TLR6

Toll样受体(TLR)在触发先天性和适应性免疫反应中发挥着至关重要的作用。它们不仅启动先天免疫反应，而且还是先天免疫和适应性免疫之间的重要连接器。 Toll样受体(TLR)可分为十个，除了TLR10与其他不同，被认为是Toll样信号传导的免疫调节剂。特异性免疫可分为四类，涉及不同的TLR组合。BiomedicinesTH1免疫反应TH1免疫反应是对抗细胞内细菌、原生动物和真菌的宿主免疫反应，涉及的免疫细胞包括M1样巨噬细胞、产生IFN-γ的CD4+ T细胞、细胞毒性CD8+ T细胞和iNKT1等。Biomedicines涉及TH1免疫通路的自身免疫性疾病包括1型糖尿病、多发性硬化症、接触性皮炎和结核病等。关键TLR：TLR7、TLR8和TLR9这三者都位于巨噬细胞的内体区室中。TLR7、TLR8 和 TLR9对应的配体分别是单链RNA、细菌核糖体RNA和未甲基化的CpG DNA寡核苷酸。这些配体是在巨噬细胞吞噬溶酶体中细菌或原生动物的消化过程中产生的。TLR7、TLR8和TLR9主要的信号通路涉及IRF5和IRF7，它们上调IL-12和IFN-γ等下游靶标。TLR8信号转导激活IRF5，而TLR7/9信号转导激活IRF7。TLR7和TLR9首先激活MyD88复合物，包含TRAF3、TRAF6、IRAK4、IRAK1、IKKα、OPNi 和 DOCK2等等。其激活顺序为：TLR7通过激活MyD88从而首先激活IRAK1，再影响IKKα，使其触发转录因子IRF7。IRF7也可以被IRAK1磷酸化。TLR8则通过激活MyD88首先激活TAK1，再影响IKKβ。TAK1还可以激活下游分子JNK。当IKKβ易位到细胞核中时，它会触发转录因子IRF5。IRF5和IRF7的协同作用以产生IL-12，从而引发TH1反应，上调IFN-γ。TH2免疫反应TH2免疫反应是应对寄生虫的免疫反应，分为TH2a和TH2b。TH2a涉及炎性嗜酸性粒细胞、产生IL-4/5的CD4 T 细胞、具有类胰蛋白酶活性(MCt)的肥大细胞、iNKT2细胞和IgG4 B细胞。BiomedicinesTh2b则涉及嗜碱性粒细胞、产生IL-13/4的CD4 T细胞、具有类胰蛋白酶/糜酶活性的肥大细胞(MCtc)、iNKT2 细胞和产生IgE的B细胞。BiomedicinesTH2免疫与1型IgE相关的过敏性疾病密切有关，如哮喘、过敏性鼻炎和特应性皮炎等。关键TLR：TLR1、TLR2和TLR6TLR2和TLR6在嗜碱性粒细胞或肥大细胞等APC的表面上表达。TLR2可以在细胞表面与TLR6或TLR1形成异二聚体，共同识别三酰基脂蛋白，从而触发MAL接头分子，其激活MyD88非依赖性通路，产生IL-4，触发TH2免疫反应。TLR2-TLR6异二聚体则激活下游PI3K和AKT通路。TLR2激活导致TPL2(MAP3K8)被激活，继而通过IKK2介导激活NFκB通路。TPL2还激活MEK1/2和ERK1/2信号转导，从而触发TH2免疫通路。除了IL-4之外，依赖TLR6而上调的IL-25和依赖TLR1/TLR6的IL-33也是驱动TH2免疫反应的关键细胞因子。Th22免疫反应Th22免疫代表宿主针对细胞外细菌、原生动物和真菌的免疫反应。涉及中性粒细胞N1、分泌IL-22的Th细胞、iNKT17细胞和IgG2 B细胞。BiomedicinesTH22主导的免疫通路与3型免疫复合物超敏反应有关，包括阿瑟氏反应和类风湿性关节炎等疾病。关键TLR：TLR2、TLR4和TLR5与TH22免疫通路相关的主要TLR是TLR2、TLR4和TLR5，在中性粒细胞、树突状细胞和单核细胞/巨噬细胞的表面表达。TLR2同型二聚糖可识别革兰氏阳性细菌细胞壁中的肽聚糖和脂磷壁酸，同时还与真菌细胞壁中的β-葡聚糖相互作用。TLR4则负责识别革兰氏阴性菌细胞壁中的 LPS 内毒素。此外，TLR5可识别在运动细菌中发现的鞭毛蛋白。TLR4 信号转导触发MyD88、IRAK1和IRAK4组成的复合物。IRAK4激活IRAK1导致IRAK1自磷酸化及其与MyD88复合物的解离。随后，IRAK1 与泛素结合酶UBC13和UEV1A结合，促进TRAF63/TAK6复合物的泛素化。IRAK1的激活也会诱导TAK1和TRAF6激活，诱导下游NFκB易位到细胞核中，从而触发炎症基因的表达，上调IL-1、IL-6和TNF-α。此外，TAK1激活也导致转录因子AP1依赖于MAPK的激活。Thαβ免疫反应THαβ免疫是宿主针对病毒和朊病毒等传染性分子的免疫反应，涉及NK1细胞、分泌IL-10的CD4 T细胞、iNKT10细胞、CD8 T细胞和IgG1 B细胞。BiomedicinesTHαβ 免疫与2型抗体依赖性细胞毒性超敏反应有关。涉及THαβ免疫通路的自身免疫性疾病包括Graves病、重症肌无力和系统性红斑狼疮等。关键TLR：TLR3、TLR7和TLR9TLR3、TLR7和TLR9主要在浆细胞样树突状细胞的内体区室中表达，内体区室为病毒和 TLR 之间的相互作用提供了理想的环境。TLR3可识别病毒复制过程中产生的dsRNA，而TLR7可检测该阶段也存在的ssRNA。TLR9则可识别在细菌和病毒基因组中未甲基化的CpG DNA。涉及TLR3、TLR7和TLR9的信号通路汇聚在IRF3和IRF7上，启动下游1型IFN信号通路，从而启动THαβ免疫应答。激活后，TLR3直接触发TRIF-IRF3信号通路，TLR7和TLR9激活IRAK1-IRF7信号通路。TRIF-IRF3信号通路触发涉及TRAF3、TBK1和IKKε的级联反应。另一方面，TLR7和TLR9激活MyD88通路，通过IRAK1进一步激活IKKα，在细胞核激活转录因子IRF7。IRF3和IRF7均能激活IFN-α和IFN-β的产生，从而启动THαβ免疫应答。此外，IL-27和IL-10也是驱动细胞因子之一。小结TLR不仅可以通过拮抗剂来治疗自身免疫性疾病，在其他领域也有应用。例如TLR激动剂可用于触发宿主对癌症的免疫反应，诱导癌细胞凋亡，从而作为肿瘤治疗的辅助药物。在疫苗开发中，配方里增加TLR激动剂也可以加强疫苗对致病原的效力。参考文献：1.Chu, Y.-T.; Liao, M.-T.; Tsai, K.-W.; Lu, K.-C.; Hu, W.-C. Interplay of Chemokines Receptors, Toll-like Receptors, and Host Immunological Pathways. Biomedicines 2023, 11, 2384. https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.3390/biomedicines110923842.Jang YH, Choi JK, et al.House Dust Mite Increases pro-Th2 Cytokines IL-25 and IL-33 via the Activation of TLR1/6 Signaling. J Invest Dermatol. 2017 Nov;137(11):2354-2361. doi: 10.1016/j.jid.2017.03.042.

摘要：基于嵌合抗原受体（CAR）免疫疗法的过继细胞治疗取得了巨大进展，美国食品和药物管理局批准了五种用于血液系统恶性肿瘤的CAR T疗法。然而，实体瘤的CAR免疫疗法明显落后。CAR免疫疗法在实体瘤中的一些主要障碍包括CAR T细胞制备、缺乏肿瘤特异性抗原、CAR-T淋巴细胞运输和渗透到肿瘤部位的效率低下、免疫抑制肿瘤微环境（TME）、治疗相关毒性和抗原逃逸。CAR自然杀伤（NK）细胞比CAR T细胞有几个优势，因为NK细胞可以由预先存在的细胞系或异基因NK细胞制备不需要进行主要组织相容性复合体（MHC）的配型；可以通过CAR依赖性和CAR非依赖性途径杀死癌症细胞；并且毒性较小，尤其是在细胞因子释放综合征和神经毒性。至少有一项临床试验显示了CAR-NK细胞治疗的疗效和耐受性。巨噬细胞是主要的免疫调节因子，可以有效地渗透到肿瘤中，并大量存在于TME中。免疫抑制性M2巨噬细胞与促炎性M1巨噬细胞在吞噬靶细胞方面有一样的效果。并且还可以诱导M2巨噬细胞分化为M1型。因此，开发用于癌症免疫治疗的CAR巨噬细胞以克服与CAR T/NK治疗相关的一些主要障碍，特别是在实体肿瘤中，具有重大的意义。尽管如此，CAR-NK和CAR 巨噬细胞都有其自身的局限性。这篇综合性综述文章将讨论CAR-T和CAR-NK治疗的现状和主要障碍，接下来将讨论将CAR巨噬细胞发展为癌症特异性吞噬细胞、抗原提呈物、免疫刺激物和TME修饰物的结构和前沿研究。背景：免疫疗法最近已经彻底改变了癌症治疗的方法，是继手术、放疗和化疗之后癌症治疗的第四个基石。这对于无法治愈的转移性肿瘤来说更是如此，现在在经历免疫治疗后一部分患者可以达到长期缓解甚至治愈。目前，免疫疗法研究探索并利用免疫系统的各个方面，其中最成功的案例是免疫检查点抑制剂（ICIs）和嵌合抗原受体（CAR）T细胞的过继细胞疗法（ACT）。其他免疫疗法方法主要在临床前研究和临床试验中。对于免疫检查点抑制剂，有1种抗体是针对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白（CTLA-4）、6种PD-1抗体和PD-L1抗体已经被FDA批准针对超过15种不同类型的恶性肿瘤。相比之下，到目前为止，只有5种CAR-T疗法被批准用于治疗B细胞来源的血液恶性肿瘤。目前超过700个CART疗法的临床试验在clinicaltrails.gov上注册，其中许多试验集中于实体肿瘤。