PSMA x 4-1BBL

摘要：嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法的出现，为儿童和成人患者中复发/难治性血液系统恶性肿瘤的长期清除带来了前所未有的成果。然而，与CAR-T细胞相关的严重毒性，如细胞因子释放综合征和神经毒性，影响了治疗的实用性；并且对实体瘤的治疗效果仍然不够令人印象深刻。因此，出现了修改其他免疫细胞类型的工程策略，特别是自然杀伤（NK）细胞。由于CAR依赖性和CAR非依赖性（先天免疫介导的）抗肿瘤杀伤能力、主要组织相容性复合体非依赖性细胞毒性、降低异体反应风险以及缺乏主要CAR-T细胞毒性，CAR NK细胞构成了有前景的下一代CAR免疫细胞，并且也适用于“现成的”治疗。在这篇综述中，我们比较了CAR-T和CAR NK细胞疗法，特别关注免疫突触、工程策略和挑战。 引言 CAR T细胞疗法基于用重组抗原特异性CAR分子对T细胞进行工程改造，赋予CAR T细胞目标特异性细胞毒性，独立于T细胞抗原受体（TCR）。与传统的细胞毒性T细胞功能不同，后者受TCR复合物在T细胞上与目标细胞上的主要组织相容性复合体（MHC）分子的结合和识别的限制，CAR介导的CAR T细胞的细胞毒性是非MHC限制性的。CAR T细胞在患有复发/难治性血液系统恶性肿瘤的患者中实现了持久的缓解。然而，严重的毒性，如细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性，以及对实体瘤的有限疗效，促使人们改造具有细胞毒性潜力的替代免疫细胞，如NK细胞。尽管美国食品药品监督管理局（FDA）批准的所有CAR T细胞疗法都依赖于患者衍生的和工程改造的CAR T细胞的自体转移以避免移植物抗宿主病（GvHD），但FDA也批准了基因改造的同种异体CAR T细胞的临床试验。目前正在研究低免疫原性同种异体CAR T细胞的开发，以实现健康捐赠者的同种异体CAR T细胞的大规模工程和输血。在这篇综述中，我们比较了T细胞和NK细胞抗肿瘤细胞毒性的机制、CAR设计和工程策略，并讨论了解决CAR T细胞和CAR NK细胞疗法面临的挑战如何影响它们未来的应用，特别是针对实体瘤。 NK细胞是如何与T细胞一起抗击癌症的NK细胞是先天免疫细胞，作为第一线的防御者。与T细胞不同，NK细胞的抗肿瘤功能独立于MHC分子，并且不需要抗原启动。NK细胞表达一系列激活受体（aNKRs）和抑制受体（iNKRs）；取决于aNKR和iNKR信号之间的协调是倾向于NK细胞激活还是抑制，分别导致目标细胞的裂解或免疫自我耐受。当肿瘤细胞下调自身MHC I类分子，创造出“缺失自我”的状态，或者通过aNKRs识别肿瘤相关的压力配体时，NK细胞的脱颗粒和目标细胞裂解就会发生。NK细胞的细胞毒性也可以通过FasL与肿瘤细胞上的相应受体结合发生，通过抗体依赖性细胞毒性（ADCC）发生，涉及NK细胞上的CD16与抗体结合的目标细胞的结合，或者间接通过释放免疫原性细胞因子。免疫系统与实体瘤的战斗涉及一个复杂的先天和适应性免疫细胞网络。这些细胞在肿瘤内的丰度和它们的信号协调影响肿瘤进展或控制的命运。在新转化的实体瘤中，NK细胞可以检测到肿瘤细胞亚群上的压力配体。 CAR NK细胞相对于CAR T细胞的优势  CAR NK细胞相对于CAR T细胞具有几个优势，可以用来治疗实体瘤。例如，CAR NK细胞可以利用NK细胞的先天抗肿瘤能力，同时更倾向于目标特异性的杀伤。这使得CAR NK细胞能够杀死表达目标的癌细胞（CAR介导的杀伤）和缺乏目标的癌细胞。 (CAR独立/先天NK细胞毒性介导的)，这一优势对于治疗实体瘤尤为重要，对于治疗实体瘤来说尤其重要，因为这些肿瘤通常以抗原异质性和逃避免疫细胞毒性为特征。由于大多数NK细胞的细胞毒性能力在癌症患者中在肿瘤进展过程中以及在如手术等治疗性方案后会降低，大多数CAR NK细胞需要同种异体来源。迄今为止，对接受同种异体CAR NK细胞治疗的患者进行的临床研究记录显示，由于缺乏MHC I类限制，没有发生移植物抗宿主病(GvHD)。 尽管可逆，细胞因子释放综合征(CRS)是一种危及生命的状况，通常发生在接受CAR T细胞治疗的患者中，这是由于效应免疫细胞的过度激活和血清细胞因子水平的放大分泌，无论是由CAR T细胞还是CAR T细胞激活的巨噬细胞分泌的，包括干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞炎症蛋白-1(MIP-1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1，也称为CCL2)和白细胞介素-6 (IL-6)及IL-10。然而，在接受CAR NK细胞治疗的患者中，CRS的发生率非常低。虽然原因尚未完全理解，但在CAR NK细胞治疗后CRS病例的罕见可能部分归因于NK细胞激活后不同的细胞因子谱，包括干扰素γ、肿瘤坏死因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和趋化因子CCL1、MCP-1、MIP-1α（也称为CCL3）、MIP-1β(CCL4)、CCL5和CXCL8，以及与CAR T细胞试验相比完成的CAR NK细胞临床研究的数量有限。 此外，从脐带血、干细胞分化、外周血或NK细胞系大量生产CAR NK细胞的前景对于未来的现成生产是有希望的。例如，在一项研究中，通过在70天内进行五轮刺激，从脐带血中获得的NK细胞扩增了大约1100万倍，从外周血中获得的NK细胞扩增了超过2500亿倍。在另一项研究中，使用辐照的自体外周血单核细胞、IL-2和抗CD3抗体的混合物，可以获得高达15000倍的高活性外周血衍生NK细胞扩增。 CAR与典型T细胞和NK细胞免疫突触的比较  CAR淋巴细胞与目标肿瘤细胞之间形成的免疫突触的类型和特征对CAR淋巴细胞抗肿瘤效果至关重要（图1）。CAR T细胞与肿瘤细胞的第一次接触涉及通过形成免疫突触，在T细胞上的CAR分子与肿瘤细胞上的目标抗原之间进行识别和稳定结合；然而，由CAR分子形成的免疫突触与典型TCR在许多方面都有所不同。一个经典的成熟的免疫突触由三个同心的超分子激活簇(SMACs)区域组成，这些对于TCR细胞毒性功能是必不可少的。在溶解性免疫突触中，中央SMAC由Lck激酶-TCR微簇组成，参与启动激活信号级联和释放溶解颗粒。外围SMAC控制LFA-1整合素与目标细胞表面的ICAM-1粘附分子的结合，被认为是稳定突触的，远端SMAC主要是一个含有如CD43和CD45等糖萼蛋白排斥因子的肌动蛋白环，这些因子保护T细胞，并由CD2的冠与目标细胞上的CD58结构域相互作用，从而实现额外的共刺激信号。然而，在某些情况下，单个受体的参与或膜微簇的形成就足以触发T细胞激活，无需成熟的突触形成。另一方面，CAR T细胞中的免疫突触不涉及成熟的突触形成，而是包括复杂的Lck微簇，对LFA-1的依赖性较小，并且缺乏粘附环。这种较不组织的突触使得CAR介导的参与更快，随后比TCR更快地释放信号级联，并且与更快的细胞毒性颗粒分泌和随后CAR从目标细胞上的脱离有关。 