合成了一个具有N端修饰的奥瑞他汀类似物10 (IC50 =0.2 nmol/L)，并首次通过更高分辨率的奥瑞他汀晶体结构实现了对其结合模式的详细研究，晶体结构显示化合物10的N端二甲基很好地贴合在受体口袋中，并不影响分子的整体结合亲和力(图 4-1B)。此外，还鉴定出关键的极性相互作用，包括末端质子化氨基与位于 T5 环上的Asp β 197 和 Phe α 351 氨基羰基之间的氢键网络、N-2 缬氨酸与 Asn α 329 之间的双焦点相互作用以及化合物10中 Tyr β 224 主链酰胺与 Dap 和 Doe 末端羰基之间的关键氢键相互作用。后者氢键网络使 Tyr β 224中的芳香环与 GDP 的核碱基发生π堆积相互作用，从而防止其从β-微管蛋白，GDP 的捕获被认为是奥瑞他汀发挥其干扰微管蛋白作用的关键机制。此外，所有分析的类似物在其功能相关的微管蛋白结合状态下在 Val-Dil 酰胺键处均具有顺式构型，而在溶液中该键仅处于反式构型。这揭示了奥瑞他汀的首选结合模式，并为基于结构的药物设计提供了有价值的工具。 图4-2. 奥瑞他汀类似物的化学结构11-20。 大多数奥瑞他汀类似物研究都集中在 C 端或 N 端修饰上： ·在 C 端修饰中，Doronina 等人描述了 MMAF 类似物11和12，其中苯丙氨酸的羧酸被四唑和膦酸酯取代。化合物11对H3396 细胞的IC50为 6.0 nmol/L，化合物12对 HCT116 细胞的IC50为 0.09 nmol/L。化合物11和12(游离酸类型)都已用于通过VC-linker与抗 CD70 的 H1F6 抗体结合形成活性ADC，其效力与 MMAF 作为有效载荷的效力相似(IC50=4-10 nmol/L)(图4-2B)。Pettit 等设计了C 端芳香族磷酸酯和喹啉修饰的奥瑞他汀类似物13-15 ，对 MCF-7 细胞的 IC50分别为0.81、0.19 和 6.35 nmol/L。其中，化合物13具有良好的水溶性(>236 mg/mL)，两个喹啉类似物14和15表现出良好的活性，化合物14 的活性明显高于其他类似物(图 4-2A)。Lerchen 等进一步说明了奥瑞他汀C 端结合域允许的修饰程度，通过在 C 端添加取代基，获得了对 768O 细胞有效的奥瑞他汀类似物16-18，IC50分别为 0.5、1.2 和 1.2 nmol/L(图 4-2B)。 ·对于 N 端修饰，Satomaa 等证明，丙醇和叠氮化物衍生物19和20尽管存在亲水侧链，但仍保持了相当大的细胞效力，19和20对 SKOV3 细胞的 IC50分别为 1.0 nmol/L 和 <1.0 nmol/L 。它们的叠氮化物和炔烃可用于后续的环化反应，形成更复杂的亲水“糖交联剂”，能够与各种抗体(赖氨酸、半胱氨酸、聚糖和转谷氨酰胺酶结合物)结合。在此基础上，制备了曲妥珠单抗和 EGFR1 ADC，其体内表现良好，效力为 1.5-10 mg/kg (DAR = 3)(图4-2A)；Doronina通过将对氨基苯甲酸取代N端氨基酸而获得奥瑞他汀类似物21 ，在 Karpas 299 细胞中显示 IC50为0.12 nmol/L，含有有效载荷21的 ADC在剂量为 1 mg/kg 时缩小了 Karpas 299 人 ALCL 异种移植模型中的肿瘤体积。然而，这种 ADC 不如相关的 VC-MMAE ADC 有效(图 4-1A)；2020 年，Svetlana O. Doronina 团队设计了一系列烷基-MMAF 类似物，以研究开发具有可调膜通透性、活性和对外排泵抗性的奥瑞他汀的可能性。MMAF 在 N 端耐受大量取代基的能力提供了一种方便的方法来调节游离药物的疏水性，而不会显着影响细胞活性，他们选择了 C1 至 C12的支链和非支链脂肪族基团作为取代基，并生成了 MMAF N-烷基衍生物22，该系列衍生物的细胞毒性随烷基链长的增加而增大，取代基的空间体积和疏水性的增加均不导致活性的下降。 新型类似物结合了MMAE和MMAF的特点：高效、旁观者活性、克服MDR，这些发现进一步拓展了奥瑞他汀作为ADC载荷的作用。Agensys最近将叠氮基引入P2和P4亚基，得到化合物23 ，在MOLM13细胞中的IC50为0.057 nmol/L，由于P2或P4位点作为ADC药物的结合位点，这为下一代奥瑞他汀衍生物提供了新的方向。Luke R. Odell教授团队开发出一种奥瑞他汀衍生物阿扎他汀(azastatin) (24)，其细胞毒性(IC50=0.13-3.0 nmol/L)高于 MMAE(IC50=0.47–6.5 nmol/L)，这表明 N-二甲胺基团增加了化合物的效力。此外，该衍生物含有中心胺侧链抗体结合位点，适合用于 ADC 开发。 3.1.3. 艾日布林(Eribulin) 聚醚大环内酯类天然产物 Halichondrin B (25) 最初从 Halichondraria Okadai 等分离得到，已被证明具有良好的抗增殖活性 (图 5A)。其结构简化的新型非紫杉烷全合成类似物甲磺酸艾日布林 (26) 是一种具有抗有丝分裂作用的微管动力学抑制剂，已于 2010 年获批用于治疗局部晚期和转移性乳腺癌 (MBC)患者。Michel O. Steinmetz 团队通过晶体结构发现艾日布林与微管蛋白的结合位点是由 β-微管蛋白的螺旋 H1、H6、H7、环 H6–H7、S3–H3 (T3) 和 S5–H5 (T5) 的疏水和极性残基形成的(图 5B)。此外，艾日布林的“笼状”结构与鸟苷酸的核糖部分接触。在微管蛋白-艾日布林复合物中，配体缠绕在Tyr224的侧链上。当艾日布林与微管中两个纵向排列的微管蛋白二聚体结合时，相邻微管蛋白二聚体的α-微管蛋白的S9链、H10螺旋和T7环将与艾日布林分子主体发生碰撞。这些结果表明，艾日布林在高浓度下可将微管蛋白二聚体隔离到组装不完全的微管蛋白-艾日布林复合物中，在低浓度下干扰微管末端原丝的延伸，从而破坏微管稳定性或抑制微管动力学。 图 5. 艾日布林类似物的设计和 SAR 分析。 (A) 艾日布林类似物25-27的化学结构；(B) 艾日布林26与微管蛋白复合的结合模式。 艾日布林在肿瘤生物学中具有很强的抗有丝分裂活性，因此有望作为ADC载荷。Earl F. Albone团队通过在C-35伯胺基团上添加连接子，设计了一种以艾日布林为载荷的ADC，对卵巢癌细胞IGBOV1有很强的作用(IC50为20 pmol/L)。在非小细胞肺癌细胞NCI-H2110异种移植模型中，5 mg/kg ADC剂量可诱导肿瘤完全消除，提示微管靶向药物艾日布林可作为ADC载荷。此外，早在2011年，Sridhar Narayan实验室合成并评价了几种具有中性C32侧链的第二代艾日布林类似物，这些侧链修饰的艾日布林类似物对U-251和SF-295细胞的抑制作用明显强于艾日布林。通过在C32侧链引入低碱性胺或增加艾日布林的亲脂性，得到的化合物27在体内外对多种异种移植肿瘤有抑制作用，具有口服生物利用价值，可增加在脑脊液中的暴露量，可能为治疗脑肿瘤等更多种人类癌症提供候选药物(图 5B)。 3.1.4. 微管溶素(Tubulysins) Tubulysins (28) 是 Hofle 等从粘菌培养基中分离出的一种天然抗有丝分裂肽(图 6)，它是一种由N-甲基-D-哌可酸(Mep)、利索莱恩(L-Ile)、微管蛋白(Tuv)和微管丙氨酸(Tup)组成的线性四肽，又称微管溶素Tut(Tut)，能抑制微管蛋白的聚合，诱导细胞凋亡，对癌细胞包括耐多药KB-V1细胞有较强的抗增殖活性(IC50 = 0.08 nmol/L)，在抗癌药物研发中具有良好的前景。2018年，KC Nicolaou团队合成了高效微管溶素类似物29和30，IC50对于HEK293T 细胞，浓度分别为 6 和 3 pmol/L。2021 年，该团队使用 T2R-TTL 对化合物30进行了晶体学研究，发现化合物30与 Vinca 结构域结合，在核苷酸结合位点附近的β和α微管蛋白分子界面口袋内形成细长的构象，其中分子的苯基氨基甲酸酯部分位于α2-微管蛋白亚基氨基酸残基 L248 的疏水袋上(图 6B)。根据该组合模式，设计了一种血浆稳定性好、对NCI-N87小鼠肿瘤模型疗效显著的ADC，在肿瘤靶向治疗研究中具有潜力。 图 6. 微管溶菌素类似物的设计和 SAR 分析。 (A) 微管溶菌素类似物28-34的化学结构；(B) 化合物30与微管蛋白的复合物的结合模式。 对微管溶素的 SAR 研究证明了微管溶素中关键残基修饰的可行性： ·在 N 端，Mep 残基的 6 元环可以有效地被 5 元无环残基N-甲基-D-脯氨酸、N -甲基肌氨酸和N, N-二甲基-D-丙氨酸取代，在大多数情况下活性损失最小； ·Tuv 部分的C11-乙酰基修饰会对活性产生显著影响：乙酰基水解成二级醇将导致活性损失高达 1000 倍，但它可以容忍各种各样的变化，尤其是对N、O-缩醛发生改变； ·相反，Tup 残基是常见的可修饰给药结合位点； ·C13 上的取代基不耐受变化，将异丙基替换为环己基或芳基(苯基和对甲氧基苯基)将导致活性丧失； ·羧酸端是常见的结合位点，因此经常被修饰。 为了克服微管溶素 C-11 乙酸酯水解引起的不稳定性，Patrick J. Burke63设计了一种 C-11 烷氧基类似物31，它表现出与微管溶素 M 相似的生物活性，且显著提高了血浆稳定性(图 6A)。Chakrapani Subramanyam鉴定出一种有效的微管溶素类似物32，该类似物含有α-甲基叔胺，所得ADC在体内和体外均表现出良好的药效。程恒制备了一种含氨基甲酸酯的微管溶素类似物33，其氨基甲酸酯基团在体内稳定，对OVCAR3和N87细胞的IC50分别为0.20和0.23 nmol/L，化合物33与抗meso抗体偶联形成的ADC，0.01 μmol/L可诱导肿瘤生长明显延缓。微管溶素衍生物34含有不可水解的 N 取代基的 tubuvaline (Tuv)，在 HT-29 细胞中的 IC50 < 0.28 nmol/L，也具有作为 ADC 有效载荷的潜力。 3.1.5. 隐藻素(Cryptophycin) Cryptophycin 是由蓝藻产生的天然大环多肽，具有 16 元环，它含有两个羟基酸(A 和 D 单元)和两个氨基酸(B 和 C 单元)。Cryptophycin 不可逆地抑制有丝分裂期间的β-微管蛋白聚合，这可导致细胞周期阻滞在 G2/M 期并激活凋亡途径，从而在体外产生皮摩尔(pM)抗增殖能力。第一个合成并评估的 cryptophycin 类似物 cryptophycin-1 (35) 对 KB 细胞的 IC50为 4.58 pmol/L，对 LoVo 细胞的 IC50 为 7.63 pmol/L (图 7)，但由于大环内酯类化合物在血液循环中不稳定，其体内抗肿瘤活性并不显著。经过进一步的结构修饰，得到了C单元β-丙氨酸的α位上比cryptophycin-1多一个甲基的cryptophycin-52 (36)，增加了空间位阻，明显提高了体内稳定性。极低浓度的cryptophycin-52 (36)在有丝分裂过程中抑制细胞增殖(IC50=11 pmol/L)，而微管长度和质量没有明显变化。cryptophycin-52 (36)与微管蛋白的结合非常紧密，cryptophycin-52 (36)-微管蛋白复合物对微管的结合率非常高 (Kd=47 nmol/L)。虽然 cryptophycin-52 有效，但由于剂量依赖性毒性，它在 II 期临床试验中被终止，使用该化合物作为 ADC 的有效载荷可能会降低其毒性。最近，Paul T. Wingfield 团队在微管蛋白二聚体界面上确定了 cryptophycin-52 (36)及其母体化合物 cryptophycin-1 (35)的结合位点，该位点与美登素部分重叠 (图 7B)，α-微管蛋白和β-微管蛋白的构象均发生了变化，尤其是在螺旋H8和H10中。α、β单体之间以及cryptophycin-52(36)结合和cryptophycin-1结合微管蛋白之间存在显著差异。然后，分析了cryptophycin上合适的位点：在单元A中，对位取代的苯基比邻位取代或间位取代的类似物更有效，对位取代的苯基可作为偶联位点；单元B对细微的修饰比较敏感，比如苯环上的5-氟取代；单元C中，C6位的苄基或异丙基等大取代基会大大降低其活性；而单元D修饰后活性变化不大，单元D中的异丁基可作为偶联位点，单元D的异丁基共轭位点可能优于单元A。该分析为后续以cryptophycin为载荷的ADC设计寻找合适的共轭位点提供了参考。 图 7. 隐藻素类似物的设计和 SAR 分析。 (A)隐藻素类似物35-40的化学结构；(B)隐藻素-52 ( 36 ) 与微管蛋白复合的结合模式。 cryptophycin-52 (36)的类似物37 (IC50 = 33 pmol/L) 是一种非常有前途的临床候选药物，已由 Eli Lilly 公司获得专利(图 7A)。 隐藻素-52 中单元 A 的芳香环可以在不显著影响其生物活性的情况下进行原位修饰，这些修饰被 Sanofi-Aventis 用作抗体偶联的偶联位点。隐藻素-52-氯醇化合物，如隐藻素-55 (38)，在体内的生物活性提高了 100-1000 倍。隐藻素-55 甘氨酸 (39)在体外表现出最高的细胞活性，隐藻素-55 甘氨酸通过可切割的连接子与靶向 HER2 受体的曲妥珠单抗偶联，所得 ADC 对 SK-BR3 细胞表现出纳摩尔活性。 基因泰克将隐藻素-52 中的苯转化为苄胺，获得化合物40，适合通过氨基甲酸酯键连接。杨金良团队将 cryptophycin-52 的前体药物 CR55(在生理条件下可转化为 cryptophycin-52)与曲妥珠单抗偶联，在 HER2 阳性肿瘤细胞株中其 IC50为低纳摩尔水平(0.58-1.19 nmol/L)，10 mg/kg 相应的 ADC 在卵巢癌(SKOV3)和胃癌(NCIeN87)异种移植模型中表现出明显的抗肿瘤活性，为基于 cryptophycin-55 和 cryptophycin-52 的 ADC 抗肿瘤药物的开发提供了思路。 3.1.6. EG5抑制剂 驱动蛋白(Kinesin) (KSP/EG5/KIF11) 是一种 ATP依赖性蛋白，参与细胞周期 G2/M 期着丝粒的分离和双极纺锤体的产生，在有丝分裂中起重要作用。EG5 在血液肿瘤(例如AML 母细胞和弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 (DLBCL))和实体肿瘤(例如乳腺癌、膀胱癌和胰腺癌)中的高表达与其预后不良有关，使其成为一个有吸引力的癌症治疗靶点。几种 EG5抑制剂，如 SB-715992 (Ispinesib) (41) 和 Filanesib (ARRY-520) (42)，已在临床试验中(图 8A)。然而，EG5 抑制剂最常见的副作用，如中性粒细胞减少症、粘膜炎和口腔炎，以及其狭窄的治疗窗口，限制了它们的治疗效果。然而，通过利用 ADC，可以保护健康组织免受细胞毒性化合物的侵害，从而可能降低其总体毒性副作用并扩大化合物的治疗窗口。Dimitrios A. Skoufias 的团队将Eg5 Arry-520 复合物的结构与 Eg5 ispinesib 复合物的结构进行了比较 (图 8B)，两种复合物的叠加表明ispinesib的喹唑啉酮与Arry-520的二氟苯环占据相似的位置，并具有相似的相互作用。在ispinesib中，两个芳香族取代基对甲苯和苄基相互堆叠，与Glu118，Arg119以及Arg119，Trp127和Asp130侧链进一步堆叠来稳定骨架。然而，在Eg5 Arry-520复合物中，这种骨架堆叠要弱得多。此外，对于Arry-520，二氟苯基和异丁基侧链残基之间存在直接的疏水堆叠相互作用，而在ispinesib复合物中，侧链移动2 Å以容纳苄基和对甲苯和苄基-甲苯，从而完全削弱或失去这种相互作用。Arry-520与ispinesib通过Gly117的伯胺与主链氧和Glu116的侧链之间形成氢键相互作用，Arry-520中甲氧基的氧可能与Tyr211(3.63 Å)的羟基发生微弱的相互作用。另外，苯环上的一个氟与Gly217的主链NH(3.03 Å)相互作用，与Arg221(3.69 Å)的侧链发生微弱的相互作用。总的来说，Arry-520的紧密结合是通过一系列与抑制剂结合袋中氨基酸侧链的强或弱的氢键相互作用和疏水相互作用实现的。此外，Eg5变构结合位点的D130A和L214A突变均可使Array-520产生耐药性，而ispinesib对L214A突变体仍然敏感。 图 8. EG5 抑制剂的设计和 SAR 分析。 (A) EG5抑制剂41–45的化学结构；(B) ispinesib (41) 与 EG5复合的结合模式。 诺华公司开发了 EG5 抑制剂43、44，作为有效载荷与抗体结合，使用不可切割的连接子靶向 HER2 (图 8A)。在 HER2 表达的小鼠异种移植模型 (SK-OV-3ip) 中，单剂量静脉 ADC (5 mg/kg) 可使肿瘤生长停止 3 周，效果优于 Kadcyla (5 mg/kg)。使用非细胞渗透性 EG5 吡啶抑制剂作为有效载荷，Anette Sommer开发了一种新型 IL3RA 靶向 ADC，该 ADC 显示出有效和选择性的抗增殖作用。Carsten Terjung研究了一种新的EG5 吡咯亚类抑制剂45作为 ADC 新型有效载荷的适用性，在尿路上皮细胞癌 (UCC) 异种移植模型中，这种 ADC 显示出高效，可完全根除肿瘤。 微管破坏可诱导细胞周期停滞在 G2/M 期，这使得微管成为药物发现的一个有吸引力的靶点。在许多情况下，治疗窗口狭窄和缺乏肿瘤特异性可能导致强效微管蛋白抑制剂单独作为抗癌剂失败。然而，使用 ADC 作为靶向疗法可能是解决微管蛋白抑制剂单一疗法局限性的一种有前途的方法。目前处于临床开发阶段的 ADC 中有一半以上以微管蛋白抑制剂(auristatins和 maytansinoids)作为有效载荷。虽然微管蛋白抑制剂作为 ADC 有效载荷取得了一些商业成功，但它们受到开发过程中各种缺点的限制，例如，它只能靶向处于分裂期的肿瘤细胞，而不能靶向处于非分裂期和静止期的细胞。此外，肿瘤细胞中的微管蛋白抑制剂靶点较多，这意味着需要更大剂量的药物才能阻止微管蛋白的激活，因此这些以微管蛋白抑制剂为有效载荷的ADC药物还远未达到理想的靶向治疗理念。 3.2. DNA 靶向有效载荷 相比于微管蛋白抑制剂，DNA抑制剂能够通过双链断裂、烷基化、嵌合、交联等方式破坏DNA，作用于整个细胞周期，产生细胞毒作用，对实体肿瘤有良好的治疗效果。此外，DNA抑制剂的靶点远少于微管蛋白抑制剂，当ADC携带相同数量的载荷进入细胞时，DNA抑制剂能够表现出更好的杀伤效果。此外，以DNA抑制剂为载荷的ADC可以靶向抗原表达较低的肿瘤细胞，这也是为什么在许多下一代ADC中都选择DNA抑制剂作为载荷的原因。 3.2.1. 烯二炔(Enediyne) 从细菌来源分离的烯二炔是迄今为止发现的最具细胞毒性的天然产物之一，其摄取会通过破坏活细胞中的单链或双链DNA而导致细胞死亡，同时它还对各种细菌和肿瘤细胞具有极强的活性。烯二炔可分为两个亚家族：钙样烯二炔和蒽醌融合烯二炔。剧毒的烯二炔化合物并不适合直接用作抗癌剂，但这些抗肿瘤抗生素的效力和作用机制使它们成为有吸引力的ADC有效载荷。天然烯二炔产物最常用的ADC有效载荷是来自 Cal烯二炔类的钙血霉素(Calicheamicin)γI1(46)和蒽醌稠合烯二炔 Uncialamycin (47) (图 9A)。 图 9. 烯二炔的设计和 SAR 分析。 (A) 烯二炔46-52的化学结构；(B) 卡奇霉素γI1(46) 与 DNA 复合物的结合模式。 Calicheamicin靶向与 DNA 结合的小沟，特异性诱导 DNA 双链断裂，导致细胞凋亡。尽管最初的实验显示出很强的活性，但Calicheamicin对正常细胞 DNA 的破坏阻碍了其临床进展。尽管如此，高细胞毒性、小分子大小和明确的作用机制使Calicheamicin成为有吸引力的 ADC 有效载荷，Calicheamicin γI1(46) 是目前研究最多的Calicheamicin。Dinshaw J. Patel 和他的团队研究了Calicheamicin γI1的高分辨率结构-DNA 双链复合物，并发现Calicheamicin的芳基四糖在以寡嘧啶寡嘌呤束为中心的小沟深处的定向排列，反过来又使附着的烯二炔环定向跨越双链的两条链，在复合物的强度精细结构中(图 9B)。