这篇综述文章讨论了CAR-T和NK细胞治疗的现状及其局限性，然后是新兴的CAR-巨噬细胞的治疗。CAR 结构初始T细胞的激活需要两个信号，一个是通过T细胞受体（TCR）与主要组织相容性复合体（MHC）上的抗原结合的第一信号；另一个是通过CD28的共刺激信号。TCR由两条高度可变的链组成通常为α和β链，有少数的T细胞是γ和δ链。这两条链形成抗原识别和结合位点，并由非常短的细胞质位点。除此之外，TCR与6个CD3受体（CD3εγ, CD3εδ andCD3ζζ）结合形成四种CD3受体蛋白（CD3δ,CD3γ, CD3ε and CD3ζ,），来形成1个八聚体的复合物。CD3的胞内结构域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序（ITAM），在TCR接合过程中传递主要信号。TCR-CD3复合物的主要信号和CD28与B7.1（CD80）或B7.2（CD86）结合的共同信号激活T细胞。CAR是一种合成的细胞表面受体，通常不依赖于MHC就可与靶细胞表面抗原结合将细胞毒性细胞与靶细胞结合。它的主要功能比如第一代CAR是替代TCR-CD3复合物并传递T细胞激活的主要信号；第二代和第三代CAR主要替代TCR-CD3复合物的信号和CD28的共刺激信号。CAR通常由四个区域组成：细胞外抗原结合区域、间隔或者铰链区、跨膜区和细胞内信号区域。抗原结合区域通常由抗体的重链（VH）和轻链（VL）通过链接器链接，形成单链片段可变区（ScFv），并决定其抗原结合特异性。有时，可以用一种与靶细胞上的受体结合的天然蛋白质或者肽来代替单链抗体。单链抗体识别并结合细胞表面标位来决定靶标特异性和TCR识别通过MHC呈递抗原的形式是不同的。铰链区域是一个间隔区域，它暴露了CART细胞表面的抗原结合区域，以便抗体与目标抗原结合。临床上常使用的铰链区通常来源于CD8、CD28或者IgG。铰链区域的长度根据经验由靶抗原的位置决定，靠近细胞膜的抗原需要较长的铰链，暴露在细胞表面的抗原需要较短的铰链。跨膜结构域的主要功能是将CAR固定在免疫细胞膜上。然而一些研究表明，该区域可以影响CAR的表达、稳定性、二聚化和信号转导。细胞内信号域在CAR的领域被广泛研究，以用来产生具有最活跃的抗肿瘤的CAR免疫细胞。当CAR参与时，细胞内信号域会传到信号激活免疫细胞攻击目标细胞。第一代CAR-T包含一个CD3ζ信号域。由于T细胞活化需要TCR-CD3和CD28两个信号通路的信号，因此第一代CART细胞治疗在过继转移后的疗效和持久性有限。未提高抗癌活性，设计了第二代CAR-T细胞。除外CD3ζ信号域外还包含一个共刺激域。两个最常用的胞内信号结构域是CD28和4-1BB(CD137)。FDA批注的axicabtagene ciloleucel和brexucabtagene autoleucel 均使用了CD28的结构域，两者都是针对CD19靶点的CAR-T。FDA批准的靶向CD19的lisocabtagene maraleucel和tisagenlecleucel，以及靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的idecabtagene vicleucel均使用4-1BB的共刺激域。其他细胞内共刺激域如OX40、CD27、和诱导性T细胞共刺激域（COS）也在临床前研究中进行了测试，与CD28和4-1BB结构域的效果差不多。其中一些共刺激域可能对CAR-T细胞有更好的有益效果，有一项研究表明CD27共刺激结构域比CD28共刺激域在体内更能增强CAR-T的持久性。它们在CAR T细胞中的活性尚未在大型临床试验中得到验证。已经发现细胞内CD28和4-1BB结构域对CAR T细胞的分化和代谢有不同的影响。4-1BB和CD3ζ可联合诱导中枢记忆T细胞的分化和持续性，增加线粒体的生物合成，促进脂肪酸氧化和氧化代谢；CD28和CD3ζ结合诱导记忆细胞分化和糖酵解。为了利用不同性质的共刺激域并增强CAR T细胞的疗效，第三代CAR T治疗被设计在CD3ζ并联设置两个共刺激域。结合CD28和4-1BB可以使得CAR T细胞能靶向低亲和力的目标抗原，增强增殖能力，增强中央记忆细胞的分化，提高体内的抗肿瘤活性。一个包含可变数量共刺激域的CAR构建库测试时发现包含两个共刺激域的CAR T细胞。DAP10和CD27在体内取得最好的抗肿瘤活性。除外CAR的基本结构，生物工程的最新进展使进一步武装CAR免疫细胞成为可能，其可以增强抗肿瘤的功能并降低毒性。如CAR-T细胞上表达趋化因子受体，以促进趋化并向肿瘤微环境浸润；促炎性细胞因子的表达可以克服免疫抑制TME；敲除抑制性受体可以防止CAR-T细胞衰竭；双CAR-T细胞可以产生靶向两个抗原并克服抗原逃逸；自杀或抑制基因可以用来预防或减少毒性，包括靶向性、非肿瘤效应及细胞因子释放综合征。CAR-T治疗的现状到目前为止， FDA已经批准了五种CAR-T细胞。5个B细胞表面标记物， 4个靶向CD19，1个靶向B细胞成熟抗原(BCMA) (表1和图1)这五种药物均已被批准用于复发或难治性血液恶性肿瘤的治疗:B细胞来源的淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。第一个FDA批准的CAR-T疗法是Tisagenlecleucel，75例复发或难治性B细胞前体急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿和年轻成人患者。在3个月内，总缓解率为81%，其中完全缓解(CR)为60%，不完全血液恢复(CRi)为21%。75例患者中55例(73%)出现3级或4级tisagenleckel相关不良事件。3级和4级细胞因子释放综合征(CRS)分别发生在21例和25%的患者中， 75例患者中有35例(47%)住进重症监护病房(ICU)进行治疗。基于该试验， CAR-T疗法于2017年8月30日获得FDA批准，用于治疗年龄≤25岁的B细胞前体ALL患者，且难治性或二次或以后复发。Tisagenlecleucel于2018年5月1日获批，用于治疗复发或难治的大B细胞淋巴瘤，包括弥漫大b细胞淋巴瘤(DLBCL)、高级别B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤引起的DLBCL，基于多中心试验。在92例可评估的患者中，最佳的总缓解率为52%，其中CR为40%，部分缓解(PR)为12%。63%发生3级或4级不良事件，怀疑与tisagenlecucel有关。Axicabtagene ciloleucel(Yescarta™)于2017年10月18日成为FDA批准的第二种CAR-T疗法，用于治疗大B细胞淋巴瘤，包括DLBCL、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、高级别B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤引起的DLBCL，经过至少两行系统治疗。一项有101名患者参加的多中心ZUMA-1试验显示， 18个月时客观缓解率(CR54%)为82%，总生存率为52%。约13%的患者发生3级或以上CRS。2021年3月5日， axicabtageneciloleucel也被批准用于复发或难治性滤泡性淋巴瘤，基于单臂、开放标签的ZAMA-5试验，经过两个或多个系列的全身治疗。91%的患者达到了缓解，约8%的患者出现了3级或3级以上的CRS。中位随访时间为14.5个月，在18个月时， 74%的患者持续缓解。基于一项单臂、开放标签的ZUMA-2试验， FDA于2020年7月24日批准了第三个靶向CD19的CAR-T疗法Brexucabta或难治性套细胞淋巴瘤。在这个多中心II期试验中，74名患者被纳入， Brexucabtageneautoleucel生产了71名患者，给药68名患者。总体而言缓解率为93%，缓解率为67%。12个月时，总生存率为83%。约15%的患者发生3级或以上CRS。Lisocabtagene maraleucel (Breyanzi™)是最近批准的针对复发或难治性大B细胞淋巴瘤的CD19靶向CAR-T治疗，经过两个或多个系列的系统治疗，包括未指定的大B细胞淋巴瘤(包括由惰性淋巴瘤引起的大B细胞淋巴瘤)、高级B细胞淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤3b阶段。在这项多中心TRANSCEND试验中，有192名可评估患者参与，客观缓解率为73% (50×106、100×106和150 ×106给药方案分别为68、74和73%)，CR为53% ((50 ×106、100 ×106和150 ×106给药方案分别为60、52和51%)，中位缓解持续时间为17个月。3级或以上CRS发生在约2%的患者中。Idecabtagene vicleucel (Abecma®)是唯一的FDA-批准的CAR-T治疗不针对CD19。它针对多发性骨髓瘤(MM)细胞的BCMA靶点，并于2021年3月26日获得FDA批准，用于复发或难治性MM，经过4个或更多系列的系统治疗，包括免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和基于KarMMa研究的抗CD38单克隆抗体。在128名接受治疗的患者中，总有效率为73%(150×106、300×106和450×106给药方案分别为50、69和82%)，CR为33% (150×106、 300×106和450×106给药方案分别为25、29和39%)。约2%的患者中发生了3级或以上CRS。到目前为止，已经有超过700个恶性肿瘤的临床试验被注册。