FAP x 4-1BB

导读：表达嵌合抗原受体（CAR）的基因工程免疫细胞已成为癌症免疫治疗的热门。用mRNA编码的CAR武装免疫细胞代表了癌症及其他领域的新前沿。 2023年9月，深圳市人民医院李斌团队在Trends in Biotechnology（IF:14.3）上发表综述《Chimeric antigen receptor therapy meets mRNA technology》，总结了基于mRNA的CAR免疫疗法的最新进展，及开发新一代活体药物方面的机遇和挑战。 周伯平和李斌两位老师是该文章的共同通讯作者。周伯平教授博士就读于中山医科大学（现中山大学），长期从事肝病研究，现任深圳市人民医院龙华分院院长。李斌老师是中国医学科学院&北京协和医学院博士，师从甄永苏院士。现任南方科技大学医学院临床副教授、硕士生导师，主要研究方向为mRNA药物递送、mRNA CAR疗法和mRNA基因编辑技术等。 01 嵌合抗原受体疗法与mRNA技术的碰撞 将CAR引入T细胞被证明是一种高效且特异性的免疫治疗策略。过去三十年里，基于CAR的疗法通过一系列迭代极大地改变了免疫医学的治疗格局。2017年，首个CAR-T细胞产品Tisagenlecleucel（Kymriah）被FDA批准用于急性淋巴细胞白血病，之后的5年里，又有7种针对血液肿瘤的CAR-T疗法获得批准，但其向实体瘤的临床转化仍受渗透性差、肿瘤异质性和免疫抑制微环境的阻碍，为克服上述问题，自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞等其他免疫细胞用于制备CAR分子（CAR-NK、CAR-M）。近年来，CAR疗法已应用于肿瘤学以外的其他免疫相关疾病，如自身免疫、慢性感染、心脏纤维化和衰老等。 图1基于mRNA的CAR技术的关键进展点 mRNA疗法最近成为关注的焦点，除mRNA疫苗外，其还在蛋白质替代疗法、再生医学、癌症免疫疗法和基因编辑领域得到探索。因简单、低成本和可接受的安全性，用编码CAR的mRNA改造免疫细胞为离体和体内快速大规模制造CAR武装细胞提供了一种替代策略，且无插入诱变的风险。截止2023年有超过10种基于mRNA的CAR疗法正进行临床评估。 图2 CAR-mRNA的构建、转移及翻译 02 利用mRNA技术释放免疫细胞的潜力 CAR-T细胞产品的离体制造过程通常包含T细胞分离、活化、T细胞工程、扩增和回输等流程，需数周至数月，治疗价格为35-50万美元/每次。在临床研究中，逆转录病毒和慢病毒载体等由于高转导率常用于将CAR基因体外转移到免疫细胞中，或通过将CAR基因靶向敲入特定位点来永久表达CAR。但由于长期基因表达及不必要的基因组整合风险，安全性问题日渐突出。 表1 制备CAR免疫细胞的病毒和非病毒方法的比较 利用体外转录（IVT）的mRNA编码CAR，经电穿孔或mRNA递送载体对免疫细胞进行编程，代表CAR疗法与mRNA技术的融合。基于mRNA的CAR疗法具下述优势： （1）mRNA在胞质中合成蛋白质，无转基因整合的风险； （2）mRNA可经体外转录，在体内快速合成任何目标蛋白； （3）mRNA工程（mRNA修饰、非翻译区优化和密码子优化等）可有效降低免疫原性、增强稳定性和翻译能力； （4）mRNA电穿孔和mRNA递送载体均可促进mRNA的内化及运输。 当前这些策略为基于mRNA的CAR疗法铺平了道路（图3）。 图3 CAR-mRNA的体外和体内T细胞工程研究 03 通过离体电穿孔生产基于mRNA的CAR细胞 电穿孔长期作为离体CAR-mRNA的转移方法，常通过优化电场、缓冲液等参数实现高性能电穿孔。 3.1 T细胞 最近研究表明，相较于病毒载体产生的CAR-T细胞，用等渗电穿孔缓冲液抑制人原代T细胞的特异性DNA感应通路可显著降低电穿孔诱导的毒性并产生更有效的CAR-T细胞。 3.2 NK细胞 NK细胞含多种激活受体，可通过天然或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性触发癌细胞的自发裂解。与CAR-T细胞疗法类似，CD19是CAR-NK细胞疗法最常见的治疗靶点。早期研究表明，与DNA电穿孔和慢病毒载体转导相比，抗CD19 CAR-mRNA电穿孔可产生高水平CAR＋ NK细胞，且CAR表达及活性可持续数天。 近年来，CD20、自然杀伤细胞2族成员D配体（NKG2DL）和B细胞成熟抗原（BCMA）已被用作电穿孔CAR-NK细胞疗法的目标靶点。对于用抗CD20 CAR-mRNA电穿孔的NK细胞，与组蛋白去乙酰化酶抑制剂联合使用可增强其在小鼠中对利妥昔单抗敏感和耐药的伯基特淋巴瘤的抗肿瘤活性；对于NKG2DL和BCMA，共同递送编码趋化因子受体和编码CAR的mRNA（如趋化因子受体CXCR1 mRNA和抗NKG2DL CAR-mRNA；趋化因子受体CXCR4 mRNA和抗BCMA CAR-mRNA）或两种类型的CAR-mRNA（如抗CD19 CAR-mRNA和抗BMCA CAR-mRNA）在NK细胞上提供一种增强CAR-NK细胞疗效的新策略。 3.3 巨噬细胞 因巨噬细胞可浸润实体瘤组织并克服靶抗原异质性，CAR-M作为针对实体瘤的新型免疫治疗候选者。用INF-β引发抗HER2 CAR-mRNA电穿孔巨噬细胞诱导巨噬细胞向M1表型持续极化，并显著增强CAR表达的持久性，最终导致抗肿瘤功能增强和对免疫抑制因子的抵抗。 04 通过mRNA递送生产CAR细胞 上述电穿孔会导致大量细胞死亡，不适用于放大应用。基于生物材料的mRNA递送载体，如脂质纳米颗粒（LNP）、聚合物纳米颗粒和外泌体被研究用于CAR-mRNA递送载体。 4.1 LNP介导的体外CAR-mRNA递送 LNP是最先进的RNA递送平台，近年来开发出新型LNP将CAR-mRNA体外递送至免疫细胞。2020年，用封装CAR-mRNA的C14-4 LNP处理人原代T细胞，在体外产生与电穿孔法相当的CAR表达及癌症杀伤活性，但细胞毒性显著降低。另一项研究开发9322-O16B LNP和76-O17Se LNP两种制剂，分别将化学修饰CAR-mRNA递送至原代巨噬细胞和CD8＋T淋巴细胞。两种工程细胞均可在体外显著消除B淋巴瘤。证明了使用mRNA-LNP对免疫细胞进行体外工程改造的可行性。 4.2 其他生物材料介导的体外CAR-mRNA递送 电荷改变可释放转运蛋白（CART）和外泌体也可用于构建CAR-mRNA免疫细胞。CART BDK-O7:N7:A13是一种比电穿孔效率更高、细胞毒性更低的寡聚物，可用于递送编码抗人CD19/4-1BB/CD3ζ CAR的mRNA，并有效生成细胞毒性人CAR-NK细胞，而无需预先的细胞活化和改变NK细胞表型。表达抗CD3/CD28单链可变片段（scFvs）的外泌体可递送CAR-mRNA用于生产CAR-T细胞及癌细胞杀伤，证明了用载有mRNA的CART或外泌体改造免疫细胞的可行性。 4.3 生物材料介导的CAR-mRNA体内递送 离体CAR细胞产品的制造成本高且耗时。将编码CAR的mRNA靶向递送至特异性免疫细胞，无需复杂的离体制造过程即可在体内快速生产CAR细胞。为实现主动靶向，可将靶向配体或抗体掺入mRNA纳米载体中，如用抗CD3或抗CD8抗体功能化的聚（β-氨基酯）聚合物纳米载体PBAE-447能将CAR-mRNA靶向递送到淋巴细胞中。 Matthias Stephan等于2017年首次报道了使用靶向T细胞的抗CD3e f（ab′）2片段修饰的基于PBAE-447的DNA纳米载体在体内对T细胞进行编程；2020年该研究组利用抗CD8抗体修饰的类似纳米载体在体内循环T细胞中表达瞬时CAR-mRNA，重复输注纳米制剂诱导肿瘤消退的水平与推注离体工程化CAR-T细胞相似。在一项独立研究中，抗CD5抗体功能化的DLin-MC3-DMA LNP被制备为一种新型抗成纤维细胞活化蛋白（FAP）CAR-mRNA递送平台，单次静脉注射后可在体内瞬时产生抗FAPT细胞，在建立的小鼠高血压心脏损伤和纤维化模型中最终恢复心功能并减少纤维化。总之，这些革命性的体内制造方法有望大幅降低制造成本，并在未来增加CAR疗法的可及性。 05 基于mRNA的CAR疗法的临床转化 由生物材料介导的CAR-mRNA递送在体外和体内产生的数十种基于mRNA的CAR免疫细胞已在临床前阶段证明其疗效，需进一步临床验证保证进一步的临床转化。目前，除两种抗BCMA CAR-T疗法（NCT04146051和NCT03448978）外，所有基于mRNA的CAR临床试验都基于离体电穿孔，仍处于1期阶段。间皮素（MSLN）是迄今为止评估的所有肿瘤适应症中最常见的治疗靶点，其他靶标包括BCMA、CD19和NKG2DL。综上，mRNA工程CAR-T细胞可作为自身免疫性疾病潜在新治疗选择。  表2 2019-2023年间mRNA CAR疗法汇总 06 总结 利用CAR-mRNA工程化免疫细胞能够以无整合风险方式快速、低成本地制造CAR免疫细胞。