相对于螺旋轴倾斜的烯二炔环在小沟深处取向，允许DNA糖磷酸骨架质子被暴露的三硫键触发物和环芳构化激活后被提取，最终导致DNA链断裂。药物与DNA小沟之间的界面具有紧密的互补性，该界面跨越复合物精细结构中的整个结合位点。该研究提供了一个数据库来解决与Calicheamicin类DNA的鉴定和切割相关的两个问题。Calicheamicin γI1(46)具有强大的细胞作用，以Mylotarg为代表的ADC的出现很大程度上依赖于Calicheamicin γI1(46)的发现，其N-乙酰基衍生物成为Mylotarg的有效载荷。Nicolaou等合成了Calicheamicin γI1的类似物Calicheamicin θI1 (48)，其对多种肿瘤细胞的IC50值<1 pmol/L，也适合作为ADC有效载荷。此外， FDA批准的Inotuzumab Ozogamicin(Besponsa)也是以Calicheamicin作为有效载荷。 Uncialamycin 是从地衣中分离出来的天然烯二炔产物，能引起 DNA 切割，表现出很强的细胞活性。Uncialamycin 强效类似物的共同结构特征之一是 A 环上存在一级或二级苯胺基团，如果将胺转化为相应的苯甲酰胺，并引入末端芳胺，则可以解决不稳定性问题，同时保持活性。Sanjeev Gangwar采用苯酚烷基化法，设计了一种高效且化学稳定的 Uncialamycin 类似物49 (图 9A)。所得 ADC 通过将有效载荷与抗间皮素 (meso) 抗体结合，在 H226 细胞中的IC50为 0.2 nmol/L，在耐受剂量下表现出特异性和持久的肿瘤生长抑制作用。Julia Gavrilyuk 等选择甲胺类似物50作为 uncialamycin ADC 有效载荷，靶向 TL 和 CD46 的 ADC 在 HEK293T 细胞中表现出低皮摩尔效力。Emmanuel N. Pitsinos修饰uncialamycin，从分子的芳香部分去除一个碳，得到化合物51(待测细胞系：IC50 (H226 细胞) = 28 pmol/L； IC50 (N87 细胞) = 11 pmol/L； IC50 (OVCAR3 细胞) = 316 pmol/L； IC50 (Adr 细胞) = 20 pmol/L)。Sanjeev Gangwar将uncialamycin 类似物52与抗间皮素 (meso)抗体结合，所得 ADC 在 H226 肺癌细胞中的 IC50值为 0.98 nmol/L，IC50值为 0.88 nmol/L。 3.2.2. 拓扑异构酶 I 抑制剂(Topoisomerase I inhibitors) 拓扑异构酶 I (TOPO-I) 是一种重要的核酶，对基因组稳定性和 DNA 结构保存至关重要，已成为 ADC 的热门靶点。TOPO-I 抑制剂与先天性和适应性免疫反应有关，这表明针对 TOPO-I 的 ADC 也可能有助于抗肿瘤免疫治疗。Lance Stewart 等报道了 TOPO-I 与双链 DNA 共价连接并与临床批准的抗癌药物拓扑替康(topotecan) (53)联合使用的 X 射线晶体结构(图 10A)，拓扑替康 (53)和人类 TOPO I-DNA 共价复合物表明，拓扑替康是一种非竞争性抑制剂，通过在酶诱导的缺口处在两条 DNA 链之间插入碱基来与酶-底物复合物结合。拓扑替康的结合模式是与 DNA 的堆积相互作用、与 Asp-533 接触的氢键以及与磷酸酪氨酸和 Asn-722 之间的活性位点的水桥接触。天然五环产物喜树碱 (camptothecin, CPT) (54) (图 10B)是拓扑替康 (53)的类似物，是一类特别有吸引力的 ADC 有效载荷，它通过与 TOPO-I 和 DNA 结合形成稳定的复合物，诱导 S 期细胞中的双链 DNA 断裂，从而导致细胞凋亡。然而，喜树碱的溶解度极低，阻碍了其作为癌症治疗药物的广泛使用。SN-38 (56) 是伊立替康(irinotecan) CPT-11 (55)的有效成分，是一种半合成喜树碱，尽管 SN-38 具有所需的效力，但由于其高度疏水性和可用的结合位点数量有限，活性结合物的制备具有挑战性。尽管如此，SN-38 已与针对滋养层细胞表面抗原 2 (Trop-2) 的人源化抗体结合，从而产生 ADC sacituzumab govitecan，该药物正在临床研究中。甲磺酸依沙替康 (DX-8951f) (57) 是一种水溶性 CPT 衍生物，与其他 CPT 类似物相比，具有更强的 TOPO-I 抑制和抗肿瘤活性。DXd (DX-8951 衍生物) (58) 是一种新型、高度膜通透性的拓扑异构酶 I 抑制剂，细胞 IC50为2.05-17.88 nmol/L，可克服P-糖蛋白介导的多药耐药性，对各种肿瘤移植模型有更强的疗效，包括体内CPT-11耐药肿瘤。 图 10. 拓扑异构酶 I 抑制剂的设计和 SAR 分析。 (A) 拓扑替康 (53) 与 TOPO I-DNA复合物的结合模式； (B) 拓扑异构酶 I 抑制剂53-60的化学结构。 DXd (58) 有一个包含第二个手性中心的 F 环，使其合成和衍生化变得复杂。为了简化其结构，Wayne C. Widdison 的SAR 研究表明，C11 位氟取代通常会使细胞毒性增加数倍，而 C20 中心必须处于S构型才能使分子保持活性，依沙替康内酯稳定性的提高归因于 C11 氟取代基和 F 环的作用。衍生自喜树碱衍生物58和59 的ADC能有效释放部分含硫化物或硫醇的喜树碱代谢物，这些代谢物对靶向的抗原阳性细胞有较强的抑制作用，在HSC-2和H1703 EGFR+异种移植模型中均表现出相似的剂量依赖性抗肿瘤活性。有效载荷59中没有F环，但其结合物在体外和体内的药效与含DXd的结合物相似，这种简化使喜树碱A环和B环的衍生化更易于用于构效关系研究和有效载荷优化。余东科通过将DXd与曲妥珠单抗偶联，获得了一种新型的HER2靶向ADC DS-8201a。SAR显示C-10的羟基取代可以增强CPT的抗肿瘤活性，而C-7和C-10的脱取代可以稳定内酯环并提高分子生物学活性。DXd在C-7和C-9位点环化，从而增加了抑制活性。DS-8201a避免了耐药性，并且通过旁观者杀伤效应在治疗异质性肿瘤方面非常有效。Scott C. Jeffrey开发了一种新型亲水性和蛋白酶溶解性谷氨酸三肽配体，使用具有高细胞毒性的7-氨基甲基-10, 11-亚甲基二氧CPT类似物60作为有效载荷，缀合的ADC在CD30高表达菌株和MDR阳性的786-O肾细胞癌裸鼠中均表现出有效的抗肿瘤活性。 3.2.3. PBD 链霉菌中发现的吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮卓类 (PBD) (61)是一类具有抗肿瘤活性的天然产物(图 11)，该类化合物由一个芳香族A环、一个1-4-二氮杂-5-1B环和一个吡咯烷C环组成，其作用方式是在DNA小沟内选择性烷基化，鸟嘌呤的N2与PBD的亲电性N10/C11亚胺形成共价键，DNA链间交联造成持续的DNA损伤，导致细胞周期停滞在G2/M期，引起细胞凋亡，从而表现出强大的细胞毒作用。Klaus Weisz团队的NMR结构数据证实了PBD杂合子与DNA双链小沟的强结合，PBD部分与外环鸟嘌呤氨基之间形成共价键。 图 11. PBD 类似物的设计和 SAR 分析61-72。 PBD二聚体具有作为ADC载荷的潜力，例如以PBD为载荷设计的靶向ROR1的ADC CS5001，在多种表达ROR1的肿瘤细胞系中表现出很强的选择性，并在血液和实体瘤异种移植小鼠模型中表现出显著的体内抗肿瘤活性，目前正在进行临床试验。为了进一步扩展更多PBD类化合物作为ADC载荷，Rahman等对PBD的C8位置进行了修饰，得到化合物62，其偶联物具有临床前活性。基于化合物62，Khondaker Miraz. Rahman合成了PBD核心，并利用苯并呋喃和N-甲基吡咯的组合构建了C8杂化物63(图 11)。随后，通过系统地缩短含有吡咯苯并呋喃结构域的C8连接单体，获得了一系列化合物(例如，化合物64的C8连接单体通过去除酰胺而缩短)。研究发现，PBD在C8位置的相对较短的侧链足以赋予细胞毒性，因此缩短的PBD单体可以用作新的ADC有效载荷。二氢苯并呋喃化合物64在原发性CLL细胞中毒性较大，而打开呋喃环在原发性CLL细胞和JN-3细胞系中也保持较低的纳摩尔活性。苯并呋喃中苯元素的变化对细胞毒性影响更显著，去除环的芳香性后细胞毒性明显降低。Jagath R. Junutula鉴定出一种异喹啉苯并二氮卓类 (IQB) 有效载荷65，其 (S, S) 立体化学在 C6a 位对于最佳 IQB 活性至关重要，这是一类新的 PBD二聚体 DNA 损伤有效载荷，在 HEPG2 A704 细胞系中表现出高活性，细胞毒性吡咯并苯二氮卓 (PBD)-二聚体分子经常用作 ADC 的有效载荷。为了进一步探索这种 ADC 有效载荷类别，Peter S. Dragovich通过系统地将酸性和碱性部分引入其化学结构中来修改其物理化学性质，结果表明，含有酸性官能团(包括高度可电离的部分，例如化合物66中存在的磺酸)的PBD-二聚体有效载荷) 能够在抗体介导的递送后有效地从细胞溶酶体转运到细胞质和/或细胞核。修饰的 PBD 二聚体化合物66与 CD22 抗体偶联，得到针对 BJAB 细胞的 IC50为 12 nmol/L 的 ADC，显著提高了未偶联 PBD 二聚体的抗增殖活性。PBD 二聚体有效载荷66将有助于设计出具有更高治疗潜力的新型ADC。Peter S. Dragovich探索了含二硫键前药的PBD二聚体作为抗体-药物偶联物的有效载荷，发现许多含二硫键前药的PBD单体对细胞内GSH水平相对较高的细胞(如KPL-4细胞)表现出较强的抗增殖活性。多种二硫键前体在生理浓度的Cys下稳定，但在肿瘤细胞中存在GSH的情况下不稳定。增加化合物67和68的端隙体积可显著提高其稳定性，例如，得到的化合物69和70含有两个甲基的 PBD 二聚体对 GSH 和 Cys 都具有高度稳定性，噻吩衍生的二硫化物在体内的稳定性得到了改善。在这些常见的 PBD 有效载荷中，PBD 二聚体上的结合位点分为两类：C2 和 N10。C2 结合的一个例子是有效载荷71，它包含一个连接到 PBD C2 位的苯环。靶向 CD19 的 ADCT-402 的有效载荷 SG3199 (72) 通过其 N10 位点进行结合，由于 PBD B 环上的 N10 位点参与与 DNA 的共价结合，因此连接子与 N10 位点的结合比与 C2 位点的结合更安全。在PBD载荷的后续工作中，其共轭位点也可作为影响修饰方向的一个因素。 3.2.4. 多卡米星(Duocarmycin) Duocarmycin A (73) 是从链霉菌中分离出来的一种强效 DNA 烷基化剂，由 DNA 烷基化部分和结合部分组成 (图 12A)。第一个发现的天然多卡米星成员 CC-1065 (74) 通过其高活性的丙烷环与 DNA 微沟结合，并在 N3 位烷基化腺嘌呤，最终导致细胞死亡。尽管 CC-1065 (74)在体外具有很强的效力，但在动物模型中仅显示出中等体内活性和不可逆的肝毒性。为了改善这些化合物的生物学特性，将它们用于 ADC 可能是一个可行的选择。Walter J. Chazin 等描述了 duocarmycin SA 的非天然对映体和 DNA 加合物的结构，发现 duocarmycin SA 的两种对映体可以在 AATTA 双链上共享相同的结合位点和相同的结合方向，但烷基化不同的位点(图 12B)。两种对映体对互补链的烷基化发生在相同的结合方向，但非天然对映体偏移一个碱基对。这种差异对两种加合物的结构具有重要意义，因此会影响它们的相对烷基化效率。对这种与相同 AATTA 双链结合的新结构的分析解释了天然和天然 DNA 位点选择性的相似性和差异性非天然对映体。在duocarmycin/CC-1065 家族的 DNA 加合物的所有结构中都观察到了亚基间扭曲，由于 DNA 具有左手螺旋扭曲，因此 DSA 的三甲氧基吲哚亚基在小沟中结合时相对于烷基化亚基自然倾向于以逆时针方式扭曲。因此，DNA 分子本身的手性对 (+) 对映体药剂施加了重要的限制，而 (-) 对映体药剂则不存在这种限制。两种 DSA 对映体的庞大 C24 甲氧基位于小沟底部的大致相同位置，位于 A16 和 T17 碱基之间的裂缝中。这项研究为控制这些化合物的DNA烷基化率的因素以及DNA结合诱导的烷基化反应激活的重要性提供了新的认识。 图 12. 多卡米星类似物的设计和 SAR 分析。 (A)多卡米星类似物73-80的化学结构； (B) 多卡米星 A (73) 与 DNA 复合物的结合模式。 Patrick H. Beusker开发了一种基于多卡米星的用于还原链间二硫键的新型有效载荷，它与抗 HER2 抗体曲妥珠单抗结合，产生具有良好体内和体外特性的 ADC SYD985。多卡米星 DUBA (75) 具有咪唑 [1, 2-a] 吡啶基，以其无活性的前药形式seco-DIBA (76)掺入结合药物中(75通过76的自发螺环化形成) (图 12A)。化合物76含有两个羟基，每个羟基都可以通过连接子与抗体偶联。Moana Tercel 采用 Pd 催化胺化法将seco-CBI(seco-1,2,9,9a-四氢环丙[c]苯并[e]吲哚-4-酮，一种合成的duocarmycin 天然产物烷基化亚基的类似物)从苯酚转化为氨基形式，然后得到苯酚 CBI 类似物77, 78和氨基 CBI 类似物79, 80。化合物77对6种人类肿瘤细胞系的IC50在 0.1-2 pmol/L 范围内，更换化合物77或78苯酚 CBI 与相应的化合物79和80氨基 CBI 结合可显著降低药效，且对 P-gp 过度表达的敏感性更高。尽管如此，化合物79在大多数测试细胞系中保持了显著较低的皮摩尔细胞毒性，并且与化合物77、78和80一样，在足够高的浓度下完全抑制了所有细胞系的增殖。 ADC领域的一个明显趋势是治疗靶点从血液肿瘤转向实体肿瘤，这一趋势可能将有效载荷的选择从微管靶向抑制剂转向DNA损伤剂，DNA损伤剂通常表现出更高的效力，并符合新一代有效载荷要求比当前有效载荷具有更高治疗指数的标准。此外，使用DNA损伤剂作为有效载荷可以靶向相对低表达水平的肿瘤特异性/相关表面受体。DNA损伤剂作为ADC的有效载荷的使用已经很成熟，但由于DNA损伤难以修复，这可能导致潜在的毒副作用，目前仅有一款以PDB为有效载荷的ADC在临床上使用，因此其安全性/耐药性问题仍需进一步研究，未来还需要研制更多新一代ADC有效载荷。 3.3. RNA 靶向有效载荷 仍有许多肿瘤对 ADC 不产生反应或产生耐药性，生长缓慢的肿瘤细胞通常不像快速分裂细胞那样依赖微管蛋白介导的细胞过程。因此，为了进一步扩大 ADC 有效载荷的范围并识别出对快速和慢速增殖细胞均有效且可以逃避 MDR 介导的耐药性的其他类型 ADC 有效载荷，人们将注意力转向了靶向 RNA 的小分子有效载荷。靶向 RNA 的小分子抑制剂可以杀死分裂和休眠的肿瘤细胞，用作 ADC 有效载荷有望解决无效肿瘤休眠细胞引起的肿瘤耐药性和肿瘤复发和扩散问题。目前可用于ADC有效载荷的RNA抑制剂主要有两种：RNA剪接抑制剂(Thailanstatin及其类似物)和RNA聚合酶II抑制剂(Amatoxins)。 3.3.1. 泰兰他汀(Thailanstatin) RNA剪接主要通过切除负责将RNA转化为mRNA的复杂细胞机制的内含子和外显子来控制代谢、血管生成、癌细胞增殖和转移，它们还可以直接控制转录的起始、延长和终止，这是癌症抑制的生物学靶点。Abdel-Wahab等研究发现在RNA剪接调控药物的干扰下，肿瘤细胞可以产生新抗原，这些新抗原可以通过MHC I类分子以新抗原表位的形式呈递，从而激发抗肿瘤免疫，表明RNA剪接调控可以作为肿瘤抗原的潜在来源，具有应用于肿瘤免疫检查点治疗的潜力。剪接体抑制剂是强效的抗增殖药物，能够靶向活跃分裂和静止的细胞，因此RNA剪接体抑制剂是一类很有前途的ADC有效载荷。Thailanstatin是一种天然产物，最初从泰国布鲁氏菌msmb43中分离得到，通过与剪接体U2 snRNA亚复合物的SF3b亚基结合而被激活。Thailanstatin 家族通过抑制真核生物的 mRNA 剪接途径，对剪接体具有很强的结合和抑制作用，导致低纳摩尔 IC50 个值适用于多种癌细胞系，可用作 ADC的潜在有效载荷。 Yi-Qiang Cheng报道了从MSMB43 中分离得到的三种新的 thailanstatin 化合物：thailanstatin A (81)、thailanstatin B (82) 和 thailanstatin C (83) (图 13)。Thailanstatin A(81)是一种潜在的天然抗癌药物候选物，Thailanstatin药物整体结构与剪接体抑制剂候选物FR901464 (84)相似，不同之处在于Thailanstatin的C1位缺少一个不稳定的羟基，而C17位则多了一个羧基部分，因此Thailanstatin具有更好的稳定性。Thailanstatin A(81)和FR901464 (84) C3位的高活性环氧物对抑制前mRNA剪接和癌细胞增殖至关重要，通过卤化修饰Thailanstatin B(82)和Thailanstatin C(83)可降低化合物的生物活性) 对环氧物的作用，向 Thailanstatin C (83)添加甲基(与 Thailanstatin B (82)相比)对化合物的生物活性没有显著影响。Stephan Rigol合成了 Thailanstatin 类似物85和86，它们的 IC50值为皮摩尔。辉瑞首次探索了 RNA 剪接抑制剂作为抗体药物偶联物的有效载荷，将含羧酸的Thailanstatin 半合成类似物87直接与曲妥珠单抗表面赖氨酸偶联，得到非常有效的 Thailanstatin ADC。化合物87其对应的ADC在HER2高表达的胃癌细胞株N87和MDR1过表达的细胞株中均有效(化合物87在N87细胞中的IC50为1.8 nmol/L)，此外该ADC在胃癌异种移植模型中，低至1.5 mg/kg剂量暴露即可产生优异的药效，优于临床批准的ADC T-DM1。 图 13. 泰兰他汀类似物的设计和SAR分析81-87。 3.3.2. 鹅膏毒素(Amatoxins) 鹅膏毒素于1941年由Heinrich Wieland和Rudolf Hallermayer首次分离出来，鹅膏毒素是由核糖体合成的有毒双环八肽，是真核RNA聚合酶II的选择性抑制剂，可导致细胞凋亡。鹅膏毒素含有八个l构型氨基酸的大环，色氨酸和半胱氨酸残基通过亚砜部分连接，其三个侧链被羟基化，因此具有良好的水溶性。对鹅膏毒素研究最深入的是α-鹅膏毒素(88)，含有6-羟色氨酸(Htp)、反式-4-羟脯氨酸(Hyp)和(3R, 4R)-4,5-二羟基亮氨酸(Dhil)，是迄今为止已知的最有效、最特异的RNA聚合酶II抑制剂，具有突破耐药性或摧毁静息期肿瘤细胞的潜力，有效阻止肿瘤转移和复发(图 14A)。 Roger D. Kornberg团队分析了RNA聚合酶II- α-鹅膏蕈碱的晶体结构，发现抑制剂的位置与Bridge Helix相邻，而Trigger Loo在远离添加位点处主要处于稳定构象(图 14B)。α-鹅膏毒肽环肽骨架形成一个口袋，允许特定的互补氢键与Rpb1 His1085侧链咪唑环结合，为Trigger Loo形成一个约束点，α-鹅膏毒肽口袋对咪唑的特异性主要通过Gly7的酰胺NH与Rpb1 His1085 N(D1)的相互作用以及Asn1的羰基与Rpb1 His1085 NH(E2)的相互作用实现。研究表明，α-鹅膏毒肽通过直接干扰RNA聚合酶II的Trigger Loo来抑制RNA聚合酶II的延伸，并表现出缓慢降低的底物选择性。 图 14. 鹅膏毒肽的设计和 SAR 分析。 (A) 鹅膏毒肽 88、89 的化学结构； ( B ) α-鹅膏毒肽 (88) 与 RNA 复合物的结合模式。 鹅膏毒素引起的细胞凋亡、坏死等毒性阻碍了其临床应用，但由于其分子量小、在水溶液中溶解性好、能抑制RNA聚合酶Ⅱ，近年来作为抗体-药物偶联物的有效载荷在癌症研究中受到越来越多的关注。