此外，CAR-T细胞疗法正在探索用于其他疾病，如自身免疫疾病和病毒感染)。表1 FDA近期批准的CAR-T治疗图1 FDA批准CAR-T治疗的时间线CAR-T细胞在癌症免疫治疗中的局限性许多因素导致了CAR-T治疗的失败，如患者的疾病进展、单采时T细胞数量不足、推迟的CAR-T生产、CAR-T细胞未满足回输剂量、固有的T细胞缺陷等。下面是与CAR-T细胞生产和治疗相关的因素。抗原选择尽管CAR-T治疗取得了巨大的成功，但仍存在一些明显的局限性。到目前为止，所有FDA批准的CAR疗法都以B细胞的标记物为靶点。CAR-T细胞治疗实体瘤落后于血液瘤的原因是多样的。缺乏癌症特异性的靶点是主要的障碍之一。尽管CD19靶向CAR T治疗会导致B细胞再生障碍，但静脉注射免疫球蛋白补充剂可以很容易地补偿大多数B细胞功能。实体瘤中很少存在这种不影响正常功能的特异性抗原。在实体肿瘤中，靶向肿瘤相关抗原的CAR-T细胞的临床试验，如被T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MART1)和糖蛋白100(gp100)，表明确实发生非靶向肿瘤的副作用，有时不能轻易逆转。这种毒性可能发生在没有或只有最低的抗肿瘤活性的情况下，甚至当靶向被认为在健康成人组织中不表达的癌症睾丸抗原时，也可导致死亡。CAR-T细胞转移和浸润到肿瘤中的效率低下转移和渗透到肿瘤部位是静脉注射CAR-T细胞的要克服的下一个主要障碍。粘附分子异常表达的异常脉管系统降低CAR-T细胞附着的附着、迁移和浸润;密集的细胞外基质，包括癌症相关的成纤维细胞(CAFs)，为CAR-T细胞进入肿瘤部位创造了一个物理屏障;紊乱的细胞因子表达会优先吸引被抑制的免疫细胞。目前已经探索了各种策略来增加T细胞对肿瘤的浸润。比如CAR-T与另一种靶向CAFs的CAR-T治疗相结合，或将CAR-T细胞与细胞因子受体结合，结合到肿瘤中上调的细胞因子上。然而，这些策略有时是有代价的，因为这些目标通常存在于机体中。一项临床前研究表明，靶向CAFs的CAR-T细胞能够识别多能骨髓基质细胞，这导致小鼠产生恶病质和死亡，这些研究提醒人们不要在人类患者中使用这种策略。恶性的肿瘤微环境进入TME后，免疫抑制环境会抑制CAR-T细胞的功能。在某些癌症中尤其如此，如胰腺癌，细胞和基质成分都为癌症免疫治疗创造了不利的微环境。细胞成分如肿瘤相关的巨噬细胞(TAMs)，调节性T -细胞(Treg)，骨髓源性抑制细胞(MDSCs)和肿瘤相关的成纤维细胞(TAFs)可以直接抑制CAR-T功能，有助于免疫抑制细胞因子和代谢微环境抑制CAR-T细胞功能。血管内皮生长因子(VEGF)在肿瘤新生血管中起着至关重要的作用。最近发现VEGF几乎可以影响免疫系统的各个方面，导致抗肿瘤免疫的抑制。此外，转化生长因子β（TGF-β）、IL-4、IL-10等也会使得T细胞功能障碍，促进免疫抑制细胞的浸润。许多策略已经存在并用在TME下促进CAR-T的治疗，例如将CAR T疗法与ICIs或其他免疫刺激疗法相结合，使CAR T细胞对免疫抑制细胞因子不敏感。抗原逃逸T细胞发挥抗癌活性，抗原丢失和下调是治疗失败的重要机制。尽管有很高的初始缓解率，但7~25%的患者接受靶向CD19的CAR-T治疗后， CD19表达减少的恶性肿瘤复发。靶向两种不同抗原的CAR-T构建或连续的CAR-T治疗正在积极地进行，以尽量减少抗原逃逸和下调。CAR-T细胞扩增和持久性不足除了靶向抗原的逃逸， CAR-T细胞扩张和体内持续存在被认为是长期缓解的关键。特别是那些需要长期治疗的恶性肿瘤，如ALL。对于其他恶性肿瘤，如非霍奇金淋巴瘤，短时间的强化化疗无需巩固和维持治疗就足以诱导缓解。在后一种情况下，尽管CAR-T细胞未被检测到， B细胞在抗cd19CAR-T治疗后恢复，但完全缓解持续存在。缺乏CAR- T细胞持久性可能与宿主对CAR-T细胞的抗转基因免疫反应有关。在这种情况下，基于氟达拉滨的淋巴消耗状态治疗可以减少抗转基因免疫反应，改善CAR-T细胞的扩张和持久性，并增强CAR- T细胞的疗效。更常见的是，CAR-T细胞扩增和持久性的缺乏是由直接与CAR-T细胞相关的因素引起的。人们设计和研究了各种策略来增强CAR-T细胞的扩展和持久性:CAR-T细胞构建、亲本T细胞选择、 T细胞培养条件、药物操作、修饰CAR-T基因表达和代谢、逆转T细胞衰竭、促进记忆表型发展等。关于CAR-T结构，大多数临床测试和FDA批准的CAR-T细胞产品含有CD3ζ一个共刺激域，通常是CD28或4-1BB。临床前研究和一些临床观察表明，共刺激结构域可以影响CAR-T细胞的表型和体内持续时间， 4-1BB结构域持续时间更长，为168天。而CD28为基础的CAR-T细胞治疗约持续30天。体外培养、激活和扩增不仅能引导T细胞转导CAR-T基因，扩大到产生足够的CAR-T细胞用于临床应用，而且对维持CAR-T功能和输注后的持久性也至关重要。体外培养导致T细胞终末分化，倾向于激活诱导细胞死亡(AICD)和衰竭，可影响体内扩张和持久性。优化培养条件可促进记忆型CAR-T细胞的发育和体内扩展和持久性。全身毒性CAR-T细胞治疗有很高的反应率，特别是在耐药或者难治的疾病中，但也与较高的副作用率相关。全身细胞因子毒性发生在急性期，当CAR-T细胞被激活并释放细胞因子作为CAR-T细胞与抗原结合的生理反应。所有有效的CAR-T治疗都观察到严重甚至致命的影响。对于大多数患者，它表现为与发热、低血压、缺氧和与高水平炎症细胞因子相关的多器官衰竭相关的CRS。一些患者也可发展为免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)。ICANS具有明显的神经学表现，继发于脑脊液细胞因子水平升高和血脑屏障破坏，表现为失语症、精神状态改变、震颤、癫痫和头痛。各种方法已经被采用，其中一些已经转化为临床应用。糖皮质激素和抗白细胞介素-6 (IL-6)抗体西妥昔单抗是最常用的药物干预。其他几种方法正在积极探索以控制或改善全身细胞因子的毒性，如根据肿瘤负荷量身定制CAR-T细胞剂量，修改CAR-T构建，在CAR-T细胞中加入关闭开关或自杀基因。在CAR-T细胞治疗后，偶尔会发生噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)/巨噬细胞活化综合征(MAS)。基于一项多中心调查，大约3.5%(7/201例)的患者接受CAR-T细胞治疗后发生HLH/MAS。主要临床表现为发热、肝脾肿大、肝功能异常、血细胞减少、高脂血症铁蛋白水平，高甘油三酯血症和低纤维蛋白原血症。有时表现与CRS相似。HLH/MAS有几种诊断标准以HLH2004为临床最常用。以皮质类固醇为基础的免疫抑制治疗是主要的治疗方法，但仍有较高的死亡率。CAR-T细胞治疗实体肿瘤的特殊考虑目前，超过70%的CAR-T细胞临床试验集中于血液恶性肿瘤，超过40%的CAR-T细胞治疗CD19，而不到30%的CAR-T细胞治疗实体肿瘤。CAR-T在实体肿瘤中的治疗遇到了上述所有的挑战。在设计实体肿瘤的CAR-T治疗时需要特别考虑。首先，靶抗原的选择至关重要。目标抗原列表和一些临床试验实例可以在之前的综述中找到，并正在扩大。在CAR-T治疗中，理想的目标抗原是那些仅表达在恶性细胞上的肿瘤特异性抗原。事实上，除了癌症新抗原和可能的表皮生长因子受体变异III(EGFRvIII)，几乎所有其他在实体肿瘤CAR-T治疗中使用的抗原都是由正常细胞共享的。在血液系统恶性肿瘤中靶向非癌症特异性抗原的主要优势是:1)在正常细胞被破坏的情况下存在挽救性补救，如图所示，免疫球蛋白补充靶向B细胞标记物的CAR-T治疗(CD19和BCMA);2)细胞更新快，有新的细胞来补充。因此，在血液系统恶性肿瘤的靶内，肿瘤外的副作用通常是可控的。相反，在实体肿瘤中靶向肿瘤相关抗原(TAAs)通常与更显著的副作用相关，因为通常难以修复实体器官中正常细胞的肿瘤外损伤。已经设计了几种策略来解决实体肿瘤和血液病中肿瘤特异性抗原的缺乏。一种是将主要和共刺激信号域分成两种不同的CARs。因此，除非靶细胞同时表达靶抗原，否则这些分裂细胞和CAR-T细胞不会被强烈激活。一个类似的分裂和方法是合成Notch(synNotch)受体系统，在该系统中，第一个目标抗原的结合触发CAR的表达， CAR的表达可以被附近表达第二个目标的细胞激活并杀死。另一种方法被称为非方法，如在分裂、通用和可编程（SUPRA）CAR系统中所见，在该系统中，CAR可以与TAA结合并激活CAR T细胞，但第二种抗原（通常是在正常细胞上表达的抗原）的存在可以竞争CARTAA结合，并阻止CART细胞激活。一些其他的方法也被探索过，比如微调CAR亲和力，以实现靶抗原过度表达的癌症细胞而非低抗原表达的正常细胞激活CAR T细胞，靶向癌症细胞中异常糖基化，并使用靶向癌症新抗原的T细胞受体。在实体肿瘤的CAR-T治疗中，抗原异质性也是一个需要考虑的关键因素。在FDA批准的CAR-T疗法中，靶向抗原CD19和BCMA是在恶性细胞的干细胞中表达的发育性生物标记物。在实体肿瘤中，这种发育性抗原/生物标志物与正常细胞共享，因此，针对这些抗原可能导致严重的靶向性、非肿瘤毒性。对于非发育性生物标志物，异质性表达在癌细胞中很常见。为了克服靶抗原的异质性，人们提出了双特异性或多特异性CAR，其中一个CAR可以识别多个靶抗原。另一种方法是将几个靶向不同抗原的CARs导入相同的T细胞中。在这两种方法中，靶向性和非肿瘤性都是一个主要问题，因为很少有肿瘤特异性抗原存在。CAR-T细胞浸润肿瘤和保留细胞毒性是实体肿瘤的主要障碍。在CAR-T细胞直接与靶细胞接触的白血病或淋巴细胞在淋巴器官中正常流动和积聚免疫反应的淋巴瘤中，这两个障碍就不那么重要了。