但用于CAR-mRNA递送的生物材料的开发仍处于早期阶段，且CAR免疫疗法的临床转化研究必须解决以下挑战： （1）与预防性mRNA疫苗相比，CAR疗法需更高mRNA剂量和重复给药才能达到持久的治疗效果。目前正寻求如缓释mRNA递送系统、mRNA序列优化、自扩增和反式扩增RNA及环状RNA等新兴技术，以延长CAR表达的持续时间； （2）对冷链储存的要求及mRNA递送系统有限的递送效率和趋向性； （3）如何开发用于治疗实体瘤和其他难治性自身免疫性疾病的高活性CAR细胞产品。 基于mRNA的CAR疗法虽仍有待解决的问题，但预计CAR和mRNA技术的迭代改进将加快下一代基于mRNA的CAR疗法的开发，以解决肿瘤学之外未满足的医疗需求。 参考文献  [1] Wu J, Wu W, Zhou B, Li B. Chimeric antigen receptor therapy meets mRNA technology. Trends Biotechnol. 2024 Feb;42(2):228-240. doi: 10.1016/j.tibtech.2023.08.005. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：过继免疫治疗使用嵌合抗原受体（CAR）重定向的T细胞是一种新的治疗范式，它使用一类新的治疗“药物”在某些迄今为止难以治疗的B细胞恶性肿瘤患者中产生完全且持久的缓解。CAR T细胞源自患者自身的免疫细胞，这些细胞在体外通过基因工程改造，带有能够结合特定目标并在目标结合时传递激活信号的CAR。CAR激活细胞毒性T细胞以有效、重复和持久的方式破坏和消除识别的癌细胞。然而，各种障碍限制了CAR T细胞在其他类型的癌症或其他疾病中的广泛应用。目前的挑战包括设计最优的CAR、积极穿透肿瘤病变，并在不诱导对健康组织产生毒性的情况下维持T细胞的抗肿瘤激活。本章回顾了CAR的代际、增强CAR T细胞效力和选择性的策略，以及为日益增多的患者建立高效的制造流程。 1.原型嵌合抗原受体（CAR，T-Body，免疫受体） 在20世纪80年代中期，Steven A. Rosenberg（美国国立卫生研究院）将从黑色素瘤活检中分离并大量体外扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）重新注入黑色素瘤患者体内时，患者T细胞识别和有效摧毁癌细胞的能力变得显而易见。这些以及随后的发展促使了采用自体免疫细胞治疗肿瘤患者的概念，这些免疫细胞有能力在大量患者中诱导肿瘤退缩和长期缓解。这些扩增的TILs被认为对特定肿瘤抗原具有特异性，并具有迁移能力以进入肿瘤病变；然而，抗原特异性大多仍然未知。 接下来的几年中，为了给患者的T细胞提供明确的靶向特异性，人们付出了巨大的努力；与T细胞受体（TCR）链或重组嵌合抗原受体（CAR）的遗传工程化，证明是成功的策略之一。与TCR不同，CAR是一个复合的、单多肽链跨膜受体，它在目标识别时提供靶向特异性和T细胞激活能力。原型CAR由四个主要结构域模块化组成：在细胞外末端是用于目标识别的单链可变区（scFv）抗体，一个连接到跨膜结构域的间隔区，以及主要来自TCR/CD3ζ或Fcε受体I（FcεRI）的细胞内信号传导结构域，有或没有连接的共刺激结构域（图1）。目标细胞表面的同源抗原的参与启动了CAR工程化免疫细胞的激活，导致持久的T细胞反应。每个CAR结构域都有独特的功能，并对重定向的T细胞激活产生影响；对于每个特定应用，CAR设计需要进行一些调整，以提供优化的靶向和T细胞激活，如下文详细描述。 图1 嵌合抗原受体（CARs）的世界在不断增长。第一代CAR在细胞外域（外域）中拥有抗原结合和间隔基团，在跨膜域中，在细胞内域（内域）中拥有来自CD3ζ或FcεRI γ链的激活基团。第二代CAR除了拥有一个共刺激域之外，第三代CAR在内域中拥有两个共刺激域。第四代CAR（“TRUCK”，“T细胞重定向用于通用细胞因子介导的杀伤”）由第二代或第三代CAR组成，该CAR在CAR信号传导后诱导转基因蛋白的表达。虽然在规范设计中描绘，但已经工程化了大量CAR变体，每种变体都针对不同的应用进行了优化。 原型CAR的基本设计最初由Zelig Eshhar及其同事（魏茨曼科学研究所）提出，他们展示了一个模块化复合受体，最初命名为“T-Body”或“免疫受体”，具有用于结合的抗体衍生结合域和用于T细胞激活的TCR信号域，为工程化T细胞提供了特异性识别和激活。在随后的几年中，引入了许多修改，允许靶向广泛的抗原，并通过各种细胞内结构域发送信号，以启动和重定向定义的免疫细胞功能（表1）。 表 1 CAR构建模块及其替代模块。 EMA（欧洲药品管理局）批准。其他使用其他宿主细胞和不同CAR设计的应用程序也在早期临床试验中越来越多地被研究。 规范的CAR由抗体衍生的结合域、间隔区、跨膜域和细胞内主要及共刺激信号域模块化组成。每个结构域可以通过不同的模块构建，这些模块影响不同的变量，并最终影响T细胞的激活和性能。 CAR工程化的细胞毒性T细胞重定向至癌细胞是该技术研究最多的应用；自体抗CD19 CAR T细胞的过继转移成为美国食品药品监督管理局（FDA）批准的首个基因工程细胞疗法；随后，欧洲药品管理局（EMA）也批准了。使用其他宿主细胞和不同CAR设计的其他应用也越来越多地在早期临床试验中研究。 2.CAR的模块化组成：细胞外CAR结构域 2.1.结合域 抗原结合域传统上由来自小鼠或人类单克隆抗体的单链可变区（scFv）组成。通过短柔性连接子（通常是(Gly4Ser)3肽）将重链（H）和轻链（L）抗体链的可变（V）区域连接起来，形成VH-linker-VL或VL-linker-VH的顺序。甘氨酸残基提供了灵活性，以允许VH和VL正确折叠形成抗原结合口袋，而丝氨酸则为连接子提供了一些溶解性。VH和VL链的空间位置和相互作用可以显著影响亲和力、特异性和溶解性。足够高的结合亲和力对于诱导T细胞激活至关重要；然而，存在一个亲和力上限，超过该上限CAR介导的T细胞激活不会改善，但会导致激活诱导的细胞死亡（AICD）。在CAR的背景下，一些scFvs通过张力信号独立于抗原参与诱导AICD、耗竭和T细胞的终端分化。除了亲和力和细胞表面的抗原密度外，目标表位在抗原内的位置也很重要；通常，靶向膜近端表位比靶向膜远端表位诱导更强的T细胞激活。 通过使用抗体进行靶向，CAR介导的识别是MHC独立的。这在靶向MHC-肽处理和呈递机制有缺陷的肿瘤时是有益的。此外，通过抗体识别目标，还可以识别传统T细胞看不见的抗原，如碳水化合物、脂质或抗原的结构变体。规范的CAR识别目标细胞表面的抗原；也可以通过使用特异性针对定义的MHC-肽复合物的抗体，工程化MHC-肽识别CAR，使其能够感知由MHC呈递的细胞内抗原。例如，一个scFv识别HLA-A2背景下的NY-ESO-1肽的CAR提供了与相应TCR类似的TCR样识别目标。 2.CAR的模块化组成：细胞外CAR结构域 2.2.间隔区 原型CAR经常在抗原结合域和跨膜域之间包含一个“间隔区”，以便接近目标抗原；连接的铰链区提供了一定的灵活性。间隔区的类型和长度对于最佳目标结合和信号传递至关重要。间隔区并非必需，因为有些CAR在scFv直接融合到跨膜域时是活跃的，而其他CAR只有在具有一定长度的间隔区时才活跃。间隔区通常来源于IgG1或IgG4恒定域或来自细胞外CD28、CD4或CD8（图2）。一般的想法是，间隔区在工程化T细胞和相应目标细胞之间提供最佳距离，以允许与目标细胞形成有效的接触区。基于TCR-MHC相互作用的知识，人们普遍认为CAR-目标相互作用需要在T细胞和目标细胞之间创建约15纳米的距离，以最佳形成接触区。因此，针对膜近端表位需要较长的间隔区，而较小的间隔区对更远离膜的表位是最佳选择；通过使用不同长度的间隔区可以轻松调整距离。在这个背景下，IgG衍生的间隔区具有可以通过结合一个、两个或三个CH1-CH2-CH3部分来调整长度的优势。IgG1衍生的间隔区还有利于CAR分子的稳定；然而，它可能与髓系细胞上的Fcγ受体（FcγR）（CD64）结合，介导CAR T细胞和髓系细胞的“非肿瘤”激活。这可以通过删除间隔区内的IgG1 CH2域或通过删除IgG1 Fc受体结合部分内的Asn297糖基化位点来预防。类似的修改也可以引入到IgG4间隔区。 图 2 第二代CAR设计的变体。由于模块化组成，可以使用各种替代域来构建CAR，其中一些示例性地列出。各个组分的变化允许调节CAR的结合和信号传导，最终调节细胞功能、代谢和工程化T细胞的抗肿瘤活性。其他变体旨在提高结合亲和力、目标的可及性、信号强度和细胞膜上的持久性等。最后，安全预防措施导致CAR设计中进一步的修改。 2.3.跨膜区 典型CAR的跨膜区来源于如CD3ζ、CD4、CD8α、CD28或OX40等类型1跨膜蛋白，由20-23个疏水性氨基酸组成，富含亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸（图2）。