α-鹅膏毒素ADC很可能同时作用于增殖细胞和静止期肿瘤细胞，在ADC领域，使用鹅膏毒素作为有效载荷是一种比较新的方法。HDP-101，一种由海德堡制药公司开发的以鹅膏毒素为载荷的靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的ADC，目前正处于I/IIa期临床试验，用于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤，并于2022年2月15日完成首例患者给药。HDP-102是一种靶向CD37的ADC药物，靶向治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)。HDP-103靶向前列腺特异性膜抗原(PSMA)，靶向适应症为转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)。Steffen Goletz113将β-鹅膏毒肽(89)的羧基与IgG赖氨酸的氨基偶联，得到一种具有良好血浆稳定性和高细胞毒性的ADC(图 14A)。 以泰兰他汀(thailanstatin)和鹅膏毒素为载荷的ADC能够避免耐药性，有效对抗休眠肿瘤细胞，而现有的标准疗法很难达到这一效果，常常导致肿瘤复发和耐药。因此，除了微管蛋白抑制剂和DNA损伤剂作为载荷外，新一代RNA抑制剂作为ADC载荷也越来越受到关注。虽然目前还没有RNA载荷的ADC上市，但其巨大的潜力值得进一步挖掘。 3.4. 免疫 ADC 有效载荷 最初ADC 仅限于肿瘤学，然而它们的临床成功鼓励了 ADC 在其他治疗领域的应用，最引人注目的是免疫学。肿瘤免疫涉及 T 细胞、巨噬细胞、树突状细胞等，它们通过免疫调节将冷肿瘤转化为热肿瘤，最终增强免疫治疗的效果，免疫检查点抑制剂通过消除肿瘤对 T 细胞的抑制来增强 T 细胞的抗癌免疫反应。然而，对于没有自发性 T 细胞反应和肿瘤周围 T 细胞浸润的癌症患者(其肿瘤通常称为冷肿瘤)，免疫检查点抑制剂效果不佳。因此，免疫疗法研发的重点之一是开发能够刺激患者先天免疫反应并促进肿瘤特异性 T 细胞募集的抗癌疗法。与传统ADC不同，免疫刺激抗体偶联物(immune-stimulating antibody conjugates, ISAC)结合了抗体导航靶向的精准性和基于小分子调节先天和适应性免疫系统的强大功能。一方面，抗体偶联免疫激动剂类型的小分子，起到增强免疫反应的作用；另一方面，抗体的肿瘤靶向性降低了小分子免疫激动剂的毒性。在靶标选择方面，传统ADC由于载荷毒性必须严格限制肿瘤特异性抗原，而免疫调节ADC可以拓展更多的肿瘤相关抗原。在内吞作用方面，传统ADC是靶向抗原介导的内吞作用，直接杀死癌细胞，而免疫调节ADC通过免疫细胞表面的FcγR介导的内吞作用激活免疫细胞。目前，多种免疫调节ADC药物正在开发中，新的有效载荷主要包括Toll样受体(TLR)激动剂和干扰素基因刺激剂(STING)激动剂，该领域具有巨大的发展潜力。 3.4.1. Toll 样受体激动剂 Toll 样受体(Toll-like receptors, TLR)是一类重要的参与先天免疫的蛋白质分子，是机体抵抗感染性疾病的第一道屏障。TLR 受体的激活能够改善肿瘤微环境中树突状细胞和巨噬细胞的抗原呈递，促进 CD8+ T细胞。Toll样受体激动剂作为免疫增强剂，在肺癌、黑色素瘤、白血病、胶质瘤等肿瘤中直接或间接诱导增强的抗肿瘤免疫反应，从而有效抑制肿瘤生长。因此，将TLR激动剂应用于肿瘤免疫治疗，有望激活先天免疫反应，介导获得性免疫反应，使冷肿瘤变热，解决单一免疫检查点抑制剂应答率低的问题，提高免疫治疗的有效性，达到重塑肿瘤微环境的目的。目前，TLR已成为免疫治疗领域的研究热点之一，而在TLR家族成员中，研究者较多关注的是TLR7、TLR8、TLR9。TLR8激动剂(90) (91)激活DC细胞并增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤(图 15)，然而免疫治疗往往伴随副作用，如细胞因子释放综合征，这是一种常见的引起全身炎症的疾病。TLR8激动剂的全身给药也存在相关的毒性，限制了患者可以服用的TLR8激动剂的数量。因此，将TLR8激动剂应用于ADC，可以同时结合抗体的靶向作用和TLR8的免疫调控作用，减少毒副作用。Toshiyuki Shimizu团队发现TLR7 TM螺旋与TLR7-TLR信号调节剂(UNC93B1) TM3和TM6螺旋及近膜区对齐，LRR-CT基序与UNC93B1 N末端六螺旋束的腔侧相互作用。TLR7–UNC93B1复合物的二聚化由TLR7-TLR7和UNC93B1-UNC93B1相互作用介导，它们分别发生在2：2复合物的顶部和底部区域。LRR11从TLR7 ECD中部区域突出的环区主要有助于TLR7的二聚化，而UNC93B1两个原体TM6和TM7连接区域的胞内螺旋以反向平行的方式相互作用，该研究阐明了TLR'的结构基础与 UNC93B1 的相互作用并促进了随后设计针对自身免疫疾病的化合物。 图 15. TLR激动剂的设计和SAR分析90-92。 Silverback 的 SBT6050是一种抗 HER2 抗体结合物，含有 TLR8 激动剂91作为其有效载荷，在体外以HER2依赖的方式驱动多种抗肿瘤免疫机制，并在小鼠肿瘤模型中表现出良好的抗肿瘤作用(图 15)。一类新的TLR7/8双重激动剂已被报道能促进肿瘤对免疫检查点抗体的反应，尤其在冷性肿瘤中。虽然该团队发现的小分子具有显著的抗肿瘤作用，且与PD-1和PD-L1抗体联合使用可观察到显著的协同作用，但与其他已报道的TLR激动剂类似，小分子在外周血中仍然过度暴露，导致更明显的免疫相关不良反应(immune-related adverse reactions, irAE)，如体重减轻和流感样症状。为了避免直接服用TLR7/8激动剂可能引起的不良反应，团队于2015年开始尝试抗体偶联药物策略，经过数年探索，成功构建了一类新型免疫调节抗体偶联药物HE-S2，其以TLR7激动剂 (92)为靶点为有效载荷，动物实验结果显示，HE-S2(150μg/小鼠)具有非常显著的抗肿瘤作用，给药后大部分结肠癌小鼠肿瘤基本消失，而在黑色素瘤模型中，HE-S2治疗效果也优于对照组。重要的是，HE-S2治疗组小鼠没有出现明显的体重下降。此外，给药后小鼠肿瘤虽然有所萎缩，但肿瘤微环境中肿瘤细胞表面及免疫细胞PD-L1表达明显增高，这可能有利于提高后续HE-S2给药的靶向性。新型ADC HE-S2不仅通过阻断PD-1/PD-L1相互作用、激活TLR7/8信号通路诱导强大的抗肿瘤免疫反应，而且还通过表观遗传调控和 IFN-γ，从而赋予 PD-1/PD-L1 阻断更高的敏感性。 Michael N. Alonso团队将 TLR7/8 激动剂与 HER2 抗体偶联，得到一种 ADC 药物，该药物通过识别 FcγR依赖的吞噬作用和 TLR 介导的肿瘤抗原激活，驱动髓系细胞肿瘤杀伤和随后的 T 细胞介导的抗肿瘤免疫，适合全身给药，安全有效。此外，越来越多的公司开始将 TLR激动剂用于抗体药物偶联： Bolt 公司的 BCC-1001，用于治疗 HER2+ 阳性实体瘤，源自 HER2 的 TLR7/8 激动剂偶联，已进入临床研究；Sutro 的 IADC 技术可用于将抗体与 TLR 激动剂偶联；Tallac 的 TRAAC 技术用于位点特异性抗体与 TLR9 激动剂的偶联；ALX Oncology 的 SIRP α与Tallac合作开发的抗体可与TLR9激动剂偶联，恒瑞医药采用TLR7激动剂，百济神州采用TLR7/8激动剂，信达生物引入Bolt技术，采用TLR7/8激动剂进行偶联，Silverback公司的ImmunoTAC技术选择TLR8激动剂作为有效载荷。这些研究提供了一种增强免疫检查点阻断疗法抗肿瘤免疫应答的新型ADC策略，同时该策略也为解决直接使用免疫激动剂导致药物质量不佳的问题提供了一种思路。 3.4.2. STING 激动剂 干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)是天然免疫信号通路中的关键调控因子，具有启动机体天然免疫防御反应、促进T细胞形成适应性免疫的功能。STING介导的I型干扰素信号通路是天然免疫领域的重大发现，为肿瘤免疫治疗提供了新的靶点。激活STING通路可诱导I型干扰素及多种其他细胞因子的表达和分泌，激活天然免疫反应，促进抗肿瘤免疫反应，达到治疗肿瘤的目的。STING激动剂广泛应用于多种研究领域，除了诱导天然免疫反应外，还参与其他DNA或RNA传感信号通路、自噬、ER应激和细胞凋亡。STING激动剂凭借抗肿瘤和免疫原性的特点，也成为新型免疫治疗试验药物和疫苗佐剂。现有的临床研究数据初步证明STING激动剂与免疫检查点抑制剂联合使用可显著增强免疫治疗疗效，有望成为一种创新疗法。非核苷小分子STING激动剂具有良好的稳定性，可以在动物模型中口服或注射给药，并显示出良好的抗癌活性。但由于STING蛋白也存在于健康细胞中，因此系统性STING激动剂需要解决的问题之一是如何刺激抗肿瘤免疫反应，而不会引起健康细胞过度的炎症反应。如果这些激动剂能够进一步优化，它们有可能彻底改变免疫治疗领域。 考虑到游离型STING激动剂的全身给药可能受毒性限制，且广泛的生物分布可能并不理想，可以考虑通过ADC实现STING激动剂的肿瘤靶向递送，以降低毒性。环状二核苷酸(CDN)(93)作为STING蛋白的天然配体已被广泛研究(图 16A)。顾立川团队确定了猪STING复合物的CBD(CDN结合位点)，该复合物含有4种CDN：2, 3 cGAMP；3, 3 cGAMP；c-di-GMP和c-di-AMP。其中，不对称配体2, 3 cGAMP与STING的结合亲和力最高(图 16B)。对猪 STING CBD 2′, 3′-cGAMP复合物进行结构分析，发现不对称单元包含两个 STING CBD 分子(原体 A 和 B)，形成二聚体。各个原体通过 α1、α2、α3 和中心β-片层区域相互作用，形成深 U 形裂口。2′, 3′-cGAMP 配体位于裂口处，嘌呤向上，核糖环向下(与膜相关)，碱基、磷酸和核糖基团均有助于与 STING 结合；2′,3′-cGAMP 的嘌呤环与两个启动子的 Tyr167 和 Arg238 堆叠；2′,3′-cGAMP 的磷酸部分通过静电相互作用和氢键被 Arg238 识别，Arg238 还在核苷部分的 Hoogsteen 边缘形成氢键。除了堆叠相互作用外，腺苷和鸟苷部分与 STING 具有不同的相互作用模式。对于两者，相互作用都涉及它们的 Watson-Crick、Hoogsteen 和糖边缘，嘌呤中的所有氮原子(9 位氨基除外)和氧原子都直接或间接(水介导)与 STING 蛋白相互作用，这些广泛的相互作用与配体和猪 STING CBD 之间的高结合亲和力一致。猪 STING CBD-2′, 3′-cGAMP复合物的一个显著特征是两个原体采用不同的构象，从而形成不对称的配体结合口袋。因此，同样不对称的 2′, 3′-cGAMP 在配体结合口袋中保持一种明确的构象。这种独特的结合模式与之前涉及其他物种的 STING 蛋白的结构中看到的结合模式形成鲜明对比，其中 2′, 3′-cGAMP 以两种替代模式与对称 STING 二聚体结合，腺苷和鸟苷部分互换位置。总之，研究发现猪 STING 采用不对称构象与 CDN 结合，对这种不对称构象的分析揭示了 STING 的配体识别和识别机制。 图 16. STING 激动剂的设计和 SAR 分析。 (A) STING 激动剂93-96的化学结构；(B) CDN (93) 与 STING 复合的结合模式。 以CDN作为ADC有效载荷，CDN与抗体可以通过磷酸酯、糖环、碱基等偶联，SPEROVIE将CDN中的硫代磷酸酯或甲酸酯与PD-1或CTLA-4抗体偶联形成ADC药物；Immunesensor从CDN 3′位核糖上引出氨基或巯基，再通过氨基甲酸酯或二硫键与抗体偶联形成ADC药物；MIT和Millennium创新性地将磷脂分子偶联到CDN的磷酸酯上，所得缀合物还可进一步形成脂质体结构，提高其与细胞膜的融合能力。北京宣仪药将TLR9激动剂CpG-DNA与CDN连接形成融合分子，可同时激活TLR和STING免疫信号通路，增强免疫活性。然而，CDN结构中的二磷酸酯会导致药物的生物利用度降低。因此，随着苯并咪唑类化合物的发现，非核酸结构的STING激动剂的研究已经开始。基于二聚苯并咪唑的ADC药物也被设计和合成。Mersana使用STING激动剂94作为有效载荷获得的ADC候选药物XMT-2056已经进入临床前研究阶段(图16A)，其目的是通过刺激肿瘤组织免疫细胞和肿瘤细胞中的STING信号来激活先天免疫系统。与STING激动剂相比，XMT-2056的效力增加了100倍以上。在临床前模型中，XMT-2056在HER2高表达和低表达的模型中均显示出强大的抗肿瘤活性，当与多种批准的药物(包括曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、抗PD-1 mAb或DS-8201)联合使用时，其疗效得到增强。临床前数据表明，XMT-2056具有实现免疫记忆以延长抗肿瘤活性的潜力。今年5月，美国食品和药物管理局授予该药物治疗胃癌的孤儿药称号。Mersana计划在今年晚些时候启动XMT-2056的I期临床试验，以研究其在一系列HER2阳性肿瘤(如乳腺癌、胃癌和非小细胞肺癌)中的治疗潜力；日本小野制药开发了一种非核酸STING激动剂95作为有效载荷，通过药物结构中的吡唑环与连接剂偶联，RYVU是基于公司开发的一类与抗体形成ADC药物的硝基杂环胺STING激动剂96。 3.4.3. 糖皮质激素受体调节剂(GRM) 糖皮质激素受体调节剂 (Glucocorticoid receptor modulator, GRM) 通常用于治疗与各种疾病相关的炎症，有可能在保持 GR 逆转录效应(被认为是预期的抗炎作用的原因)的同时，将 GR 逆转录效应(被认为是不良副作用的原因)降至最低。然而，GRM 还会引起肌肉骨骼、内分泌和胃肠道副作用以及其他毒性，从而限制其治疗效果(尤其是长期使用时)。使用 GRM 作为免疫型 ADC 的有效载荷可能是一种理想的选择，因为靶向给药将最大限度地减少全身对 GRM 有效载荷的暴露，从而可以在不引起有害副作用的剂量下提供显着的疗效，并能够实现慢性给药。这种 ADC将结合单克隆抗体(针对炎症靶点)和选择性糖皮质激素受体调节剂的功效，糖皮质激素有效载荷含有胺基官能团，可用于结合溶酶体可切割抗体连接子。首次报道 GRM 作为 ADC有效载荷时使用了已知的地塞米松(dexamethasone) (97) (图 17A)，GRM ADC抗体组分选择了α-TNF，连接子则连接在地塞米松的C21羟基上。艾伯维正在开发的ABBV-3373也是由α-TNF和GRM组成的ADC药物，可以精准靶向调控活化免疫细胞，调节TNF介导的炎症信号通路，显著降低糖皮质激素相关的全身副作用，并有望治疗类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)。近期，Adrian D. Hobson启动了α-TNF-GRM ADC项目，并获得了α-TNF-GRM ADC (DAR=4)，使用马来酰亚胺-Gly-Ala-ALA 作为连接子。P1NP 和皮质酮生物标志物的分析表明，ADC 在疗效和不良反应之间具有足够的治疗窗口。在慢性小鼠关节炎模型中，α-TNF-GRM ADC 比具有相同 GRM 有效载荷的α-TNF 单克隆抗体和同型对照更有效。 图 17. 糖皮质激素受体调节剂 (GRM)的设计和 SAR 分析。 (A) GRM 97-102的化学结构； (B) 化合物97与 GR 复合的结合模式； (C) 化合物98与 GR 复合的结合模式。 Victor Gualla研究小组确定了 GR 与地塞米松(97) 和98 (前体药物环索奈德的活性代谢物) 的晶体结构，GR 和地塞米松(97) 的结构采用开放构象，GR 在 H6–H7 区域表现出较高的突变频率。对 PDB 共晶体结构进行评估，其中配体在 GR 的配体结合域 (残基 500–777) 中复合，揭示了与 GR 复合的去异丁酰环索奈德的结构 (图 17B 和 C)。Peter S. Dragovich合成测试了多种含有不同胺取代缩醛基团的类似物，其中哌嗪化合物99表现出与地塞米松 (97)和化合物98 (GRE 细胞，+ mTNF，IC50 = 33 nmol/L) 相似的细胞活性。然而，化合物99的渗透性较差，这可能是由于化学结构中存在碱性胺，从而削弱了其细胞功效。化合物99使用二肽基蛋白酶 (Ala-Ala) 可切割连接子与抗 TNF mAb 结合，所得结合物在基于细胞的评估中活性较弱 (IC50 = 8.1 μmol/L)。进一步研究发现含苯胺的化合物100比化合物99更有效，且其 GR 结合和细胞活性与地塞米松 (97)和化合物98 (GRE 细胞，+ mTNF，IC50 =4.0 nmol/L) 相似或更好。随后，通过将化合物100通过含有蛋白酶可切割的二肽部分但缺少氨基苄氧羰基间隔基的连接子与抗 TNF 单克隆抗体结合，所得结合物在含有膜结合 TNF 的细胞中表现出强的 GR 活性，而在外部缺乏该蛋白质的细胞中表现出最小的活性(GRE 细胞，+ mTNF，IC50 = 0.44 μmol/L；GRE细胞，mTNF，IC50>50 μmol/L)。在胶原诱导性关节炎 (CIA) 模型中，以 1、3 和 10 mg/kg 的剂量对小鼠进行腹膜内注射，在 21 天内爪肿胀程度呈剂量依赖性下降。重要的是，这种结合物具有较低的毒副作用。因此，通过抗体结合物靶向递送糖皮质激素可以最大限度地减少不良副作用，同时提高未结合化合物的抗炎活性。 William Olson团队描述了新的糖皮质激素类药物，他们开发 GC 结合物 (GC-ADC) 的策略是确定布地奈德(budesonide)中可以进行修改的区域，以提高结合物对新游离有效载荷的稳定性和滴度。然后评估了两种布地奈德的修饰方法：首先，用胺或苯胺取代 C21 羟基，其次，用氟取代 C9 和 C6 氢。含有胺和苯胺的有效载荷可以通过氨基甲酸酯键与抗体结合，氨基甲酸酯键比羟基提供的碳酸酯或磷酸酯键更稳定。该团队获得了两种先导化合物101和102，通过对布地奈德分子的SAR分析和分子模拟。化合物101、102的功效测试发现，这两种化合物对糖皮质激素受体(GR)的选择性高于其他核激素受体，在细胞试验中具有与布地奈德更好或相同的效力，在hERG中没有心脏毒性，在Ames中没有遗传毒性，并在体内促炎小鼠模型中表现出效力。在脂多糖(LPS)刺激的小鼠中，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的释放) 显著降低。随后通过组氨酸蛋白酶可切割连接子获得的 GC-ADC 在血浆中高度稳定，并特异性地在抗原阳性细胞中释放 GC，这表明这些新型 GC 可以作为 ADC 有效载荷来治疗自身免疫和炎症疾病。 免疫激动剂全身给药时会激活非特异性免疫反应，严重时可引发致命的细胞因子风暴。将免疫激动剂与肿瘤靶向抗体偶联，可将免疫激动剂递送至肿瘤微环境并局部释放，缓解免疫刺激剂全身给药的严重毒性，有助于避免抗肿瘤治疗中的全身副作用。然而，虽然通过诱导免疫机制发挥抗肿瘤作用的免疫刺激ADC药物思路非常清晰，临床前数据也相对较好，但在临床试验中剂量依赖性毒性问题却难以解决。激动剂疗效提升的同时，毒性也会随之提升，难以确保疗效提升的方式能够安全可靠，例如在小鼠肿瘤模型中展现出良好抗肿瘤效果的SBT6050，目前因毒性问题，在临床研究中效果不佳，因此后续研究最重要的考量就是毒性与疗效的平衡，重新设计以减弱毒性、改善给药窗口也是非常有利的。 3.5. 新型潜在 ADC 有效载荷 3.5.1. Bcl-xL 抑制剂 Bcl-xL是一种抗凋亡蛋白，在肿瘤形成、转移和耐药性中起重要作用，理论上，阻断 Bcl-xL 上 BH3 结合域的药物可以引发癌细胞凋亡。然而，Bcl-xL 对血小板存活至关重要，而 Bcl-xL 的泛抑制剂可能会产生血小板毒性。将 Bcl-xL 视为 ADC 药物有效载荷的靶点，可以保留 Bcl-xL 抑制剂的活性，同时降低其对血小板的毒性。