肿瘤激活的NK细胞释放XCL1、XCL2和CCL5趋化因子，吸引传统的1型树突状细胞（cDC1s），导致炎症活跃的微环境，通常被称为“热肿瘤”。新抗原呈递或肿瘤相关抗原（TAA）呈递的cDC1s在肿瘤引流淋巴结中启动CD8+ T细胞，使进一步的T细胞浸润和MHC I类介导的肿瘤细胞裂解成为可能。多克隆的CD4+和CD8+肿瘤浸润性淋巴细胞，包括一个能够通过MHC II类介导的肿瘤杀伤的细胞毒性CD4+ T细胞亚群，具有多样化的TCR库和不同的记忆分化和耗竭表型，响应于这种启动而浸润实体瘤。免疫逃逸可以通过肿瘤细胞分泌前列腺素E2来促进，它不仅阻断了CD8+的细胞毒性，还降低了NK细胞的存活率、活性以及趋化因子CCL5和XCL1的分泌，这削弱了NK细胞介导的cDC1s到肿瘤微环境（TME）的招募。肿瘤细胞内在的对干扰素-γ（IFNγ）的敏感性，由活化的TAA特异性CD8+ T细胞分泌，促进肿瘤细胞上PD-L1和其他免疫检查点配体的表达，通过与T细胞上的相应检查点受体（如PD-1）结合，使肿瘤细胞对T细胞细胞毒性产生抗性。在这种情况下，免疫检查点阻断（ICB）可以是一种有效的免疫疗法；然而，肿瘤也可以通过减少抗原呈递来逃避T细胞细胞毒性并获得对ICB的抗性，从而使肿瘤内的T细胞通过CXCL12-CXCR4介导的趋化作用进入邻近的淋巴结。由于iNKR与自身MHC I类复合物的结合有利于NK细胞的抑制，ICB耐药肿瘤细胞中MHC I类复合物的丢失通过限制iNKR的结合，重新使肿瘤内的NK细胞敏感，从而恢复NK细胞的细胞毒性。然而，并非所有肿瘤内的NK细胞都具有细胞毒性。一项研究发现，在三阴性乳腺癌患者中存在一个促进肿瘤发生的亚群Socs3hiCD11b−CD27−未成熟NK细胞，这与预后不良相关，并可能促进肿瘤进展和阻碍异种移植小鼠模型中ICB的效力。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和髓源性抑制细胞被肿瘤细胞招募以创造一个缺氧和免疫抑制的TME。抗炎M2样巨噬细胞通过释放抑制性的转化生长因子-β（TGFβ）并推动NK细胞上CD85j抑制性受体的上调来抑制NK细胞的脱颗粒和功能。根据肿瘤类型、恶性阶段和TME的状态，TAMs可以通过向CD4+ T细胞交叉呈递新抗原来增强抗肿瘤功能，这些T细胞获得细胞毒性能力。TAMs也可以帮助肿瘤逃逸。最近的研究显示，TAMs是TME内主要的葡萄糖消耗者；通过细胞内在的持续糖酵解作用导致TME内乳酸积累，TAMs有利于调节性T（Treg）细胞的招募和CD8+ T细胞的驱逐。髓源性抑制细胞表达NK抑制性配体，分泌活性氧，有助于抑制性的腺苷和TGFβ的积累，并激活Treg细胞释放更多的TGFβ，这些协调作用对NK和T细胞功能有严重影响。TME中丰富的Treg细胞和表达PD-1的滤泡调节性T（TFR）分化细胞，具有强大的免疫抑制能力，可以减少肿瘤浸润性淋巴细胞的细胞毒性，并可能进一步抑制抗PD-1 ICB的效力。因此，持久的免疫抑制TME和克服肿瘤免疫逃逸机制对于成功的CAR T或CAR NK细胞疗法至关重要。 图1 | T细胞和NK细胞中的典型免疫突触与CAR免疫突触。辅助T细胞-APC相互作用代表了TCR和MHC之间典型的免疫突触。这种免疫突触由中心TCR-Lck复合体（中心SMAC）构成，但不包含溶解颗粒，周围是由外周LFA-1/ICAM-1组装（外周SMAC）和伴随CD45和CD2结合的远端肌动蛋白聚合环（远端SMAC）所环绕。CTL-肿瘤细胞溶解突触具有类似的SMAC簇，但也涉及MTOC极化后的中心SMAC内溶解颗粒释放。NK溶解免疫突触包括aNKR配体结合以及CD16介导的ADCC，抑制性NK细胞受体-自身MHC I类结合的丰度低或缺失，并由LFA-1/ICAM-1的外周组装所环绕。NK细胞在静息阶段含有溶解颗粒，并且只有在涉及MTOC极化的时空有序的信号级联发生后，才会经历“定向分泌”。CAR T细胞中的免疫突触包括卷曲的CAR-Lck微簇，对LFA-1的依赖性较小，并且缺乏粘附环。同样，CAR NK细胞的免疫突触涉及溶解颗粒释放和多个CAR-抗原聚集，但在突触裂隙处的肌动蛋白组织较少。PDZ CAR NK细胞-肿瘤细胞溶解突触与CAR NK细胞相比具有更好的突触组织，其特征是Scribble的积累以及浓缩的突触区域和激活的ZAP70与溶解颗粒的增强聚集。使用BioRender.com创建。 NK细胞的功能取决于aNKRs和iNKRs之间的信号平衡。抑制性受体，如人类杀手免疫球蛋白样受体（KIR）和小鼠Ly49，在维持自身MHC I类耐受对内源性健康细胞的同时，在促进NK细胞激活对抗低MHC I类表达细胞的过程中也起着关键作用，这一过程被称为“教育”。在NK细胞激活过程中，NK溶解免疫突触的形成始于含有SH2结构域的磷酸酪氨酸磷酸酶-1（SHP-1）形成小的中心簇，周围环绕着LFA-1，随后是细胞毒性颗粒在中心SMAC中的聚集，而LFA-1重新定位到外围，这一步骤使得NK细胞激活突触对低MHC I类表达目标的教育成为可能。有趣的是，在未受教育的自耐受小鼠Ly49A+ NK细胞（来自MHC I类敲除小鼠）与经过MHC I类分子H2Dd教育的自耐受Ly49A+ NK细胞（来自H2Dd转基因小鼠）中，SHP-1在NK细胞激活突触中的聚集模式不同，包括SHP-1在激活免疫突触中的积累程度以及SHP-1与F-肌动蛋白和SLP-76信号适配器的共定位。研究表明，激活突触中SHP-1的积累导致下游信号蛋白的去磷酸化，以维持“自我耐受”。一旦激活突触通过iNKRs接受“教育”，SHP-1就被排除在激活突触之外，从而解除抑制，激活下游信号，并提高NK细胞的响应性。 一般而言，免疫突触形成的多步骤过程对于许多免疫细胞相互作用都是成立的，包括辅助T细胞-抗原呈递细胞（APC）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）-肿瘤细胞，以及NK细胞-肿瘤细胞或NK细胞-健康细胞。对于溶解突触，它始于抗原识别和受体信号，并随后是效应器激活、微管组织中心（MTOC）极化和脱颗粒，并以从溶解目标细胞的解离结束，使免疫稳态和串行杀伤级联成为可能。然而，研究表明NK和CTL溶解突触之间存在一些动力学和机械转导差异。与T细胞不同，T细胞是在激活后诱导溶解颗粒，NK细胞在静息阶段就含有溶解颗粒，因此在激活和突触形成期间遵循精确的空间时间机制的溶解颗粒分泌，这一过程称为“定向分泌”。NK细胞也可以通过聚集iNKRs，例如与健康细胞上的自身决定因素结合的KIR，形成抑制性突触，形成超分子抑制簇，阻止SMAC形成并保护健康细胞不受溶解。NK细胞膜突出物有助于抑制性突触形成和细胞间蛋白转移。在一项研究中，从肝癌患者体内分离的肿瘤内NK细胞与肿瘤周围NK细胞或健康供者的外周NK细胞相比，膜突出物较少。肿瘤诱导的丝氨酸代谢改变降低了肿瘤内NK细胞膜中的鞘磷脂水平，导致膜突出物调节异常，损害了溶解突触形成和细胞毒性。阻断鞘磷脂代谢增加了解离自膜突出物的突触数量，并在体外以及在肝癌人源化小鼠模型中恢复了肿瘤内NK细胞的溶解活性。 