带有CD3ζ跨膜域的CAR似乎比其他CAR更有效地整合到TCR/CD3复合体中，因此在表达和信号传导方面更为稳健；带有CD28跨膜区域的CAR似乎同样稳定。另一方面，带有CD8α铰链和跨膜域的CAR不易于AICD；然而，它们通过减少促炎细胞因子的释放来介导较少的T细胞激活。 2.4.细胞内信号传导域 “第一代”CAR完全通过主要信号传导域（信号-1）进行信号传导。TCR/CD3ζ细胞内链含有三个免疫受体酪氨酸激活基序（ITAMs），FcεRI γ链含有一个ITAM，这些在磷酸化后作为下游信号蛋白的特定适配器。因此，CAR利用内源性TCR信号机制来启动T细胞激活事件的级联。下游激酶如Lck或Fyn也可以作为CAR介导的T细胞激活的主要信号，等等（图2）。CAR信号传导域本身足以与下游激酶结合并启动有效的激活级联，因为CAR在TCR敲除细胞和非T细胞如NK细胞中也是功能性的。然而，仅有主要信号的CAR不足以激活以允许长期持久；这样的CAR T细胞迅速进入凋亡。根据“双信号假说”，静息T细胞还需要一个共刺激信号以持续激活。这就是将主要信号与共刺激信号（信号-2），如CD28或4-1BB（CD137），结合在“第二代”CAR中的理由。也在临床前和临床上探索带有替代共刺激域的CAR，如OX40、ICOS、CD27、CD40-MyD88、CD2和CD244。为了方便下游激酶的接近，CD28通常位于膜近端位置，随后是远端位置的CD3ζ；OX40和4-1BB在膜远端和近端位置都活跃。与第一代CAR相比，第二代CAR T细胞在细胞因子释放、扩增和抗肿瘤活性方面显示出稳健和持久的反应。 CAR介导的共刺激以不同的方式影响T细胞效应功能、存活、持久性和代谢。例如，4-1BB CAR T细胞在患者血液中的持久性超过6个月，而CD28 CAR T细胞在3个月之后大多无法检测到。经过重复刺激后，CD28 CAR T细胞重新编程为CD45RO+ CCR7−效应记忆细胞，这些细胞随后需要OX40来延长持久性并避免快速耗竭；4-1BB CAR T细胞主要转化为CD45RO+ CCR7+中央记忆细胞，并在外围血液中长期持久。CD28 CAR信号激活PI3K/Akt/mTOR途径，刺激有氧糖酵解，增加葡萄糖摄取和ATP生成，而4-1BB CAR信号激活Wnt/β-catenin途径和脂肪酸氧化，增加代谢和线粒体呼吸链能力。典型的Wnt/β-catenin有利于中央记忆细胞的形成和T细胞的长期存活，而CD28诱导的PI3K/Akt信号维持效应细胞的即时响应。在高剂量下，CD28和4-1BB CAR T细胞都能在临床前模型中根除大型已建立的肿瘤；在低剂量下，CD28 CAR T细胞比4-1BB CAR T细胞表现出更大的耗竭程度，结果是4-1BB CAR T细胞在长期内更有效地根除大型肿瘤负荷。另一方面，带有4-1BB CAR的T细胞仍然对肿瘤介导的通过TGF-β的抑制敏感，这对CD28 CAR T细胞来说较少见。因此，选择CAR设计的标准取决于多个参数，包括T细胞持久性、抗抑制能力、共刺激和共抑制配体的模式、肿瘤细胞上的抗原密度、T细胞上的CAR密度等。 “第三代”CAR结合两个共刺激域以及主要激活信号。联合共刺激的好处只在少数情况下得到证明，例如，通过CAR提供CD28-OX40共刺激对T细胞在终端成熟中的进展有益。 3.TRUCK：“第四代”CAR T细胞 CAR T细胞可以用来按需将转基因蛋白输送到预定的、靶向的组织。因此，CAR T细胞被设计成带有CAR诱导表达盒的额外“有效载荷”。所谓的“第四代”CAR T细胞，即TRUCKs（“T细胞重定向用于通用细胞因子介导的杀伤”），旨在在靶向组织中沉积分泌型转基因蛋白，以实现治疗有效浓度（图3）。“有效载荷”的表达受NFAT6-IL-2最小启动子的控制，该启动子在CAR信号传导时被激活；有效载荷可以是转基因编码的任何蛋白或肽。这种策略特别有趣，因为它结合了重定向CAR T细胞攻击和局部沉积的生物活性蛋白的作用，同时避免了系统毒性。只要CAR T细胞保持激活状态，TRUCKs就会沉积转基因产物，例如，IL-12或IL-18作为转基因免疫调节剂，以特定方式塑造靶向肿瘤环境，而不引起系统毒性。累积的TRUCK产生的IL-12在CAR靶向的肿瘤组织中招募天然免疫细胞，如NK细胞和巨噬细胞，在那里反过来启动二次抗肿瘤免疫反应。IL-12 TRUCKs抵抗Treg细胞的抑制，并显示出增加的细胞因子释放和扩增。当快速进展的肿瘤积累抗原丢失的癌细胞，导致对CAR T细胞不可见的肿瘤复发时，这种策略特别有趣。释放IL-18的TRUCKs将CAR T细胞转化为T-bet高FoxO1低效应细胞，抵抗耗竭并显示出对大型已建立肿瘤的优越细胞毒性。IL-18 CAR T细胞治疗改变了整个肿瘤免疫细胞景观，特别是通过增加CD206− M1型巨噬细胞和NKG2D+ NK细胞的数量，减少抑制细胞如Tregs、抑制性CD103+ DCs和M2型巨噬细胞。其他例子包括释放过氧化氢酶以保护T细胞免受过氧化压力介导的抑制和释放肝素酶以改善T细胞通过肿瘤基质的穿透。 图 3 第四代CAR T细胞（“TRUCKs”）。在抗原结合时，第二代或第三代CAR诱导表达一种转基因蛋白，该蛋白在细胞内作用、整合到膜中或由CAR T细胞释放。释放的转基因蛋白旨在改变肿瘤环境、重塑肿瘤组织或吸引二次免疫反应。CAR T细胞被诱导仅在CAR与其靶标结合时释放蛋白质，从而将“有效载荷”在预定义的交付点作为“TRUCK”进行交付。这种CAR T细胞被理解为“活体工厂”，用于精确和持续地交付治疗性细胞产品。 所谓的“装甲CAR”通过产生4-1BB配体提供增加的共刺激通过刺激4-1BB途径。工程化的T细胞被设计为分泌Toll样受体（TLR）配体，可以刺激T细胞和抗原呈递细胞上的TLR途径，然后可以激活一组T细胞进行广泛的抗肿瘤攻击。靶向Muc16ecto（即黏蛋白-16（CA-125）的膜保留残余物）并分泌IL-12的CAR T细胞正在临床试验中评估（NCT02498912）。IL-15 TRUCK细胞显示出改善的扩增和抗肿瘤活性，但在未受控制的扩增情况下需要自杀基因，由于其白血病潜力。“装甲”CAR通过与CAR共表达IL-7受体-α链来恢复对IL-7的反应性，并促进Th1反应。类似地，在IL-4水平增加的前列腺癌中，共表达IL-4结合/IL-7信号传导受体提高了抗PSCA CAR T细胞的抗肿瘤活性。另一方面，CAR T细胞上共表达的显性负性TGF-β DNRII受体可以在TGF-β存在的情况下与TGF-β竞争，以改善T细胞的抗肿瘤活性。也可以设想提供细胞因子或细胞因子受体之外的应用，如输送可溶性HVEM外域，以靶向肿瘤血管，以维持肿瘤穿透。 4.具有双重特异性、组合抗原识别和条件性CAR的CAR T细胞 原型CAR通过一个scFv将特异性重定向到一个抗原；多种原因要求具有多重特异性的CAR：(1)肿瘤病变在可靶向抗原方面可能是异质的，或在肿瘤进展过程中丢失抗原；(2)靶向癌细胞和肿瘤基质或血管可能有益或需要增加治疗效果。将两种或更多CAR T细胞产品应用于癌症患者基本上是可行的，尽管需要在GMP条件下制造两种细胞产品。例如，通过顺序输注应用CD19和CD22 CAR T细胞目前正在评估治疗难治性B-ALL的试验中（NCT03620058）。或者，T细胞被设计为表达两个CAR，即所谓的双顺反子CAR，每个CAR针对不同的抗原（图4）。通过灵活的连接子将两个scFv相互连接，设计出具有双重特异性的CAR。这种串联排列的双特异性CAR（“串联CAR”，“Tan-CAR”）或环状结构，针对两种不同的抗原，并能够在结合任一抗原时提供T细胞激活（“或”门控）；具有其中一种相应抗原的目标细胞仍然被识别。除了两个连接的scFv外，双抗体、二合一抗体和双变量域抗体也可以用来设计具有两种特异性的CAR。三特异性CAR包含单价和/或多价CAR结构的组合，以针对三种抗原，进一步扩大靶向特异性。一个例子是设计了一种双特异性CAR，将针对CD20和CD19的scFv连接起来，旨在减轻在接受CD19 CAR T细胞治疗后经常发生的B细胞白血病/淋巴瘤的复发。CD19− CD20+白血病细胞的复发旨在通过CD20-CD19双特异性CAR T细胞得到控制。双特异性CAR中scFv的顺序取决于特定抗原中目标表位的空间可及性。CD20-CD19 CAR对CD19和CD20都具有相同的结合能力，并重定向T细胞激活，而CD19-CD20 CAR则效率要低得多。其他双特异性CAR的例子是针对CD19和CD123治疗B-ALL或CD19共靶向CD22、ROR1和免疫球蛋白κ轻链（Igκ）。多特异性CAR T细胞目前正在早期临床试验中评估。通过双顺反子表达盒设计了同时具有CD19和CD22 CAR的T细胞，正在进行治疗高风险B-ALL或干细胞移植后复发的试验（NCT03289455）。