目前正在探索几种增强CAR-T细胞在实体肿瘤中的活性的方法。一种方法是增强CAR-T功能，并添加分子武装这些细胞以增强抗肿瘤活性。例如，用趋化因子受体武装CAR-T细胞可以通过上调目标趋化因子来增强T细胞向肿瘤的浸润。TGF-β 是TME抗癌免疫的主要负调控因子。在CAR T细胞中敲除TGF-β 可以增强其抗癌活性。然而，一种更常见的方法是将CAR-T细胞与另一种药物结合，以克服障碍并提高疗效。有人提出了一种基于药理学的抗癌药物排名，这可能会指导免疫疗法联合的发展。CAR NK细胞解决与CAR T治疗相关的未满足需求NK细胞是先天免疫系统的一组细胞毒性淋巴细胞，可以对非自身细胞产生快速反应。与识别MHC上呈递的抗原的T细胞不同，NK细胞可以在没有MHC的情况下直接识别靶细胞。事实上，MHC与NK细胞上的杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）结合，抑制NK细胞的功能。此外，与可以释放炎症细胞因子并导致CRS和神经毒性的CAR T细胞的参与和激活不同，NK细胞具有不同的细胞因子谱。因此，目前正在积极探索NK细胞作为过继细胞治疗的替代方法(表2)。表2 CAR T，NK和巨噬细胞的比较CAR-NK细胞相对于CAR-T细胞的一个主要优势是免疫细胞的来源。由于同种异体反应性和移植物抗宿主病(GVHD)， CAR-T治疗需要使用自体T细胞。由于这些患者通常在接受CAR-T治疗之前接受了大量治疗，他们中的许多人在外周血中T细胞计数较低。因此，获因此，采集足够的自体T细胞会显著延迟治疗，有时不可能采集足够的细胞用于CAR T制备。在一项研究中，22.5%(16/71)的患者使用低于目标的CD3+ T细胞的自体淋巴细胞来生产CAR-T细胞。冗长而繁琐的CAR-T制造过程使得更多的患者要么不适合治疗，要么在参与治疗过程后出现疾病进展。例如，在导致FDA批准的ALL的tisagenlecucel的I期试验中， 83名患者中只有54名患者接受了CAR-T细胞输注， 9名患者在治疗前病情进展或死亡， 15名患者接受了其他治疗。由于NK细胞不通过MHC途径激活，并且降低了异源反应的风险， CAR-NK细胞的制造不需要自体NK细胞。它可以使用现有的NK92细胞系、脐带血和诱导多能干细胞(iPSCs)。事实上，有5项临床试验使用NK-92细胞系在人类患者身上进行。在一项使用脐带血开发的HLA-不匹配CAR-NK疗法的试验中，11例患者中没有一例出现GVHD。因此，CAR-NK治疗的一个主要优势是，“现货的”准备使用的CAR-NK细胞可以通过批量生产生产，并在任何时候注入患者。CAR-NK治疗相对于CAR-T治疗的第二个主要优势在CRS和神经毒性。CAR-T细胞激活导致大量炎症细胞因子的释放，导致CRS和神经毒性。在使用tisagenlecucel治疗ALL的I期试验中，85%(45/53)的患者发生了3级或以上毒性的CRS，26%(14/53)的患者发生了3级或以上毒性， 41.5%的患者发生了3级或以上神经毒性。其他CAR-T治疗也观察到类似的毒性。在11例使用来自脐带血的HLA未配对的 anti-CD19 CARNK细胞治疗的患者中，没有一例出现CRS或神经毒性。CAR-T和NK细胞之间这两种毒性的差异可能是由于细胞激活时释放的细胞因子的差异。CAR-T细胞的活化导致炎症细胞因子的释放，如肿瘤坏死因子α，IL-1β，IL-2和IL-6等，而接受CAR-NK治疗的患者这些炎症细胞因子并没有增加。CAR-NK细胞释放不同类型的细胞因子，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。第三，除了CAR途径外， NK细胞还有多种靶向和消灭癌细胞的机制(图2)。NK细胞是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性的关键媒介，NK细胞表达的CD16能够识别IgG结合在肿瘤细胞上的Fc部分并杀死癌细胞。此外， NK细胞可以激活，通过接触和/或脱离癌细胞在细胞表面激活和抑制杀伤igg样受体(KIRs)。激活型和抑制性KIRs分别通过ITAMs(免疫受体酪氨酸基激活基序)和ITIMs(免疫受体酪氨酸基抑制基序)传递信号。应激细胞和癌细胞下调MHCI类表达并脱离抑制性KIRs，或上调应激诱导的分子，如MICA/MICB (MHCI类链相关蛋白A/B)，激活KIRs，使得NK细胞的激活以杀死目标细胞。第四， NK细胞的寿命有限。NK细胞的平均寿命约为2周。这意味着，在靶向非肿瘤毒性发生的情况下，它可以随着CAR的消失而自我限制。然而，这也创造了一把双刃剑，反复输注CAR-NK细胞可能需要延长缓解期。CAR结构的比较到目前为止，大多数CAR-NK细胞研究使用的CAR-T细胞使用的相同的CAR-T细胞结构，具有与第一代CAR-T细胞相同的细胞内CD3ζ域，或CD3ζ加一个共刺激域4-1BB，与第二代CAR-T细胞使用的一样(图1)。添加4-1BB共刺激域显著改善NK细胞激活，细胞毒性和细胞因子的产生，如干扰素-γ 和粒细胞-巨噬细胞集中性刺激因子。由于NK细胞有自己相互关连的激活和抑制受体来控制NK细胞的激活和细胞毒性，因此有人提出，利用NK细胞特异性的细胞内信号域，如适配器分子DAP10或含ITAM的信号域，如DAP12和2B4，可以提高细胞毒性。2B4属于信号淋巴细胞活化分子(SLAM)家族受体，通过SLAM相关蛋白(SAP)在NK细胞中转导活化信号。2B4与CD48结合在靶细胞上诱导NK细胞活化，增加细胞毒性和干扰素-γ产生。与含有4-1BB-CD3ζ 的CAR-NK细胞相比，含有2B4- CD3ζ的CAR-NK细胞具有更好的细胞毒性、干扰素γ的产生和体内抗肿瘤功效。为了进一步优化NK细胞CAR-T的构建，Li等人将一个CAR-T细胞构建与九个不同的CAR-NK细胞进行了比较，这些细胞包含四个不同的跨膜结构域和不同的细胞内信号域，并靶向相同的间皮素抗原。CAR-NK细胞包含NKG2D跨膜结构域， 2B4共刺激结构域和CD3ζ 信号域，表现出强烈的抗原特异性细胞毒性。CAR-NK细胞由携带该构建物的人iPSC发展而来，具有典型的NK细胞表型，具有显著的抗肿瘤活性，并延长了在体内的生存时间。CAR-NK细胞治疗的现状到目前为止，至少有24个CAR-NK细胞的临床试验已经计划或正在进行中。恶性肿瘤、靶抗原和临床试验信息见表3和补充信息1。这些临床试验均处于I/II期试验阶段。使用“嵌合”和“NK”这两个关键词， PubMed仅确定了一项临床试验(表4)。Liu等人发表了一项针对cd19阳性淋巴类肿瘤的CAR-NK细胞I期临床试验。在这个试验中，一个类似的CAR-T细胞结构被用来建立CAR-NK细胞与抗cd19单链抗体抗原结合的细胞外域和CD3ζ 作为细胞内信号域。此外， CAR-NK细胞表达白细胞介素-15以增强CAR-NK细胞在体内的扩张，而rimiducid诱导的caspase-9作为一种安全措施，在发生严重不良事件时可触发CAR-NK细胞凋亡。11名b淋巴恶性肿瘤患者被纳入试验。这些患者在入组前接受了四种治疗线的中位数。CAR-NK细胞来自部分HLA匹配的脐带血标本(前9例患者)或没有考虑HLA匹配的脐带血标本。11例患者均未出现CRS、神经毒性、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症或移植物抗宿主病。在这些患者中没有观察到炎症细胞因子的增加。11例患者中有8例(73%)获得客观缓解，包括7例CRs(3例CLL和4例淋巴瘤)， 1例CLL Richter's转化患者的高级别淋巴瘤完全缓解。CAR-NK细胞可以持续至少12个月。表3 CAR NK细胞的临床试验表4 一期靶向CD19的CAR NK的临床试验总结CAR-NK细胞的局限性虽然CAR-NK细胞治疗比CAR-T细胞治疗的优势是显而易见的，正如上面讨论的，显著的局限性也存在。几乎所有与CAR-T治疗相关的限制也适用于CAR-NK细胞，从目标抗原选择，抗原异质性， CAR-T设计，制造到输注后挑战，如NK细胞迁移到肿瘤部位，敌对的肿瘤微环境。目前正在进行积极的研究，以改善CAR-NK的制造和储存，特别是“现成的”CAR-NK细胞，优化CAR-NK的结构，以增加CAR-NK渗透到肿瘤中，并保持免疫抑制TME的细胞毒性，并最大限度地减少靶向性和非肿瘤毒性。此外， NK细胞的半衰期较短(< 10天)，这是CAR-NK治疗中的一把双刃剑。这在发生严重毒性的情况下具有优势，但也产生了一个挑战，可能需要反复给药，以实现持久的反应。重新编程CAR-NK细胞，使其具有记忆细胞特性，并在体内长期存活，以进行持续的免疫监测和预防癌症复发是目前一个积极探索的领域。此外，与T细胞相似， NK细胞在细胞表面同时具有活化和抑制KIRs。有核细胞上普遍表达的MHC分子可抑制NK细胞功能。CAR-巨噬细胞来解决与CAR-T和CAR-NK治疗相关的未被满足的需求CAR-T治疗已经在血液系统恶性肿瘤中取得了很高的成功，但它还没有在实体肿瘤中取得成果，即使具有很强的临床前研究。血液病和实体恶性肿瘤之间存在着一些明显的区别。例如，在B细胞恶性肿瘤中观察到的CD19在实体肿瘤中存在罕见的靶抗原。这种显著的差异也可能是继发于血液肿瘤和实体肿瘤之间潜在的生理差异。当考虑癌症免疫周期时， CAR-T细胞绕过了该周期的前三个步骤:癌症抗原释放和呈现， T细胞启动和激活。然而， CAR-T细胞的有效性仍然受抗癌免疫的最后四个步骤的控制，即T细胞转移(步骤4)和渗透(步骤5)到肿瘤，识别(步骤6)和杀死肿瘤(步骤7)。