由于CAR溶解突触需要比典型免疫突触更高的抗原识别阈值才能启动杀伤，并且更容易受到磷酸酶诱导的失活，科学家们假设通过靶向细胞极化并引发CAR免疫突触的更有序组装，可能会实现更好的CAR实体瘤细胞毒性。通过将细胞毒性和调节性T细胞分子（CRTAM）的突触后密度-95、discs large和紧密连接蛋白-1结合基序（PDZbms）插入到称为CAR PDZ NK的CD28z CAR的C末端，生成了突触调节的CAR NK细胞。与传统CAR NK细胞相比，这些发现表明体外增强了亲和力、抗原敏感性、细胞毒性、突触强度和CAR PDZ NK细胞极化，以及在实体瘤小鼠模型中延长了CAR PDZ NK细胞的存活和持久性。同样，当在T细胞中测试时，CAR PDZ构建物与传统CAR T细胞相比，在体外和异种移植小鼠模型中都有增强的效应功能。 CAR T细胞与CAR NK细胞工程 CAR设计的相似之处、差异和进展 与传统的T细胞受体（TCR）相比，CAR是一种合成受体，它赋予CAR T细胞以非MHC限制性机制的靶向特异性细胞毒性。第一代CAR由一个细胞外的单链可变片段（scFv）构成，通过一个铰链域和跨膜域连接到C末端的CD3ζ激活域，该激活域将非TCR外部-内部激活信号传递到T细胞。然而，第一代CAR T细胞的临床效果有限，可能是由于有限的植入和细胞毒性。为了提高CAR T细胞的细胞毒性、产生细胞因子和对目标刺激的增殖能力，后来对CAR分子进行了修改，包括插入一个（第二代）或两个（第三代）细胞内共刺激（ICS）域在CD3ζ上游（见图2a）。值得注意的是，CAR模块化域或链接结构的任何遗传改变都可能影响CAR T细胞的亲和力、效力和持久性。目前美国食品药品监督管理局（FDA）批准的六种靶向CD19或BCMA的CAR T细胞疗法已经在许多血液恶性肿瘤患者中实现了持久缓解。然而，为了创造下一代CAR T细胞以治疗实体瘤并增强CAR T细胞的细胞毒性、持久性、渗透性和安全性，已经实施了额外的工程策略。 CAR NK细胞采用了用于CAR T细胞工程的CAR骨架，但在跨膜和ICS域方面有更多的变化[7]（见图2a）。将scFv替换为aNKR的细胞外域，如NKG2D CAR T细胞和CAR NK细胞，可以增加对传统NK细胞靶标的效力。纳米抗体是单域骆驼抗体片段，由于更高的稳定性、改善的TME渗透性和更容易的遗传工程，比传统的单克隆抗体表现更好。对于CAR T细胞和CAR NK细胞，将CAR scFv域替换为纳米抗体在临床前对血液和实体瘤都显示出有效性。CAR NK细胞的一个主要特点是缺乏MHC依赖性细胞毒性，这使得来自健康捐赠者的异体NK细胞可以耐受MHC I类分子在供体和受体之间的差异。然而，从健康捐赠者异体CAR T细胞中遗传删除TCR以及MHC类-I相关和MHC类-II相关基因，以及在诱导的多能干细胞（iPS）细胞衍生的CAR T细胞中过表达HLA-E，允许生成通用CAR T细胞，这些细胞可以承受受体宿主免疫系统而不会诱发GvHD。尽管供体细胞中MHC类I的遗传删除提供了来自受体异体T细胞的保护，但它创造了一个“缺失自我”信号，使供体细胞暴露于受体NK细胞攻击。因此，规避受体NK细胞细胞毒性的策略包括额外过表达HLA-E、HLA-G或CD47，以生成低免疫原性CAR T或CAR NK细胞。 图2 | CAR设计和工程策略以克服实体瘤逃避CAR T和CAR NK细胞。a，典型TCR信号涉及Lck、CD3ζ和ZAP70的顺序激活，以及SLP76和LAT的磷酸化，它们与GADS和PLCγ形成信号复合体，导致T细胞激活。第一代CAR通过一个重组细胞外（Exc）域通过一个铰链和TM域连接到细胞内CD3ζ作为主要激活信号，以促进CAR细胞激活。在第二代和第三代CAR中，信号由一个或两个ICS域支持。LINK CAR T细胞使两个scFv CARs的门控激活成为可能，其信号取决于SLP-76与LAT作为ICS域的复合，仅当肿瘤细胞上呈现两种认知抗原并且与scFv CARs结合时。b，通过工程DN-TGFβ-RII单独或与IL-15受体激动剂（HCW9218）复合；DN-PD-1作为ICB；或者通过遗传删除T细胞或NK细胞中的负调节因子来阻断CAR细胞功能障碍。增强CAR T细胞细胞毒性的方法包括工程化TRUCK CARs，这些CARs使CAR诱导的细胞因子分泌，插入细胞因子受体作为额外的ICS，工程化组成型活性IL-7受体（C7R），或者通过过度表达orthoIL-2/orthoIL-2Rβ。增强CAR NK细胞细胞毒性的方法包括增加细胞因子载荷或使用K562/4-1BBL/膜结合IL-21（mbIL-21）或K562/膜结合IL-15（mb15）/4-1BBL饲养细胞，或补充IL-2、IL-15和/或IL-21的培养基，体外扩增CAR NK细胞。通过与IL-12、IL-15和IL-18的刺激，可以产生具有改善持久性和代谢适应性的类似记忆的CAR NK细胞。多靶向CAR设计的例子以克服抗原异质性和丧失包括IL-13/抗EphA2 Tan-CAR T细胞或一种多靶向CAR NK细胞，该细胞共表达肿瘤可切割的抗CD73 scFv连接到抗GD2 CAR以及NKG2D CAR。抗CD73 scFv与CD73的结合阻止了从腺苷酸（AMP）产生免疫抑制腺苷。通过过度表达趋化因子受体或肝素酶，可以增强CAR T细胞的渗透和持久性，肝素酶降解蛋白聚糖和其他细胞外基质（ECM）蛋白，与CAR一起。αFAP-scFv CAR T细胞靶向癌症相关成纤维细胞上的FAP，以减轻FAP诱导的ECM重塑。将scFv替换为FAP在CAR NK细胞上改善了ECM降解，并增加了NK细胞的渗出和渗透。癌症相关成纤维细胞（CAF）、成纤维细胞激活蛋白（FAP）、髓源性抑制细胞（MDSC）。使用BioRender.com创建。 成功实施CAR T和CAR NK细胞疗法的另一个主要挑战是，由于正常组织共享抗原识别，存在严重的肿瘤外毒性风险。为了缓解这个问题，已经开发了几种逻辑门控和开关受体CAR T细胞[1]。最新的是一种可逆的布尔逻辑AND门控细胞内网络(LINK) CAR，其中CD3ζ被替换为细胞内近端下游信号分子LAT和SLP-76，以产生CD19-28TM-LAT和HER2-8TM-SLP-76 CAR T细胞(图2a)。CD19+ HER2+ 目标细胞诱导的LINK CARs刺激在体外和体内效应功能改善以及限制肿瘤外靶向毒性方面，优于以前开发的逻辑门控平台。同样地，对于CAR NK细胞，SENTI-202是一种新型的“或门和非门逻辑门控”CAR NK细胞候选物，它被设计成通过一个或门激活CAR靶向急性髓系白血病(AML)相关靶标FLT3或CD33，同时通过一个非门EMCN靶向抑制性CAR，避免健康造血干细胞受到肿瘤外毒性的影响。这最终将增强AML白血病干细胞/母细胞肿瘤清除，同时减少对骨髓移植的需求。 针对血液肿瘤的CAR T和CAR NK细胞的临床试验已在其他地方讨论。这里我们关注以实体瘤为靶标的CAR T或CAR NK细胞的临床试验，从Clinicaltrials.gov截至2023年7月1日提取，胶质母细胞瘤、乳腺癌和卵巢癌是目标肿瘤列表中的首选。