具有CD19和CD22特异性的双价CAR正在评估治疗B-ALL或B细胞淋巴瘤（NCT03241940, NCT03233854, NCT03330691, NCT03448393, NCT03019055）。目前正在进行的II期试验中评估了针对BCMA两个表位的双特异性CAR（NCT03758417）。 图4 基于逻辑门控的CAR介导的T细胞激活，以证明在肿瘤靶向中的选择性。共表达两种CAR，每种CAR在与相应的目标抗原结合时都能完全激活T细胞；双特异性CAR（串联CAR，Tan-CAR）也是如此。在这种情况下，通过表达抗原A或B或两者的细胞激活T细胞（"OR"门控）。为了仅通过同时表达A和B抗原的细胞激活CAR T细胞，识别A的CAR仅通过CD3ζ提供基本激活，这不足以实现完全和持续的激活，而识别B的CAR提供共刺激；通过两种CAR的同时信号传导诱导T细胞完全激活（"AND"门控）。识别抗原A的synNotch CAR驱动转录并表达第二种CAR，该CAR在识别抗原B时驱动T细胞完全激活。具有ITIM（免疫受体酪氨酸基抑制基序）的抑制性CAR在其识别的抗原B结合时阻止通过激活CAR的信号传导。当抗原B不存在时，CAR可以在结合抗原A时激活T细胞（"A-not-B"门控）。 当结合两种抗原时，双特异性CAR比单特异性CAR具有更高的亲和力，理论上稳定了突触并改善了T细胞对低抗原水平目标细胞的反应。这种情况可以用来只将CAR T细胞重定向到表达两种抗原而不是一种的细胞（图4）。这种“与”门控的抗原模式旨在提高对癌细胞的靶向选择性，同时保留健康细胞。两个共表达的抗原被两个共表达的CAR识别，每个CAR识别特定的抗原，并分别提供主要或共刺激信号。这样，只有同时结合两种抗原才提供完全T细胞激活所需的两个信号；结合一种抗原是不足够的。组合抗原识别的例子是，通过CD3ζ CAR靶向ErbB2和通过CD28 CAR靶向Muc1，或通过CD3ζ CAR靶向间皮素和通过CD28 CAR靶向叶酸受体-α。靶向CD13和TIM3的双特异性和分裂CAR T细胞在临床前模型中根除患者衍生的急性髓性白血病细胞，减少了对骨髓和外周髓性细胞的毒性。 通过异二聚体化两个多肽链，可以加强两个CAR上的初级和共刺激信号的组合；一个链由细胞外和跨膜以及初级信号传导部分组成，第二个链提供共刺激信号传导部分，并通过添加“二聚体化剂”与第一个链相连。CAR在二聚体化剂允许异二聚体化和功能性CAR形成之前保持沉默。通过滴定二聚体化剂剂量可以微调T细胞活性；撤除二聚体化剂终止CAR信号。只有当每个CAR信号单独不足以驱动T细胞激活时，才能通过组合抗原识别实现清晰的“开-关”T细胞激活。由于预先激活的T细胞中的CD3ζ信号可能重新诱导T细胞反应，因此需要调整信号或降低结合亲和力以实现平衡的激活阈值。 可调CAR的另一种策略基于合成Notch（synNotch）受体。Notch由一个细胞外受体、一个跨膜域和一个细胞内转录调节器组成，激活后介导内部域的蛋白水解，释放细胞内转录调节器。这些特性用于控制与Notch受体不同特异性的真正CAR的转录。优点在于Notch受体的抗原识别基于逻辑“与”门控，并以空间定义的方式控制CAR T细胞功能。在CD19结合后，CD19特异性synNotch受体释放转录效应域Gal4-VP64或TetR-VP64以诱导抗间皮素CAR的表达。只有当在靶向组织中同时识别synNotch配体和CAR配体时，T细胞才被激活。另一个例子是通过CAR靶向ROR1和通过Notch受体靶向EpCAM或B7-H3。虽然CAR的“开开关”决定了靶向癌细胞的选择性，但这种策略可能受到诱导足够水平的CAR表达和在没有Notch信号进一步发生时衰减CAR所需的时间的限制。 工程化T细胞的TCR特异性也可以用来提供更复杂的识别轮廓。带有γδ TCR的T细胞识别肿瘤细胞特有的磷酸化抗原；转基因表达GD2特异性CAR和共刺激域只会在γδ TCR和CAR同时结合它们相应的抗原时提供完全的T细胞激活；由于缺乏γδ TCR激活，不会攻击GD2+的健康细胞。 虽然许多可靶向的抗原既表达于健康细胞也表达于癌细胞，但有些抗原仅由健康细胞表达，而癌细胞缺乏表达。在这种情况下，结合共同抗原“A”但在结合健康细胞上的抗原“B”时阻断，将阻止CAR T细胞激活对抗健康细胞（图4）。带有ITIM（免疫受体酪氨酸基抑制基序）的抑制性CAR只要结合其相应的抗原“B”，就阻止通过激活性CAR的信号传导。结合缺乏抗原“B”的“A”癌细胞允许CAR T细胞激活，因为缺乏通过抑制性CAR的信号传导（“A非B”门控）。 5.具有植入多重抗原特异性的通用CAR 目前，原型CAR具有一个确定的抗原特异性；改变特异性需要用新的CAR工程化T细胞。在这种情况下，开发了一种“通用”CAR，它识别一种抗体，该抗体转而提供癌症特异性（图5）。例如，抗癌抗体的免疫球蛋白Fc区域被具有CD16作为结合域的CAR结合。CD16 CAR T细胞结合抗癌抗体，从而获得对癌细胞的特异性。或者，CAR结合至与抗癌靶向抗体相关联的蛋白质表位。具有荧光素异硫氰酸酯（FITC）特异性CAR的T细胞识别FITC标记的叶酸，该叶酸与叶酸受体阳性癌细胞结合。也可以设想将其他表位与桥接抗体相关联，如亲和素。同时添加不同特异性的抗体，允许将相同的CAR T细胞产品（“UniCAR”）重定向至多种抗原，无需重新制造CAR T细胞。该策略的优点是同时使用不同的抗体靶向广泛的抗原，同时只应用一种制造的CAR T细胞产品。实际的特异性由应用的抗体混合物在治疗足够浓度下定义。随着应用的抗体的短半衰期，此外，意外的不良事件在抗体撤除后很快就会有限。从机制上讲，有效的肿瘤控制需要CAR T细胞和连接抗体都渗透到肿瘤病变中；目前尚不清楚这是否适用于晚期实体瘤。也尚未解决“通用”CAR T细胞是否能够建立对癌症抗原的持久免疫记忆，这被认为是长期控制癌症所需的。 图 5 “通用”CAR的概念。T细胞表达一种特异性针对标签的CAR，该标签与连接分子相连，最好是天然抗体、单链抗体(scFv)或双特异性T细胞导向抗体(BiTE)，这些分子能够识别肿瘤细胞上的目标抗原。通过添加不同的连接分子，无需工程化新的CAR T细胞，就可以为T细胞配备不同的特异性。这被认为在将CAR T细胞应用于患者后也是可行的；注入针对不同肿瘤抗原的抗体，为CAR T细胞提供不同的特异性。 6.转换抑制信号为激活信号的Switch CAR 在肿瘤病变中，重定向的T细胞攻击通常以各种方式受到抑制；抑制性配体如程序性细胞死亡配体-1（PD-L1）和PD-L2与激活的T细胞表达的程序性细胞死亡-1（PD-1）结合。一种结合这种抑制性配体但向工程化T细胞传递激活信号的CAR，不仅可以与抑制性受体竞争结合，还可以通过提供激活信号克服抑制（图6a）。理想情况下，PD-L1:CD28 “开关”CAR在工程化T细胞中克服PD-1介导的抑制信号。特别是，一个具有PD-1细胞外域结合PD-L1和CD28细胞内信号传导域的CAR，将抑制信号转换为激活信号，导致ERK磷酸化增加，促炎细胞因子释放，T细胞扩增和目标细胞的细胞溶解。由TIGIT（具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体）的外域与CD28共刺激域融合而成的嵌合受体，在结合TIGIT配体CD155时增强T细胞功能。鉴于肿瘤组织提供的大量抑制信号，确定需要克服的“关键”抑制因素以维持有效的T细胞反应仍然是一个挑战。 图 6 开关CAR和抑制性CAR（iCAR）。(a) 开关CAR与生理性T细胞抑制性受体的配体结合，但为工程化T细胞提供激活信号。(b) 抑制性CAR在与抗原结合后，通过ITIM信号向工程化T细胞提供负信号。抑制信号压倒了通过TCR或共表达的激活CAR的激活。 7.抑制性CAR：iCARs 虽然原型CAR向工程化T细胞提供激活信号，但具有抑制信号的CAR旨在在结合健康细胞时抑制CAR T细胞激活。理想情况下，抑制性CAR通过在面对健康组织时覆盖激活CAR信号来减轻非肿瘤毒性。与激活性、肿瘤特异性CAR共表达的具有优势抑制信号的CAR，识别健康细胞；从而CAR T细胞只在结合癌细胞时激活，抑制性CAR不结合健康细胞（图6b）。这种抑制性CAR提供PD-1或CTLA-4信号，并覆盖癌症特异性CAR的激活信号。 8.异体CAR T细胞和CAR NK细胞 到目前为止，CAR T细胞治疗是一种通过体外制造患者自己的T细胞的个性化治疗。这不仅繁琐、成本密集和耗时，而且在患者晚期疾病无法提供足够或足够活跃的T细胞进行CAR工程化时通常也不适用。在这种情况下，异体“现成的”CAR T细胞将为广泛的患者群体带来好处。为了避免移植物抗宿主病（GvHD），需要删除内源性的αβ TCR和HLA分子，这可以通过锌指核酸酶或CRISPR/Cas技术实现。随后清除剩余的TCRαβ T细胞，通过污染的异体TCR+细胞降低GvHD风险。