如上所述，这四个步骤为T细胞创造了巨大的障碍。例如，许多实体瘤是免疫“冷”瘤，免疫细胞很少渗入TME。由于TME具有免疫抑制作用，即使在那些有显著免疫细胞浸润的癌症中，免疫细胞也不能消灭癌细胞。尽管CAR-NK细胞相对于CAR-T细胞有一些优势，但与CAR-T细胞相关的大多数障碍也适用于CAR-NK细胞。NK细胞通常不是TME中主要的免疫细胞群。武装CAR-NK细胞可以解决一些障碍。例如，在CAR-NK细胞中加入IL-15可以显著增强CAR-NK细胞在体内的扩张和持久性，提高小鼠模型的抗肿瘤活性和总生存期。由于迄今为止只有一项I期临床试验报道，尚不清楚用细胞因子武装CAR-NK细胞是否可以推广到其他恶性肿瘤。NK细胞一旦进入肿瘤部位，具有免疫抑制作用的TME可以抑制NK细胞的功能。由于与CAR-T和CAR-NK细胞治疗相关的障碍，最近CAR-巨噬细胞已经成为一种替代疗法。CAR巨噬细胞和CAR-T细胞有许多共同的特点和障碍，如特异性抗原的需求，抗原逃逸和下调，以及全身细胞因子的毒性。然而， CAR巨噬细胞在实体肿瘤的其他两个主要障碍上比CAR-T细胞具有独特的优势:免疫细胞贩运和渗透到TME，以及免疫抑制TME(表2)。由于免疫细胞向TME转运和浸润，巨噬细胞在许多肿瘤中大量存在，而T细胞浸润较差。新鲜冷冻肿瘤切片显示，巨噬细胞在许多癌症类型中占肿瘤浸润细胞的大多数，在黑素瘤、肾细胞癌和结直肠癌中高达50%。TME巨噬细胞的浸润是继发于肿瘤部位分泌的许多细胞因子。缺氧诱导肿瘤细胞和间质产生细胞因子，如CCL2 (C-C motif chemokine ligand 2)、 CXCL12 (CX-C motif chemokine ligand 12)、 CSF1 (ColonyStimulating Factor 1)和VEGF招募巨噬细胞。一旦被募集到缺氧的TME中，这些可溶性因子的受体就会被下调，从而将巨噬细胞锁定在TME中。此外，巨噬细胞可以直接感知缺氧状态及其代谢产物，如低pH，并迁移到TME中。TME的另一个特点是免疫抑制微环境，这对T细胞来说是一个主要障碍，而对巨噬细胞来说则不是。由于这种环境，渗透到肿瘤部位的T细胞往往发展衰竭表型，有时不能被免疫检查点抑制剂逆转。巨噬细胞的情况可能并非如此。巨噬细胞大致分为两大类，经典活化的促炎M1巨噬细胞和交替活化的抗炎M2巨噬细胞。TAMs，尤其是M2 TAMs，被广泛认为是TME的中枢免疫抑制细胞群之一。甚至M2巨噬细胞虽然抑制了其他免疫细胞的功能，但仍具有吞噬功能。事实上， M2巨噬细胞比M1巨噬细胞具有更高的吞噬能力。此外，巨噬细胞具有较高程度的表型可塑性，可以对环境刺激作出反应，改变表型。CAR巨噬细胞中的CAR结构CAR -T细胞中的CAR-巨噬细胞具有与CAR-T细胞相同的结构，具有细胞外抗原结合域、铰链区、跨膜域和细胞内域(图1)。它们在细胞内信号域上有所不同。CAR-T巨噬细胞可以直接使用CD3ζ 胞内区域，就像CAR-T细胞使用的那样，CAR-T细胞包含基于免疫受体酪氨酸的激活基模(ITAMs]。在CAR-T细胞中， ITAMs在CAR结合时被Src家族激酶磷酸化，与串联的SH2 (tSH2)激酶ZAP70结合，并激活CAR-T细胞发挥细胞杀伤作用。巨噬细胞不表达ZAP70。它们表达另一种含有tSH2结构域的激酶Syk，可以结合CD3ζ并在巨噬细胞中转导吞噬信号。除了CD3ζ，其他含有itam的细胞内结构域，如Fc受体的γ亚基(FcRγ )和多个表皮生长因子样结构域蛋白10(Megf10)，也被使用，并可诱导类似CD3ζ 的吞噬作用。FcRγ 转化巨噬细胞中抗体依赖细胞吞噬(ADCP)的典型信号转导。Megf10在巨噬细胞吞噬凋亡细胞中发挥着重要作用。与第二代和第三代CAR-T细胞相似，一个额外的信号域增强了吞噬作用。含有CD3结构域而没有共刺激结构域的CAR-T细胞，正如第一代CAR-T细胞所见，其体内活性有限。因此，所有FDA批准的CAR-T产品都包含一个共刺激的细胞内结构域，要么是CD28，要么是4-1 BB(表1)。在CAR-巨噬细胞中也观察到类似的结果。此前有报道称，磷脂肌醇3-激酶(PI3K)信号通路对大颗粒吞噬作用十分重要。CD19 PI3K招募域与CAR -FcRγ 的串联融合使目标全细胞的吞噬能力增加了三倍。CAR-巨噬细胞的现状到目前为止， CAR-巨噬细胞研究主要处于临床前阶段，一项I期试验正在进行中，该试验使用自体CAR-巨噬细胞靶向HER2过表达的实体肿瘤(表5)。Morrissey等人系统分析了可用于构建靶向CAR-巨噬细胞的CD19-和CD22-的胞内结构域。CAR-巨噬细胞含有任何含有ITAM的细胞内结构域，CD3ζ，FcRγ或Megf10，具有相当的吞噬效率，而含有Bai1和MerTK细胞内结构域的CAR-巨噬细胞不能结合到目标珠。大多数CAR-巨噬细胞只内在化目标细胞的碎片，类似于trogocytosis或啃噬活细胞的现象。全细胞吞噬少见。阻断“don’t eat me”信号CD47或CAR的抗体含有FcRγ-PI3Kk招募域，增强了整个细胞的吞噬作用，但在孵育4-8小时后，仍只有不到10%的巨噬细胞包含整个细胞。Klichinsky等人报道了CD3ζ-based anti-HER2 CAR-巨噬细胞的产生和表征。在本研究中，一个复制无能腺病毒载体被用来高效和可复制地将CAR传递到巨噬细胞。腺病毒感染诱导CAR-巨噬细胞M1分化，并使TME向促炎状态倾斜，而不是与大多数肿瘤相关的抗炎M2状态。此外，腺病毒转导的CAR-巨噬细胞作为专业的抗原呈递细胞，除了靶向抗原外，可以交叉呈递肿瘤来源的抗原，从而更有效地激活T细胞。与这些体外发现一致，这些CAR-巨噬细胞显著延长了携带肿瘤植入物的小鼠的生存时间，并减少了肺转移。L.Zhang等人报道的一项研究通过诱导多能干细胞(iPSCs)来源的CAR-巨噬细胞解决了生物工程巨噬细胞用于癌症免疫治疗的低效问题。在本研究中，利用非整合的episomal载体编码重编程因子来诱导iPSC克隆。然后含有CD86和FcRγ 细胞内结构域的CAR被转导到iPSC诱导的巨噬细胞中。这些iPSC衍生的CAR-iMACs巨噬细胞(CARiMACs)具有M2表型。然而，在与目标细胞相遇时，这些CARiMACs可以吞噬目标癌细胞，并向促炎M1状态倾斜。体内研究表明， CARiMACs可以扩展、持久并发挥其抗肿瘤活性。W.Zhang等人利用CAR-巨噬细胞来解决细胞外基质(ECM)引起的肿瘤免疫细胞浸润不足。ECM为T细胞渗透到肿瘤部位并发挥其抗癌免疫功能创造了一个物理屏障。CAR-T细胞靶向癌症相关的成纤维细胞或基质降解酶，肝素酶，可以促进免疫细胞浸润和增强抗癌免疫。在Zhang的CAR-巨噬细胞中，靶向HER2的scFv是结合到铰链区域和CD147跨膜和细胞内结构域，生成CAR-147巨噬细胞。CD147通过基质金属蛋白酶（MMPs)的表达对ECM重构至关重要。由于CD147不转导吞噬信号， CAR-巨噬细胞与靶细胞的结合显著上调了某些MMPs的表达，但不影响其他巨噬细胞功能，如吞噬、活性氧(ROS)的产生和炎症细胞因子的分泌。与体外实验结果一致， CAR-147巨噬细胞上调少量MMPs的表达，显著降低肿瘤中胶原含量，诱导CD3+ T细胞浸润，抑制肿瘤生长。Niu等人报道了一项使用CAR-巨噬细胞靶向表达ccr7的免疫抑制细胞进行癌症免疫治疗的研究。这个组以前发现脂滴高-(LDhi)免疫抑制细胞表达cc趋化因子受体7(CCR7)，在肿瘤组织中积累，抑制抗癌免疫。因此， CAR巨噬细胞被设计表达CCR7自然配体CCL19 (C-C Motif Chemokine ligand19)作为细胞外结构域，以靶向表达CCR7的免疫抑制细胞。为了开发一个最佳的CAR结构，我们使用并比较了以下细胞内结构域:TLR2, TLR4, TLR6,MerTK，或经典的CAR- t激活域，4-1BBCD3ζ。含有MerTK或CAR-m(MerTK)的CAR-巨噬细胞在体外具有最强的吞噬和细胞杀伤活性。由于CCR7也在毛囊和肠绒毛中表达，当使用大剂量CAR-M(MerTK)时，观察到靶向非肿瘤毒性。低剂量时，能诱导CD3+T细胞向肿瘤浸润，增加促炎细胞因子的产生，抑制肿瘤生长，延长总生存期，减少转移，且毒性小。表5 近期CAR-巨噬细胞研究CAR-巨噬细胞的临床发展现状进展到目前为止，只有一项CAR-巨噬细胞的I期临床试验(Clinicaltrials.gov标识号:NCT04660929)。如上文所述，本临床试验是基于Klichinsky等人开发的CAR-巨噬细胞。本试验使用嵌合腺病毒载体Ad5f35修饰的CAR-巨噬细胞，并携带靶向HER2的单链抗体。腺病毒感染诱导巨噬细胞分化为促炎性M1样表型。该临床试验于2021年2月开始。到目前为止，还没有报告结果。第二项CAR-巨噬细胞研究也被注册(Clinicaltrials.gov标号:NCT05007379)。这是不是临床试验。本研究是一项观察性研究，目的是确定CAR-巨噬细胞在来自100名患者的患者源性类器官中的抗肿瘤活性。CAR-巨噬细胞的局限性CAR-巨噬细胞仍处于初期阶段，仅启动了一项临床试验，尚无结果报道。因此，许多限制还有待揭示。类似于CAR-T和NK细胞，CAR-巨噬细胞将需要经过7个步骤沿着癌症免疫周期来实现细胞毒性作用。巨大的努力正在优化CAR-巨噬细胞的结构，制造，储存，肿瘤浸润，和保留细胞毒性在TME。重复给药可能需要维持足够的CAR-巨噬细胞水平，以进行积极的癌症监测。使用巨噬细胞进行ACT治疗的一个主要优点是它有向肿瘤迁移和浸润的倾向。随着促炎型M1和抗免疫型M2表型间分化的可塑性，巨噬细胞向肿瘤的高浸润和向M2表型分化可促进肿瘤的生长和转移。