对于CAR T细胞，针对实体瘤的试验总数为340（23项已完成，23项正在进行/不招募，165项积极招募或邀请注册，67项状态未知，33项暂停/终止/撤回，29项尚未招募）。与此同时，已报告19项针对实体瘤的CAR NK细胞试验（9项积极招募，6项状态未知，4项尚未招募）。表1列出了所有CAR NK细胞试验和已完成的针对实体瘤的CAR T细胞试验。虽然来自CAR T细胞疗法的临床数据未能再现血液肿瘤的持久反应率，但CAR NK细胞的数据仍在等待中。对于CAR T和CAR NK细胞来说，肿瘤内归巢和在实体瘤环境中的持久性是尚待克服的主要障碍。缺乏关于CAR NK细胞在实体瘤中的归巢的临床数据；然而，从第一个CAR NK细胞试验中推断出的投入，该试验利用了携带人类IL-15的CD19 CAR NK细胞，证明了输注的CAR NK细胞在患者外周血中至少持续1年，尽管水平较低。在NK细胞中过表达DNAM-1和/或NKG2D是增强NK细胞肿瘤内渗透的提议策略之一，并已在体外对患者衍生的肉瘤标本显示出有效性。 增强CAR T和CAR NK细胞特别是对实体瘤的抗肿瘤细胞毒性是一个不断增长的研究领域。研究人员使用的策略包括工程化共刺激域，增强CAR修饰细胞的激活细胞内信号。尽管TCR是介导T细胞细胞毒性的唯一主要受体，但许多跨膜共刺激分子，如CD28、4-1BB、ICOS和OX-40，可以放大TCR下游的信号能力，以获得优越的细胞毒性效果。这些分子中的每一个都有利于不同的信号通路，一旦包含在CAR构建物的ICS域中，就会影响CAR T细胞的细胞毒性、增殖和持久性。与此同时，NK细胞有各种激活和抑制受体，它们招募不同的下游信号介导者，其信号线索的微调控制了NK细胞的激活与抑制作用。研究表明，使用NK特异性信号域，如2B4和DAP10或DAP12，作为ICS域，定制NK细胞的CAR工程，可以增加CAR NK细胞抗肿瘤功效和IFNγ分泌，与T细胞定制的CAR构建物相比（图2a）。 克服实体瘤逃逸是CAR基础细胞工程中另一个积极扩展的领域。克服CAR T和CAR NK细胞功能障碍的方法包括过表达TGFβ（DN-TGFβ-RII）或PD-1（DN-PD-1）的优势负性受体(DNRs)，或遗传删除包括PD-1和二酰甘油激酶在内的负面CAR细胞调节器。正交和/或膜结合细胞因子/细胞因子受体工程策略也已被用于增强CAR T或CAR NK细胞的抗肿瘤功能。通过CAR T或CAR NK细胞对TAAs进行多靶向和串联靶向可以提高对实体瘤及其相关抗原异质性或丢失的功效，与单一CAR相比。改善CAR T或CAR NK细胞通过基质屏障的运输和渗透的策略包括过表达趋化因子受体，生成FAP-scFv CAR T或过表达FAP的CAR NK细胞，或过表达肝素酶。图2b总结了已经研究的突出工程方法。 增强抗肿瘤效果的联合免疫疗法 癌症免疫疗法是一系列旨在动员并增强免疫细胞效应功能以消灭肿瘤的治疗方式。图3a描述了CAR T和CAR NK组合免疫疗法的主要模型。 重组单克隆抗体或作为替代品的纳米抗体可以用多种方式增强CAR T和CAR NK细胞的功能[57]。激活性单克隆抗体作为特定激活受体或共刺激分子（如CD28、4-1BB和SLAMF7）的激动剂，对T细胞或NK细胞的扩增和持久性很重要。肿瘤特异性单克隆抗体单独使用或与高亲和力CD16的过表达结合，通过抗体结合的肿瘤细胞的Fc部分的包被作用，将CAR表达细胞重定向至肿瘤细胞和/或增强ADCC功能。阻断性单克隆抗体（如ICB中使用的）通过阻断免疫检查点受体或配体（如TIM3、CTLA4和PD(L)-1）靶向免疫抑制性的TME。尽管FDA批准的ICB作为单一疗法为一些实体瘤患者提供了持久缓解，但在许多其他患者中失败是因为肿瘤特异性的一级和二级抵抗机制。NK抑制性受体阻断单克隆抗体通过模仿通常在抑制配体下调或丢失时发生的“缺失自我”信号，促进NK功能。其他阻断性单克隆抗体靶向炎症性细胞因子受体。例如，tocilizumab是一种FDA批准的阻断性单克隆抗体，靶向IL-6受体（IL-6R），用于管理CAR T细胞诱导的CRS。免疫结合剂，如BiTE和TriTE（对T细胞）以及BiKE、TriKE和TetraKE（对NK细胞），是双特异性或多特异性T细胞或NK细胞结合剂，结合了scFv、纳米抗体和/或其他分子如细胞因子，以促进CAR表达细胞有针对性地消灭肿瘤。 Lenalidomide是E3泛素连接酶途径的免疫调节剂，具有多种免疫效应。除了诱导肿瘤细胞周期停滞外，lenalidomide可以通过阻断血管生成和抑制Treg细胞来调节TME，以及介导恢复与淋巴瘤相关的免疫突触缺陷。与T细胞结合使用时，lenalidomide是一种共刺激剂，增强了抗CD133或抗HER2 CAR T细胞对实体瘤的细胞毒性和细胞因子分泌。在I期临床试验中，lenalidomide促进了NK细胞的扩增，与抗抑制性KIR疗法结合使用，增强了对多发性骨髓瘤的类固醇节约细胞毒性。 溶瘤病毒是一组经过工程改造的病毒，可以增强肿瘤免疫原性和树突状细胞诱导的NK细胞活性，以及实现转基因的肿瘤靶向传递。溶瘤病毒表达截断CD19（OV19t）和抗CD19 CAR T细胞的联合瘤内治疗导致实体肿瘤消退。同样，溶瘤病毒表达人类IL-15/IL-15受体α sushi结构域融合蛋白（IL-15–suIL-15Rα）复合物（OV-IL15C）和抗EGFR CAR NK细胞的组合，在胶质母细胞瘤小鼠模型中引发了协同抗肿瘤细胞毒性和CAR NK细胞的持久性，并改善了生存率。 对于所有这些组合疗法，正在进行血液和实体瘤的临床前和临床评估。虽然ICB与CAR T细胞结合使用的临床评估看起来很有前景，但它在CAR NK细胞毒性中的作用还有待商榷。基于纳米抗体的疗法可能很快会在针对实体瘤的免疫疗法时代占据主导地位，因为它们能够穿透密集的基质；然而，纳米抗体从循环中的快速清除需要额外的工程化。增强两种CAR基础疗法的细胞毒性和持久性的细胞因子装甲已被证明是有效的，还有更多灵活的机会有待探索。最终，由不同癌症免疫疗法介导的多模式机制在增强CAR基础疗法时，考虑到可能的肿瘤外毒性，对未来选择与CAR T和CAR NK细胞一起的最佳组合免疫疗法至关重要。 这些数据来源：https://clinicaltrials.gov。DLL3，类DLL3配体3；CLDN6，紧密连接蛋白6；ROBO1，漫游导向受体1；MUC，粘液蛋白；Meso，间皮素；CIR，嵌合免疫受体；GPC3，糖蛋白聚糖3；CEA，癌胚抗原；CD133，蛋白I；CLDN18.2，紧密连接蛋白18.2；GD2，二唾液酸神经节苷脂；HCC，肝细胞癌；PSMA，前列腺特异性膜抗原；TNBC，三阴性乳腺癌；Cytoxan，环磷酰胺；Fludarabine，抗代谢物；Pembrolizumab，针对PD-1的单克隆抗体；Ezabenlimab，针对PD-1的人源化单克隆抗体；Aldesleukin，重组人类IL-2；AP1903，一种通过交联FKBP结构域发挥作用的化学二聚体剂。NA，不适用。 影响实体瘤中细胞毒性和持久性的挑战 用于体外扩增的T细胞来源包括外周血和iPS细胞衍生群体，很少有文献报告使用脐带血扩增的T细胞，因为这些细胞在扩增后往往富含Treg细胞。