T细胞通过转录激活样效应核酸酶（TALENs）技术在TCRα和CD52位点进行基因编辑，用于治疗无法生产自体CAR T细胞的患者的儿童CD19+ ALL。CD52存在于患者的恶性B细胞上，需要从CAR T细胞中删除，以允许消除恶性淋巴细胞，同时保留注入的CD52阴性CAR T细胞。对于工程化异体CAR T细胞，CRISPR导向RNA和Cas9目前由病毒载体编码以实现组成性表达；当前的研究旨在短暂提供基因编辑工具，而不持久的载体，以最小化非目标编辑。 针对BCMA治疗多发性骨髓瘤的异体CAR T细胞，通过BCMA CAR和基因编辑技术进行了改造，以限制TCR介导的免疫反应。通过将CD20模拟表位整合到CAR的细胞外域，使CAR T细胞能够通过利妥昔单抗消除，从而提供了异体BCMA CAR T细胞的安全性。 关于使用异体效应细胞，NK细胞也可以用于诱导有效的抗肿瘤反应，因为它们具有细胞毒性潜力和分泌促炎细胞因子。除了使用异体细胞，使用NK细胞进行癌症的过继细胞治疗有很强的生物学理由；NK细胞表现出广泛的抑制性和激活性受体库，以识别外来、感染或恶性细胞。两种信号的平衡最终诱导或阻断细胞毒性CD56dim NK细胞释放细胞毒性颗粒以杀死目标细胞。虽然可能存在广泛的NK细胞亚群多样性，基于激活和抑制受体的库，但通过CAR工程化NK细胞将为特定癌细胞提供预定的特异性。原型CAR具有CD28-CD3ζ信号也在NK细胞中活跃；具有NK细胞2DS2和DAP12信号蛋白的CAR产生了更强的抗肿瘤活性。为NK细胞工程化的CAR通常包含DAP10或DAP12用于激活，单独或与CD3ζ一起。具有NKG2D作为结合物和DAP10-CD3ζ用于激活的CAR有效地激活了小鼠模型中针对骨肉瘤的原代NK细胞。CD3ζ在NK细胞中作为激活域优于DAP10，而DAP12优于CD3ζ。 9.制造CAR T细胞用于临床应用 对于临床应用，CAR T细胞产品是根据良好生产规范（GMP）规则，使用预期接受患者的自体T细胞制造的（图7）。在大多数情况下，通过白细胞分离术收集血液，分离T细胞，通过病毒感染或电穿孔进行基因工程改造，并扩增到临床相关的数量。大多数临床试验使用通过γ-逆转录病毒或慢病毒基因转移修饰的T细胞；基于转座子的载体，如Sleeping Beauty和PiggyBac，越来越多地应用于临床，其好处是避免了成本和时间密集型的病毒生产。病毒和转座子介导的基因转移程序旨在永久性地修改患者的T细胞以表达CAR；一些试验使用通过RNA电穿孔修饰的T细胞进行短暂的CAR表达。在永久性基因改造后，插入突变和随后成熟T细胞的致癌转化的风险似乎很低，到目前为止在这方面还没有报告致癌事件。一个需要注意的问题是，通过慢病毒转移，CAR基因插入到Tet2位点导致T细胞的克隆扩增，然而，它们自发地收缩了。然而，白细胞分离产品中污染的恶性细胞也可能意外地被CAR改造，存在重新输注给患者后通过CAR介导的肿瘤促进的风险。 图7 CAR T细胞制造和患者治疗时间表。(a) 通过白细胞分离术从患者体内收集T细胞，并在体外处理以获得最终的CAR T细胞产品，包括T细胞工程化以携带CAR、扩增至临床相关数量，以及最终的质量控制程序（QC）。在输注CAR T细胞产品之前，患者需接受非清髓性淋巴细胞减少（“预处理”），以促进CAR T细胞的植入和体内扩增。随后需要院内护理以管理潜在的副作用，如CRS或神经毒性。(b) 体外CAR T细胞制造过程通常从白细胞分离产品开始，并涉及多个后续生产步骤，包括T细胞分离和激活、基因工程、CAR T细胞扩增、制剂、CAR T细胞产品的冷冻保存，以及最终的质量控制以供释放。整个过程可以手动运行，或在监督下（半）自动化进行。 经过基因改造后，CAR T细胞在细胞因子存在的情况下在体外广泛扩增到临床相关的细胞数量；目前使用手动处理的摇动反应器或袋子以及完全自动化和监督处理设备。自动化的目标是允许以高再现性和质量进行生产，并从越来越多的患者中并行生产细胞，并缩短静脉到静脉的时间。 最适合CAR治疗的T细胞群体被认为是具有急性炎症特征的原始或年轻中央记忆细胞。在IL-2存在下扩增CAR T细胞优先触发效应T细胞，而IL-7或IL-2加IL-15扩增具有持续细胞因子释放和抗肿瘤活性能力的中央记忆T细胞。添加IL-21使CAR T细胞保持较少分化状态。刺激方式不仅决定了扩增CAR T细胞的产量，还决定了代谢依赖性；IL-15增加氧化代谢以及肉碱棕榈酰转移酶，这是脂肪酸氧化的限速步骤。IL-7通过STAT5和Akt激活增加Glut1，并诱导甘油运输和甘油三酯合成，从而改善T细胞持久性和存活。在体外扩增期间抑制Akt触发具有高水平脂肪酸氧化的中央记忆表型，最终改善CAR T细胞的抗肿瘤活性。CD45RO+ CD62L+记忆CAR T细胞比更高级分化阶段的效应T细胞提供更持久的抗肿瘤反应，使富含CD62L的CAR T细胞成为进一步探索的有吸引力的选择。 因此，中央记忆CAR T细胞在临床应用中似乎更优越，因为响应的患者没有累积具有早期记忆和耗竭特征的T细胞，而非响应的患者则累积了。最终产品中工程化细胞的活性可能影响治疗效果。然而，基于制造的细胞产品的活性对CAR T细胞治疗结果的首次回顾性分析表明，当患者接受70-80%活性的产品与至少80%活性的产品相比，CD19 CAR T细胞扩增或患者存活没有差异的证据。 制造T细胞产品是一种个性化方法，当前程序有一些显著的限制： 一些癌症患者淋巴细胞减少或具有低数量的原始T细胞，导致生产延迟或失败，如在为儿科患者生产时所经历的。 生产过程耗时，这对急性或晚期疾病的患者不利。 由于疾病，患者的T细胞可能功能失调，如CLL和一些实体瘤所报告的，导致产品反应率低。 在某些情况下，工程化异体T细胞可能是另一种策略。在接受造血干细胞移植的患者中，使用移植的异体T细胞制造CAR T细胞产品。这样的异体CD19特异性CAR T细胞诱导了部分和完全缓解；然而，一些患者遭受了GvHD。病毒抗原特异性、部分HLA匹配的供体T细胞缺乏异体反应性，并且通过CAR工程化，显示出抗淋巴瘤活性。NK细胞以其MHC独立活性也是第三方供体细胞CAR工程化的来源；然而，它们在患者中表现出较差的持久性。 10.通过CAR T细胞的过继治疗在血液学恶性肿瘤中诱导持久缓解 过继转移CAR T细胞的治疗效果取决于多个参数，包括CAR设计、CAR信号传导、结合亲和力、目标细胞上的抗原数量、目标抗原表位的空间可及性、T细胞的成熟阶段、CAR T细胞的持久性和扩增、患者免疫系统的预处理等。目前的努力旨在优化特定疾病的状况；一些治疗方案已在CAR T细胞治疗恶性疾病的方面证明成功，特别是B细胞白血病/淋巴瘤；少数试验旨在治疗实体癌。 在迄今为止难以治疗的B细胞白血病和淋巴瘤的治疗中，使用“第二代”抗CD19 CAR T细胞的早期临床试验实现了完全且持久的缓解；使用“第一代”CAR T细胞的治疗大多失败，因为CAR T细胞从循环中迅速清除。目前，近600项早期阶段的CAR T细胞试验正在进行临床探索，主要由学术中心进行（截至2020年初，中国有268项，美国有227项，欧洲有67项）。用于治疗儿童B-ALL（Kymriah™，tisagenlecleucel，诺华）和成人大B细胞淋巴瘤（Yescarta™，axicabtagene ciloleucel，Kite-Gilead）的抗CD19 CAR T细胞已获得FDA和EMA的批准；其他将很快跟进。 CAR T细胞治疗的标准程序从患者的白细胞分离开始，分离T细胞，体外基因工程改造相应的CAR，CAR T细胞扩增，以及在非清髓性淋巴细胞减少和IL-2支持后，通过静脉输注将最终的细胞产品重新给患者（图7）。由于CAR T细胞的持久性对临床效果至关重要，目前在试验中使用的CAR具有一个或两个共刺激内域，其中大多数提供CD28或4-1BB共刺激。在持久性方面，4-1BB共刺激的CAR T细胞似乎优于CD28 CAR T细胞，在循环中持续4年以上，而CD28 CAR T细胞持续30天。由于CD19 CAR T细胞不区分健康和恶性B细胞，只要CD19 CAR T细胞持续存在，患者就会经历持久的B细胞耗竭。尽管B细胞耗竭在临床上是可管理的，但这种情况要求在靶向恶性B细胞时更具选择性。最近，Fcμ（IgM）受体被确定为治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）时可能更具肿瘤选择性的目标，由于目标表达水平较低，因此大多数健康B细胞免于被淘汰。目前也在探索其他替代靶标。 在缓解期间，大多数接受4-1BB CAR T细胞治疗的白血病/淋巴瘤患者没有接受进一步的癌症特异性治疗；接受CD28 CAR治疗的患者经常接受异体干细胞移植，这似乎是有益的，因为CD28 CAR T细胞的持久性不如4-1BB CAR T细胞。需要进一步探索以确定长期内更成功的策略。 迄今为止，患有DLBCL、CLL、B细胞急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）和滤泡性淋巴瘤的患者已通过CD19 CAR T细胞成功治疗。