M1表型的分化和保留正在研究中。结论综上所述， ACT联合CAR-T治疗已取得了较好的疗效迄今为止， FDA批准的5种CAR-T疗法在血液系统恶性肿瘤方面取得了巨大进展。实体肿瘤的CAR-T治疗由于缺乏癌症特异性抗原、 CAR-T细胞迁移到肿瘤部位的效率低、免疫抑制TME等原因而滞后。CAR-NK细胞也被研究并转化为临床试验。CAR-NK细胞有几个优点。有限的NK细胞寿命意味着更低的靶向/非肿瘤毒性风险;NK细胞释放的不同细胞因子谱降低了细胞因子释放综合征和神经毒性的风险；和降低的异源反应性的风险，允许使用NK细胞系生成现成的异源CAR-NK细胞。巨噬细胞是TME主要的浸润细胞之一。即使是免疫抑制的M2巨噬细胞也具有很强的吞噬活性。最近， CAR-巨噬细胞正在被探索作为一种替代方法的ACT。一项针对HER2表达实体肿瘤的CAR-巨噬细胞的临床试验正在进行中，临床前研究已经显示出有希望的抗肿瘤活性。未来的CAR-巨噬细胞治疗仍然需要克服CAR-T治疗遇到的一些其他障碍。由于肿瘤相关的巨噬细胞是TME的主要细胞类型和主要的免疫调节因子，因此开发CAR是一个主要的研究方向巨噬细胞不仅是一种吞噬机制，更重要的是，它是一种抗原呈递剂、TME修饰剂和免疫刺激剂，以促进抗肿瘤免疫。由生物制品圈&抗体圈主办的“2023生物制品工艺发展大会”将于9月22-23日在上海举办，本次大会将主要聚焦生物制品前沿技术、CMC、生产、工艺等热点话题进行探讨交流，涉及人用疫苗、兽用疫苗、抗体药、细胞治疗、基因治疗等生物制品领域。届时将邀请生物制品领域经验权威的专家进行报告，欢迎各界同仁参会学习交流。1.会议名称：2023生物制品工艺发展大会2.会议时间：2023年9月22-23日（周五、周六）3.会议地点：上海（酒店定向通知）4.主办单位：生物制品圈、抗体圈5.媒体支持：药时空、药创客、细胞基因研究圈6.报名方式及费用：扫描识别下方二维码进行报名登记。转发分享福利：生物医药研发企业、科研院校和监管机构人员，前100位报名人员转发分享至朋友圈本通知可免费参会（不含餐饮）报名后，加微信13585867695发截图给工作人员即可。组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。各类商务合作咨询：13585867695（同微信）大会日程识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

点击上方图片链接可报名疫苗佐剂（Vaccine adjuvants）被定义为与疫苗抗原联合给药时能够增强疫苗免疫反应的强度、广度和持久性的各种成分，被广泛用于疫苗开发，是大部分疫苗产品不可缺少的组成部分。佐剂的范围可以涵盖从合成小分子化合物到复杂的天然提取物和纳米颗粒材料。常见的有矿物盐，微生物产物，乳液，皂苷，合成小分子激动剂，聚合物，纳米颗粒和脂质体。尽管佐剂长期以来一直广泛用于疫苗中，但它们增强免疫反应的机制尚未得到很好的表征，因此对佐剂的作用机制几乎没有系统的概括和总结。此外，现已有或正处于研发阶段的佐剂平台，业内普遍对机制、特性、免疫有效性和应用场景缺乏系统和深入的了解，难以匹配和设计适合特定疫苗的佐剂。这些原因导致目前的疫苗产品在临床实践与应用中渐显颓势，如无法提供长期保护性免疫，无法为老年、易感人群提供有效的免疫保护。2023年7月19日，来自四川大学华西医院的研究团队在Signal Transduction and Targeted Therapy上发表了题为“Vaccine adjuvants: mechanisms and platforms”的综述文章，在本文中详细解读了疫苗佐剂增强疫苗效力的作用机制，并对当前已有的佐剂平台（含在研）进行了分析汇总。疫苗佐剂的作用机制根据作用机制，佐剂通常被分为免疫刺激剂（Immunostimulants）和递送系统（Delivery Systems）两大类，但核心概念不外乎通过直接或间接帮助疫苗成分激活APC，促进抗原呈递信号（图1，①）和共刺激信号（图1，②）产生。抗原呈递信号的产生，首先由抗原被摄取和处理后呈递在APC表面的抗原肽-主要组织相容性复合体（MHC）上，并与naive T细胞表面TCR受体结合诱导T细胞的激活。共刺激信号包括表达在APC表面的共刺激分子（例如 CD40、CD80、CD86）和分泌的炎性细胞因子（例如 IL-6、IL-10、IL-12 和 TNF-α），通过与naive T细胞表面共刺激受体（CD28或细胞因子受体）结合，诱导T细胞激活，增强适应性免疫反应。图1. 佐剂的作用机制示意图免疫刺激剂免疫刺激剂通常为危险信号分子(Danger signal molecules)，以化学合成的小分子激动剂充当PAMP，DAMP，通过靶向APC上的模式识别受体(PRR)，触发先天免疫反应并诱导APC的激活和成熟。APC成熟后终止抗原吞噬活性，并增强其抗原呈递和表达高水平共刺激信号和细胞因子的能力，启动并增强适应性免疫反应。需要注意的是，不同类型的免疫刺激剂会通过不同PRR发出信号并导致不同的细胞因子分泌。目前所使用的免疫刺激剂主要按靶向受体的不同分为4类（图2）。图2. 免疫刺激剂作用机制靶向TLRs免疫刺激剂通过靶向激活TLRs（Toll 样受体），可以增强抗原呈递并上调共刺激信号和细胞因子表达（图2a）。TLR1，TLR2，TLR4，TLR5和TLR6通常在细胞表面表达，主要识别生物膜成分，包含脂质，脂蛋白和蛋白质。作用于该类TLRs的相应免疫刺激剂将促进促炎细胞因子，如IL-1β，TNF-α和IL-6的产生，并最终激活Th1或Th2型免疫应答。TLR3、TLR7、TLR8和TLR9是在细胞囊泡中表达并与核酸反应的细胞内TLRs。相应类型的免疫刺激剂激活这些细胞内TLR通常会导致I型干扰素的产生。27I型干扰素可促进Th1细胞分化并调节其功能。此外，I型干扰素通过常规树突状细胞（DC）促进抗原交叉呈递到CD8 T细胞，并直接刺激CD8 T细胞的增殖。靶向cGAS-STING通路cGAS-STING全称为环鸟苷单磷酸-腺苷单磷酸合酶-干扰素基因刺激因子，该通路在协调先天免疫和适应性免疫方面具有独特的作用，受到佐剂研发科学家们的广泛青睐（图2b）。cGAS是一种细胞质DNA受体，被双链DNA激活后将促进胞质单磷酸腺苷(Adenosine monophosphate, AMP)和鸟苷单磷酸(guanosine monophosphate, GMP)环化形成环鸟苷酸-腺苷酸(cGAMP)。随后cGAMP将与STING二聚体的V形结合域结合，引起STING的构象变化，聚集和活化，并激活NF-κB和IRF3，促进促炎细胞因子和I型干扰素表达。靶向CLRsC型凝集素受体（CLR）是一个超家族，包括Dectin-1，Dectin-2，MINCLE，DC-SIGN，CD206，CD205等，主要位于细胞膜上，作为抗原受体参与抗原捕获和抗原呈递（图2c）。具有碳水化合物结构的免疫刺激剂通常会激活CLR，随后诱导APC启动抗原的内化，加工和呈递，以增强适应性免疫应答。此外，一部分免疫刺激剂激活CLRs后可激活不同信号通路，诱导特定细胞因子的表达，控制naive T细胞的极化方向。如β-葡聚糖通过激活Dectin-1诱导Syk激酶磷酸化，进而激活NF-κB通路，促进促炎细胞因子IL12，IL-1β，IL6和IL23的表达，诱导naive T细胞分化为Th1和Th17细胞。Th1细胞诱导强烈的CTLs（细胞毒性T淋巴细胞）反应，并驱动B细胞中免疫球蛋白转化为IgG2a。Th17效应细胞的特征在于产生IL-17，IL-17F和IL-22，并通过募集中性粒细胞引发大量炎症反应。靶向其他PRRs 除上述机制外，免疫激动剂还可激活其他PRRs，主要分为核苷酸结合寡聚结构域样受体(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors, NLRs) 和视黄酸诱导基因I样受体(Retinoic acid-inducible gene I-like receptors, RLRs)。核苷酸结合寡聚化结构域1(NOD1)、核苷酸结合寡聚化结构域2(NOD2)和NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)是NLRs家族的主要成员。免疫刺激剂通过激活该类受体可诱导APC上调MHC II，增强抗原呈递。此外，该类受体的激活将导致促炎细胞因子如IL-1β和IL-18的表达，驱动naive T细胞偏向极化为Th2型细胞，产生Th2细胞免疫反应。视黄酸诱导基因I(RIG-I)和黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)是RLRs家族的主要成员，主要识别RNA。激活RIG-I和MDA5将导致IRF3和IRF7的激活，进而诱导I型干扰素的表达。靶向这两种受体的免疫刺激剂最终偏向于导致Th1细胞和CTL的产生。递送系统递送系统通常被定义为搭载抗原以增加APCs对抗原摄取和呈递的载体材料。主要促进抗原的呈递，包括APCs对抗原的识别、摄取和内化。因此，递送系统通常可以以一种或多种方式增强抗原呈递信号（图3）。图3. 递送系统作用机制延长抗原生物利用度目前延长抗原生物利用度的策略主要有（1）允许抗原持续释放；（2）形成免疫生态位；（3）为抗原载物提供保护延长生物利用度，使APCs有足够抗原促进MHC抗原肽信号产生。抗原持续释放目前已被证实可实现抗原持续释放的递送系统，包括纳米乳液递送系统(MF59, AS03)，可注射水凝胶以及可生物降解的PLGA或聚酐聚合物制成的固体聚合物颗粒。