尽管CAR T细胞治疗在对抗血液恶性肿瘤方面取得了显著成功，但在对抗实体瘤方面却表现不佳[1]。除了长期体外扩增后诱导的CAR T细胞产品耗竭，影响记忆表型、寿命和增殖能力外，阻止CAR T细胞成功治疗实体瘤的第一障碍是由癌症相关成纤维细胞形成的密集基质，这抑制了CAR T细胞渗透到肿瘤部位。绕过这一障碍的肿瘤内CAR T细胞在持续刺激目标抗原和/或免疫抑制性肿瘤和相关TME后可能会变得耗竭。肿瘤逃逸可能发生，因为肿瘤试图通过突变逃避有效的肿瘤内CAR T细胞毒性，导致抗原丢失或抗原异质性。肿瘤内CAR T细胞也可能因内在和外在因素的复合作用而被驱逐到淋巴结，导致增殖能力降低和持久性丧失。 与可以存活数月的T细胞不同，NK细胞的寿命很短，年轻成人的半衰期不到10天，这一限制因素强调了需要反复输注NK细胞产品以维持体内的有效性和持久性。此外，扩增的NK细胞对冷冻和解冻的敏感性影响了输注后的细胞毒性和存活率。在三维肿瘤模型中，解冻后迁移NK细胞的比例下降了六倍，对细胞毒性效果有严重影响，这可能部分解释了冷冻保存的CAR NK细胞在体内的持久性受损。目前正在研究优化冷冻保存方案，包括使用替代二甲基亚砜的替代品，二甲基亚砜是传统上用于冷冻细胞的保护剂，以保持CAR T和CAR NK细胞在解冻后的完整性、活性、功能和效力，并促进未来的现成生产和冷冻保存。 体外扩增NK细胞需要用细胞因子进行启动，以防止NK细胞耗竭和衰老。NK细胞可以从多种来源扩增用于临床测试，如外周血、脐带血、iPS细胞和不朽的NK细胞系，如NK-92细胞；每种来源都有特定的限制和优势。CAR NK细胞的产生反映了未经编辑的NK细胞的体外扩增方案，尽管后者需要额外的病毒或非病毒工程以表达CAR构建物。这些扩增方案依赖于持续的细胞因子刺激，有或没有饲养细胞的共激活。尽管扩增的CAR NK细胞在体外对目标细胞提供了显著的细胞毒性，但研究表明，它们对细胞因子和激活信号的依赖可能是输注到患者后功能失常和寿命缩短的原因，特别是当这些信号线索在TME内变得稀疏时。 NK细胞暴露于许多肿瘤诱导和TME介导的细胞因子和代谢物中，这可以减少NK细胞的持久性和功能。对患者的血液和实体瘤样本分析表明，肿瘤介导和TME介导的NK细胞功能障碍，以及细胞毒性、持久性和寿命受损，可以总结为五种主要机制：耗竭、抑制、无反应、可塑性和增殖缺陷。导致NK细胞耗竭的肿瘤相关因素包括肿瘤细胞持续激活NK细胞导致效应功能降低。肿瘤相关和TME相关释放的TG-β和其他抑制性代谢物诱导aNKR下调；溶解颗粒释放减少；细胞因子产生缺陷；以及iNKR过度表达。无反应可能是由于过度抑制性信号或在缺乏iNKR许可的情况下持续刺激aNKR所致。由于NK细胞属于第1组先天淋巴细胞（ILC1），肿瘤相关因素诱导的ILC1和ILC3亚类之间的可塑性可能允许将传统的细胞毒性NK细胞转换为细胞毒性较低的或ILC1样表型，具有促肿瘤潜力。NK细胞功能障碍还伴随着增殖能力受损和NK细胞浸润数量减少。 图3 | CAR T和CAR NK组合免疫疗法及CAR细胞工程方法。a，抗CD3和抗CD3/抗CD28激活单克隆抗体偶联珠增强CAR T细胞扩增。CAR NK细胞激活单克隆抗体(mAbs)和纳米抗体(Nbs)的靶标包括共刺激分子和aNKR，单独或与高亲和力CD16(ha-CD16)的过表达结合。阻断单克隆抗体和纳米抗体针对免疫检查点受体或配体(ICB)、iNKR或IL-6受体(IL-6R)。FDA批准的阻断单克隆抗体的例子包括托珠单抗、阿特珠单抗、尼伏单抗和伊匹单抗。来普尼增强了CAR T细胞的细胞毒性和增殖，并且通过在多发性骨髓瘤(MM)细胞上增加aNKR配体的表达，与KIR阻断单克隆抗体(IPH2101)联合使用时增强了CAR NK细胞的细胞毒性。OV19t溶瘤病毒通过实体瘤细胞诱导截短型CD19(CD19t)的表达，使其易于受到抗CD19 CAR T细胞的细胞毒性，而OV-15C诱导肿瘤细胞表达和分泌人类IL-15/IL-15受体α寿司结构域融合蛋白(IL-15–suIL-15Rα)，这提高了抗EGFR CAR NK细胞的抗肿瘤效果。免疫结合剂的例子包括BiHC(抗HER2-Nb/抗CD3-scFv BiTE)或布利纳图单抗(抗CD19-scFv/抗CD3-scFv BiTE)用于CAR T细胞，以及抗EGFR-Nb/抗CD16-Nb BiKE或抗CD16-Nb/重组IL-15/抗CLEC12A-Nb TriKE，后者结合了ADCC和TAA特异性杀伤CAR NK细胞。b，病毒CAR转导导致CAR在T细胞或NK细胞内的整合。c，非病毒CAR工程策略的例子包括通过电穿孔或脂质纳米颗粒传递的mRNA，DNA纳米载体平台和转座子以及CRISPR-Cas9和碱基编辑作为基因编辑工具。正在开发中的先进策略包括使用生物材料进行体内CAR传递和扩增，以及通过顺序磁声激活将抗CD3/抗CD28珠与CAR T细胞结合创建的CAR T细胞基活体微型机器人(M-CAR T细胞)的靶向传递和扩增。使用BioRender.com创建。 当前CAR T和CAR NK细胞高效开发的工程策略包括通过额外的遗传操作或组合疗法来增强这些细胞，以解决T和NK细胞功能障碍和持久性问题。 增强CAR-T和CAR NK细胞的传递技术  传统的CAR T细胞生成涉及病毒载体传递CAR构建体，以实现高转导效率和CAR的稳定表达。最广泛使用的载体是慢病毒、逆转录病毒或腺相关病毒载体。与T细胞相比，NK细胞更难进行工程改造，这是由于其固有的抗病毒能力、对凋亡的高敏感性和有限的扩增潜力。由于慢病毒包膜直接影响原代NK细胞的转导效率，因此可以使用泡状口炎病毒G（VSV-G）、长臂猿白血病病毒包膜（GALV）、猫科内源性逆转录病毒包膜蛋白（RD114-TR）或狒狒包膜（BaEV）对慢病毒进行伪型化，后者显示出与逆转录病毒相当的转导效率。然而，增加的免疫原性、可能的插入突变、有限的插入大小、高昂的GMP级病毒生产成本和相关的监管复杂性是主要缺点，这些缺点激发了探索成本效益的非病毒传递途径。非病毒转座子平台Sleeping Beauty和PiggyBac能够更安全地整合CAR构建体，但效率低于病毒系统。通过电穿孔或脂质纳米颗粒传递的非病毒mRNA基CAR构建体产生高但短暂的CAR表达效率。科学家们还开发了一种简单、多功能、经济实惠、非病毒、非整合的DNA纳米载体平台，能够在体外和体内实现T细胞的非染色体CAR表达，且没有免疫原性或遗传毒性。其他的非病毒基因编辑平台包括CRISPR-Cas9，它能够实现CAR和其他有利基因的位点定向整合或免疫细胞负调节因子、TCR或MHC相关基因的删除。在一项研究中，通过结合T细胞相关基因的基础编辑和CAR-慢病毒转导，产生了抗兄弟细胞毒性的双重CAR T细胞。最后，生物材料传递车辆允许定向转移编辑或未编辑的免疫细胞，有病毒或非病毒编辑的选项，在体内，而无需事先的体外扩增，而基于CAR T细胞的活体微型机器人能够通过磁声激活实现CAR T细胞的靶向传递和激活。 结论  过去十年在CAR基础免疫疗法的工程方面取得了革命性的成功，已有六种FDA批准的CAR T细胞疗法使一些儿童和成人患者的血液恶性肿瘤实现了长达十年的缓解。