Tomoyasu Ishikawa 对 Bcl-xL 抑制剂 ABT-737 (103) 与 Bcl-xL 共结晶，结果表明，化合物的联苯部分(单元 W)在由 Phe146、Leu130、Leu108 和 Phe105 组成的口袋中形成亲脂性相互作用(西部区域；h1 H2)，而化合物的烷基磺酰胺部分(单元 E)在由 Phe97、Tyr195 和 Tyr101 组成的另一个口袋中形成亲脂性相互作用(东部区域；h4)(图 18)。单元E中三个芳香环形成分子内π-π相互作用，形成独特的刚性U型构象，该构象可能增强ABT-737(103)与Bcl-xL的分子间结合。此外，研究了一系列小分子抑制剂的构效关系，发现单元E对Bcl-xL的抑制作用比单元W更重要，尤其是B环。晶体结构和构效关系分析将为设计更有效的抑制剂进行ADC载荷鉴定提供基础。 2017年，AbbVie首次将Bcl-xL抑制剂104与Bcl-xL偶联，作为有效载荷以 ADC 的形式传递给抗 B7H3 抗体，得到针对 EGFR 的 ABBV-155，该药物仍处于临床试验阶段(WO2017214301A1、WO2017214282Al)。 图 18. Bcl-xL 抑制剂的设计和 SAR 分析。 (A) Bcl-xL 抑制剂103、104 的化学结构；( B) ABT-737 (103) 与 Bcl-xL复合的结合模式。 3.5.2. NAMPT 抑制剂 烟酰胺磷酸核糖转移酶 (Niacinamide phosphate ribose transferase, NAMPT) 可将烟酰胺转化为烟酰胺单核苷酸，是一种控制细胞内 NAD+ 浓度的限速酶。当 NAMPT 受到抑制时，NAD+ 水平会降至代谢所需的水平以下，从而导致能量危机并最终导致细胞死亡。尽管 NAMPT 抑制剂是有效的细胞毒性分子，但由于其毒性，它们在癌症治疗中用作化疗药物受到阻碍。几种NAMPT 抑制剂，如 FK-866 (105) (图 19A)因剂量依赖性毒性而停止临床试验。但 NAMPT 抑制剂结构简单、药效强，且其激活机制不同于目前的 ADC 有效载荷，因此 NAMPT 抑制剂可作为具有良好活性和耐受性的 ADC 有效载荷，有望改善 NAMPT 抑制剂的治疗窗口，进而应用于临床环境。Chris Tse 及其团队发现了新型非底物 NAMPT 抑制剂，它们具有强大的临床前疗效和药代动力学特性，可实现口服给药，该系列的先导分子A-1293201 (106)，含有异吲哚啉“头部基团”，可有效抑制重组人 NAMPT。通过 X 射线晶体学检查 A-1293201 与 NAMPT 之间的相互作用，发现了几个不同的协同相互作用位点(图 19B)。这些位点包括 PRPP 结合亚位点 A，其本质上是亲水性的，未被烟酰胺占据；烟酰胺结合亚位点 B，在此与烟酰胺进行重要的 pi 堆积和氢键相互作用；系链亚位点 C，其狭窄、亲脂性，未被结合烟酰胺占据；以及远端开口亚位点 D，其加宽并提供多个结合水分子和疏水表面。与 FK866 类似，A-1293201 的异吲哚啉脲部分参与亚位点 B 中的重要 pi 堆积相互作用以及亚位点 C 中的氢键和疏水相互作用。与 FK866 以及最近的第二代 NAMPT 抑制剂相比，异吲哚啉脲化合物是第一种已知的强效非磷酸核糖基化 NAMPT 抑制剂。Carl Uli Bialucha设计的新型 NAMPT 抑制剂107在 nmol/L 范围内对 NCI-H526、MDA-MB453 和 NCI-N87 等多种细胞系有效，构效关系表明吡啶氮可被 NAMPT 酶磷酸化，是药效团的重要组成部分。此外，整个 3-吡啶 (S, S) 环丙基甲酰胺基团对于高水平的细胞活性至关重要。R3 区域可以容忍多种取代基，乙基取代基化合物108是通过替换更刚性的未取代苯环获得的，其对 A2780 和 CORL23 细胞系的作用与化合物107相似。苯环可进一步衍生化，以提供最佳的连接载体，在苯环对位添加哌嗪取代基是耐受性良好的化合物109，哌嗪基团上的游离二级胺可作为连接子的结合点与抗体结合。R3处的苯基哌嗪取代以及R1和R2分别被F和H取代，得到略有改善的类似物110 ，其在nmol/L浓度下对C-Kit和HER2表达细胞系有效。使用不可切割连接子与有效载荷110获得的抗c-Kit缀合物不仅具有低聚集性，而且具有最佳的抗CKIT活性(IC50分别为 9 和 40 pmol/L)，并被证明是 c-Kit 阳性胃肠道间质瘤 GIST-T1 异种移植模型的靶向药物。ADC 的有效载荷需要包含活性杂原子才能结合可切割的连接子，而 FK-866 缺乏氨基、羟基或巯基官能团。为了获得易于集成并保持效力的有效载荷，Peter D. Senter制备了一系列 FK-866 类似物，在芳香尾部的不同位置进行苯胺取代。进一步评估了这些化合物对 L540cy、A549 和 HepG2 细胞系的细胞毒性。化合物111在两种测定中都表现出与 FK-866 相似的效力，NAMPT 和化合物111的晶体结果表明，新加入的苯胺基团通过氢键与 Glu376 的主链酰胺相互作用，可能抵消了添加极性官能团所导致的任何去溶剂化损失。用吡啶基氰基胍基团中发现的强效抑制剂 chs-828 制备的化合物112和用吡啶基方酰胺基团制备的化合物113保留了与NAMPT 的强结合力并具有强细胞毒性，这些化合物已作为 ADC 药物有效载荷进入评估阶段。在耐受性良好的剂量下，在几种肿瘤模型中显示出显著的活性水平。 图 19. NAMPT 抑制剂的设计和 SAR 分析。 (A)NAMPT抑制剂105-113的化学结构；(B)A-1293201(106)与 NAMPT 复合的结合模式。 3.5.3. 卡马霉素(Carmaphycins) 蛋白酶体活性抑制剂是一类新兴的抗癌药物，对某些癌细胞具有超强的细胞毒性，环氧酮蛋白酶体抑制剂carmaphycins就是此类的代表。从海洋蓝藻Symploca sp.中分离鉴定出的carmaphycins A(114)和B(115) ，其α，β-环氧酮直接与甲硫堇亚砜或甲硫堇砜结合，在低纳摩尔浓度下抑制蛋白酶体的β5亚基，对多种癌细胞系有效(图 20)。但由于其选择性较差，常常表现出毒副作用。使用剧毒的carmaphycins衍生物作为ADC有效载荷，既能保持所需的效力，又能获得更好的耐受性。carmaphycins可分为四个不同的部分(P1-P4)，William H. Gerwick通过替换6-氨基己酸链，合成了第一代类似物116，其P4末端带有胺基，这显著降低了对NCI-H460细胞的杀伤作用(IC50 = 860 nmol/L)。第二代carmaphycins类似物在P2处含有2-氨基乙基同型半胱氨酸残基，直链烷基链被芳香族苯基或吡啶环取代，得到类似物117，其对HCT116和NCI-H460的细胞杀伤作用低于carmaphycins B(115)，因为P2的脂肪胺在生理pH下呈碱性且带正电荷，降低了其细胞通透性。为了降低P2处的碱性，该团队将carmaphycin B(115)的P2甲基砜部分替换为4-硫代苯胺或4-磺酰基苯胺，得到化合物118或119。化合物119比118更有效，这意味着碱性胺的效力越少越好。此后，合成了在P1和P2处含有两个亮氨酸-环氧酮药物簇的类似物120，其IC50在HCT116和NCI-H460细胞系中的IC50 分别为0.2和5.4 nmol/L，P1处的环氧酮对化合物120的强效细胞毒活性至关重要。类似物121含有含苯胺的P3侧链，对SKBR3细胞的IC50为21 nmol/L。与化合物121相比，将苯胺官能团置于类似物122的P4位置可更有效地抑制细胞生长。类似物系列中的化合物119保持了较高的细胞效力，但与游离抗体相比，其目前的偶联ADC对所测试的癌细胞系并未表现出更优异的细胞杀伤能力。 图 20. 卡马霉素类似物114–122的设计。 3.6. 新型ADC有效载荷 3.6.1. 以PROTAC分子为有效载荷的ADC ADC 开发的主要挑战与剂量限制性毒性(dose-limiting toxicity, DLT) 有关，这表明很难平衡药物治疗的疗效和脱靶毒性。ADC 实际输送到肿瘤的药物剂量非常小，这意味着药物分子必须具有极强的细胞毒性，尽管这会导致毒性副作用。PROTAC 是一组双功能化合物，由靶向目标蛋白 (POI)的配体、E3 连接酶的配体和连接子组成。PROTAC 将 POI 和 E3 连接酶拉近，用泛素化标记 POI，然后将其由蛋白酶体降解。PROTAC 具有催化作用，因此可以在较低剂量下有效降解目标蛋白。PROTACs可能是ADC理想的有效载荷，将抗体与PROTAC分子偶联形成的抗体PROTAC偶联物可以在特定细胞中特异性降解靶蛋白，实现PROTAC技术在细胞或组织水平的选择性。抗体-PROTAC偶联物将PROTAC的催化特性与ADC的组织特异性相结合，从而克服了传统靶向降解剂和ADC的局限性，具有靶向新靶点的巨大潜力。 将靶向BRD4蛋白的PROTAC 123与HER2抗体连接，可形成分子量约为150kD的抗体PROTAC偶联物，平均每个抗体分子上有4个PROTAC分子(图 21)。抗体PROTAC偶联物能有效降解HER2高表达细胞SK-BR-3中的BRD4蛋白，而对HER2低表达细胞MCF-7中的BRD4蛋白无降解作用。BRD4抑制剂124通过基于马来酰亚胺的偶联反应与HER2靶向mAb的链间Cys残基偶联，得到可降低BT-474(HER2阳性)细胞系中BRD4水平的ADC偶联物。两种降解ERα的ADC最近也在专利文献中被描述，第一种是将基于VHL的PROTAC 125通过以下方式连接到HER2靶向mAb上碳酸盐部分；第二个 ADC 使用含酶可切割的焦磷酸连接子连接到同一 PROTAC 的 VHL 结合区。在 MCF7-neo/HER2 细胞中，两种结合物均表现出有效的抗原依赖性 ERα降解，并且两种结合物在小鼠稳定性和药代动力学试验中均表现出可接受的结果。PROTAC 126具有 CRBN 作为 E3 连接酶并靶向 TGF-β R2 蛋白，可通过不可切割的连接子与抗 HER2 抗体偶联。在转染 HER2 受体的 HEK293 细胞中，0.5 和 1.0 μmol/L 的 ADC 在 24 和 48 h后降解了 TGF-β R2 蛋白。此外，使用PROTAC 127单次静脉注射 1 mg/kg ADC，一种基于 VHL 的可降解 BRM 蛋白，作为有效载荷，在已知表达高 CD22 表面受体的 BJAB 淋巴瘤异种移植肿瘤中实现了 BRM 蛋白的强效、抗原依赖性还原。该结合物在体内表现出所需的生物活性，并进一步多样化了可通过 ADC 模式成功调节的靶蛋白，扩大了将 PROTAC 靶向表达该表面蛋白的细胞的可能性。 图 21. PROTAC 分子123–127的化学结构。 尽管抗体-PROTAC 偶联物领域仍处于起步阶段，但已经创建了一组多样化的此类实体，其成员随后已显示出有意义的体外和/或体内生物活性。与大多数已知的细胞毒性 ADC (DAR=2-4)相比，许多这些新实体采用了更高的有效载荷有效载荷(DAR=6)，但对于典型的抗体-PROTAC 偶联物应用，这种增加是否通常是必需的仍有待确定。在体内和体外都实现了抗原依赖性活性的多个例子抗体-PROTAC 结合物与所述结合物进行了比较，这些结果证明了抗体-PROTAC 结合物能够将其各自的 PROTAC 有效载荷递送至特定肿瘤和/或目标细胞。鉴于这些有希望的初步结果，抗体-PROTAC 结合物似乎为未来的发展和应用做好了准备，预计未来抗体-PROTAC 结合物将应用于组织或生物体，为药物治疗或生物学研究提供新思路。 3.6.2. 以NIR-PIT药物为有效载荷的ADC 近红外光免疫治疗(Near-infrared photoimmunotherapy, NIR-PIT)药物一般由靶向肿瘤的肿瘤特异性单克隆抗体和光激活化学物质通过连接子组成，本质上是ADC药物。NIR-PIT药物可以与照射红外光到肿瘤部位的装置一起，形成一个新的靶向抗癌平台。该平台使抗体介导的靶向递送达到高度的肿瘤特异性，同时利用红外光激活药物的生物物理机制，精准诱导癌细胞快速死亡，而不伤害周围的正常组织。NIR-PIT药物诱导的多克隆免疫反应可以消灭在NIR-PIT药物第一步中存活下来的肿瘤细胞，即使NIR-PIT药物不足、递送不均匀，或由于靶抗原表达不均匀导致剂量不足，因为后续的第二步多克隆免疫反应也会杀死残留的肿瘤细胞。此外，NIR-PIT 药物还可以作为先前存在的 PD-1 单克隆抗体、PD-L1 单克隆抗体或 CTLA-4 单克隆抗体的有益补充，增强其肿瘤免疫反应。NIR-PIT 药物中的有效载荷不是细胞毒性物质，而是水溶性酞菁衍生物(例如硅酞菁衍生物 IR700 (IRDye700DX)(128)(图 22A)。IR700是一种小的光活化分子，可被近红外光激发，无光毒性或生物毒性。当抗体与肿瘤表面抗原结合时，在近红外光的刺激下，IR700发生光诱导配体释放反应，释放亲水侧链，导致剩余部分的疏水性显著增加。这反过来会破坏细胞膜，引发针对癌细胞的快速、高选择性免疫原性细胞死亡(ICD)(图 22B)。NIR-PIT诱导的ICD在直接杀伤癌细胞的同时，可以导致癌细胞接近死亡的未成熟树突状细胞快速成熟，启动宿主的抗癌免疫反应，促进针对死亡癌细胞释放的抗原的CD8+ T细胞重新形成，进一步放大NIR-PIT的治疗效果。 图 22. IRDye700DX (128)的设计与分析。 (A) IRDye700DX (128) 的化学结构；(B) NIR-PIT ADC 的作用机理。 乐天医疗的西妥昔单抗沙罗他洛康于2020年以商品名Akalux获得PMDA加速批准，是一种由西妥昔单抗和水溶性硅酞菁衍生物IRDye700DX组成的抗体偶联药物，靶向表皮生长因子受体，用于治疗无法切除的局部晚期或局部复发性头颈癌，是全球首个获批的光免疫治疗药物。给药24h后，该药物可特异性聚集在EGFR阳性肿瘤细胞表面。使用690nm波长的近红外光照射肿瘤部位，诱导西妥昔单抗沙罗他洛康杀死癌细胞并激活免疫反应，在NIR-PIT药物研究中进展最快的是乐天医疗的ASP-1929(又名RM-1929)。ASP-1929是西妥昔单抗与IR700的结合药物，靶向表皮生长因子受体EGFR，可用于治疗无法切除的局部晚期或复发性头颈癌。除了ASP-1929，乐天医疗还有一款NIR-PIT药物，在临床前研究中与PD-1单克隆抗体联合在晚期肿瘤动物模型中表现出优异的抗肿瘤活性。其他一些NIR-PIT药物研究，包括131I(PcMAb)(CD38单克隆偶联NIR-PIT药物)、TROP-2-IR700、雷莫芦单抗-IR700、偶联物AvIR介导的PIT、抗TF抗体1849-ICG偶联物、MN-14-700DX、Avelumab-IR700等均以IR700为有效载荷。 作为ADC领域的“冷门赛道”，光免疫ADC的临床和市场前景尚需经过时间的考验，但基于相关原理开发新靶点和新型光激活效应分子或将成为ADC赛道新的突破点。 3.6.3. 双载荷ADC 随着 ADC 治疗耐药性的出现，将一种抗体与两种甚至多种不同的细胞毒性有效载荷结合为开发下一代 ADC 提供了一个有吸引力的选择。为了证明双有效载荷药物 ADC 的可能优势，Levengood 等在 2017 年制备了一类含有两种不同微管蛋白聚合抑制剂的 ADC，该团队将具有不同物理和化学性质的 MMAE 和 MMAF 与同一种抗 CD30 抗体结合，以发挥互补的抗癌活性。这项工作清楚地展示了一种构建强效双药 ADC 的潜在有效方法，以及如何递送多种细胞毒性有效载荷来提高 ADC 活性。后来，Kumar 等开发了一种异质三功能连接子，该连接子结合 MMAE 和 PBD二聚体有效载荷以产生双有效载荷药物 ADC。Nilchan 等使用双抗体结合方法，通过在工程硒化半胱氨酸和半胱氨酸残基位点特异性结合HER2 抗体，生成含有靶向微管蛋白有效载荷 MMAF 和 DNA 拓扑异构酶 II 抑制剂 PNU-159682 的双有效载荷 ADC。PNU-159682 由于其 DNA 损伤活性而导致 S 期细胞周期停滞，而 MMAF 同时抑制微管蛋白聚合并导致 G2/M 期细胞周期停滞。双药物 ADC 对 HER2 表达细胞系表现出选择性和强效细胞毒性，并表现出与所连接药物一致的双重作用机制。 ADC药物经常会遇到肿瘤内异质性的问题，例如乳腺癌通常由多种具有不同基因表达谱的细胞组成，其异质性是化疗后产生耐药、复发和转移的主要因素。为了解决这一问题，Kyoji Tsuchikama通过化学酶联法高效构建了一系列具有明确药物抗体比(DAR)的双有效载荷ADC(DAR组合分别为2+2、4+2和2+4)，并且DAR调节的灵活性有利于根据疾病靶点和有效载荷组合精细调节ADC的理化性质、疗效和毒性(图 23)，其中DAR为(4+2)的MMAE/MMAF双药ADC比DAR为4或6的MMAE单药ADC疗效更佳，且具有特异性的HER2细胞杀伤能力、理想的药代动力学性质、最小的炎症反应、治疗剂量下的边缘毒性。此外，在HER2异质性及T-DM1耐药性增加的JIMT-1/MDA-MB-231混合异种移植瘤小鼠模型中，双药有效载荷ADC比两种单药组合有更好的治疗效果和生存获益。原因可能是更强的MMAF分子杀死JIMT-1细胞，有助于结合的MMAE分子有效发挥对邻近的MDA-MB-231细胞的旁观者效应。重要的是，这种显著的疗效无法单独通过MMAF ADC和MMAE ADC的1：1组合来实现。双有效载荷 ADC 的增强疗效还在另一种乳腺癌的 hCC1954-TDR 异种移植小鼠模型中得到证实，这种乳腺癌具有低 HER2、肿瘤内异质性和 T-DM1 耐药性。结果凸显了双有效载荷 ADC 克服乳腺癌异质性和耐药性的潜力，表明同时递送两种具有不同药物特性的有效载荷是一种有希望的 ADC 治疗方法，可用于治疗具有异质性和耐药性的其他难治性癌症，这表明同时递送两种具有不同药物特性的有效载荷是一种有前途的方法。 剑桥大学的研究人员利用他们的Synthemer平台设计了一种双有效载荷ADC，它结合了MMAF羟丙基酰胺(AF-HPA)和DNA单烷基化剂(I-BiP)，表现出很强的细胞毒性，可以发挥两种作用机制。然而，虽然多有效载荷ADC药物可以提高疗效，降低耐药性的可能性，但它们治疗引起的副作用也值得考虑。例如，Mersana开发的靶向NaPi2b的新型ADC药物Upifitamab Rilsodotin(UpRi，XMT-1536)通过抗HER2单抗HT-19的切割连接子与MMAF结合(DAR=12)。XMT-1536具有极强的抗肿瘤活性，尤其是对HER2低表达的癌症，但卵巢癌中期I期临床数据显示，XMT-1536可引起严重的治疗相关副作用，发生率高达48% (47/97)，最常见的副作用为胃肠道梗阻(7%)，发热、肺炎、腹痛发生率为5%。虽然Mersana尝试降低剂量，但治疗窗选择范围较窄，前景不容乐观。因此，对于多有效载荷ADC，安全性控制是进行多类有效载荷组装时需要注意的重要问题，关键是找到并解决治疗窗口狭窄的原因，未来的研究也应继续朝着疗效和毒副作用之间的平衡方向发展。 图 23. 双有效载荷药物 ADC 的模式图(红色和绿色形状表示不同的有效载荷)。 3.6.4. PDC 的有效载荷 肽药物偶联物(Peptide drug conjugates, PDC)是一种新型靶向治疗方法，由连接子、归巢肽和细胞毒性有效载荷组成。与ADC药物相比，PDC药物具有分子量小、肿瘤穿透力强、免疫原性低、可采用固相合成大规模合成、生产成本低、药代动力学相对较好、批次产品相对均匀等优势，是继小分子靶向药物、单克隆抗体、ADC之后的新一代靶向抗肿瘤药物。但PDC作为治疗药物的应用也存在一定的局限性，如口服生物利用度低、半衰期短、部分有效载荷切割不完全导致生物活性与原型药物相比明显降低、靶向性可能不如ADC等。PDC的作用机制根据连接子和归巢肽的不同而不同，一种是PDC被内化并在细胞内释放有效载荷，另一种是在肿瘤微环境中PDC被切割，有效载荷被内化并发挥作用(图 24A)。大多数载荷不仅可以杀死靶标高表达的肿瘤细胞，还可以通过肿瘤微环境中的旁观者效应杀死周围靶标低表达或不表达的肿瘤细胞。多肽可影响PDC内化的效率，理想的PDC多肽应具有靶标结合亲和力强、稳定性高、免疫原性低、内化率高、血浆半衰期相对较长等特点。