此外，具有大孔结构的自组装支架也具有缓慢释放抗原的能力，且还可同时搭载免疫刺激剂来释放炎症信号，提高血清抗体水平和CTL水平。形成免疫生态位一些递送系统可以通过在注射部位形成抗原库/免疫生态位来实现更高效的免疫活化。除了延长抗原在免疫系统中的作用时间，还可招募更多的免疫细胞浸润注射部位，这将增加抗原的摄取并提供局部炎症线索来激活随后的适应性免疫反应。先天免疫细胞的浸润会进一步使得生态位形成递送材料比常规递送材料具有更强大的免疫激活能力，并可掺入细胞因子，增加细胞迁移。可注射聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯热敏水凝胶可同时包封GM-CSF和卵清蛋白，增加注射部位DCs的募集，并提高抗原摄取效率。介孔二氧化硅棒是一种具有自佐剂效应的递送材料，可以激活NLRP3先天免疫路径。当注射到小鼠体内时，它会增加先天免疫细胞对注射部位的浸润并增强免疫反应。为抗原载物提供保护递送系统可以通过保护以DNA和mRNA为主的抗原免受体内酶的分解来延长抗原的生物利用度，从而保持其生物活性。mRNA抗原容易被细胞外血清中的RNA酶降解。LNP是一种经过验证的有效mRNA递送系统，其基本功能之一是封装mRNA并保护其免受降解RNA酶的影响。增强APCs靶向性 递送系统可通过两种主要方式增强APCs靶向性。第一种方法是通过模拟病原体的大小、维度和空间结构，利用微尺度或纳米级材料来促进APC摄取抗原。与可溶性抗原相比，用脂质体纳米颗粒包封抗原可改善APC对抗原的识别和内吞作用，从而增加抗原呈递和诱导更高幅度和更高亲和力的抗体。此外，免疫系统会以高度敏感的方式识别和响应病原体固有的高度有序和重复的空间结构，自组装蛋白质纳米颗粒和其他多价颗粒递送系统通过模拟病原体的这类结构可有效增加APCs抗原摄取率。值得注意的是，即使没有补充其他免疫刺激剂，这些递送系统也能引起强烈的体液和细胞免疫反应。递送系统高度有序和重复的空间结构也有利于B细胞受体（BCR）的共聚集，导致B细胞的强激活。第二种方法是通过直接靶向APCs表面特定受体（Fc受体，CLR）增加抗原摄取。纳米颗粒递送系统的表面可以被特异性修饰以主动靶向特定的细胞群。使用CLRs配体（通常是碳水化合物，如甘露糖）来修饰递送系统将导致抗原更直接地靶向特异性DC，从而增强抗原摄取。淋巴结递送由于淋巴结是初始免疫反应的部位，聚集大量先天免疫细胞和淋巴细胞，因此成为递送系统的关键靶点。常用方法通过设计合适尺寸和表面特性（如电荷和疏水性）可以使递送载体通过被动扩散进入淋巴管和淋巴结。据报道，最佳尺寸在通常在5到100 nm之间，若过小就会进入毛细血管而太大就难以通过淋巴管内皮细胞间隙。在该种方法中，递送材料通常设计为携带负电荷，避免与淋巴管间质基质中带负电荷的糖胺聚糖相互作用降低通过效率。另一种方式被称为内源性白蛋白“搭便车”机制。内源性白蛋白是脂肪酸分子的转运蛋白，利用其在淋巴系统中的循环特性，将抗原与内源性白蛋白结合，可实现淋巴结的靶向。早前报道的一项具有亲脂性尾巴的肿瘤肽疫苗通过结合白蛋白在淋巴结中大量积累，小鼠注射后使T细胞产量增加30倍，抗肿瘤功效显著增强。抗原的交叉呈递抗原的交叉呈递是外源性抗原通过MHC I分子呈递给CD8 T细胞的过程，也是抗病毒感染疫苗和癌症疫苗设计中的重要一步。在正常情况下，外源性抗原大多仅由APC单独内化，并由MHC II分子呈递给CD4 T细胞，不会发生任何交叉呈递。研究已报道三种主要方式：质子海绵效应当具有质子胺基团的阳离子聚合物或脂质递送载体被APC内化后将缓冲内涵体/溶酶体的酸性环境，导致大量氯离子和细胞质的水流入使得内涵体/溶酶体肿胀破裂，释放抗原并促进MHC I分子抗原的交叉呈递。内涵体/溶酶体膜融合一些递送系统通过融合或结合内涵体/溶酶体膜来破坏稳定性，促进抗原释放。颗粒化乳液(PAPE)就可通过结合内涵体/溶酶体膜，破环其稳定性，使抗原释放到细胞质中并交叉呈递给CD8 T细胞。光化学内化释放技术将光敏剂掺入递送系统中和抗原一起递送，光敏剂暴露于特定光源后会被激发形成单线态氧(singlet oxygen)，导致脂质过氧化和内涵体膜破坏，使抗原释放到细胞质中，增强CD8 T细胞介导的免疫应答。经典佐剂平台铝佐剂，MF59，AS01，AS03，AS04和CpG ODN 1018是经典的人用疫苗佐剂。它们已被广泛批准用于各种疫苗，并用于增加疫苗抗体滴度和增强细胞免疫反应。铝佐剂铝佐剂是第一类获准用于人用疫苗的佐剂，上市疫苗中常用的两种铝基佐剂是氢氧化铝和磷酸铝，具有广泛认可的安全性和可靠性。铝佐剂通过促进Th1细胞反应来增强IgG2和IgE抗体的产生。然而，铝助剂的作用机制很复杂，学术界仍在争论，但已在延长抗原的生物利用度和激活先天免疫途径的PRR这两个机制上得到了充分的认识。铝佐剂可以充当与抗原紧密结合并持续释放抗原的递送系统延长抗原的生物利用度并增加抗原呈递。此外，铝佐剂也可作为免疫刺激剂诱导DAMPs的产生，从而激活先天免疫途径的PRR，从而产生IL-1β和Th2型免疫应答等细胞因子。有研究表明，铝佐剂可在注射部位诱导宿主细胞死亡并释放宿主DNA或尿酸充当内源性危险信号，作为DAMPs诱导先天免疫途径的激活。目前学术界的争论点在于铝佐剂靶向的PRR，但并不影响铝佐剂成为疫苗行业的首选佐剂。含铝佐剂广泛用于预防和治疗各种疾病，包括白喉、破伤风、脑膜炎和乙型肝炎病毒（HBV）疫苗，已获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准。然而，铝佐剂也有一些缺点，包括难以诱导强烈的细胞免疫反应和引起不良反应（红斑，过敏反应）的可能性。目前佐剂研究科学家致力于改进配方和开发纳米铝佐剂来克服现有的缺点。 图4. 铝佐剂激活的信号通路乳佐剂MF59由角鲨烯、吐温80和司盘85组成。MF59于1997年获准作为流感疫苗佐剂，成为第一个获准用于人用疫苗的非铝佐剂。MF59乳剂具有抗原递送和免疫刺激的双重功能。MF59可用作乳液递送系统，当与抗原共同递送时，它可以延长抗原与免疫系统的相互作用，并通过在淋巴结中缓慢释放抗原来增加抗原呈递，可激活更多的APC抗原信号呈递。此外，MF59还充当免疫刺激剂。MF59可以靶向特定的PRR，并通过诱导产生内源性危险信号激活先天免疫细胞。在肌肉中施用MF59可激活先天免疫细胞，如巨噬细胞和DC，并促进趋化因子如CC-趋化因子配体2（CCL2），CCL4，CCL5和CXC-趋化因子配体8（CXCL8）的产生。这些趋化因子又可以将更多的先天免疫细胞募集到注射部位以进一步放大免疫反应，并促进这些招募的先天免疫细胞迁移到引流淋巴结以激活B细胞和T细胞。然而，MF59的确切靶向PRR尚不清楚，一般认为MF59可能通过NLRP3非依赖性ASC激活途径和TLR非依赖性MyD88激活途径起作用。简而言之，接种MF59佐剂会导致Th2偏向的免疫反应和体内Th1反应的弱诱导。目前，MF59已广泛应用于多种人用疫苗中，并显示出良好的安全性和有效性。AS03由α-生育酚、角鲨烯和吐温80组成，和MF59佐剂作用相似。与MF59一样，AS03通过NLRP3非依赖性ASC激活途径和TLR非依赖性MyD88激活途径发挥免疫刺激作用。此外，AS03还含有α-生育酚作为额外的免疫刺激剂成分。研究表明，α-生育酚参与调节某些趋化因子和细胞因子的表达，如CCL2、CCL3、白细胞介素6和CXCL1，可增强APC的抗原摄取，增加募集到引流淋巴结的先天免疫细胞的数量。一般来说，AS03也主要诱导Th2偏向的免疫反应，对Th1反应的诱导较弱。AS03主要用于多种流感疫苗中，以增加抗体的滴度和持久性。最近，AS03在COVID-19疫苗（NCT04450004，NCT04405908）的开发中也显示出良好的临床益处。基于TLR激动剂分子的佐剂AS04是通过铝吸附TLR4激动剂分子制备的，含有铝佐剂，因此还具有免疫刺激和传递抗原的功能。但AS04的免疫刺激功能强于铝佐剂，这是因为AS04含有一种更有效的免疫刺激分子，称为单磷酰脂质A（MPLA）。MPLA是从LPS中分离出的低毒性衍生物，可以特异性激活APC上的TLR4，导致NK-κB的激活和促炎细胞因子的表达，从而产生更强的Th1细胞反应。此外，当将补充AS04的疫苗与仅补充铝佐剂的疫苗进行比较时，发现补充AS04的疫苗诱导了更高水平的抗体。这证明了TLR4激动剂MPLA在AS04中起到重要作用。总体而言，AS04可以诱导比铝佐剂更强的抗体反应和Th1细胞反应，并诱导更平衡的Th1 / Th2免疫反应。目前被批准主要用于人瘤病毒（HPV）疫苗（Cervarix）和HBV疫苗（Fendrix），增加抗体产生和抗原特异性T细胞的活化。CpG ODN 1018是一种人工合成的单链DNA分子，作为TLR激动剂已被广泛研究。CpG ODN 1018特异性激活TLR9，并导致TRF7的激活，进而导致促炎细胞因子和I型干扰素的表达，最终引起强烈的Th1型细胞反应和细胞毒性T细胞产生。CpG ODN 1018最初被批准用于HBV疫苗，目前正在临床试验中作为COVID-19疫苗（NCT04450004，NCT04405908）的潜在疫苗佐剂进行评估。三叶草生物SCB-2019的CpG ODN 1018佐剂COVID-19疫苗已经在国内获紧急使用授权。微粒佐剂系统AS01是一种经典的脂质体微粒佐剂系统，含有免疫刺激剂MPLA和从Quillaja Saponaria(QS)树皮中提取的称为QS-21的活性成分，具有抗原呈递和免疫刺激的双重功能。该脂质体是一种中空磷脂双层人造膜，可用于抗原的包封和递送，保护抗原不被降解并延长其生物利用度，从而使APC能够捕获更多的抗原信号。AS01的MPLA通过TLR4激活先天免疫系统，促进Th1型反应增加。