然而，血液恶性肿瘤患者在接受CAR T细胞输注后的复发率是可变的，而且尚未实现对实体瘤有显著数量的完全缓解。CAR T和CAR NK细胞的耗竭、低反应性和被宿主免疫系统排斥被认为是许多患者肿瘤抵抗和复发的主要因素。因此，要实现CAR基础免疫细胞功能的最优化，需要解决这些细胞疗法面临的多重挑战，同时优化临床给药环境，并利用组合免疫治疗模式。 尽管一些CAR NK和CAR T细胞基础的临床前研究展示了对实体瘤的有效细胞毒性，但CAR NK细胞的临床数据很少，而CAR T细胞在临床上尚未成功。未来的治疗方案应该操纵工程策略和组合疗法，以解决阻碍CAR T和CAR NK细胞对实体瘤效果的挑战。这些挑战包括克服肿瘤诱导的抗原异质性或丧失；促进长期肿瘤内抗原遭遇，以实现有效的肿瘤细胞毒性；在肿瘤内维持更好的CAR表达细胞的持久性和保留；耐受缺氧和免疫抑制的TME；以及维持类似记忆的CAR细胞库，以实现更持久、更具肿瘤特异性的细胞毒性。与溶解性突触形成和稳定性相关的额外挑战，如免疫细胞-目标识别、结合动力学和效力，应该得到解决。应该继续研究消除受体中超活性或有毒CAR细胞的方法，包括逻辑门控和开关式CAR设计以及其他新方法，直到实现最佳平台。最终，成功开发针对实体瘤的高效CAR疗法可能需要一个全面的组合方法，而不是单独针对个别障碍。 未来需要从MHC不匹配的健康捐赠者那里生产“现成的”通用CAR T细胞产品，以促进在疾病关键阶段向患者、弱势社区或缺乏CAR T细胞开发设施的医疗机构提供已经FDA批准的产品。基于MHC非限制性细胞毒性、降低的肿瘤外靶向毒性和“现成的”生产便利性，我们预计未来十年将带来更多的研究结果，帮助优化NK细胞扩增工作流程；减轻NK细胞耗竭，改善解冻后恢复，并增强移植后的细胞毒性和持久性。然而，由于同种异体CAR NK细胞可能促进免疫原性并在后期被宿主免疫细胞排斥，因此需要进行额外的遗传操作，类似于应用于通用CAR T细胞的操作。也应该采用创造最佳无饲养层扩增的新型策略，以实现CAR NK细胞的大规模生产，并绕开监管和一致性问题。 关于CAR T或CAR NK细胞抗肿瘤效果的大多数临床可用数据都是从分析晚期癌症的重度预处理患者中推断出来的，同时缺乏作为早期肿瘤进展阶段的一线疗法的有效性证据。因此，进一步研究CAR基础疗法的最佳时间、剂量、途径和频率，将更好地指导临床决策，并扩大治疗适用患者的范围。CAR基础细胞疗法的另一个主要缺点是治疗成本的显著提高，包括对伴随副作用的症状管理。未来有助于降低成本的步骤包括优化“现成的”生产和冻存“通用”工程CAR产品，减轻肿瘤外靶向毒性，缩短体外扩增工作流程，优化非病毒CAR递送以及微调体内动力学和个别CAR设计的效力。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

在过去的十年中，用于癌症免疫治疗的4-1BB激动剂的临床开发引起了人们的极大兴趣。进入临床的第一代4-1BB激动型抗体Urelumab(BMS-663513)和Utomilumab(PF-05082566)分别因肝毒性或无效而失败。这两种抗体在亲和力、4-1BB表位识别以及决定FcγR交联活性的isotype上存在差异。基于这一经验，最近开发了一系列多样化的第二代4-1BB激动剂，旨在解决第一代激动剂的一些问题。目前许多第二代4-1BB激动剂药物也已进入了临床I期和II期研究。本文就第二代差异化的4-1BB激动剂分子做一个简要介绍。 第一代4-1BB激动剂 激动型4-1BB抗体的临床开发始于2005年的urelumab，这是一种人源化的抗4-1BB IgG4抗体。虽然最初的疗效还不错，但发生了两起由肝毒性引起的致命性不良事件。随后的研究表明，当urelumab在安全剂量(0.1mg/kg)下给药时，其效果非常有限。第二个4-1BB激动型抗体utomilumab是一种全人源抗4-1BB IgG2抗体，于2011年进入临床(NCT01307267)。与urelumab不同，utomilumab没有引起重大毒副作用，但它无论是作为单一疗法还是与利妥昔单抗联合使用疗效均有限，最终导致临床开发中断。 Urelumab和utomilumab表现出完全不同的特征，被认为可能影响毒性和疗效。Urelumab的亲和力(22或16.6 nM)高于utomilumab(69或71.2 nM)。然而，4-1BB激动性抗体的亲和力似乎不是激动性活性和肝毒性诱导的关键，而是由FC介导的交联和表位结合驱动的。 人IgG2(用于utomilumab)与人IgG4(用于urelumab)一样，表现出较低的铰链灵活性。因此，铰链灵活性可能不能解释urelumab较高的激动活性。Fc介导的交联，特别是与FcγRIIB的结合可以促进激动型抗体的活性。作为一种IgG4，urelumab对FcγRIIB具有更高的亲和力，因此可能介导更强的FcγRIIB依赖的激动性活性，但这可能不是utomilumab和 urelumab激动性差异的唯一因素。然而，FcγRIIB在肝脏中的交联与4-1BB激动型抗体诱导的肝炎有关。 Urelumab和utomilumab识别的不同表位已被广泛研究，以了解它们对观察到的差异的影响。Urelumab与4-1BB膜远端富含半胱氨酸的假重复序列结构域(CRD1)的表位结合，其不干扰配体4-1BBL的结合。utomilumab与4-1BB结构域CRD2和CRD3结合，并与天然配体竞争。因此，内源性4-1BBL与utomilumab竞争4-1BB受体结合并限制其4-1BB受体聚集活性，而urelumab的活性被内源性4-1BBL增强，导致超级激动性特性(图1)。 图1. Urelumab与utomilumab的区别 第二代4-1BB激动剂 根据已发布的报告和数据，目前至少有40多种4-1BB激动剂药物进入了临床试验（图2）。 另有几十种新的4-1BB激动剂正在积极的临床前开发中，预计未来将有更多的4-1BB激动剂进入临床。图2. 进入临床阶段的4-1BB激动剂药物继urelumab和utomilumab之后进入临床第二代4-1BB激动剂具有不同的分子的分子设计，大致可以分为两大类：基于IgG的分子和双、三或四特异分子(图3)。 图3. 第二代4-1BB激动剂的不同分子设计基于IgG的4-1BB激动剂 基于IgG的4-1BB激动剂部分遵循第一代4-1BB激动型的作用模式，即大多数依赖于功能性的FcγR交联，但结合的表位不同于urelumab和utomilumab（图3a）。ADG106、ATOR-1070、PE0116和CTX471是人IgG4亚型，类似于urelumab，但不识别urelumab的CRD1表位(图4)。ADG106、PE0116和ATOR-1070为4-1BBL所阻断，CTX-471非4-1BBL阻断，与表位CRD3和CRD4结合。这些抗体表位的改变旨在保持功能活性但又相对安全。 图4.第二代4-1BB激动剂结合表位示意图 两个IgG4抗体LVGN6051和STA551在Fc上做了突变，以通过增强FcγRIIB结合，从而促进FcγRIIB的超聚簇。