连接子的选择是PDC设计的关键因素之一，连接子需要平衡稳定性和释放效率，可切割的连接子释放效率较高，不可切割的连接子稳定性较高。载荷的毒性和理化性质可直接影响药物杀伤肿瘤的能力，从而影响其疗效，理想的载荷应具有细胞毒性高(通常IC50较低) 、免疫原性低、稳定性高、疏水性适宜、溶解性好等特点。 图 24. PDC 的关键结构和作用机制。 (A) PDC的一般作用机制；(B) 常见 PDC 有效载荷的化学结构。 PDC有效载荷可分为化学药物(图 24B)、蛋白质类药物、多肽类药物等，其中以化学药物和蛋白质类药物较为常见。常用的化学药物有DM1(2)、MMAE(8)、KSP抑制剂(45)、喜树碱(54)、阿霉素(129)、紫杉醇(130)、甲氨蝶呤(131)、柔红霉素(132)、吉西他滨(133)等；蛋白质类药物主要有干扰素和肿瘤坏死因子；放射性同位素也是PDC常用的有效载荷。PDCs用于癌症诊断时，可用正电子发射放射性同位素(氟-18(18F)、铜-64(64Cu)、镓-68(68Ga))标记，产生PET显像，通过与肿瘤细胞上的靶向受体结合，准确定位恶性组织；放射性同位素标记的PDC也可用于治疗。肽受体放射性核素治疗(PRRT)根据肿瘤细胞过表达的受体，对肿瘤细胞进行靶向和组织特异性放射，最常用的放射性同位素是铟-111(111In)、钇-90(90Y)和镥-177(177Lu)。 截至2023年4月，全球获批上市的PDC药物仅有两种，分别是Lutathera®和Pepaxto®。Lutathera®是诺华公司旗下Advanced Accelerator Applications SA开发的靶向生长激素抑制激素受体的PDC，进入细胞后释放放射性同位素177Lu，通过辐射损伤肿瘤细胞，于2017年9月首次获欧洲药品管理局(EMA)批准。在晚期神经内分泌肿瘤患者中，与高剂量长效奥曲肽相比，Lutathera®具有更长的无进展生存期和更高的反应率，于2018年1月26日获FDA批准。Pepaxto®是Oncopeptides公司开发的靶向氨基肽酶的PDC，由DNA烷化剂Melflufen(134)与氨基肽酶靶向肽共价连接。Melflufen 具有高亲脂性，可被骨髓瘤细胞快速吸收。一旦进入细胞，Melflufen 的结合肽立即被氨基肽酶切割，释放出亲水性烷化剂美法仑(Melphalan) (135)，造成肿瘤细胞DNA损伤，导致肿瘤细胞死亡。Pepaxto®于2021年2月首次获得FDA批准，与地塞米松联合使用，用于治疗成人复发或难治性多发性骨髓瘤。但同年10月，Oncopeptides公司宣布将Pepaxto®撤出美国市场，主要原因是验证性OCEAN研究中死亡率增加。2022年8月，Pepaxto®获得EMA批准。目前，全球共有17个PDC药物处于临床开发中，其中3个处于III期，9个处于II期，5个处于I期。PDC 是一种等效抗体-药物偶联物，克服了 ADC 的部分局限性，具有许多独特的优势。虽然目前上市的 PDC 药物较少，但曾出现过因严重安全性问题而退市的案例。但随着相关技术问题的解决和配套技术的突破，相信 PDC 药物也将成为未来十年拥挤赛道上研究和投资的热点。 4.结论 ADC药物开发前景广阔，因为它整合了特异性抗体以选择性靶向肿瘤细胞，结合了多种强效的细胞毒性有效载荷，并采用多样化的连接子技术来产生有效的癌症治疗药物。从技术角度来看，ADC药物至今已经历三代变革，在抗体、药物载体、连接子等方面均有突破，尤其是在有效载荷的使用上。 虽然新一代ADC载荷的特异性和细胞毒性比早期表现出了明显提升的特性，但目前的载荷仍然存在一些局限性： 首先，它们普遍对实体瘤的通透性和毒性有限，限制了它们在实体瘤中的应用。 其次，部分肿瘤对目前的ADC药物不敏感。 第三，载荷药代动力学的复杂性、肿瘤靶向性和释放不充分都会影响ADC药物的疗效。 第四，和其他抗肿瘤药物一样，ADC药物也会出现耐药性。 最后，早期的载荷选择往往是有毒但有效的药物，但它们较高的毒性限制了载荷的系统应用。 虽然抗体-药物偶联物在治疗中显示出有效性，与高毒性载荷的联用并不一定是极好的，因此其他类型的载荷如RNA抑制剂、免疫激动剂、促凋亡的Bcl-xL抑制剂等正在被开发。尤其是随着免疫检查点阻断疗法被FDA批准，肿瘤免疫治疗时代开始了。免疫激动剂ADC也被开发出来，其可以利用抗体将免疫激动剂运送到肿瘤微环境并局部释放，缓解免疫激动剂全身给药带来的严重毒性问题。免疫激动剂(如Toll样受体、STING激动剂等)作为新型载荷在ADC中也越来越受欢迎，免疫调节ADC有望进一步增强免疫检查点阻断疗法的抗肿瘤免疫应答。虽然免疫ADC尚处于发展初期，尚未取得满意的临床效果，但免疫调节ADC有可能大大拓宽ADC的治疗窗口，提高其抗肿瘤活性，并具有理想的安全性和有效性。相信通过免疫调节载荷修饰设计靶向肿瘤微环境的ADC仍是未来研究领域的热点，尤其是使用对细胞不直接有毒性的载荷(例如可以引导免疫系统攻击癌细胞的载荷)。此外，使用PROTAC分子作为ADC载荷，可以充分结合PROTAC的催化特性与ADC的组织特异性优势，并克服了传统靶向降解剂和ADC的局限性(如耐药性、毒副作用等)。鉴于其良好的效果，PROTAC-ADC是未来ADC药物开发的重要方向。抗体结合载荷还包括来自植物的蛋白衍生酶(例如皂苷、蓖麻毒素A链)或细菌毒素(PE、假单胞菌外毒素、DT、白喉毒素)，通过催化不可逆地抑制蛋白质合成来诱导细胞死亡。新型载荷类别还包括寡核苷酸、siRNA、蛋白质等。为了解决传统ADC载荷的不足，除了开发和修改传统和新型的潜在载荷外，ADC设计也出现了许多新策略。例如，通过将同一抗体与具有不相关机制的不同载荷相结合来设计ADC药物，可以通过最小化耐药性的可能性并同时针对不同的靶点实现协同效应，这为治疗具有异质性和耐药性的其他难治性癌症开辟了新途径，这对于实体瘤尤为重要。此外，在设计混合载荷时，应强调疗效和毒性之间的平衡。此外，通过使用抗体介导的靶向递送，由光激活化学物质作为载荷与特异性单克隆抗体组成的ADC可以实现较高的肿瘤特异性并能利用激光激活的生物物理机制精准诱导癌细胞快速死亡，避免对周围正常组织的伤害，实现精准治疗的要求，也是未来值得探索和期待的发展方向。 ADC虽然发展至今，但其可用的载荷骨架种类并未增加，大部分细胞毒性药物均为前核心骨架的衍生物，目前仅有有限数量的高细胞毒性天然化合物、衍生物或合成类似物有潜力作为ADC的载荷进入临床。虽然新颖的ADC载荷和指导ADC构建的新策略不断涌现，但这些还处于发展的初级阶段，未来的方向还需要通过更多的实验来验证。因此，在下一代ADC中，需要开发结构新颖的高效载荷(例如通过筛选天然产物库、化学合成、天然产物直接衍生化等方法提高活性和耐受性，有望获得结构简单、活性高、作用机制特殊的NAMPT抑制剂(具有多种作用机制、更高疗效和更少副作用的NAMPT抑制剂)。但新的骨架化合物的发现具有挑战性，需要在天然产物鉴定、高通量筛选或基于结构的药物设计等方面进行大量工作。相比之下，对已经获批或研究充分的有效载荷进行结构修改可以更快地识别新型有效载荷。在获得母核化合物后，应充分利用构效关系和晶体学技术，探索靶标与母核化合物的结合方式以及化合物的有效作用位点和有效功能团，才能高效地进行后续母核化合物的优化改造。在修饰有效载荷分子时，调整其理化性质，特别是极性，可以解决ADC制备和应用中的一些难题。连接过多的疏水性有效载荷分子会改变抗体的构象稳定性，增加其聚集沉淀的倾向，最终影响其最大DAR、血浆稳定性、旁观者效应等。疏水性有效载荷分子很容易穿透细胞膜，通过旁观者效应杀死周围的抗原阴性肿瘤细胞，而亲水性有效载荷分子从癌细胞中扩散出来的速度较慢。此外，大部分ADC面临的一大问题是毒副作用较大，其中载荷引起的毒副作用主要体现在对快速增殖的健康细胞的损伤，如淋巴细胞减少、胃肠道反应等。因此可以选择分子量小、组织穿透性好、半衰期短的载荷，释放后可以在靶位快速富集，快速发挥杀伤癌细胞的功能，同时在血液中药物分子可以被快速清除，有利于降低全身毒副作用。也可以对靶点的重要位点进行突变，进而修饰筛选出耐受性更好的化合物。 综上所述，新型ADC有效载荷与传统有效载荷存在一些区别： 1)传统ADC有效载荷多选择药理作用强但毒副作用也较大的小分子，例如PBD，而新型ADC有效载荷则倾向于选择药理作用中等、毒副作用较小的小分子，例如Dxd。 2)传统ADC有效载荷主要以微管抑制剂和DNA损伤剂为主，而新型ADC有效载荷相比传统有效载荷靶点类型更加丰富，选择更多，作用机制也不同，例如使用免疫刺激剂作为ADC有效载荷。 3)传统ADC小分子有效载荷结构一般复杂，合成难度大，新型ADC有效载荷倾向于选择结构简单、分子量较小的小分子，大大降低了合成难度，拓展了ADC有效载荷的应用市场。 4)传统ADC有效载荷一般采用单一类型的小分子化合物通过连接子直接连接抗体，而新型ADC可以组合不同类型的有效载荷，达到1+1>2的效果。除传统小分子化合物外，新型有效载荷还选取PROTAC、光活化分子等新型类型作为有效有效载荷。 虽然ADC药物发展至今，疗效也有了很大的提高，但仍然存在耐药性、不良反应、血液稳定性不够等问题亟待解决。有效载荷在ADC药物的疗效中占有重要的地位，因此结合相关的晶体结构和构效关系研究，对ADC小分子有效载荷及其未来趋势进行综述，旨在为ADC药物有效载荷的未来发展方向以及后续的优化改造提供更多新的参考，从而构建更多的ADC药物，提高其治疗效果，克服耐药性，减少不良反应，促进ADC药物研究的发展。 原文链接 Antibody–drug conjugates: Recent advances in payloads. Acta Pharm Sin B. 2023, 13(10): 4025-4059. doi: 10.1016/j.apsb.2023.06.015 免责声明：公众号推文基于已公开的资料信息撰写，用于传递最新热点资讯，在任何情况下，本文中信息或所表述意见均不构成对任何人的建议。如因版权等存在疑问，请于本文刊发30日内联系本公众号删除，更多精彩内容欢迎关注和分享公众号。 END 免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 OTC2024类器官前沿应用与3D细胞培养论坛圆满落幕，点击图片可查看会后报告，咨询OTC2025类器官论坛请联系：王晨 180 1628 8769

摘要:佐剂性和递送性是mRNA疫苗设计的两个关键方面。在现代mRNA疫苗中，佐剂功能被整合到mRNA疫苗纳米颗粒中，允许抗原mRNA和佐剂以统一的、一体化的形式共递送。在这种配方中，许多mRNA疫苗利用mRNA的免疫刺激性特性以及疫苗载体组分（包括脂质和聚合物）作为佐剂。然而，需要谨慎设计，因为过度的佐剂性和不当的先天免疫信号激活反而会阻碍疫苗效果并引发不良反应。mRNA疫苗还需要递送系统来实现在淋巴器官内的抗原呈递细胞（APCs）中的抗原表达。一些疫苗直接针对淋巴器官中的APCs，而另一些则依赖于APCs在摄取mRNA疫苗后迁移到引流淋巴结。本综述探讨了这些过程的当前机制理解以及基于这种理解正在进行的提高疫苗安全性和有效性的尝试。 1.引言 mRNA为疫苗提供了一个强大的工具。在传染病的情况下，一旦建立了mRNA递送平台，只需改变mRNA序列，疫苗就可以针对各种病原体。这一特性使得两种mRNA疫苗BNT162b2和mRNA-1273在由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）爆发后的一年内迅速获得紧急批准。这些疫苗在各种疫苗形式中展示了高效果，对控制大流行起到了关键作用。mRNA疫苗有效诱导中和抗体，有助于其在预防SARS-CoV-2感染方面的高效性。此外，mRNA疫苗还激发细胞免疫反应，这些反应比体液免疫反应更持久，更能抵抗病毒突变。细胞免疫可能在预防COVID-19的严重疾病和死亡中发挥关键作用。mRNA疫苗的广泛免疫原性，包括细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的诱导，也使其成为癌症疫苗的一个有吸引力的候选者。mRNA癌症疫苗通过针对共享的肿瘤相关抗原和来自每个患者基因突变的新抗原，在临床试验中显示出有希望的结果。新抗原疫苗的准备需要在识别癌症基因突变并预测合适的表位后迅速适应。在这方面，mRNA疫苗允许通过改变mRNA序列，简单地对应于每个患者中的突变蛋白，快速且方便地准备。从安全角度来看，mRNA在注射后一周内迅速降解，在体内持续存在的风险最小。最近的一项研究在人体样本中解决了这个问题，显示mRNA在接种后一个月内通过定量PCR（qPCR）检测不到。每年数十亿剂的可扩展性是另一个关键属性，特别是在大流行中。 早在1990年代中期就有关于针对传染病和癌症的mRNA疫苗的记录。然而，它们需要多年的研究和技术突破才能达到目前的临床成功，特别是在mRNA合成和递送系统领域。在前者中，mRNA的假尿苷修饰减轻了对mRNA的先天免疫反应，并提高了蛋白质翻译效率。其他关键技术包括添加5'帽和聚A尾，编码和非翻译区域的序列优化，以及去除体外转录mRNA的杂质。这些mRNA合成技术通过避免不良的炎症反应来提高mRNA疫苗的安全性，并通过增加抗原产生效率来增强疫苗效果。mRNA疫苗还需要递送系统来保护mRNA免受酶降解，将mRNA递送到APCs和淋巴组织，并促进mRNA在细胞内的运输到细胞质中的翻译位点。此外，最近的研究表明递送纳米颗粒作为免疫刺激性佐剂的作用。值得注意的是，在2010年代中期之前，大多数mRNA疫苗临床试验采用了体外mRNA递送后的APC移植。然而，体外策略需要在移植前进行临床级别的细胞培养的繁琐程序，限制了mRNA在癌症免疫疗法中的应用。最近的技术进步使得有效的体内mRNA递送成为可能，扩大了mRNA在传染病疫苗中的应用，并避免了癌症疫苗中繁琐的体外程序。在上述描述的mRNA疫苗的各种设计属性中，本综述关注两个问题：疫苗佐剂性和针对APCs和淋巴器官的递送系统，这在疫苗开发中尤为重要。同时，我们将读者重定向到其他综述中，以获得mRNA递送系统的一般描述，特定于COVID-19疫苗的主题，以及mRNA疫苗的临床概况。 2.佐剂性 2.1.佐剂性概述 免疫刺激性佐剂通过引发先天免疫反应，将抗原表达与适应性免疫诱导联系起来，从而提高疫苗效果的效率和持久性。在由重组蛋白或编码蛋白的核酸衍生的现代疫苗中，佐剂的作用变得越来越重要。值得注意的是，这些疫苗缺乏传统活减毒和灭活疫苗中存在的许多病原体相关分子模式（PAMPs），这些模式充当佐剂。在两种批准的mRNA COVID-19疫苗中，佐剂功能被整合到离子化脂质基脂质纳米颗粒（iLNPs）配方中，作为内置佐剂，而不是作为额外的佐剂补充。事实上，小鼠和人类对mRNA iLNPs的强烈先天免疫反应在疫苗功能中发挥着关键作用。iLNPs的脂质组分和mRNA分子都有助于mRNA疫苗中的佐剂性。内置佐剂方法允许mRNA疫苗的简单一体化配方，有助于平稳的临床转化。此外，一体化配方使得抗原mRNA和佐剂能够共递送到相同的APCs中，有效激活表达从递送的mRNA中得到的抗原蛋白的APCs。在这方面，重组蛋白疫苗的广泛研究表明共递送抗原和佐剂的好处。在一项开创性研究中，共包埋CpG DNA和卵清蛋白（OVA）的聚（D,L-乳酸-羟基乙酸共聚物）（PLGA）微球在诱导小鼠抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性方面优于分别包埋这两种组分的微球混合物。尽管佐剂在疫苗接种中起着关键作用，但佐剂性应该精确控制，以在最佳强度下激活适当的信号通路，因为过度和意外的佐剂性会带来安全问题，并对疫苗效果产生负面影响。本节提供了关于mRNA疫苗中佐剂性的机制理解和开发的观点。 2.2.当前mRNA疫苗的先天免疫反应 mRNA通过几种先天免疫受体触发先天免疫反应，包括内体内的Toll样受体（TLRs）和细胞质中的视黄酸诱导基因I（RIG-I）和黑素瘤分化相关蛋白5（MDA5）（图1(a)）。每个受体的首选配体分别是TLR3的>45碱基对（bp）双链RNA（dsRNA），TLR7,8的>20核苷酸（nt）单链RNA（ssRNA），MDA-5的几千bp dsRNA，以及RIG-I的>20 nt dsRNA，其在5'端有一个三磷酸基团。这些受体的主要适配分子分别是TLR3的Toll/白介素-1（IL-1）受体结构域包含的适配分子诱导干扰素-β（IFN-β）（TRIF），TLR7,8的髓样分化初级反应88（MyD88），以及MDA-5和RIG-I的线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）。这些分子最终触发I型IFN和其他促炎细胞因子的产生。此外，mRNA的5'帽结构对于区分自身和非自身mRNA至关重要。5'帽结构基于第一和第二核糖体的2'O-甲基化状态进行分类。在Cap0中，第一和第二核糖体中都没有2'O-甲基化，在Cap1中，只有第一核糖体有2'O-甲基化，而在Cap2中，第一和第二核糖体都有2'O-甲基化。在高等真核生物中，mRNA具有Cap1或Cap2结构，留下Cap0 mRNA主要被RIG-I识别为非自身。最近的一项研究表明，与Cap1结构相比，Cap2结构进一步降低了mRNA对RIG-I的亲和力。 图1. mRNA疫苗诱导的先天免疫。(a) 外源性RNA的受体及其信号通路。ppp-dsRNA：在5'端具有三磷酸基团的双链RNA。(b) 对iLNPs脂质成分的先天免疫反应的潜在机制。 体外转录mRNA中的杂质，包括未加帽和长dsRNA，引发强烈的先天免疫反应。体外转录制备的未加帽RNA在5'末端有一个三磷酸基团，刺激RIG-I。尽管包括CleanCap在内的最新技术已经提高了加帽效率，但在CleanCap mRNA制备过程中产生的少量未加帽RNA仍然显著激活先天免疫反应。事实上，CleanCap mRNA溶液的南极磷酸酶处理，去除未加帽mRNA杂质的5'三磷酸基团，显著降低了培养巨噬细胞中的细胞因子反应。这一结果突出了CleanCap mRNA中未加帽mRNA污染物的显著免疫刺激。长dsRNA是先天免疫的强烈诱导剂，是从体外转录过程中的RNA模板转录RNA制备的。在这个过程中，从DNA模板制备的预期mRNA链作为模板合成互补的非预期RNA链，导致长dsRNA的形成。如后文讨论的，这些杂质对先天免疫反应可能会极大地影响mRNA疫苗接种的结果，需要仔细讨论在免疫刺激杂质的背景下的疫苗接种效果。 尽管mRNA疫苗需要先天免疫反应作为佐剂，但过度的反应会带来安全问题，并负面影响疫苗效果，如后文所述。此外，对体外转录mRNA的细胞反应通过诱导全局mRNA降解和损害翻译启动，对mRNA的蛋白表达效率产生负面影响（图1(a)）。2'-5'-联腺苷酸合成酶（OAS）的mRNA识别和随后的RNase L激活导致大量细胞内ssRNA降解。此外，外源RNA通过激活RNA依赖性蛋白激酶（PKR）和磷酸化翻译启动因子2-α（eIF-2α）损害蛋白翻译的启动过程。因此，mRNA疫苗的开发需要控制细胞对体外转录mRNA的感知。为此，许多mRNA疫苗使用假尿苷（Ψ）或N1-甲基-假尿苷（1 mΨ）的核苷修饰，这减轻了对mRNA的先天免疫反应。此外，使用高效液相色谱（HPLC）消除长dsRNA，并通过南极磷酸酶去除未加帽mRNA的5'三磷酸也减少了mRNA杂质的免疫刺激。mRNA纯化的更近期技术包括具有光敏疏水标签的帽类似物，用于从未加帽mRNA中纯化加帽mRNA，以及为最小化dsRNA产生的工程化RNA聚合酶。这些方法可以通过增加抗原蛋白翻译和减轻促炎反应来提高mRNA疫苗的安全性和有效性。 在当前mRNA疫苗广泛使用的iLNP配方中，其脂质组分是先天免疫反应的主要诱导剂。事实上，不含mRNA封装的空iLNPs在小鼠局部注射后诱导了强烈的促炎反应。值得注意的是，在去除离子化脂质组分后，促炎反应几乎消失，表明离子化脂质在免疫刺激中的关键作用。离子化脂质在细胞外pH下呈中性电荷，在内/溶酶体pH下变为阳离子。因此，离子化脂质被认为比无pH响应的传统阳离子脂质的炎症性小，因为使用离子化脂质而不是阳离子脂质可能减少LNP与细胞膜的相互作用及其随后的膜损伤。相反，将iLNP中的离子化脂质替换为阳离子脂质减少了对纳米颗粒的先天免疫反应。几份报告提供了iLNP先天免疫激活的机制见解（图1(b)）。