值得注意的是，接受CD19 CAR T细胞治疗的多发性骨髓瘤患者也经历了缓解，尽管通过流式细胞术评估，骨髓瘤细胞是CD19low或CD19阴性。目前也在探索用于治疗B细胞恶性肿瘤的其他替代靶标，包括CD20、CD22、Igκ轻链、ROR-1和CD30。 由于缺乏标准化的试验设计、CAR组成、靶向抗原、预处理等方面，很难比较各种试验中CAR T细胞治疗的成功。然而，越来越明显的是，CAR T细胞剂量和淋巴细胞减少的程度或淋巴细胞减少方案对于允许广泛的T细胞扩增、持久性和最终治疗效果至关重要。应用后对CAR T细胞的重复再刺激可能改善它们在长期内的持久性和抗肿瘤效果。这是使用病毒特异性T细胞进行CAR植入的合理性，它们在接触病毒抗原时通过TCR重复再刺激；例如，Epstein-Barr病毒（EBV）特异性T细胞通过CAR工程化，并被EBV感染的细胞触发扩增。事实上，EBV特异性CAR T细胞的表现优于没有病毒特异性的CAR T细胞。 11.治疗实体癌的CAR T细胞面临的挑战 虽然血液学恶性肿瘤的治疗越来越成功，但实体癌的治疗仍然具有挑战性（表2）。作为“活药”的CAR T细胞基本上非常适合治疗实体癌，特别是由于T细胞固有的迁移和组织穿透能力，穿透血脑屏障，并在几乎所有组织中积累，包括睾丸和眼睛等特权组织，因此特别适合消除（微）转移。然而，大多数实体肿瘤具有大量策略，以非常有效的方式对抗CAR T细胞的迁移、渗透和激活。其中，改变的趋化因子环境损害了CAR T细胞向肿瘤的迁移；肿瘤内皮细胞上丢失了一些粘附因子，妨碍了T细胞的渗透。通过局部沉积TNF-α可以对抗后者，它增加了血管粘附分子，如血管细胞粘附蛋白-1和内皮细胞上的细胞间粘附分子-2。靶向血管内皮生长因子（VEGF）受体-2或阻断迁移抑制因子如内皮素B受体也改善了内皮细胞粘附和/或T细胞的跨内皮迁移。在T细胞上下调的趋化因子受体被重新表达，如CXCR2（CXCL1受体），以便于靶向黑色素瘤或CCR2b用于靶向神经母细胞瘤。 表 2 CAR T细胞疗法面临众多挑战。 为了绕过迁移障碍，CAR T细胞被瘤内植入或分别注入胸膜或腹膜以治疗间皮瘤和卵巢癌。通过内窥镜将抗CEA CAR T细胞应用于肝转移；抗c-Met CAR T细胞被注入乳腺癌转移。一旦进入肿瘤病变，CAR T细胞需要突破基质细胞和细胞外基质的障碍，才能接近癌细胞以执行它们的细胞毒性攻击。通过基因工程释放的肝素酶在基质中降解肝素硫酸蛋白多糖，改善T细胞的渗透；需要高水平的IFN-γ来消除基质细胞并根除大型已建立的肿瘤病变。通过直接针对基质细胞的CAR T细胞特异性针对成纤维细胞激活蛋白（FAP），一种参与细胞外基质重塑的丝氨酸蛋白酶，整体抗肿瘤活性得到改善。 许多过程使肿瘤病变对重定向的CAR T细胞产生敌意，使它们变成耗竭状态或进入凋亡。调节性T（Treg）细胞、髓源性抑制细胞（MDSCs）和肿瘤相关M2型巨噬细胞释放抑制性细胞因子，如IL-4、IL-10、白血病抑制因子（LIF）和TGF-β。MDSCs和巨噬细胞降低肿瘤内色氨酸水平；基质细胞释放吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）和犬尿氨酸，抑制T细胞效应功能并剥夺组织中的葡萄糖和其他营养物质。严重的酸中毒也对抗肿瘤活性的CAR T细胞产生反作用。由于MDSCs释放的精氨酸酶，低精氨酸水平抑制CD3ζ表达和TCR信号传导。 12.CAR T细胞治疗与毒性相关 作为“活药”的CAR T细胞治疗在一些试验中取得了显著的治疗效果；然而，CAR T细胞在初始应用后的几天甚至几周内可能导致严重的副作用，需要重症监护干预，甚至可能致命。大多数毒性是由于CAR T细胞的特殊生物学特性，其他与CAR T细胞相关的毒性目前尚未完全理解。从机制上讲，主要毒性是(1)由于大量T细胞激活、细胞因子释放和肿瘤溶解引起的全身毒性，以及(2)由于CAR T细胞与健康组织相互作用引起的特异性毒性（“靶上非肿瘤”毒性）。 12.1.系统性毒性 细胞因子释放综合征（CRS）：大量CAR T细胞与目标细胞的结合导致大量细胞因子释放，血清中促炎细胞因子（包括IFN-γ和TNF-α、IL-10和IL-6）的水平异常高，这本身会导致其他免疫细胞的交叉激活，以及进一步的细胞因子释放，直至达到有毒水平。这些毒性被称为细胞因子释放综合征（CRS），临床上伴有高烧、不适、疲劳、肌肉痛、恶心、厌食、心动过速、低血压、毛细血管渗漏、心脏功能障碍、肾功能损害、肝功能衰竭和弥散性血管内凝血。CRS常与血管渗漏综合征（VLS）一起出现，与巨噬细胞激活综合征（MAS）和巨噬细胞激活密切相关，临床上类似于噬血细胞性淋巴组织细胞增多症（HLH）。CRS的风险与T细胞激活和扩增有关，这可能与总体肿瘤负荷相关，但并非绝对。为了避免CRS，需要在肿瘤负荷高的患者中使用较低剂量的CAR T细胞，这是一个需要通过精确定义治疗窗口来解决的悖论，通过调整T细胞激活、细胞因子释放和抗肿瘤活性。 CRS的早期诊断和临床管理通过新建立的评分系统和治疗指南得到便利。C反应蛋白，即由肝细胞在IL-6水平增加时释放的蛋白质，目前作为CRS发作和严重程度的实验室标志物；成人的预测标志物还包括可溶性gp130（sgp130）、IFN-γ和IL-1Rα的增加，在儿科患者中，IFN-γ、IL-13和MIP1α的增加。目前CRS的治疗基于阻断IL-6/IL-6受体信号轴，通过阻断抗体如抗IL-6受体抗体tocilizumab或抗IL-6抗体siltuximab，这似乎不会干扰CAR T细胞的疗效。短期系统性皮质类固醇治疗也能迅速逆转CRS，且不影响最初的抗肿瘤反应；然而，它可能在长期内损害CAR T细胞反应。在CRS期间中和促炎细胞因子有助于减轻CRS的严重程度。在CRS期间，活化的单核细胞和/或巨噬细胞释放高水平的IL-1；通过IL-1受体拮抗剂中和可以改善临床模型中的CRS和神经毒性。通过给予lenzilumab抗体中和巨噬细胞-单核细胞激活细胞因子GM-CSF，降低了CRS的风险。通过阻断酪氨酸羟化酶减少儿茶酚胺，降低了小鼠模型中的细胞因子水平，暗示了临床干预的途径。 与CAR T细胞相关的HLH/MAS通常与CRS症状一起出现，伴有铁蛋白和肝酶血清水平升高、噬血细胞现象、细胞减少、肺水肿、脾肿大、肾功能衰竭和NK细胞丢失。治疗包括使用依托泊苷或阿糖胞苷进行系统性化疗，如果与神经毒性相关，也可以鞘内应用；在这种情况下，IL-6/IL-6R阻断大多无效。 神经毒性（ICANS）：CAR T细胞治疗相关的神经毒性现在被称为免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）。神经系统效应包括失语症、幻觉、混乱、谵妄、表达性失语症、肌阵挛、谵妄、癫痫发作和脑水肿。这种神经毒性发生在大约40%的患者中，是可逆的，并且在CD19 CAR T细胞治疗期间频繁发生；其他CAR T细胞也可以引起神经毒性，指向由于活化CAR T细胞的浸润导致的弥漫性但暂时性脑病。神经毒性的机制尚不清楚，但与破坏血脑屏障和脑脊液中细胞因子水平增加有关。如果与CRS一起治疗，用IL-6阻断和类固醇治疗可以成功。 12.2.“靶上非肿瘤”毒性 由于大多数靶向抗原也由健康细胞表达，CAR T细胞治疗与攻击健康组织的风险相关，导致巨大的“靶上非肿瘤”毒性。治疗B细胞白血病的CD19靶向CAR T细胞也消除了健康的B细胞；持久的B细胞耗竭需要免疫球蛋白替代和抗生素及抗真菌保护，这在临床上是可管理的。当目标抗原由重要组织表达时，毒性更严重。在一项针对肾癌患者的碳酸酐酶IX特异性CAR T细胞治疗试验中，患者由于胆管上皮细胞上碳酸酐酶IX水平较低而出现肝毒性；通过预先给予阻断抗体，可以减少“非肿瘤”毒性的严重程度。避免“靶上非肿瘤”毒性的策略目前旨在增加肿瘤选择性，并以空间和时间的方式限制CAR活性。T细胞给药的替代途径可能是避免通过血液系统分布大量CAR T细胞的选项。通过内窥镜或胸膜内或腹膜内应用局部CAR T细胞给药，在肿瘤部位提供高剂量的CAR T细胞，并在一定程度上避免了非肿瘤毒性。然而，这种应用是有限的，因为在大多数情况下，肿瘤病变无法接触或肿瘤广泛扩散。 12.3.“靶外非肿瘤”毒性 大多数过去工程化的CAR在细胞外部分包含IgG1 CH2CH3结构域作为间隔区，这可能会与Fcγ受体（FcγR）（CD64）结合，从而激活NK细胞和巨噬细胞等先天细胞。尽管到目前为止在临床上并不突出，但理论上可以通过删除IgG1 CH2结构域或突变FcγR结合位点内的Asn297来减少风险。替代间隔区包括IgG4 Fc结构域或细胞外CD8结构域。 第三代曲妥珠单抗衍生的CAR T细胞靶向ErB2导致可能由于急性呼吸窘迫综合征和CRS导致的致命的心肺衰竭。同样，在用EGFR变体3特异性CAR T细胞和CEA特异性CAR T细胞治疗时记录了肺水肿，而没有直接证据表明CAR T细胞攻击肺上皮。