另外，LVGN6051通过与4-1BB较弱的结合，STA551通过只有在TME中ATP浓度较高的情况下才能结合来避免全身活性。 AGEN2373和ADG206是人的IgG1亚型，因此将显示出更大的铰链灵活性。IgG1与IgG4具有类似的抑制型FcγRIIB亲和力，但对激活型FcγR，如FcγRI和FcγRIII的亲和力更高。对于ADG206，通过突变增加了FcγRIIB的结合。对于AGEN2373，其主要的MOA是由FcγRIIB交联激活4-1BB+效应T细胞驱动的，还是由4-1BB+Treg细胞通过ADCC和ADCP耗竭驱动有待进一步观察。 HOT-1030也是IgG1亚型，但通过突变抑制FcγR的结合。与urelumab类似，它与CRD1结合，因此它可以以超激动剂的方式交联4-1BBL结合的4-1BB受体。这使得HOT-1030可以依赖于内源性4-1BBL的存在，以FcγR不依赖的方式系统地激活4-1BB。开发该抗体是基于这样一种假设，即FcγRIIB交联而不是表位是观察到urelumab诱发肝脏毒性的主要驱动因素。 双、三或四特异性4-1BB激动剂 另一组第二代4-1BB激动剂是双、三或四特异性4-1BB激动剂(图3b)。 除了与4-1BB结合外，它们至少与一个其他靶点结合，从而使这些药物具有双、三或四特异性。第二个靶点大多是肿瘤细胞表面表达的靶点(HER2、PSMA、EGFRvIII、Claudin18.2、ROR1、Nectin-4、CD47、CD19、B7H4)、肿瘤间质和肿瘤浸润性淋巴结表面表达的靶点(FAP)、肿瘤细胞和抗原提呈细胞共同表达的靶点(PD-L1)或仅在免疫细胞上表达的靶点(CD40、OX40、CD3)。这些的靶点导致特定的靶向和超强交联，但也可以表现出激动性或抑制活性，从而进一步增加抗肿瘤特性。 基于IgG的双、三或四特异性的药物通常表现出Fc的修饰，以消除与FcγR的结合，但保持与FcRn的结合。消除与FcγR的结合的目的是防止全身活性，并抑制肝毒性。因此，这些类型的激动剂的原理是严格通过与交联靶部位的结合来提供交联，以提供更好的安全性。一些三特异性分子缺乏Fc(CB307，ND021/NM21-1480，MP0310)，但通过依靠与HSA的结合来增加半衰期。 大多数分子仍然显示抗体骨架或包括抗体衍生结合域，例如scFv(ABL503/TJ-L14B，ABL111/TJ-CD4B，ABL105/YH32367，ATG-101/YN051，LBL-024)， VH(CB307)， VH/VL(ND021/NM21-1480)，5sdAb(INBRIX-105/ES101)或VHH(PM1003，PM1032)。FAP-4-1BBL(RG7827)和CD19-4-1BBL(RG6076)是基于人4-1BBL胞外结构域融合到IgG1框架上的抗体融合蛋白；DSP107是一种没有抗体成分的三聚体融合蛋白。PRS-343和PRS-344/S095012在IgG4骨架的重链的C末端融合了两个anticalins。FS120和FS222含有一个二价结合Fcab(与抗原结合的Fc区)，它整合在Fc区C端。其他新的分子包括MP0310，使用“设计的锚蛋白重复蛋白”(DARPins)作为抗体框架的替代品；BT7480，基于双环肽平台，产生具有抗体样亲和力和特异性的分子。 表位结合 据预测，4-1BB激动剂的大小和表位可能对最佳突触的形成起作用。例如，对于ND021/NM21-1480，靶向4-1BB N末端(膜远端) 表位比膜近端表位功能要好。有报道预测140 Å是最佳的突触间距，这可能使较小的分子具有优势。 Hinner及其同事测试了不同的4-1BB anticalin融合位点，PRS-343具有HER2结合和4-1BB结合之间最大的距离，但在体外诱导了最佳的T细胞激活以IL-2和IFN-γ的分泌。因此，最佳的表位和突触空间可能取决于分子设计。 不同4-1BB激动剂一个重要的特征是4-1BBL非阻断或阻断特性。一方面，高水平的可溶性4-1BBL可能会阻碍4-1BB激动剂的功能。另一方面，一些临床前数据显示，抑制4-1BBL反向信号可导致更好的T细胞激活。4-1BB激动剂与CRD1(如Urelumab，HOT1030)或CRD4(如ABL50，ABL111，65AGEN2373，51PM1003，PM1032，49CTX-47135)的至少双价结合而不被4-1BBL阻断可能导致全身性激活，特别是含有高水平的可溶性4-1BBL。然而，ND-021/NM21-1480只能与一个4-1BB受体结合，因此在没有同时与PD-L1结合的情况下，不能使4-1BB受体超交联化。在PD-L1存在下，可溶性4-1BBL水平也可以增强ND-021/NM21-1480的功能。 对于大多数4-1BB激动剂，表位还尚未披露，尽管它已被预测为确定安全性和功能性的主要参数之一。 结合位点与结合亲和力之比 4-1BB激动活性强烈依赖于4-1BB受体的有效交联性。以往研究表明表明，较高的4-1BB与交联靶标个数的比率有利于最佳的4-1BB信号转导导致T细胞激活。然而，大多数双、三或四特异性激动剂显示偶数个4-1BB和交联靶部位，在图3b中描述为1+1、2+2或2+2+2+2或3+3。只有4个分子具有奇数个4-1BB结合位点，即2+1(MP0310和BT7480)或3+1比率(RG7827和RG6076)。在较低的交联靶标表达的情况下，不均匀的比率可以导致更好的4-1BB超聚集 (图5)。 图5.不同4-1BB受体与交联/靶标结合位点比对超交联性的理论影响这些在分子质量较高的情况下尤其重要(图6)，例如，在低交联靶表达的组织中的激活(如FAP)。虽然在临床前已经证明了高4-1BB/靶结合位点比的优点，但这在多大程度上转化为临床仍然未知。例如，在靶标表达高的情况下，具有较高的4-1BB/靶标结合位点比率的分子所提供的优势可能并不显著。此外，高的靶标结合亲和力导致靶结合位点和4-1BB结合位点之间差异具有诱导更好的功能性的潜在优势，特别是在低靶表达的情况下。 图6. 4-1BB激动剂的相对分子质量 如表1所示，大多4-1BB KD/靶标kD比率在100到500之间。然而，Gen1046/BNT311是一种PD-L1靶向的4-1BB激动剂，其4-1BB KD/靶KD比率低至0.94，并已在临床I期阶段试验中显示活性。 表1. 4-1BB激动剂药物结合 4-1BB KD和靶标kD 动物模型研究4-1BB激动剂的局限性 在临床试验中，第一个激动型4-1BB抗体urelumab在有效剂量(1或5 mg/kg)下诱导了两例与肝炎相关的死亡(NCT00612664)，而utomilumab是安全的，但显示出无效。4-1BB对肝髓系细胞的激活导致IL-27依赖的T细胞激活被描述为肝脏炎症诱导的机制。由4-1BB激动剂触发的非特异性肝记忆CD8+T细胞激活的肝巨噬细胞也被预测是可能的原因。此外，肝巨噬细胞分泌的可溶性因子S100A4已被证明是关键的，而其中和抗体能在不影响抗肿瘤效果的情况下可阻止4-1BB诱导的小鼠肝脏病变。 有研究表明，4-1BB抗体的结合表位和Fc Crosslinking而非高亲和力是降低肝毒性以及抗肿瘤活性的关键。