如后文所述，几种离子化脂质特别激活先天免疫受体，包括TLRs和细胞内干扰素基因刺激剂（STING）。此外，mRNA iLNPs和其他纳米颗粒的研究表明，溶酶体破裂，mRNA递送的一个重要细胞内过程，通过炎症体激活引发先天免疫反应。在注射部位受损细胞释放的损伤相关分子模式（DAMPs），包括DNA、RNA和蛋白质，也可能在iLNP递送后刺激先天免疫受体。事实上，最近的一项动物研究表明，在肌肉注射（i.m.）批准的COVID-19 mRNA疫苗BNT162b2后，包括双链DNA、高迁移率族蛋白盒（HMGB）1和尿酸在内的DAMPs血清水平急剧增加。在人类中，批准的COVID-19 mRNA疫苗诱导了强烈的局部反应，可能造成DAMPs的释放。 2.3.桥接佐剂性到疫苗效果 本节讨论先天免疫反应如何影响疫苗效果，重点关注iLNPs。最近的一项全面研究通过为各种受体准备基因敲除小鼠，调查了各种先天免疫受体在接种批准的COVID-19 mRNA疫苗BNT162b2后诱导体液和细胞免疫的参与情况。目标受体包括RNA感知途径中的TLR3、TLR7、RIG-I和MDA-5，炎症体中的NLR家族PYD结构域含有蛋白（NLRP）3和凋亡相关斑点蛋白含有C末端胱天蛋白酶募集结构域（ASC），以及TLR2、TLR4、TLR5、环状GMP-AMP合成酶（cGAS）和STING，其中一些是离子化脂质介导的免疫刺激的潜在靶分子。在这些基因中，只有MDA-5基因敲除显著降低了疫苗接种后刺突抗原特异性CD8+T细胞的频率。更准确地说，MDA-5基因敲除减少了IFN-α的分泌，这是MDA-5信号传导的下游分子，并阻止了树突细胞的激活。此外，IFN-α/β受体（IFNAR）1基因敲除也损害了刺突特异性CD8+T细胞的诱导。这些结果揭示了MDA-5和IFN-α在诱导CD8+T细胞反应中的关键作用。MDA-5可能识别mRNA疫苗配方中的dsRNA或作为DAMPs释放的受损细胞中的dsRNA。 然而，体液免疫诱导的途径更为复杂。上述任何先天免疫受体的基因敲除都没有降低刺突特异性抗体的效率。此外，只有在IFNAR1基因敲除后检测到刺突特异性抗体的最小减少。这一结果与人类研究的结果一致。该人类研究评估了COVID-19 mRNA疫苗在由于TLR7、IFNAR1或干扰素调节转录因子（IRF）7的固有缺陷或对I型IFNs的自身抗体而患有先天性和获得性I型干扰素信号传导缺陷的患者中的有效性。mRNA疫苗在这些患者中有效地诱导了中和抗体和记忆B细胞，水平与健康对照组相当。同时，几项动物研究提供了对体液免疫诱导至关重要的途径的见解。MyD88基因敲除，该基因编码许多TLRs的适配蛋白，显著抑制了使用mRNA iLNP疫苗接种后抗原特异性滤泡辅助T（Tfh）和生发中心（GC）B细胞的诱导。此外，编码Tfh细胞分化中关键细胞因子的白介素（IL）-6基因敲除也消除了疫苗效果。相比之下，RIG-I和MDA-5的适配蛋白MAVS基因敲除后，疫苗效果得以维持。另一项关于自扩增RNA（saRNA）的研究也证明了IL-6在小鼠疫苗接种中的作用，表明IL-6基因敲除损害了抗体反应和Tfh细胞及GC B细胞的诱导。与此同时，IL-6基因敲除后，saRNA疫苗对致命性流感病毒挑战的保护效果得以保留。这些研究表明，在诱导体液免疫反应的先天免疫信号传导途径中存在冗余，而TLRs和IL-6发挥主要作用。 在人类疫苗接种中，第二剂COVID-19 mRNA疫苗大幅增强了体液和细胞免疫，并同时引起了比第一剂更严重的全身反应原性。这一观察结果意味着，第二剂后负责反应原性的促炎分子可能也有助于增强适应性免疫。先前的一项研究评估了人类BNT162b2疫苗接种者血浆中67种细胞因子的概况。其中，IFN-γ显示出一个独特的概况，特别是在第二剂后急剧增加。小鼠模型也在第二次接种BNT162b2后复制了IFN-γ水平的急剧增加，伴随着巨噬细胞、单核细胞和树突细胞的激活。进一步分析揭示了CD4+和CD8+ T细胞在第二次接种后产生IFN-γ的显著贡献。有趣的是，IFN-γ受体中和抗体的给药减弱了巨噬细胞、单核细胞和树突细胞的激活，证明了IFN-γ在第二剂后的佐剂功能。然而，IFN-γ受体中和抗体对抗原特异性抗体产生和CD4+及CD8+ T细胞诱导的效率影响很小。因此，需要进一步的研究来解读COVID-19 mRNA疫苗的佐剂性机制。 2.4.脂质和mRNA的佐剂性 iLNP佐剂性的另一个关键问题是，脂质和mRNA组分中哪一个主要促进免疫刺激，以及每个组分激活的信号通路是什么。一项全面的机制研究通过比较空iLNP与封装修饰mRNA的iLNP来解决这个问题。有趣的是，两种配方在小鼠皮内（i.d.）注射后4和24小时引流淋巴结中产生的细胞因子和趋化因子水平相似，表明脂质组分在对iLNP的先天免疫反应中占主导地位。因此，两种iLNP都作为佐剂，并提高了重组蛋白疫苗的效率，使其比AddaVax（模仿临床上批准的MF59佐剂的角鲨烯佐剂）更有效地产生抗原特异性抗体。有趣的是，空iLNP的佐剂效应在MyD88和MAVS基因敲除后大多得以维持，但在IL-6基因敲除后减少。因此，空iLNP可能通过IL-6分泌发挥其佐剂性。然而，同一研究的详细分析揭示了mRNA对mRNA iLNPs的先天免疫反应的贡献，即使mRNA在化学上被修饰以最小化免疫刺激。当比较空iLNP和装载mRNA的iLNP对其作为佐剂以提高重组蛋白疫苗的效率时，MyD88基因敲除减少了装载mRNA的iLNP的体液免疫诱导，而不是空iLNP。这一结果表明，mRNA而不是脂质组分激活了MyD88。在另一项研究中，非人类灵长类动物（NHPs）肌肉注射和皮内注射后，只有装载修饰mRNA的iLNP，而不是空iLNP，在引流淋巴结中的树突细胞中诱导了I型IFN表达和树突细胞的成熟，揭示了mRNA在iLNP佐剂性中的关键作用。 随着未修饰mRNA的使用和较少免疫刺激性的mRNA递送载体，mRNA的佐剂性变得更加明显。在这方面，用于癌症疫苗临床试验的阴离子脂质体比iLNPs的免疫刺激性小。有趣的是，当装载未修饰的mRNA时，阴离子脂质体提供了强大的CTL活性，但相反，当装载1 mΨ mRNA时，诱导了抗原特异性免疫耐受。这些研究强调了未修饰mRNA的佐剂性，将免疫耐受疫苗转化为抗癌疫苗。在装载未修饰mRNA的阴离子脂质体中，TLR7和IFNAR1基因敲除，而不是TLR3、4和9，减少了疫苗接种后树突细胞、NK细胞、T细胞和B细胞的激活。这一结果表明，mRNA通过TLR7识别和随后激活I型IFN在未修饰mRNA的佐剂性中的贡献。 2.5.设计递送系统以改善佐剂性 迄今为止回顾的机制理解意味着改善mRNA疫苗的佐剂性的好处，促进了这一领域的积极研究（表1）。事实上，在某些情况下，佐剂性，而不是抗原表达效率，可能决定疫苗接种的效果，其中提供增强免疫刺激和较低抗原表达的疫苗比提供效率较低的免疫刺激和增强抗原表达的疫苗表现更好。在设计mRNA疫苗佐剂时，首选包含抗原mRNA和佐剂的一体化疫苗配方，允许抗原和佐剂的共递送。如上所述，重组蛋白疫苗的研究已经显示了共递送抗原和佐剂对强大疫苗接种的好处。此外，这种简单的疫苗配方在临床转化中是有利的。 一种策略是将佐剂和mRNA共封装到相同的纳米颗粒中。基于脂质的系统有两个选择：将水溶性佐剂封装在水相中，或将疏水性佐剂封装在脂质相中（图2(a)）。前者的方法是iLNP封装锰，这是STING途径的激活剂，在针对SARS-CoV-2的疫苗接种中显示出有希望的结果。在后一种方法中，R848，一个小分子TLR7/8激动剂，被结合到棕榈酸中以并入阳离子mRNA脂质复合物。该脂质复合物显示出强大的CTL诱导和抗癌效果。另一个例子是Pam2Cys，一个由半胱氨酸、硫甘油和两个棕榈酸链组成的TLR2/6佐剂，被并入iLNP，从而增强了细胞和体液免疫反应。其他系统使用了α-半乳糖神经酰胺，它在APCs上呈现后激活不变自然杀伤T（NKT）细胞，证明了它们在针对癌症和疟疾的疫苗中的效用。针对疟疾的疫苗靶向感染的肝细胞。 除了使用额外的佐剂外，将佐剂性纳入可离子化或阳离子脂质是脂质基疫苗的一个选项（图2(a)）。无需额外的佐剂，这种方法通过最小化成分来简化疫苗配方，可能有利于临床转化。佐剂脂质具有激活先天免疫反应和促进mRNA递送的双重功能。例如，具有环胺头基的可离子化脂质比具有线性胺头基的脂质更有效地诱导先天免疫反应和针对癌症的抗原特异性CTL活性。有趣的是，STING基因敲除消除了由环胺iLNP诱导的先天和适应性免疫反应，表明可离子化脂质中的环胺激活了STING。最近的一项研究在环胺和烷基链之间引入了可生物降解的酯类连接物，以促进佐剂环胺的清除，提高安全性。另一项研究开发了一种类似阳离子脂质的材料，激活TLR4。由此产生的基于脂质的疫苗在野生型小鼠中提高了细胞免疫，但在TLR4基因敲除小鼠中没有提高，证明了TLR4信号在疫苗中的参与。将现有的佐剂或其组分结合到可离子化脂质上是更直接的方法。最近的一项研究设计了一种与TLR7/8佐剂结合的佐剂可离子化脂质体，提高了细胞和体液免疫的诱导效率。另一项研究将维生素E（临床上批准的AS03佐剂的组分）引入可离子化脂质的疏水尾部。含有维生素E的可离子化脂质展现出增强的佐剂性，比含有肉豆蔻酸或油酸尾部的对照可离子化脂质更有效地诱导CTL反应。 在脂质基配方中使用无机系统是另一个具有递送和佐剂功能的双功能系统的例子。先前的一项研究设计了由mRNA负载的钙磷酸核心和脂质层涂层组成的纳米颗粒（图2(b)）。钙磷酸核心在细胞外环境中稳定纳米颗粒，但在细胞内释放Ca2+。由此产生的细胞内Ca2+浓度增加触发树突细胞成熟的信号。此外，钙磷酸核心可以与抗原mRNA共同封装PD-L1 siRNA，用于免疫检查点阻断，进一步增强癌症疫苗的效果。 聚合物基系统，作为一大类mRNA递送系统，与脂质基系统相比，在mRNA疫苗配方中的关注度较小。先前的一项研究比较了聚聚体和iLNP中saRNA的疫苗效果。有趣的是，装载saRNA的iLNP在肌肉注射后远远优于装载saRNA的聚聚体，在细胞和体液免疫诱导方面，尽管聚聚体比iLNP提供了更有效的抗原表达。一致地，iLNP在诱导IL-6（mRNA疫苗佐剂性的关键分子）的表达方面比聚聚体更强。因此，作者将其低疫苗效率归因于其低佐剂性，尽管其他因素，包括递送到淋巴组织的效率，也可能影响疫苗效果。 与此同时，一些聚聚体系统在疫苗接种中提供了有希望的结果（图2(c)）。在几项临床试验中使用的精蛋白/mRNA聚聚体利用未修饰mRNA的佐剂性刺激TLR7（图2(d)）。在这个系统中，与精蛋白的mRNA复合增加了先天免疫反应，但与裸mRNA相比，在小鼠皮内注射后降低了抗原表达效率。因此，控制mRNA和精蛋白的混合比例，以在注射溶液中包含游离mRNA和精蛋白/mRNA聚聚体，以同时获得抗原表达和佐剂性。在一项机制研究中，TLR7基因敲除几乎完全抑制了聚聚体给药后的IL-12分泌。此外，聚聚体通过TLR7基因敲除减少了其CTL诱导潜力，而不是TLR9基因敲除，突出了TLR7佐剂性在这种疫苗配方中的作用。在另一个例子中，硅纳米颗粒被聚(乙二醇)（PEI）涂层，随后PEI交联，mRNA装载和甘露糖涂层。然后，移除硅核心，提供中空核心糖胶囊（图2(e)）。甘露糖的功能是靶向树突细胞并激活树突细胞作为佐剂。结果，这个系统为癌症疫苗提供了强大的CD4+和CD8+免疫。最近的研究还展示了mRNA疫苗中佐剂性多阳离子的潜力（图2(c)）。例如，用于mRNA复合的200-kDa阳离子壳聚糖也作为佐剂，通过激活STING和炎症体，增强抗原特异性细胞和体液免疫。在另一项研究中，具有C18侧链的多阳离子由于其佐剂性激活树突细胞和有效的淋巴结迁移，展现了有效的癌症疫苗效果。一项关于亚单位疫苗的研究也揭示了多阳离子佐剂性。在这项研究中，PEI通过释放宿主细胞的DNA作为DAMPs，激活IFN调节因子-3信号，发挥其佐剂性。这些研究表明了聚合物基系统在疫苗接种中的潜力，这尚未被充分探索。如前所述，iLNP也产生DAMPs，这可能作为佐剂。同时，过量的DAMPs可能引发自身免疫性疾病。例如，通过自身DNA过度激活cGAS-STING途径可能会引起艾卡迪-古特雷斯综合症和共济失调毛细血管扩张症。疫苗开发需要考虑这些风险。 图2. 提高mRNA疫苗佐剂效应的策略。(a) iLNPs或其他脂质系统。(b) 含有磷酸钙核心的脂质载体。(c) 聚复合物。(d) 普罗胺/mRNA聚复合物。(e) 用甘露糖涂层的空心糖胶囊。(f) 设计用于提高佐剂效应的mRNA。用于增强佐剂效应的策略和组分用粗体标出。 2.6.设计mRNA以提高佐剂性 调节mRNA佐剂性提供了另一种改善疫苗效果的选项。这种mRNA佐剂方法包括添加编码免疫刺激性蛋白的mRNA，并利用RNA分子的内在免疫刺激性特性（图2(f)）。这些策略允许使用单一纳米颗粒配方共递送抗原mRNA和佐剂RNA。此外，佐剂RNA在注射后几天内经历酶促降解，避免长时间的免疫刺激。关于编码免疫刺激性蛋白的mRNA，一项开创性的研究将抗原mRNA与三种类型的免疫刺激性mRNA混合，编码CD40配体、TLR4的组成性活性形式和CD70。这种设计显著提高了与单独注射裸mRNA相比的抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞诱导和抗癌效果，在淋巴结内注射后。最近的研究证明了免疫刺激性mRNA在iLNP配方中的好处。例如，先前的一项研究通过筛选编码参与先天免疫信号传导的各种蛋白的mRNA物种，确定组成性活性STING mRNA是最有效的mRNA，能在小鼠中诱导CTL活性。另一项研究使用了编码C3d的mRNA，C3d是哺乳动物补体成分，能激活滤泡树突细胞和B细胞。C3d mRNA封装到iLNP中提高了抗原特异性细胞和体液免疫。 RNA分子，特别是dsRNA的内在免疫刺激性特性可以作为佐剂使用。在这方面，dsRNA的免疫刺激性特性可能对saRNA疫苗的疫苗效果产生积极或消极的影响。saRNA具有单链RNA病毒的复制机制，可以在宿主细胞内自我放大，提供抗原蛋白的持续表达。此外，细胞内增殖过程中的dsRNA中间体也可能增强细胞dsRNA受体的激活，以诱导先天免疫反应。这些特性使得使用低剂量的saRNA在动物和人类中进行有效的疫苗接种。然而，dsRNA中间体的持久性可能导致长时间的免疫刺激和PKR激活，可能在某些情况下对疫苗效果产生负面影响。事实上，IFNAR1或MAVS基因敲除提高了saRNA疫苗接种后体液或细胞免疫诱导的效率。此外，saRNA通过共表达MERS-CoV-2 ORF4a提高了其疫苗效率，该蛋白通过结合dsRNA抑制MDA-5和RIG-I的激活[86]，或天花病毒免疫逃逸蛋白阻断PKR和IFN-β的活性。 相反，使用dsRNA对先天免疫反应进行短暂刺激有助于改善mRNA疫苗以提高CTL活性。在这个策略中，dsRNA结构是通过将互补RNA与mRNA杂交到非复制mRNA中准备的（图3）。以前的研究评估了互补RNA与mRNA杂交在蛋白翻译效率和先天免疫反应方面的影响。当互补RNA靶向蛋白编码区域时，在与17 nt互补RNA杂交后翻译效率保持稳定（图3(a)），但在与23 nt或更长的RNA杂交后下降（图3(b)）。与mRNA杂交的短RNA在细胞内环境中特别被从mRNA上脱落，可能是通过翻译过程中蛋白质翻译机制的内源性解旋酶活性。这个过程可能允许从与17 nt互补RNA链杂交的mRNA中有效表达蛋白。关于佐剂性，23 nt或更长的互补RNA杂交，而不是17 nt互补RNA，增加了mRNA的免疫刺激性特性。同时，当靶向mRNA的非编码区域时，RNA杂交的影响是不同的。在先前的研究中，通过体外转录准备的120 nt poly U RNA与mRNA的120 nt poly A杂交。有趣的是，poly U杂交极大地增强了mRNA诱导先天免疫反应的能力，对翻译效率的影响最小（图3(c)），提供了具有佐剂性的mRNA的优秀配方。机制分析揭示了RIG-I在先天免疫激活中的主要作用。事实上，120 nt poly U RNA在体外转录时没有5'帽类似物，在5'端有一个三磷酸基团，是RIG-I的配体。在小鼠疫苗接种中，这种配方在淋巴结内裸mRNA的形式下增强了模型抗原mRNA的疫苗效果。然而，这个系统中的免疫刺激强度是不可控的。因此，后来的研究重新设计了这个系统，以实现对免疫刺激强度的微调。为此，通过17 nt互补RNA与mRNA杂交，准备了梳状结构的mRNA，精确设计了dsRNA牙齿以诱导RIG-I刺激。更重要的是，通过改变免疫刺激性牙齿的数量，这个策略使佐剂性的微调成为可能，以最大限度地提高疫苗效率，同时最小化不良反应。最终，这个系统提高了三种不同mRNA配方的CTL活性：阴离子脂质体、iLNP和聚乙二醇化聚聚体。 图3. mRNA与dsRNA佐剂杂交。展示了RNA杂交后的翻译效率和免疫刺激性。(a-c) 互补RNA与mRNA的编码区(a, b)和聚A区(c)杂交。(d) 梳状结构的mRNA与设计用于靶向mRNA编码区RIG-I的dsRNA杂交。 2.7.杰基尔和海德的佐剂特性 上述描述集中在mRNA疫苗中先天免疫反应的积极方面。然而，许多研究揭示了佐剂特性更为复杂的方面。例如，mRNA修饰在疫苗接种中提供了复杂的结果。像Ψ和1 mΨ这样的mRNA修饰减轻了对mRNA的先天免疫反应，即佐剂效应。未修饰的mRNA的佐剂效应对CTL诱导和抗体产生产生相反的效果。几项iLNP研究表明，未修饰的mRNA在诱导抗原特异性CD8+ T细胞反应方面优于修饰的mRNA。根据最近的一项研究，不含核苷修饰的抗原mRNA包裹在iLNP中，比包裹1 mΨ修饰的抗原mRNA更有效地诱导抗原特异性CD8+ T细胞，包括那些对颗粒酶B呈阳性的细胞，并更有效地激活肿瘤浸润性树突状细胞。结果，未修饰的mRNA在小鼠模型的癌症疫苗中优于修饰的mRNA，显示出有效的肿瘤体积抑制和延长小鼠存活时间（图4（a））。引人注目的是，在一项使用编码荧光蛋白的mRNA的报告试验中，未修饰的mRNA在淋巴结和脾脏的树突状细胞和巨噬细胞中提供的报告蛋白表达效率远低于1 mΨ修饰的mRNA（图4（b））。这些结果证明了未修饰的mRNA在诱导CTL反应方面的潜力，即使以牺牲抗原表达效率为代价。在机制分析中，未修饰的mRNA比修饰的mRNA更有效地激活脾脏树突状细胞，并且使用抗IFNAR1抗体的给药减少了未修饰的mRNA在疫苗接种中的好处。因此，未修饰的mRNA可能通过I型IFN途径发挥其佐剂效应。 图4. 1 mΨ修饰对癌症疫苗接种的影响。(a) 装载卵清蛋白（OVA）mRNA的iLNP被肌肉内注射到皮下携带表达OVA的B16F0肿瘤的小鼠中。评估了肿瘤大小。(b) 使用iLNPs肌肉内注射0、40、70和100% 1 mΨ修饰的mCherry mRNA。量化了淋巴结和脾脏中常规类型1和2树突状细胞（cDC1和cDC2）中mCherry表达的效率。版权所有© 2022 sittplangkoon, Alameh, Weissman, Lin, Tam, Prompetchara和Palaga。 相反，与iLNP一起传递的1 mΨ mRNA在产生抗原特异性抗体方面比未修饰的mRNA更有效，这表明未修饰的mRNA中佐剂效应的负面影响。一项全面研究调查了1 mΨ修饰对基于iLNP的流感病毒疫苗在小鼠中结果的影响。在i.d.疫苗接种后，1 mΨ mRNA在诱导抗原特异性CD4+ T细胞和抗体方面优于未修饰的mRNA（图5（a）），伴随着脾脏中Tfh和GC B细胞的增强产生。这些结果可能反映了未修饰的mRNA佐剂效应的负面影响。同时，1 mΨ mRNA比未修饰的mRNA产生了更有效和持久的报告蛋白表达（图5（b））。值得注意的是，1 mΨ修饰对蛋白表达效率的好处在器官和细胞类型之间有所不同，在脾脏免疫细胞中尤为明显，包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。因此，1 mΨ修饰的mRNA在免疫细胞中提供增强的抗原表达的能力也可能有助于其高疫苗潜力。最近的一项研究通过调查使用三种不同的iLNPs在小鼠和NHPs中1 mΨ修饰的效果，提供了关于先天免疫反应和抗体产生效率之间关系的机制见解。在研究中，1 mΨ修饰增加了抗体产生效率，并伴随着系统性趋化因子和细胞因子分泌的减少。更具体地说，在三种iLNPs中，两种在没有1 mΨ修饰的情况下诱导了大量I型IFN分泌的iLNPs，在1 mΨ修饰后获得了比其他iLNPs更大的疫苗效率好处，后者在没有修饰的情况下显示出最小的I型IFN反应。