由于使用针对同一目标的不同表位或传递不同信号的CAR可能产生显著不同的毒性，因此毒性概况更加复杂，例如，使用来自FRP5抗体的第二代ErB2 CAR的T细胞在肉瘤患者中并未诱导靶外非肿瘤毒性。 12.4.改善CRS的策略 基本上，当CRS在临床上显著时，需要对CAR T细胞进行下调或去激活；瞬时CAR表达、“关闭开关”和“自杀开关”是常用工具。 当存在严重CAR T细胞相关毒性的重大风险时，瞬时CAR表达可能有益。RNA转移产生瞬时表达的CAR。CAR在T细胞表面存在数天，并在目标细胞结合时介导有效的T细胞激活，然而，随着RNA降解和T细胞扩增时RNA稀释，CAR表达会下降。这种RNA修饰的T细胞在试验中显示出一些虽短暂但有效的效果。然而，由于CAR T细胞迅速清除，其缺点是短期效果。 然而，永久性修改的CAR T细胞需要在毒性不受控制的情况下主动消除这些细胞的策略。大剂量脉冲治疗类固醇在应用碳酸酐酶IX特异性CAR T细胞后停止了自身免疫。虽然这是非选择性地清除激活的T细胞，但可以通过特定靶向更有选择性地消除CAR T细胞。CAR结合域基本上也可以通过抗独特型抗体进行靶向，以诱导CAR T细胞的溶解性消除。通过给予识别细胞外CAR结构域中整合的表位的消耗性、FDA批准的抗体，也可以实现CAR T细胞的消耗。例子包括使用利妥昔单抗来消耗具有CD20表位或模拟表位的CAR T细胞，或使用西妥昔单抗来消耗具有EGFR表位的CAR T细胞。是否能够迅速实现足够的CAR T细胞清除以逆转正在进行的CRS，还有待在临床情况下证明。 诱导凋亡的CAR T细胞消除似乎是这种情况下更快速的解决方案。转基因脲酶-9（Cas9）与FKBP1A相连，在系统应用原本惰性的小分子AP1903后，会在工程化CAR T细胞中诱导凋亡，该分子促进二聚体化和激活诱导性Cas9（iCas9）。这种策略是有效的，因为供体T细胞介导的GvHD可以在实验系统中通过iCas9介导的T细胞凋亡在一小时内停止。 与其消除CAR T细胞，不如通过整合模块控制细胞表面的CAR。CAR被设计为融合蛋白，整合了一个自切割降解结构域，该结构域被可以被特定蛋白酶抑制剂特异性阻断的蛋白酶反向调节。在蛋白酶存在的情况下，产生的CAR融合蛋白从连接的降解结构域分离并表达在细胞表面；抑制蛋白酶导致CAR降解和缺乏表面表达。 CAR也可以通过添加酪氨酸激酶抑制剂dasatinib来降低其表达或调节其信号强度，该抑制剂可以迅速且可逆地阻断Lck激活；从而在小鼠模型中减少CRS的严重程度。该策略的好处是，只要存在dasatinib，CAR T细胞的信号强度就会减弱，但不会被清除；然而，该策略仍需临床验证。 需要进一步开发以降低细胞因子介导毒性风险的CAR。调节信号强度的一个关键是CAR共刺激。CD28-ζ CAR更快地诱导T细胞激活，并诱导更高的细胞因子释放、扩增和随后的耗竭，而4-1BB-ζ CAR则驱动较少的急性扩增，但具有较低的细胞因子水平，因此与严重CRS的风险较低。因此，4-1BB-ζ CAR可能更适用于肿瘤负荷和抗原密度高的患者，而CD28-ζ CAR可能需要用于肿瘤负荷低的情况。 降低CAR介导的T细胞激活的其他策略，例如，修改CD8跨膜和铰链区域，从而降低ICANS或高于1级CRS的风险。作为一种替代策略，“通用”CAR允许通过调整将CAR T细胞与目标细胞链接的适配器分子来动态控制T细胞激活。 13.CAR T细胞治疗的挑战 在过去的几年里，临床试验正致力于将CAR T细胞治疗确立为治疗几种类型的B细胞白血病和淋巴瘤；然而，在治疗其他恶性疾病的方面，仍然存在重大障碍。 13.1.如何选择最佳的肿瘤选择性抗原作为靶标？ 在CAR T细胞治疗中，肿瘤靶向的选择性对于长期兼容性至关重要。大多数可靶向的肿瘤相关抗原并不具有肿瘤选择性，这增加了CAR T细胞疗法中诱导靶上非肿瘤毒性的风险。肿瘤特异性的表面蛋白突变或肿瘤相关糖基化变体如Muc1或Muc16是罕见的。然而，有些抗原虽然由健康组织表达，但似乎是安全的靶标。例如，癌胚抗原（CEA，CD66e）严格表达在胃肠道和肺部健康上皮的腔面，而在癌细胞上以去极化方式表达。系统性应用CEA特异性CAR T细胞（NCT01212887, NCT02349724）和通过肝动脉输注局部给药的抗CEA CAR T细胞（NCT01373047）在减缓肿瘤进展的同时，并未诱发治疗相关结肠炎。其他如ErB2等抗原可能在高表达ErB2的肿瘤细胞被选择性靶向时是合适的靶标，同时保留中低表达的健康细胞。 为了增加肿瘤选择性，优先考虑靶向一组抗原模式而不是单一特定抗原。技术上，在同一T细胞中共表达两种具有不同特异性的CAR，以在两种CAR同时结合它们相应的抗原时仅诱导完全的T细胞激活；一种CAR提供主要信号，另一种CAR提供共刺激信号，从而仅在存在两种抗原的情况下补充完全T细胞激活所需的信号。该策略需要一个弱的主要信号，以避免在存在一种抗原的情况下进行一些基本的CAR T细胞激活，以及一个强的共刺激信号以驱动完全的T细胞激活。 为了在结合健康细胞时阻断CAR T细胞激活，与激活性CAR共表达具有细胞内PD-1或CTLA-4信号传导的抑制性CAR（iCAR）。iCAR识别健康细胞上存在但在癌细胞上不存在的抗原。因此，仅在结合缺乏iCAR识别的抗原的目标细胞时才发生CAR T细胞激活。 有些抗原在癌细胞上的表达水平高于健康细胞；“亲和力调节”CAR结合域可能有助于区分这两种组织。虽然在临床前模型中证明了可行性，但癌细胞可能通过下调相应抗原来逃避监视。亲和力调节的治疗窗口狭窄，因为增加亲和力可能导致识别健康细胞，如GD2特异性CAR在实验模型中诱发致命性脑炎。 13.2.如何优化CAR结构？ 目前临床评估中的大多数CAR基于近二十年前设计的原型CAR结构。临床前研究表明，对于每种抗原，特定CAR需要针对目标抗原表位、结合亲和力、间隔区长度以及信号传导和跨膜结构域等进行优化。由于各组分之间复杂的依赖性，目前无法预测特定抗原的最佳CAR组成。例如，结合亲和力和目标表位的位置为靶向高抗原负载的癌细胞同时保留低抗原负载的健康细胞提供了狭窄的亲和力窗口。 13.3.如何在CAR T细胞治疗后建立长期癌症控制？ 尽管在儿童B-ALL中可以高频率诱导完全缓解，但约40%的白血病患者在持续存在CAR T细胞的情况下仍然复发。多种原因导致复发频率高，包括整个CD19分子的丢失或表达缺乏目标外显子2的CD19异构体，从而使其对CAR T细胞不可见。在CD19 CAR治疗后，B-ALL的两个案例中通过转换为CD19阴性的髓系谱系丢失CD19。在这种情况下，靶向对癌细胞存活至关重要的抗原将是一个理想的策略。由于这样的抗原通常不可用，通过双特异性CAR共靶向第二种抗原（例如CD20或CD22）可能会增加对白血病细胞的治疗压力。在实体瘤中这种情况更为重要，因为它们在抗原表达上通常表现出深刻的异质性；在初始肿瘤消退后的早期肿瘤复发可能是由于选择抗原丢失的癌细胞。这些癌细胞可能以抗原非依赖性方式被先天免疫细胞反应识别和消除。为了吸引和激活先天细胞并启动更广泛的免疫反应，CAR T细胞在实验模型中被赋予了诱导释放转基因IL-12的能力，使抗肿瘤攻击更有效。有一些迹象表明，结合抗原依赖性和非依赖性免疫反应可能在长期内控制肿瘤。 13.4.哪种T细胞亚群提供长期肿瘤控制？ 临床前模型表明，具有增强扩增能力和长期持久性的原始或早期中央记忆T细胞是过继治疗最合适的细胞。沿着这条线，CD62L+记忆T细胞似乎表现出优越的性能。发现中央记忆干细胞（TSCMs），这是CD62L+中央记忆T细胞库的一部分，具有非凡的扩增潜力，激发了对这些细胞进行过继细胞治疗的探索。人们对识别和调节干细胞样T细胞形成和维持的因素和调控网络越来越感兴趣，因为这些细胞在过继转移到患者后似乎对长期治疗效果至关重要。另一种策略是基于预测性地诱导T细胞成熟。例如，4-1BB共刺激在年轻T细胞中启动中央记忆T细胞反应，这与CD28 CAR T细胞表现出更短暂的效应细胞反应形成对比。另一方面，更成熟的阶段的细胞在大多数肿瘤所在的外围显示出优先积累。然而，这些细胞需要不同的共刺激信号，即优先迁移到外围的CCR7− T细胞从联合CD28-OX40共刺激中受益。特定T细胞亚群的功能能力也可以通过与激酶抑制剂的联合治疗来调节；ibrutinib，一种布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂，降低了PD-1和CAR T细胞的耗竭，从而增加了持久性和抗肿瘤活性。 13.5.如何使CAR T细胞制造适应日益增长的患者数量？ 目前，大多数CAR T细胞由专门的GMP设施生产，冷冻并运送到患者的医院。生产越来越多的细胞产品将使当前程序达到极限，特别是当及时需要数千个自体细胞产品时。在医院内（半）自动化、完全控制和完全封闭系统的分散制造是解决这种情况的首选概念之一。这也将需要在制造过程中高度标准化，并避免血液和细胞产品运输中的复杂物流。