但这些研究大多是在同基因小鼠或人类4-1BB转基因小鼠上进行的，存在一定的局限性，对人的临床可译性也有限。当4-1BB激动剂在小鼠中使用时，必须考虑到小鼠FcγR结合的跨物种反应性。Kamata-Sakurai和他的同事通过设计被称为StA-MB(用于STA551)和URE-MB(用于Urelumab)的小鼠替代物来显示小鼠IgG1(MB)的工程恒定区域来模拟小鼠的FcγRII交联，从而克服其中的一些限制。 此外，还必须考虑到，小鼠4-1BB/4-1BBL复合体是二聚体，不同于人4-1BB/4-1BBL三聚体，而且人4-1BB与小鼠4-1BBL不相互作用。因此，人4-1BB转基因小鼠模型不能用于预测内源性4-1BBL竞争或阻断作用。最近，人4-1BB/人4-1BBL双转基因小鼠也被开发，以提高其对人类的可译性。 受体占有率与最佳剂量寻找 受体占有率已被预测为激动型抗体最佳剂量发现的关键因素。如图7所示，假设在受体占有率为~50%时的最大效应，导致由靶细胞、药物和表达4-1BB的效应细胞的三元复合体提供最佳4-1BB超聚集。较高的药物浓度导致受体占有率为100%但将阻止最佳三聚体的形成并导致钟形激活曲线。因此，了解4-1BB的表达是必要的，但这具有挑战性，因为4-1BB在T细胞上的表达受到严格控制。正常情况下，CD3激活的PBMC来源的T细胞表面具有4-1BB的表达，但5天后便检测不到4-1BB的表达。4-1BB的激活可将4-1BB的表达延长至第5天，并且CD8+T细胞上的4-1BB表达强于CD4+T细胞，导致肿瘤微环境中CD8+T细胞优先结合4-1BB激动剂。同时， 4-1BB激动剂也可能激活4-1BB内化、以及4-1BB脱落等。 图7. 预测的最佳剂量取决于受体占有率，导致钟形活性曲线 最佳剂量的预测不仅取决于受体的最佳占有率，还取决于可溶性4-1BB、可溶性交联靶蛋白和可溶性4-1BBL介导的可能的外周下沉。机制效应也将发挥作用，如受体结合后的内化，4-1BB/靶的亲和力关系，或肿瘤组织穿透的因素，如分子大小和PK。因此，临床上寻找最佳剂量是具有挑战性的，特别是在具有不同4-1BB和交联靶表达的患者群体中。已报道临床试验的4-1BB激动剂的给药方案如图8所示。总体上，选择了固定剂量或基于体重的剂量(mg/kg)。正在测试不同的给药方案，包括Q1W、Q2W、Q3W、Q4W和Q6W给药。到目前为止，关于最佳剂量发现的数据有限。 图8. 已报道临床试验的4-1BB激动剂的给药方案 联合疗法 目前大多数4-1BB激动剂是在实体瘤中测试的。在实体瘤中，4-1BB的表达与抗肿瘤CD8+TIL的功能呈正相关，但4-1BB在T细胞上的表达似乎是多样的，可能是动态的。为了充分发挥4-1BB激动剂的潜力并促进最佳剂量发现，理想的联合是使得4-1BB表达增加和更匀质。例如可能的联合伙伴是T-cell engagers从而促进CD3介导的4-1BB在 CD8+T细胞的上调或ADCC-inducing antibodies导致NK细胞的4-1BB上调。促进T细胞启动和激活的标准疗法，如某些化疗或放射疗法也可以作为联合伙伴 (图9)。 图9. 临床试验中正在进行或计划中的联合策略临床安全性和功能性亲和力、表位和交联性依赖对4-1BB激动剂药物安全性和功能性影响的不同假设，以及在临床前小鼠研究它们的局限性，使临床结果更具有决定性意义。现有的关于4-1BB激动剂药物的临床结果公开数据还是有限的，大多数试验仍在进行中。如上所述，诱导肝炎是第一代4-1BB激动剂urelumab的主要挑战。AGEN2373是一种与CRD4结合，非4-1BBL竞争方式的IgG1抗体。到目前为止，在一组19名接受0.03-2 mg/kg AGEN2373的5个队列中，未观察到与药物相关的肝转氨酶(ALT、AST)或胆红素升高超过1级。 LVGN6051是一种经改良的FcγRIIB交联的IgG4抗体。在接受LVGN6051(剂量递增至7mg/kg)治疗的16名患者中，没有发生与治疗相关的不良事件(TRAE)。然而，联合使用Keytruda，1例患者出现了3级ALT/AST升高。 4-1BB激动剂联合PD-1/PD-L1抑制可能会增加肝脏炎症的风险，因为肝损伤是PD-L1/PD-1阻断已确认的副作用，而且PD-L1在非实质肝细胞上的结构性表达也已被报道，包括肝窦内皮细胞和Kupffer细胞。 在接受PD-L1和4-1BB双特异性抗体Gen1046/BNT-311治疗的患者中，26.2%的患者出现了与治疗相关的转氨酶升高(1-3级)，其中9.8%的患者出现了3级转氨酶升高。尽管应用皮质类固醇后得到迅速改善，但6名患者中有3名因此而停止治疗。类似地，在另一种PD-L1和4-1BB双特异性抗体MCLA-145的剂量增加中，34名患者中有1名ALT/AST 3级升高。6例(17.6%)患者出现1~3级ALT/ AST升高，主要是剂量在50 mg或以上。 在CD40和4-1BB双特异性抗体GEN1042/BNT312治疗期间，50例患者中有1例出现4级转氨酶升高，经皮质类固醇治疗后缓解。第二代4-1BB激动剂在实体肿瘤中的疾病控制率似乎约为56-70%。Stable disease率（SD）在为26-70%之间，总有效率(ORR)在3.6-40%之间。但这些数据主要是在正在进行的I期试验中获得的。到目前为止，所有已公布临床数据的第二代4-1BB激动剂总体上都有良好的安全性和耐受性。常见的不良反应多为1级和2级。一些不良反应，如肺炎、瘙痒、皮疹或注射相关不良反应、ALT/AST升高、甲状腺功能减退、腹泻和结肠炎，在癌症免疫治疗中很常见，可定义为常见的免疫相关不良反应(irAEs)。这些irAEs是否与更好或更差的结果相关尚不完全清楚，但一项研究表明，在癌症免疫治疗期间发生的irAEs与较好的结果相关。因此，在未来，irAEs的管理将是改进癌症免疫治疗的重要任务。 小结 在过去的5年里，对第二代4-1BB激动剂的研究有了很大的进展，正在实施几种策略来克服第一代4-1BB激动剂的缺陷。开发中的4-1BB激动剂分子高度多样化。虽然这些分子在大小(分子量)、半衰期、亲和力、交联靶标以及靶标结合位点的价态上不同，但它们都旨在实现安全和有效的4-1BB超聚集。到目前为止，所有4-1BB激动剂似乎都表现出良好的安全性和耐受性。但哪种分子设计是诱导抗肿瘤反应的理想分子，并具有良好的安全性，仍有待证实。无论设计如何，克服临床发展中的挑战，如寻找最佳剂量和最佳联合合策略，将是新一代4-1BB激动剂能够获得成功的关键。参考出处1.The emerging landscape of novel 4-1BB (CD137) agonistic drugs for cancer immunotherapy.2.Epitope and Fc-mediated Crosslinking, but not High Affinity, Are Critical for Antitumor Activity of CD137 Agonist Antibody with Reduced Liver Toxicity. 内容来源于网络，如有侵权，请联系删除。