QS-21激活APC中的NLRP3，随后激活半胱天冬酶1以促进活性细胞因子IL1β，IL18和IL33的表达。此外，还发现QS-21可促进内涵体逃逸并促进交叉呈递。总体而言，这两种免疫刺激剂成分协同作用，使AS01诱导以Th1为主的免疫反应并促进CTL的产生。AS01是已获得许可的疟疾和带状疱疹疫苗的一部分。最近，AS01还被应用于开发针对结核病的新型肽疫苗（M72 / AS01E），并显示出在健康成人中预防结核病的安全性和有效性前景（NCT01755598，NCT01755598）。研究中的佐剂平台目前被广泛使用的佐剂在增强疫苗效力的同时也暴露了一些问题。例如，它们增强疫苗免疫力的能力较弱，不提供长期保护性免疫力，对老年人群效果较差。此外，这些批准的佐剂大多只能诱导抗体反应，诱导CD8 T细胞介导的细胞免疫能力较弱，这对于针对病毒感染性疾病和癌症疫苗至关重要。大多数许可佐剂的作用机制在很大程度上仍不清楚，这可能导致这些佐剂的不当使用和无法控制的副作用。因此，需要新型佐剂来解决这些问题。双链核糖核酸 （dsRNA）人工体外合成的双链RNA（dsRNA）可以靶向并激活APC上的TLR3和MDA5，导致促炎细胞因子如IL-12和I型干扰素的产生，并促进强Th1极化免疫反应和CTL的产生。Poly-I：C及其修饰的变体Poly-ICLC是研究最多的合成dsRNA免疫刺激剂。在体外实验中，poly-I：C和poly-ICLC诱导人外周血单核细胞来源DC的成熟，促进IFN-β和促炎细胞因子IL-6和IL-12的分泌，使外源性抗原与CD8 T细胞发生交叉呈递并触发Th1极化免疫反应。poly-I：C和poly-ICLC在临床上多用于肽疫苗，DC疫苗和全细胞疫苗，主要用于多种癌症疫苗的开发。在癌症疫苗中添加poly-I：C或poly-ICLC可增强疫苗诱导的抗肿瘤T细胞和NK细胞反应，从而有助于肿瘤消退或根除。然而，值得注意的是，poly-I：C/poly-ICLC 除了具有触发强大免疫反应的功能外，还可能具有剂量依赖性全身发热和凝血异常等副作用。因此，应考虑合理的给药系统以保护其免受降解，在剂量上需要确保激活APCs并减少副作用。图5. 目前用于癌症疫苗开发的poly-I：C/poly-ICLCGLA及其衍生物吡喃葡萄糖脂质A（GLA）是一种人工合成的LPS模拟物，是MPLA的替代品，通过激活APC上的TLR4在体内诱导Th1型免疫反应。GLA通常制备为吡喃葡萄糖基脂质A-水性纳米悬浮液（GLA-AF），吡喃葡萄糖基脂质A-稳定乳液（GLA-SE），吡喃葡萄糖脂质A-脂质体（GLA-LS）和吡喃葡萄糖脂质A-氢氧化铝（GLA-明矾），以GLA-SE在临床前和临床研究中研究最多。在几项临床试验中，当GLA-SE被用作结核病疫苗的佐剂并针对ID93重组蛋白进行测试时，发现该疫苗可诱导高滴度抗原特异性抗体产生和CD4 T反应，在接种疫苗的人群中显示出良好的安全性和免疫原性（NCT01599897，NCT02465216，NCT02508376，NCT01927159）。咪唑喹啉咪唑喹啉能够激活TLR 7/8通路，激活NF-κB和IRF7，促进促炎细胞因子和I型干扰素的表达，引起强大的Th1细胞免疫反应和CTLs产生。咪喹莫特（R837）、瑞西莫特（R848）和3M-052（也称为替拉莫德）是临床前和临床环境中研究最多的咪唑喹啉佐剂。大量证据表明，R837在黑色素瘤、HPV、乳腺癌和T细胞淋巴瘤疫苗中表现出很强的佐剂作用。病毒疫苗和肿瘤疫苗与R848相结合已被证明可诱导更强的体液反应和CD8 T细胞免疫反应。然而，咪唑喹啉作为疫苗佐剂仍存在一些缺点。具体而言，它们经常从注射部位扩散至全身，从而远离抗原，降低疗效并诱发全身副作用。因此，这些咪唑喹啉佐剂需要与合成聚合物支架、纳米凝胶、脂质基纳米颗粒或其他递送材料偶联，以增强其免疫作用并减少其副作用。环状二核苷酸 （CDN）CDN可以靶向并激活cGAS-STING途径，导致IRF3和NF-κB的激活，诱导I型干扰素和促炎细胞因子的产生，刺激抗原交叉呈递并产生强烈的Th1型细胞响应和CTL响应。目前还未有使用这些合成CDN作为疫苗佐剂的具体例子。由于这些合成CDN在临床前和临床试验中已显示出显着增强人体免疫反应的能力，我们相信使用这些合成CDN作为疫苗佐剂的愿望将很快实现（NCT03172936，NCT03010176，NCT03010176，NCT04096638，NCT04020185），利用纳米颗粒包封CDNs被视为提高CDNs体内利用效率的策略。代谢佐剂 一些靶向代谢途径的小分子调节剂被发现可用作新型疫苗佐剂。靶向甲羟戊酸途径的小分子抑制剂在增加小鼠和食蟹猴的抗体滴度和增强细胞免疫反应方面显示出佐剂作用，延长抗原保留从而增强了抗原呈递。许多研究结果表明，细胞代谢途径的酶或调节因子可能是设计和开发新型佐剂的潜在靶标。锰佐剂及其衍生物锰（Mn）及其衍生物被发现具有潜在的佐剂活性，可充当cGAS的激活剂，诱导2'3'-cGAMP的非规范催化合成，并通过这种方式激活cGAS-STING的先天免疫途径，诱导I型干扰素的产生。研究人员开发了一系列基于Mn纳米助剂，例如纳米级锰凝胶（MnJ）。它不仅具有激活cGAS-STING通路作为免疫刺激剂诱导I型干扰素产生的能力，而且还具有携带抗原的递送系统作用。研究中的递送系统平台 脂质纳米颗粒LNP 是非病毒纳米脂质囊泡递送系统，由可电离脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇修饰脂质组成。可电离脂质是LNPs的主要成分，磷脂和胆固醇有助于LNPs的结构完整性，聚乙二醇改性有助于维持LNPs的稳定性。LNP的作用机制主要包括（1）为抗原提供有效的货物保护，延长其生物利用度;（2）增加抗原的粒径以靶向APCs并促进APCs吸收;（3）通过膜融合促进抗原从内体逃逸，引起CD8 T细胞免疫应答。LNP已被用于各种疫苗的递送，也被认为是目前最适合mRNA疫苗的递送系统聚合物颗粒聚合物颗粒一般分为天然聚合物颗粒和合成聚合物颗粒，主要实现抗原的缓慢释放。疫苗递送中最常用的天然聚合物是壳聚糖。壳聚糖具有高阳离子电荷和生物粘附特性。因此，壳聚糖可以通过静电相互作用与阴离子核酸形成紧密的络合物。此外，壳聚糖的生物粘附特性使其能够长时间与粘膜表面保持接触，促使抗原持续刺激免疫细胞，表明壳聚糖可能是核酸疫苗和粘膜疫苗的有前途的递送系统。此外，壳聚糖最近还被发现通过激活cGAS-STING通路诱导CD8 T细胞免疫的I型干扰素产生。与天然聚合物相比，合成聚合物颗粒通常具有更高的重现性和更可控的缓释速率。PLGA是一种合成聚合物颗粒材料，现在被广泛用作疫苗递送的载体。目前，PLGA颗粒作为癌症疫苗的输送系统已经经过临床测试（NCT01753089，NCT04751786）。此外，PLGA已被FDA批准用于兽用药物递送。因此，相信基于PLGA的疫苗递送系统将在不久的将来被批准用于人类疫苗。病毒样颗粒 （VLP）VLP来源于病毒衣壳的外壳蛋白，由蛋白质单体的自组装形成，其出色的粒径和几何形状使其成为递送疫苗抗原的有效平台，使疫苗很容易进入淋巴管，靶向淋巴结。由于VLPs的高度有序和重复的空间结构，非常有利于交联BCR，即使在没有T辅助（Th）细胞的情况下也能强烈激活B细胞。目前，基于VLP的疫苗已经取得成功，并且已经在市场上广泛使用，例如用于HPV的Cervarix®和Gardasil®，用于肝炎病毒的Sci-B-Vac™以及RTS,S VLP疫苗。蛋白质纳米颗粒笼（Caged protein nanoparticles）笼状蛋白质纳米颗粒通常由一系列重复的基序组成，这些基序允许抗原表位或抗原掺入其亚基结构中，从而使这些掺入的抗原表位或抗原显示在组装颗粒的表面上。与VLP类似，笼养蛋白质纳米颗粒具有高度有序和重复的空间结构以及淋巴结运输的最佳大小等特性。然而与VLP不同，笼状蛋白质纳米颗粒是非病毒来源的。蛋白质纳米颗粒中，铁蛋白应用最频繁。铁蛋白是一种具有八面体对称结构的蛋白质，由24个亚基自组装形成，每个亚基由四个α-螺旋束组成。无机纳米材料金纳米颗粒是常用的无机纳米材料输送系统之一。由于金纳米颗粒的大小、形态、疏水性、表面电荷、均匀性和分布等理化性质可以通过材料合成和表面化学修饰来精确调节，以形成特定的免疫类型，因此近年来金纳米粒子作为一种有前途的抗原递送系统获得了广泛关注。金纳米颗粒通过（1）保护抗原免受降解和（2）形成合理粒径的纳米疫苗以促进抗原直接转运到淋巴结来促进抗原呈递并增强适应性免疫反应。有研究报道，金纳米颗粒可以通过激活NLRP3炎症小体和促进Th2型细胞因子的产生来增强抗原特异性抗体的产生。与金纳米颗粒类似，介孔二氧化硅纳米颗粒（MSN）也具有负载能力强和易于表面改性的特点。改良的MSN已被研究为有效的疫苗递送系统，当用作癌症疫苗递送系统时，它增加了抗原特异性CTL的产生，抑制了小鼠的肿瘤生长，提高了荷瘤小鼠的存活率。总结选择合适的佐剂来辅助抗原呈递和改善免疫反应是开发新疫苗的重要问题。在佐剂的选择上，除了需要考虑给药途径，病原体类型，抗原类型和疾病阶段外，还需要重视接种者的生物学特征，如种族、年龄、病史和遗传因素。此外，在作为疫苗产品研究时，还需要考虑佐剂的安全性和经济性。最终这些因素都将或多或少影响疫苗佐剂的有效性。撰文：三姐夫 来源：RNAScript识别微信二维码，添加小编，符合条件者即可申请加入微信群！请注明：姓名+研究方向！声明：本文旨在传递更多信息，版权归原作者所有。原创文章转载均需经过授权并注明来源，如涉及内容、版权或其他问题请时联系小编删除！文章仅代表作者个人观点，并不代表公众号立场。本公众号拥有对此声明的最终解释权！投稿邮箱：yck19876@163.com