因此，I型干扰素反应可能是抑制疫苗结果的罪魁祸首。 图5. 1 mΨ修饰对传染病疫苗的影响。(a) 小鼠通过皮内注射使用iLNPs装载的未修饰或1 mΨ修饰的表达流感病毒血凝素（HA）的mRNA进行疫苗接种。评估了HA抑制滴度。(b) 在使用装载未修饰和1 mΨ修饰mRNA的iLNP皮内注射后评估荧光素酶表达效率。版权所有© 2018 Pardi等人。 mRNA杂质的免疫刺激也可能产生负面影响。在最近的一项iLNP mRNA疫苗研究中，C57BL6小鼠比BALB/c小鼠表现出更弱的体液免疫诱导。在这两种小鼠之间比较，C57BL6小鼠的树突状细胞产生的I型IFN比BALB/c小鼠多10倍以上。在使用HPLC从mRNA中去除dsRNA污染物后，C57BL6中的IFN产生被抑制，C57BL6小鼠中的抗体产生增加到与BALB/c小鼠观察到的水平相当。这些数据也表明了I型IFN对体液免疫诱导的抑制效应。在人类中，如上所述，I型IFN信号通路的缺陷并没有损害SARS-CoV-2 mRNA疫苗中的抗体产生。因此，人类的抗体产生可能不需要强烈的佐剂效应和I型IFN激活。从安全角度来看，1 mΨ修饰减轻了使用iLNP在NHPs中mRNA疫苗接种后系统性细胞因子和趋化因子的释放。因此，诱导最小I型IFN反应的mRNA疫苗配方可能在专注于体液免疫的疫苗中更实用。同时，也应注意到化学修饰的必要性仍然是有争议的。事实上，装载未修饰的mRNA的iLNP在NHPs中诱导了有效的体液免疫，其水平与临床批准的COVID-19疫苗装载1 mΨ mRNA的水平相当。 除了核苷修饰，I型IFN信号在CTL诱导中的作用提供了另一个复杂机制的例子，这些机制是佐剂效应的基础。值得注意的是，I型IFN信号根据疫苗接种途径对CTL诱导产生相反的效果。IFNAR1基因敲除或IFNAR1阻断抗体改善了局部给药后mRNA脂质复合物的CTL诱导效率，包括皮内(i.d.)、皮下(s.c.)和淋巴结内给药，显示出I型IFN信号对疫苗接种的负面影响。重要的是，即使没有从mRNA中大幅度提高蛋白表达效率，IFNAR1阻断也改善了疫苗接种效果。因此，除了抗原表达效率之外的机制，大概是I型IFN信号的过度佐剂效应，可能会损害疫苗接种效果。相反，IFNAR1基因敲除降低了系统性注射后CTL诱导的效率，显示出I型IFN佐剂效应的积极影响。根据对疫苗接种中I型IFN信号的后期机制研究，局部给药后的负面影响和系统性给药后的积极影响在条件性IFNAR1基因敲除的CD4+ T细胞中被消除，但在树突状细胞中没有。因此，I型IFN对CD4+ T细胞的作用可能解释了其在疫苗接种中相互矛盾的效果。 对于CD4+ T细胞的激活，I型IFN信号和抗原呈递的动力学在CD4+ T细胞的命运中起着关键作用。在抗原呈递给T细胞受体之前，I型IFN信号对T细胞具有抗增殖和促凋亡作用。另一方面，同时或延迟的I型IFN信号对T细胞具有增殖和抗凋亡作用。这种动力学上的差异可能解释了系统性给药和局部给药之间I型IFN的相互矛盾效果。系统性注射可能将mRNA直接送入脾脏树突状细胞，允许与I型IFN暴露相对快速和同时的抗原呈递，从而激活T细胞。另一方面，局部注射需要时间让组织残留的APCs迁移到淋巴器官。这可能会延迟抗原呈递，从而对T细胞功能产生负面影响。 最近的一项研究揭示了iLNP对先天和适应性免疫反应的长期影响，持续数周。有趣的是，预先注射装载非抗原mRNA的iLNP或空iLNP减少了2周后注射的后续iLNP疫苗产生抗体和GC B细胞的效果（图6(a,b)）。当预注射到疫苗接种的时间间隔从2周增加到8周时，抑制效果仍然存在，但程度较小。预注射降低了后续疫苗接种中mRNA iLNP的抗原表达效率，这可能有助于抑制效果。进一步的机制实验通过评估iLNP预注射对预防传染病的保护效果，调查了先天免疫在这种抑制效果中的作用。在这个实验中，接受装载非抗原mRNA的iLNP的小鼠在2周后被流感病毒和白色念珠菌挑战，其中先天免疫决定了对感染的易感性（图6(c)）。有趣的是，预注射对流感病毒（图6(d)）提供了保护效果，但加剧了白色念珠菌的感染（图6(e)）。iLNP预注射后血液中中性粒细胞水平的降低可能解释了白色念珠菌的结果，而涉及流感病毒挑战实验的机制尚不清楚。重要的是，两个结果都表明iLNP注射对先天免疫反应的长期影响对抗随后的传染病。通过显示iLNP对后续疫苗接种的抑制效果，这项研究可能具有临床意义。通过延长初次和加强剂量之间的时间间隔，提高了COVID-19疫苗在人类中的效力。初次剂量对加强剂量的抑制效果可能解释了这一临床结果。 图6. iLNP预注射对后续先天和适应性免疫反应的影响。(A-B) 装载非抗原mRNA (eGFP)、空iLNP (eLNP) 或PBS被皮内注射。两周后，注射装载血凝素（HA）的iLNP，随后在疫苗接种后两周评估疫苗效果。(a) 实验方案。(b) HA特异性抗体产生。(c-e) 注射装载非抗原mRNA的iLNP两周后，小鼠被流感病毒或白色念珠菌挑战。(c) 实验方案。(d, e) 流感病毒挑战后的病毒载量(d)和白色念珠菌挑战后的病毒载量(e)。版权所有© 2021 Qin等人。 总的来说，这一节提供了过度佐剂效应阻碍疫苗效果的例子，而佐剂效应是mRNA疫苗的重要组成部分，如前几节所描述的。免疫刺激的强度、信号通路和动力学可能部分解释了佐剂效应的杰基尔和海德特性，尽管需要进一步的机制研究来理解和控制佐剂效应的结果。 3.传递 3.1.传递概述 有效的疫苗接种需要在淋巴器官中表达抗原的APCs（抗原呈递细胞），包括淋巴结和脾脏，与T细胞和B细胞合作以诱导适应性免疫。mRNA疫苗在淋巴器官中的APCs实现抗原表达主要有两条途径（图7）。在一条途径中，mRNA疫苗在非淋巴组织给药后，残留的APCs在注射部位摄取抗原mRNA，然后通过淋巴管迁移到淋巴组织。这些过程需要数小时到数天。在APCs较少的组织中，这一途径需要mRNA疫苗引发的先天免疫反应触发免疫细胞向注射部位的浸润。将mRNA疫苗传递到富含APCs的组织，如皮肤组织，是利用这一途径的另一种策略。在另一条途径中，疫苗纳米颗粒通过淋巴管传递，直接将mRNA传递到淋巴组织中的APCs，这一过程需要数分钟到数小时。值得注意的是，淋巴管有对流以促进这一过程。这一途径需要具有适合淋巴运输的尺寸和表面特性的纳米颗粒。此外，靶向配体可以帮助疫苗在淋巴组织中的积聚和保留，并将疫苗传递给特定类型的免疫细胞。从安全角度来看，疫苗在淋巴器官中的保留对于避免疫苗分布到非淋巴器官、异位抗原表达和先天免疫激活至关重要。以下各节将从传递的角度讨论mRNA疫苗接种，重点关注传递途径和纳米颗粒设计（表2）。每个部分首先一般性地描述每种疫苗传递途径，然后专注于mRNA疫苗接种。 图7. iLNP mRNA疫苗肌肉内注射后的可能机制。在一条途径中，iLNPs迁移到淋巴结以在淋巴结中的APCs中提供抗原蛋白表达。在另一条途径中，免疫细胞浸润到注射部位并在摄取抗原后迁移到淋巴结。 3.2.非淋巴组织的传递 大多数临床可用的疫苗都是注射到肌肉或皮下组织，尽管这些组织中APCs很少。因此，需要浸润注射部位的APCs摄取疫苗并迁移到近端引流淋巴结，以促进适应性免疫反应的协调激活。或者，疫苗可能直接通过淋巴管传递到这些淋巴结。与皮下途径相比，肌肉内注射通常在注射部位的不良事件风险较低，并诱导更强的免疫反应。肌肉组织通常血管和淋巴循环更丰富，允许疫苗有效运输到淋巴结。这可能解释了肌肉内注射途径相对于皮下途径在疫苗接种中的优势。相比之下，皮下给药的疫苗倾向于在注射部位停留较长时间，大概是因为皮下脂肪组织的血管化有限和物质交换能力低。因此，皮下途径在疫苗接种中依赖于APC迁移到淋巴结，而不是疫苗迁移。 在mRNA疫苗引起广泛关注之前，其他领域的广泛研究已经讨论了疫苗纳米颗粒的物理化学特性如何决定它们在细胞间质给药后的命运。特别是，它们的尺寸和表面特性，如电荷和亲水性，是它们淋巴结转移的决定因素。尺寸在10到100纳米之间，更具体地说是20-50纳米的纳米颗粒，适合穿越细胞间质并进入和通过淋巴管。然而，尺寸在100-200纳米的纳米颗粒表现出较差的淋巴结迁移能力，因为大约100纳米大小的水通道限制了它们通过细胞间质的扩散和对流。尺寸超过200纳米的纳米颗粒停留在注射部位，并完全依赖于APCs的摄取和APC迁移到淋巴结以提供疫苗效果。相反，小于10纳米的纳米颗粒更倾向于进入血管而不是淋巴管，因为尺寸允许穿透血毛细血管壁。此外，血毛细血管中的流动大约是淋巴流动的100-500倍，有助于清除纳米颗粒。 关于纳米颗粒的表面特性，带正电荷的纳米颗粒被注射部位的负电荷细胞膜和细胞外基质所困。相比之下，带负电荷或未带电荷的纳米颗粒缺乏这种局部相互作用，可以穿过淋巴管传递到淋巴结，显示出在疫苗接种中的适宜特性。用包括聚乙二醇（PEG）在内的亲水性隐形材料涂层纳米颗粒表面，可以进一步提高纳米颗粒向淋巴结的迁移效率，因为这种表面与细胞间质的相互作用最小。有趣的是，纳米颗粒的PEG化使超过100纳米尺寸的纳米颗粒转移成为可能，如120纳米尺寸的阴离子脂质体和250纳米尺寸的阳离子脂质体，大概是因为PEG化可能改善了纳米颗粒的胶体稳定性，并减少了它们在注射部位细胞间环境中的非特异性吸附。同时，纳米颗粒表面的PEG密度需要优化。例如，含有1摩尔% DSPE-PEG2000的阳离子脂质体在淋巴结中的保留时间延长，并且比含有5摩尔% DSPE-PEG2000的APCs摄取增强，而两种脂质体都有效地迁移到淋巴结。另一项研究也揭示了PEG密度优化对最大化疫苗效力的重要性。针对APCs的配体，如甘露糖衍生物和针对DC40、CD11c和DEC-205的抗体，也可以提高传递效率到APCs。然而，这些方法增加了制造的成本和复杂性。考虑到APCs的高吞噬活性以及它们在淋巴结中的丰富性，一旦纳米颗粒到达淋巴结中的APCs，调整纳米颗粒的物理化学特性可能就足够了。 这些关于纳米颗粒疫苗的研究为mRNA疫苗的开发提供了基础。根据之前的一项mRNA研究，直接将裸mRNA疫苗注射到淋巴结中可以产生强大的CTL反应，而裸mRNA疫苗在其他传递途径中，包括皮内、皮下和近淋巴结注射，未能诱导出可检测的疫苗效果。淋巴结内裸mRNA注射在针对新抗原的癌症疫苗的临床试验中也显示出有希望的结果。这些研究强调了在淋巴结中获得抗原表达的重要性。然而，淋巴结内注射需要在超声成像的指导下进行繁琐的操作，阻碍了广泛的临床应用。相比之下，在普通医疗护理中进行的局部注射，如皮下和肌肉内注射，针对的是非淋巴组织。因此，mRNA疫苗应该具有在传递到非淋巴组织后在淋巴组织中的APCs诱导抗原表达的功能。促进mRNA疫苗和APCs向淋巴结迁移是实现这一目的的两条主要途径（图7），而这两个途径通常无法区分。 有趣的是，mRNA iLNP在肌肉内注射后在引流淋巴结中有效地产生表达抗原的APCs，这可能有助于批准的COVID-19 mRNA疫苗的高效性。之前的一项研究通过正电子发射断层扫描-计算机断层摄影术跟踪了NHPs中放射性标记的iLNP。肌肉内注射后4小时内，iLNP在距离注射部位远达9.2厘米的淋巴结中提供了强烈的信号。其他研究通过观察小和大动物肌肉内注射iLNP后mRNA分布和报告蛋白表达，进一步深入了解了局部传递后mRNA iLNP在细胞水平上的过程。iLNP诱导免疫细胞浸润到注射部位，并在浸润的免疫细胞以及残留的成纤维细胞和脂肪细胞中提供报告蛋白表达。报告蛋白表达在注射后8小时在引流淋巴结中有效观察到，但在非引流淋巴结中未观察到。表达水平逐渐下降，但在注射后7天仍高于检测限。在淋巴结中的各种细胞类型中，位于被膜下和髓质窦的巨噬细胞表现出强大的报告表达，而树突状细胞和单核细胞的表达效率较低，T细胞和B细胞中几乎检测不到。巨噬细胞可能作为APCs通过与T细胞和B细胞的相互作用来触发强大的适应性免疫。值得注意的是，人类引流淋巴结在肌肉内疫苗接种后也显示出疫苗mRNA和抗原蛋白表达的有效积累。尽管上述研究没有精确区分在淋巴结中获得抗原表达的两条途径，即iLNP和APCs的迁移（图7），但iLNP在远处淋巴结的快速积累意味着iLNP迁移的贡献。此外，iLNP在全身器官中诱导了强大的蛋白表达，包括肝脏和脾脏，大概是通过iLNP迁移而不是APC迁移，突出了iLNP在注射部位以外传播的潜力。 几项研究试图进一步区分这两条途径的贡献。为了这个目的，最近的一项研究准备了一个在注射部位具有高效抗原蛋白表达效率而在引流淋巴结中效率低的系统。mRNA和空iLNP的混合物在肌肉内注射后在注射部位提供了可比较的蛋白表达水平，但与装载mRNA的iLNP相比，在引流淋巴结中的水平要低得多。值得注意的是，与装载mRNA的iLNP相比，mRNA和空iLNP的混合物在诱导体液和细胞免疫方面的效率要低得多。这些结果表明，淋巴结中抗原表达在疫苗接种中的重要贡献。尽管这项研究无法精确区分iLNPs和APCs的迁移，但可以合理假设装载mRNA的iLNP可能比mRNA和空iLNP的混合物更有效地将抗原mRNA传递到淋巴结。因此，结果表明iLNP迁移到引流淋巴结在疫苗接种中的重要角色。考虑到纳米颗粒的大小对其淋巴结迁移效率的影响，mRNA iLNPs的大小也可能影响其疫苗结果。在这种情况下，之前的一项研究使用小鼠中的135批iLNP进行回顾性研究，显示了抗体产生效率和iLNP大小之间的明确相关性。这一结果支持iLNP迁移到淋巴结在疫苗接种中的参与。同时，这种相关性在NHPs中变得不那么明显，这可能反映了小鼠和NHPs之间淋巴系统解剖学的差异。 另一项研究比较了iLNP、阳离子纳米乳和阳离子脂质体的疫苗效果，揭示了每种配方的目标细胞类型影响体液和细胞免疫的诱导效率（图8(a)）。肌肉内注射后，与其他配方相比，iLNP产生了更高水平的抗体产生，但细胞免疫水平较低（图8(b)）。在报告试验中，阳离子脂质体在小鼠的引流淋巴结中诱导蛋白表达的效率比其他配方更高。在培养细胞实验中，iLNP在蛋白表达方面对肌细胞的偏好超过了树突状细胞。相反，阳离子纳米乳和脂质体在树突状细胞中显示出高效的蛋白表达。基于这些结果，作者假设阳离子脂质体在淋巴结中的有效积累和有效的mRNA传递到树突状细胞有助于细胞免疫的强烈诱导。相比之下，iLNP可能主要在肌细胞中提供蛋白表达，然后APCs摄取肌细胞释放的抗原。这一过程可能更倾向于诱导体液免疫。重要的是，非APCs中的抗原蛋白表达以几种模式对疫苗结果做出贡献。当mRNA编码分泌性抗原时，APCs可以摄取非APCs分泌的抗原。在质粒DNA（pDNA）疫苗的研究中，编码分泌性OVA的pDNA在肌肉内和皮内裸注射后产生的抗OVA抗体水平比编码膜结合或细胞质OVA的更高，显示了抗原分泌的好处。同时，在mRNA iLNP疫苗中，编码细胞相关和分泌性血凝素（HA）的mRNA显示出可比的抗HA抗体产生，表明在这种情况下抗原分泌的作用边缘化。在另一种模式中，非APCs的细胞碎片也可以在疫苗接种后表达抗原的非APCs受损时向APCs提供抗原。 图8. 不同mRNA疫苗配方的接种效果。(a) mRNA疫苗配方。(b) 针对SARS-CoV-2尖峰蛋白的受体结合域（RBD）的每种疫苗配方诱导的体液和细胞免疫。版权所有© 2022 Shi等人。 一些研究表明mRNA疫苗不需要迁移到淋巴组织就能有效地进行疫苗接种。最近的一项研究对裸saRNA进行了皮内注射，该saRNA优选在皮肤温度范围（30-35°C）内复制，但在体温或超过37°C时变得失活。裸RNA分布在注射部位以外的其他器官是不可能的，因为在迁移到其他器官的过程中裸mRNA可能会被降解。此外，其他组织中非最佳温度限制了saRNA仅在皮肤中复制。即使仅在皮肤中表达抗原，这种疫苗配方也能诱导强大的细胞免疫。另一项研究表明，即使阳离子纳米乳基saRNA疫苗的分布最小化到淋巴结或其他器官，也能通过强烈的体液免疫诱导。在saRNA疫苗中，saRNA附着在纳米颗粒的表面，与脂质层内装载mRNA的iLNP相反。该研究比较了阳离子纳米乳和iLNP之间的生物分布和疫苗效果。在小鼠肌肉内注射后，纳米乳主要将蛋白表达限制在注射的肌肉中，而iLNP在引流淋巴结和肝脏中提供了强烈的蛋白表达。然而，纳米乳比iLNP诱导了更强烈的体液免疫反应，表明迁移到淋巴结在疫苗接种中并非不可或缺。值得注意的是，纳米乳的这种局部分布有助于避免全身炎症反应，而iLNP诱导了全身细胞因子释放和体重减轻。 值得注意的是，最近的一项研究揭示了NHPs中mRNA iLNP的大量系统分布，在肌肉内注射后在脾脏、肝脏和血浆中检测到注射的mRNA。这种系统分布可能在人类中引起安全问题，包括罕见的自身免疫性肝炎和心肌炎病例。自身免疫性肝炎的人类研究揭示了针对肝脏中尖峰蛋白的CD8+ T细胞的存在。这一结果表明，T细胞可能在mRNA疫苗接种后攻击表达尖峰蛋白的肝细胞。关于心肌炎，对mRNA疫苗接种后死亡的患者进行的mRNA分布调查揭示了在几位患者的心肌中存在疫苗衍生的mRNA。有趣的是，这些患者的心脏部分可视化显示心脏损伤的证据，有巨噬细胞浸润，而这种变化在心脏中未检测到疫苗mRNA的患者中要少得多。这些结果暗示了心肌炎和iLNP分布到心脏之间的因果关系。 尽管这些研究强调了mRNA疫苗系统分布的潜在安全风险，但mRNA疫苗更倾向于超越注射部位到淋巴器官。因此，研究人员试图开发能够迁移到引流淋巴结而不发生系统泄漏的mRNA疫苗配方。例如，之前的一项研究筛选了基于引流淋巴结中蛋白表达水平的iLNP配方，使用了一组可电离脂质和具有不同混合比例的四种脂质成分的iLNP。与BNT162b中使用的iLNP相比，最佳iLNP在淋巴结中提供了增强的蛋白表达，并最小化了肝脏或其他系统器官中的表达。另一项研究通过使用大约100 nm（小）、180 nm（中）和330 nm（大）大小的iLNP来调查iLNP大小的影响，从而提供了机制上的见解。肌肉内注射后，小型和中型iLNP从注射部位泄漏出来，在肝脏中积累并提供了强烈的蛋白表达，而大型iLNP显示出从注射部位的最小泄漏。 使用iLNP以外的传递系统也可能减少mRNA疫苗的系统泄漏，因为iLNP在肝脏积累中具有积极机制。血液中的载脂蛋白E（ApoE）与iLNP结合，通过肝脏中的低密度脂蛋白受体促进其被肝细胞吸收。没有这种积极机制，一些脂多聚复合物和多聚复合物避免了在肝脏中的积累，但允许有效地传递到淋巴器官，实现安全有效的疫苗接种。脂多聚复合物的研究比较了其分布与肌肉内注射后iLNP的分布（图9(a)）。脂多聚复合物在淋巴器官中，包括淋巴结和脾脏中，提供了有效的荧光素酶表达，而在肝脏中的表达最小，而肝脏是iLNP注射后表达荧光素酶的主要器官（图9(b)）。在脂多聚复合物注射后的定量PCR评估中，83%的mRNA停留在注射的肌肉中，其余的mRNA主要分布在血液中，只有0.06%分布在肝脏中（图9(c)）。这些结果表明了脂多聚复合物有利的分布概况。这种脂多聚复合物在小鼠和NHPs中诱导了针对SARS-CoV-2的强大疫苗接种，显示出对感染的保护效果。疫苗显示出可接受的安全性概况，全身细胞因子释放和白细胞的短暂增加。 图9. 脂多聚复合物的生物分布。(a) 脂多聚复合物的制备。(b) 脂多聚复合物和装载荧光素酶mRNA的iLNP肌肉注射后的荧光素酶表达分布。(c) 通过qPCR评估脂多聚复合物注射后的mRNA分布。饼图显示了每个器官中累积的mRNA拷贝数。版权所有© 2021 Yang等人。 3.3.皮内传递 与肌肉和皮下组织相比，皮肤是一个高度免疫原性的组织，为疫苗接种提供了一个有吸引力的场所。表皮中的免疫相关细胞包括角质形成细胞、APCs（如朗格汉斯细胞）、真皮树突状细胞和巨噬细胞，以及特定的T细胞亚群，它们共同作用于触发先天和适应性免疫。角质形成细胞占表皮细胞的80%，它们表达一系列模式识别受体，并通过分泌促炎细胞因子（IL-1α、IL-1β、IFN-α、IFN-β和G-CSF）以及促进朗格汉斯细胞迁移和分化的细胞因子（IL-6、IL-10、IL-18和TNF-α），为发展免疫原性环境做出贡献。朗格汉斯细胞和真皮树突状细胞擅长捕获抗原并迁移到引流淋巴结进行抗原呈递，从而激活适应性免疫反应。真皮环境富含血管和淋巴管，吸引免疫细胞并促进它们在对促炎刺激的反应中进入淋巴流动，允许疫苗有效地传递到淋巴结。 真皮组织作为免疫器官的这些有利特征促使多年来开发皮内mRNA疫苗。早期的动物研究已经证明了皮内普罗胺/mRNA疫苗针对传染病和癌症的潜力。皮内普罗胺/mRNA疫苗还在癌症疫苗的人类临床试验中提供了可检测的抗原特异性T细胞反应。此外，针对狂犬病病毒糖蛋白的皮内喷射普罗胺/mRNA疫苗在人类中诱导了强大的中和抗体和CD4+ T细胞反应，没有严重的安全问题。皮内给药途径即使在裸mRNA疫苗中也显示出其临床潜力。在一项临床试验中，使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）作为佐剂的裸mRNA疫苗针对几种肿瘤相关抗原，通过诱导对抗原有反应的CD4+和CD8+ T细胞，减缓了一些患者的肾癌进展。最近，BNT162b2和mRNA-1273，这两种基于iLNP的COVID-19疫苗在临床上被批准用于肌肉内给药，它们在临床试验中被测试了皮内注射的潜力。皮内注射10μg或20μg的mRNA-1273产生了几乎与肌肉内注射100μg mRNA相当的尖峰特异性抗体，表明皮内给药在剂量节省方面的潜力。BNT162b2的临床研究评估了作为灭活疫苗接种者的增强剂量的疫苗接种结果。在这些研究中，皮内注射五分之一剂量和肌肉内注射全剂量诱导了几乎相当的针对尖峰蛋白的体液和细胞免疫反应。值得注意的是，与全剂量注射BNT162b2相比，五分之一剂量的皮内疫苗接种减轻了系统性反应原性。 一项机制研究使用NHPs对皮内和肌肉内mRNA疫苗接种进行了详细比较。在针对流感病毒的基于iLNP的mRNA疫苗中，皮内途径在产生抗原特异性抗体和CD4+记忆T细胞方面优于肌肉内途径。皮内和肌肉内iLNP给药都导致循环中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞浸润到注射部位。值得注意的是，皮内给药刺激了CD209+残留真皮APCs的增殖。有趣的是，在皮内传递荧光标记的装载报告蛋白mRNA的iLNP后，CD1a+和CD209+真皮APCs有效地摄取了iLNP，提供了长达9天的报告蛋白表达，激活表达CD80，并迁移到引流淋巴结。这些真皮APCs可能增强了皮内传递后的疫苗效果。最近的一项研究评估了使用敲除这些细胞类型的小鼠在接种装载saRNA的iLNP后朗格汉斯细胞和常规类型1树突状细胞（cDC1）的贡献。缺乏这两种细胞类型的小鼠表现出血清中疫苗特异性抗体诱导和引流淋巴结中Tfh和GC B细胞反应受损（图10(a)）。有趣的是，那些只缺乏一种细胞类型的小鼠没有表现出疫苗效果受损，表明朗格汉斯细胞和cDC1s在mRNA疫苗接种中的冗余作用。同一研究还通过评估有无中性粒细胞耗竭的疫苗效果，探索了中性粒细胞在疫苗接种中的作用。中性粒细胞耗竭并没有显著减少Tfh和GC B细胞反应和抗体产生（图10(b)），表明在皮内mRNA疫苗接种中浸润中性粒细胞的较小贡献。如图7所示，mRNA疫苗有两种机制来获得APCs在淋巴结中的抗原表达：组织残留APCs迁移到淋巴结和mRNA疫苗纳米颗粒的迁移。在这种情况下，本节中的皮内疫苗接种研究表明，通过展示真皮组织残留APCs的关键作用，前一种机制做出了巨大贡献。同时，并非所有mRNA疫苗都受益于皮内给药途径。例如，以前的saRNA疫苗报告显示，皮内途径提供了与肌肉内途径相当或效率较低的疫苗效果。其他因素，包括抗原蛋白表达的效率、saRNA生物分布和佐剂效应，可能是这些设置中疫苗接种结果的决定因素。 图10. 朗格汉斯细胞（LCs）和常规树突状细胞1（cDC1）在皮内mRNA疫苗接种中的作用。使用iLNPs皮内注射表达HA的mRNA。(A) 在野生型（WT）小鼠或缺乏一个或两个LCs和cDC1的敲除小鼠中的抑制滴度。(B) 在疫苗接种前用中性粒细胞耗竭抗体（1A8）注射的WT小鼠中的抗体水平。版权所有© 2022 Ndeupen等人。 皮内疫苗接种途径在临床设置中面临技术困难和注射不准确的问题。这一问题促使了新的注射方法和设备的开发。其中，喷射注射器在狂犬病毒的临床试验中被使用。有趣的是，普罗胺/mRNA多聚体的喷射注射，而不是多聚体的针头注射，在人类中诱导了可检测的抗体产生。这一结果揭示了喷射注射改善疫苗效果的额外好处，大概是通过提高多聚体的传递效率。 微针提供了另一个有希望的皮内疫苗接种选择。例如，裸mRNA和脂质mRNA载体在用空心微针注射后在猪皮中提供了有效的报告蛋白表达，这种微针允许从每个针尖的孔中注入液体。最近的一项研究开发了由可溶解聚合物基质组成的微针，其中包含mRNA iLNP。微针在插入皮肤后30分钟内溶解以释放iLNP。这一系统在水平上显示出与相同iLNP的肌肉内注射相当的强大疫苗效果对抗SARS-CoV-2。此外，该系统可以在室温下耐受6个月的储存，储存后蛋白表达效率没有显著下降。 3.4.系统性传递 通过静脉注射进行的系统性给药提供了一条有效的途径，可以达到全身的器官或组织。与其它注射途径相比，其低侵入性、技术简单性和普遍适用性也具有吸引力。值得注意的是，通过系统性给药的重组蛋白癌症疫苗在治疗黑素瘤和结直肠癌方面显示出高疗效。在目标器官中，脾脏和淋巴结作为富含免疫细胞（包括T细胞、B细胞和树突状细胞）的二级淋巴器官，在疫苗接种中发挥关键作用。特别是，疫苗的主要靶器官是静脉注射的脾脏和局部给药的淋巴结。 多年来，除了mRNA疫苗领域外的研究已经解决了控制系统给药纳米颗粒生物分布的一个艰巨挑战。纳米颗粒的物理化学属性决定了它们在系统给药后的生物分布。例如，纳米颗粒应具有直径大于6纳米或分子量大于50 kDa，以避免通过肾脏肾小球滤过快速清除。尺寸在10到200纳米之间的纳米颗粒优先在肝脏中积累，肝脏是一个主要的清除器官。这一尺寸范围与肝脏窦状内皮细胞中的孔径（50-200纳米）和Kupfer细胞的大小依赖性吞噬活性一致。此外，肝脏窦状内的慢血流促进了纳米颗粒对窦状壁的捕获，肝脏的重量也是一个导致纳米颗粒在肝脏中积累的原因。疫苗纳米颗粒应避免这些清除和清除机制，以改善脾脏靶向。用生物相容性亲水性聚合物，如PEG或两性离子聚合物，涂层纳米颗粒表面，可以有效地减少纳米颗粒的肝脏摄取。PEG化肝脏窦状内皮壁，而不是纳米颗粒，也可以抑制纳米颗粒在肝脏中的积累。脾脏通过脾脏窦隙的内皮缝隙物理捕获大于200纳米的纳米颗粒，这些缝隙过滤血液成分，而微米级聚集体则受到肺微血管的捕获。此外，将纳米颗粒的表面电荷从正变为负或用亲水性聚合物修饰它们可以显著改善它们对脾脏的选择性。总的来说，略大于200纳米的大小、阴离子表面和亲水性隐形涂层可能是适合脾脏靶向的属性，而脾脏APCs的靶向配体可以进一步增强纳米颗粒在脾脏中的积累。 在mRNA疫苗领域，一项开创性研究已经证明了系统性mRNA疫苗在动物实验和人类临床试验中对抗癌症的效用。在该研究中，具有不同表面电荷的脂质体，通过改变mRNA和阳离子脂质体的混合比例制备，基于它们在系统注射到小鼠后在脾脏中的mRNA传递效率进行筛选。在报告试验中，用mRNA对阳离子脂质体的过量电荷比制备的阴离子脂质体，有效地将mRNA传递到脾脏、淋巴结和骨髓中的CD11c+树突状细胞，提供蛋白表达。这一系统在几种小鼠癌症模型中展示了有效的治疗效果，并在人类中诱导了可检测的抗原特异性T细胞。随后的临床试验通过靶向肿瘤相关抗原和新抗原展示了这一系统的强大的抗肿瘤效果。人类中的荧光-2-脱氧-2-D-葡萄糖正电子发射断层扫描（FDG-PET）显示，在这一阴离子脂质体传递后，脾脏中葡萄糖摄取选择性增加（图11），表明这一系统在人类中也成功地靶向脾脏。 图11. 通过系统给药使用脂质体靶向人类脾脏。在使用阴离子脂质体进行静脉疫苗接种后的人体中进行18F-2-脱氧-2-D-葡萄糖正电子发射断层扫描。脾脏被圈出。版权所有© 2018 Pektor等人。 这一临床成功正在促进针对脾脏的mRNA传递系统的开发。例如，向mRNA iLNP中添加阴离子脂质将iLNP从肝脏重新定向到脾脏，而iLNP具有肝脏的内在亲和性。随后的机制研究表明，添加阴离子脂质改变了血液循环中附着在iLNP上的蛋白质冠的组成，这可能决定了iLNPs的组织亲和性。同样，来自报告mRNA和聚阳离子的聚复合物在小鼠静脉注射后选择性地在脾脏和淋巴结中提供报告蛋白表达（图12(a)）。聚阳离子具有两性离子结构，向阳离子侧链添加了带负电荷的磷酸基团。在淋巴结中，CD4+ T细胞和巨噬细胞有效地表达了报告蛋白（图12(b)）。尽管阴离子纳米颗粒经常用于mRNA疫苗中靶向脾脏，但一种称为两亲性碳点的阳离子纳米颗粒也展示了选择性mRNA传递到脾脏。 图12. 使用聚复合物在小鼠中靶向淋巴组织。系统性注射编码荧光素酶（a）和tdTomato（b）的报告mRNA。（a）荧光素酶表达的分布。（b）淋巴结中表达tdTomato的细胞类型。版权所有© 2021美国化学会。 碳点是通过将疏水烷基链结合到基于多胺的纳米颗粒上制备的。通过体外筛选选出的两种碳点配方在系统注射后评估了其体内功能。其中一种实现了对脾脏的选择性mRNA传递，在癌症疫苗中诱导了有效的抗肿瘤活性。总的来说，这些系统利用纳米颗粒的物理化学属性进行脾脏靶向。然而，在大多数系统中，靶向的确切机制仍然不清楚，阐明这些机制将有助于未来合理设计脾脏靶向系统。 除了依赖于物理化学属性的策略外，配体基础系统也被追求作为一种实现细胞水平精确靶向的策略。一项开创性的研究将甘露糖配体附着在脂多聚复合物上，这增加了mRNA传递到脾脏树突状细胞的效率4倍。在应用于靶向肿瘤相关抗原的癌症疫苗时，脂多聚复合物显示出有效的抗肿瘤效果。然而，脂多聚复合物在脾脏以外的器官中诱导了蛋白表达，包括肝脏。为了提高对脾脏树突状细胞的选择性，随后的研究使用三甘露糖而不是单甘露糖作为配体。结果，三甘露糖脂多聚复合物将mRNA专门传递到脾脏，并在其他器官中最小化了传递mRNA的蛋白表达。此外，在小鼠中耗尽CD11c+ APCs后脾脏中的蛋白表达显著减少，显示出该系统在脾脏APCs中的高特异性。有趣的是，该系统诱导的CTL反应独立于I型IFN，因此即使带有1 mΨ修饰也保留了CTL活性。因此，装载1 mΨ修饰的mRNA的脂多聚复合物提供了有效的癌症疫苗，并最小化了系统性细胞因子释放的诱导。另一组使用唾液酸作为配体，靶向树突状细胞表面表达的唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-1 (Siglec-1) 作为iLNP的配体。有趣的是，将唾液酸引入iLNP显著增加了内体逃逸效率。结果，iLNP在系统给药后允许有效的mRNA传递到脾脏树突状细胞，从而增强了抗癌症疫苗。 3.5.粘膜传递 粘膜疫苗接种可以避免侵入性注射程序，并在粘膜相关淋巴组织（MALT）中触发强大的局部和系统免疫反应。特别是，包括肺在内的上呼吸道和下呼吸道的粘膜，是针对传染病的疫苗的一个有吸引力的场所。针对COVID-19的鼻内（i.n.）给药或吸入活减毒和腺病毒载体粘膜疫苗在临床试验中显示出有希望的结果。在粘膜免疫中，分泌到粘液中的IgA在中和和消除最初进入点的外来病原体中发挥重要作用，有效预防感染。此外，鼻内疫苗接种有效地诱导交叉反应性抗体，赋予广泛的交叉保护性免疫。这一特性对于预防具有高突变率的病毒（如RNA病毒）的感染是吸引人的。有效地诱导IgA分泌需要将抗原传递到位于粘液覆盖的上皮屏障下的淋巴组织中的APCs。粘膜上皮中的M细胞介导抗原从粘膜表面到固有层的采样。因此，以前的鼻内疫苗接种研究已经尝试促进疫苗穿透粘液以被M细胞吸收，证明了这一策略的可行性。在这种给药途径中，靶向APCs也是至关重要的，其中被APCs激活的B细胞在激活的CD4+ T细胞的协助下大量分泌IgA。值得注意的是，不同部位的粘膜具有交叉对话。因此，在粘膜部位的疫苗接种可以在远处的粘膜部位诱导抗原特异性免疫，促进整个粘膜系统对病原体感染的加强。除了粘膜IgA分泌外，激活的B细胞还为全身免疫提供系统性IgG分泌。此外，粘膜疫苗接种可以诱导细胞毒性CD8+ T细胞直接杀死感染细胞或表达抗原的细胞，激励其应用于癌症疫苗。 尽管粘膜疫苗接种具有这些优点，但mRNA疫苗的应用仍然具有挑战性，很少有报告涉及这一主题。在一项针对流感病毒和SARS-CoV-2的疫苗研究中，saRNA iLNP的鼻内（i.n.）给药产生的抗体滴度比其肌肉内（i.m.）注射低10倍以上，并且细胞免疫效率较低。机制分析显示肌肉内注射后的血清细胞因子水平高于鼻内给药。因此，作者通过鼻内途径的低佐剂效应来解释i.n.路线的疫苗效率降低。随后的一项研究在i.n.、i.m.和皮内（i.d.）saRNA疫苗接种中进行了更全面的比较，使用了4种不同的疫苗配方：固体LNP、聚合物纳米颗粒、阳离子LNP和iLNP。在每种配方中，i.n.疫苗接种一致地产生了比其他疫苗途径效率低的体液和细胞免疫，即使i.n.疫苗接种使用的mRNA剂量比其他两条途径高10倍。荧光素酶mRNA报告试验显示，荧光素酶表达在i.n.给药后仅持续几天，而肌肉内和皮内注射提供了超过10天的表达。因此，通过i.n.给药引入的saRNA细胞的快速清除可能解释了i.n. saRNA疫苗接种的低免疫原性。 与此同时，几份报告在利用基于脂质和聚合物系统的i.n. mRNA疫苗接种中展示了有希望的结果。在脂质系统方面，一项开创性的研究使用了一种商业脂质试剂进行i.n. mRNA疫苗接种，在小鼠模型中预防性和治疗性给药后诱导了抗癌症活性。在另一项研究中，mRNA被装载到使用普罗胺缩合的聚乙二醇化阳离子脂质体中。这一系统在培养细胞中展示了有效的抗原表达和免疫刺激，以及在小鼠中伴随CD4+和CD8+ T细胞有效诱导的抗肿瘤活性。在最近的一项研究中，通过用阳离子脂质替代两性离子辅助脂质来增强mRNA传递效率到粘膜组织，iLNP被用于i.n.疫苗接种。结果iLNP实现了有效的mRNA传递到粘膜APCs。最终，iLNP展示了与相同系统在装载编码SARS-CoV-2尖峰蛋白的受体结合域和补体C3蛋白的融合蛋白的mRNA后肌肉内疫苗接种观察到的水平相当的强系统IgG诱导。 在聚合物系统的领域，一系列研究试图克服阻碍mRNA疫苗到达APCs的鼻上皮屏障。虽然多聚阳离子通过打开上皮细胞之间的紧密连接有效地破坏屏障，但它们可能引起组织损伤。因此，这些研究通过将聚乙烯亚胺与环糊精结合来减轻细胞毒性，从而减少电荷密度。在i.n.疫苗接种后，得到的聚复合物成功地在鼻腔和阴道腔中产生了IgA，以及IgG和抗原特异性CD8+和CD4+ T细胞。根据随后的机制研究，聚复合物在浅表颈、深颈和腋窝淋巴结中有效地提供了蛋白表达，并激活了淋巴结中的树突状细胞，从而增强了疫苗效率。在安全分析中，聚复合物没有引起血液中毒性标记物或细胞因子的增加，并且在鼻上皮和肝脏的组织切片中没有观察到异常。在最近的一项研究中，通过聚乙二醇化mRNA聚复合物传递到肺部尝试了粘膜疫苗接种。对于聚复合物的肺部传递，需要优化表面PEG密度。PEG减轻了由阳离子聚复合物引起的组织损伤，并促进了它们对粘膜的穿透，尽管它们表面密集的PEG层阻碍了进入目标细胞。疫苗研究首先通过基于传递效率到肺部的筛选优化了PEG密度和多阳离子结构。最优聚复合物在肺部APCs和上皮细胞中有效地提供了蛋白表达。在SARS-CoV-2疫苗方面，聚复合物在引流淋巴结中诱导了抗原特异性T细胞和B细胞，包括表达IgA的B细胞。此外，观察到抗原特异性组织驻留CD8+ T细胞和强粘膜IgG分泌，证明了成功诱导粘膜免疫。最终，该系统有效地保护了小鼠免受病毒挑战。然而，该系统未能诱导可检测的IgA分泌，需要进一步改进疫苗设计。 4.未来展望 mRNA疫苗需要多种功能，包括保护mRNA免受RNase攻击、以最小化非靶向分布为目标APCs和淋巴组织，以及时空控制先天免疫激活。虽然先天免疫的刺激对于有效的疫苗接种至关重要，但过度的佐剂效应可能导致不良反应并阻碍疫苗结果。在mRNA传递系统方面，mRNA纳米颗粒迁移到淋巴器官有利于疫苗效果。然而，它们广泛分布到非靶向组织，如肝脏和心脏，可能导致罕见但严重的不良反应。在mRNA疫苗中微调这些各种因素仍然具有挑战性，需要大规模筛选以确定最优的mRNA疫苗设计。例如，SM-102是一种用于批准的COVID-19疫苗mRNA-1273的可电离脂质，它是基于小鼠和NHPs中抗原产生能力从30种LNPs配方中筛选出来的。值得注意的是，可电离脂质结构的微小变化可能导致体液免疫诱导的显著差异，而pKa在6.6和6.9之间的可电离脂质往往表现出有效的疫苗效果。有趣的是，虽然五种领先的LNPs在小鼠中展示了可比的抗体产生效率，但它们在NHPs中导致了抗体诱导的大差异，强调了疫苗效力的物种特异性变化。更详细地解密结构-功能关系可能有利于未来疫苗开发，为此，正如本评论所讨论的，正在进行有力的机制分析。 前述的物种差异是纳米医学领域的一个重要问题。例如，临床前动物模型和人类之间在纳米药物生物分布上存在显著差异。吸附到纳米药物上的蛋白质冠在不同物种中的特异性变化可以通过影响克服多种生物学屏障的过程（如有限的组织扩散和不良的清除机制）来影响它们在各个物种中的分布。此外，对mRNA疫苗构成额外障碍的炎症反应在不同物种之间也有所不同。例如，小鼠对阴离子mRNA脂质体的耐受性比人类高，系统给药时炎症反应最小。小鼠在对炎症刺激的反应中更有效地产生抗炎IL-1ra，与人类相比，减轻了mRNA疫苗的系统反应原性。解决物种差异对未来疫苗开发至关重要。 尽管mRNA疫苗在对抗COVID-19方面取得了成功，但当前的mRNA疫苗仍需改进，特别是在减少反应原性方面。虽然在大流行期间，反应原性可能被认为是可以接受的，但人们需要反应原性更温和的mRNA疫苗配方，以用于反复增强针对COVID-19的免疫力，以及更广泛地应用于其他传染病。此外，强烈的反应原性也是疫苗犹豫的原因之一。关于反应原性和免疫原性（疫苗效果）是否可以分离的辩论仍在继续。在人类中，疫苗的系统反应原性在第二次剂量后比第一次剂量更常见，这表明适应性免疫在反应原性中的参与。此外，增强的反应原性与第二次剂量后系统IFN-γ分泌水平的升高相吻合，这在人类和小鼠中都有观察到。在小鼠研究中，CD4+和CD8+ T细胞是第二次剂量中IFN-γ的主要产生者，给予IFN-γ受体中和抗体减弱了巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞的激活。这些发现表明反应原性和免疫原性之间存在密切关系。然而，IFN-γ受体中和抗体对小鼠体液和细胞免疫诱导的效率影响很小。此外，系统反应原性的强度与人类体液和细胞免疫诱导的效果之间的相关性有限。这些结果表明反应原性和免疫原性有潜力被分离。关于佐剂效应，阐明负责反应原性和免疫原性的先天免疫信号通路可能有助于开发具有降低反应原性的高效疫苗。在淋巴结中有效积累且系统泄漏最小的mRNA传递系统可能在减轻系统不良反应的同时保持效果。 虽然这篇综述主要关注佐剂效应和mRNA传递系统，但与其他策略的结合对未来mRNA疫苗的设计至关重要。旨在延长抗原表达持续时间的RNA设计，包括saRNA和环状RNA，也可以增强mRNA疫苗的效力。saRNA疫苗ARCT-154在3期临床试验中作为加强疫苗接种，比BNT162b2或mRNA-1273的两剂接种后显示出更强的免疫原性。编码SARS-CoV-2尖峰蛋白受体结合域的环状RNA在小鼠和NHPs中诱导了强大的免疫反应，尽管环状RNA和线性mRNA之间的疫苗效果几乎相当。在重组蛋白疫苗的研究中，抗原和佐剂的暴露动力学对疫苗接种结果有很大影响，持续暴露导致增强的抗体产生。因此，在mRNA疫苗中调节动力学可以提高其效力。为了实现这一点，一些报告尝试通过水凝胶控制mRNA纳米颗粒的释放。例如，与基于脂质的商业试剂复合的mRNA被装载到基于聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(pHEMA)的多孔支架上。在皮下注射后，这种支架保留mRNA超过3天，并提高了与mRNA注射相比的蛋白表达效率。最近的研究开发了一种由氧化石墨烯(GO)和线性聚乙烯亚胺(LPEI)组成的水凝胶，装载抗原mRNA和TLR7激动剂。这种水凝胶在小鼠注射后逐渐释放装载mRNA和激动剂的GO-LPEI纳米颗粒，超过一个月，同时在此期间保护mRNA免受降解。结果，水凝胶注射比纳米颗粒的注射提高了抗肿瘤效果。由mRNA编码的蛋白质的工程也大大影响疫苗接种效果。有趣的是，在mRNA疫苗中将SARS-CoV-2的尖峰蛋白工程化形成类病毒颗粒，提高了中和滴度10倍以上。在癌症疫苗中，准确的表位预测和与其他免疫疗法的结合是关键。优化佐剂效应和传递系统，结合上述其他策略，将大幅扩展mRNA疫苗在未来的潜力。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。