作为另一种概念，一个高度专业化的、集中的生产设施，具有多个并行的自动化制造过程，可能作为患者细胞产品的区域供应商。 另一个限制是由患者自体T细胞治疗的需要设定的；对于每位患者来说，“通用”供体将使治疗在多个方面更容易。一个包含不同工程化CAR的“通用”供体T细胞产品库将在临床应用中提供更大的灵活性，根据患者的具体情况。此外，扩大生产规模将使更多的患者能够使用CAR T细胞产品。正在努力生成可以应用于众多患者的这种“通用”T细胞。这需要使CAR T细胞对宿主免疫细胞“隐形”，缺乏对患者健康组织的异体反应性，同时保留CAR介导的抗肿瘤活性。在这种情况下，通过基因组编辑技术获得的MHC缺陷、CAR修饰的病毒特异性T细胞和TCRα敲除T细胞，目前正在开发作为“现成的”或“第三方”细胞产品，GvHD风险低。CAR基因插入TCRα位点一步实现CAR的遗传工程和TCR表达的废除。编辑MHC I类以防止宿主识别和排斥供体T细胞可能通过NK细胞诱导消除，并不防止MHC II类介导的排斥。然而，目前探索的所有基因编辑程序在某种程度上都容易受到非目标修饰的影响，因此与意外的突变风险相关。该领域发展迅速，首次使用异体CAR T细胞治疗B细胞恶性肿瘤和实体瘤的试验已经启动。 13.6.如何平衡CAR T细胞的疗效和副作用？ 目前，一些CAR T细胞治疗与高风险的严重副作用相关，可能需要重症监护住院治疗。尽管各种CAR T细胞协议和治疗程序不同，并且没有在比较性的临床环境中进行评估，但一些临床管理规则变得明显。例如，CRS的早期诊断、分级和临床管理将标准化，建立共识的治疗方案。在毒性不受控制的情况下，可以通过各种手段选择性地和迅速地消除CAR T细胞。通过添加二聚体化剂AP1903二聚体化转基因诱导的脲酶-9（iCasp9），在30分钟内消除超过90%的T细胞。或者，通过给予针对CAR结构域或共表达表位的抗体，诱导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）清除循环中的CAR T细胞。免疫介导的CAR T细胞消除的缺陷仍然是，癌症患者的潜在功能障碍免疫系统可能通过ADCC消除CAR T细胞的能力有限。 13.7.我们是否需要针对每种癌症类型的特定预处理？ 在大多数试验中，患者在过继T细胞治疗前接受非清髓性淋巴细胞减少，使用氟达拉滨和环磷酰胺；这种预处理的理由是暂时提供“空间”和细胞因子，以实现转移的CAR T细胞在体内的充分扩增。淋巴细胞减少还通过免疫调节提供抗肿瘤效果，因为它耗尽抑制细胞，并在肿瘤破坏时释放肿瘤相关抗原到免疫系统。尽管目前的预处理方案基本上是有效的，但基本方案可能需要针对每种癌症实体进行调整。例如，用于治疗Her2+肿瘤的调节方案通过应用nab-紫杉醇来耗尽间质性基质，并促进Her2呈递，并通过应用环磷酰胺耗尽Treg和MDSC，用于胆道和胰腺癌的修改。另一方面，预处理在CAR T细胞治疗的背景下可能具有高度毒性，通过诱导脑水肿和神经系统毒性，特别是在最近的一项试验（NCT02535364）中观察到的氟达拉滨治疗后。 13.8.如何激活免疫网络以诱导广泛的炎症性抗肿瘤反应？ CAR T细胞作为“活药”，越来越成为在目标器官产生和释放生物活性化合物的“活工厂”。使用CAR T细胞作为工厂的合理性基于实验肿瘤模型的证据，即宿主免疫系统在肿瘤排斥中起着重要且必要的作用，这使得在目标肿瘤组织内产生免疫刺激性条件成为必要。释放IL-12的CAR T细胞（IL-12 TRUCKs）可以通过吸引和激活M1型巨噬细胞来在肿瘤组织中诱发免疫反应，这些巨噬细胞可以消除CAR T细胞未能识别的癌细胞。其他具有特定影响局部免疫环境的细胞因子也可以使用；释放IL-18的CAR T细胞增加了肿瘤相关CD206+ M1型巨噬细胞和NKG2D+ NK细胞的数量，并减少了如Treg细胞、CD103+树突细胞和M2型巨噬细胞等抑制细胞。目前正在试验中探索使用靶向PD-1的检查点阻断，以激活CAR T细胞和浸润性淋巴细胞（NCT02650999）；其他检查点的阻断或组合，以重新激活肿瘤内源性免疫细胞，同样值得进行临床探索。 14.CAR T细胞用于其他疾病的治疗 将T细胞激活重定向的CAR不仅限于靶向癌细胞，还可以用于靶向任何由目标抗原定义的细胞。通过抗Dsg3 CAR靶向记忆B细胞的CAR T细胞被设计用来消除导致天疱疮病理的细胞。通过识别MHC呈递的自身抗原的CAR T细胞靶向自反应性T细胞。CAR被工程化以靶向病毒感染的细胞，如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、巨细胞病毒和HIV感染的细胞。源自Dectin-1的CAR T细胞被用于破坏真菌Aspergillus的发芽。实验模型暗示，CAR重定向的Treg细胞可用于促进自身免疫疾病如结肠炎、过敏性哮喘和移植物抗宿主病的免疫耐受治疗，通过靶向HLA。最近，通过识别心脏成纤维细胞激活蛋白（FAP）的CAR T细胞靶向心脏纤维化，该蛋白在心肌损伤重塑时由心脏成纤维细胞高度表达。采用FAP特异性CAR的T细胞过继转移减少了心脏纤维化并恢复了小鼠的损伤后功能。该报告暗示CAR T细胞作为“活药”，在治疗目前疗法非常有限的心脏病中消除激活的心脏成纤维细胞。CAR T细胞用于治疗非恶性疾病其他应用的临床前开发正在进行中。 要点 采用嵌合抗原受体（CAR）重定向的T细胞的过继细胞治疗在某些血液学恶性肿瘤中取得了显著的治疗效果；然而，在其他疾病中的治疗效力仍然有限。 CAR是由结合域、跨膜域和细胞内信号传导域组成的模块化、重组的跨膜分子，用以激活工程化细胞。最佳分子设计需要通过变化组成域在每种情况下探索。 原型CAR设计可以通过使用各种靶向和信号传导元件进行修改，使CAR更加通用。此外，各种免疫细胞可以通过CAR重定向，提供方便的治疗细胞。 CAR T细胞治疗经常与毒性相关，这些毒性可以通过同时进行的治疗、改变CAR设计和靶向替代抗原来减少靶上非肿瘤毒性来减轻。 通过共同激活广泛的免疫反应、共同靶向肿瘤基质、癌症干细胞和其他与肿瘤相关的结构，可以提高CAR工程化免疫细胞的抗肿瘤效力。 生产CAR T细胞产品仍然具有挑战性，为所有患者提供个性化治疗；正在努力为广泛的患者群体制造异体细胞产品“现成”。 下章预告：抗体关键特性的改进 往期内容： 第二章：抗体：发现及特性的历史 第三章：单克隆抗体和杂交瘤细胞 第四章：抗体展示系统 第五章：转基因动物用于产生人类抗体 第六章：抗体在治疗、诊断和科学中的应用 第七章：双特异性抗体 第八章：抗体偶联药物 第九章：替代性结合框架：用于基础研究和治疗应用的多功能结合剂 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法的出现，为儿童和成人患者中复发/难治性血液系统恶性肿瘤的长期清除带来了前所未有的成果。然而，与CAR-T细胞相关的严重毒性，如细胞因子释放综合征和神经毒性，影响了治疗的实用性；并且对实体瘤的治疗效果仍然不够令人印象深刻。因此，出现了修改其他免疫细胞类型的工程策略，特别是自然杀伤（NK）细胞。由于CAR依赖性和CAR非依赖性（先天免疫介导的）抗肿瘤杀伤能力、主要组织相容性复合体非依赖性细胞毒性、降低异体反应风险以及缺乏主要CAR-T细胞毒性，CAR NK细胞构成了有前景的下一代CAR免疫细胞，并且也适用于“现成的”治疗。在这篇综述中，我们比较了CAR-T和CAR NK细胞疗法，特别关注免疫突触、工程策略和挑战。 引言 CAR T细胞疗法基于用重组抗原特异性CAR分子对T细胞进行工程改造，赋予CAR T细胞目标特异性细胞毒性，独立于T细胞抗原受体（TCR）。与传统的细胞毒性T细胞功能不同，后者受TCR复合物在T细胞上与目标细胞上的主要组织相容性复合体（MHC）分子的结合和识别的限制，CAR介导的CAR T细胞的细胞毒性是非MHC限制性的。CAR T细胞在患有复发/难治性血液系统恶性肿瘤的患者中实现了持久的缓解。然而，严重的毒性，如细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性，以及对实体瘤的有限疗效，促使人们改造具有细胞毒性潜力的替代免疫细胞，如NK细胞。尽管美国食品药品监督管理局（FDA）批准的所有CAR T细胞疗法都依赖于患者衍生的和工程改造的CAR T细胞的自体转移以避免移植物抗宿主病（GvHD），但FDA也批准了基因改造的同种异体CAR T细胞的临床试验。目前正在研究低免疫原性同种异体CAR T细胞的开发，以实现健康捐赠者的同种异体CAR T细胞的大规模工程和输血。在这篇综述中，我们比较了T细胞和NK细胞抗肿瘤细胞毒性的机制、CAR设计和工程策略，并讨论了解决CAR T细胞和CAR NK细胞疗法面临的挑战如何影响它们未来的应用，特别是针对实体瘤。 NK细胞是如何与T细胞一起抗击癌症的NK细胞是先天免疫细胞，作为第一线的防御者。与T细胞不同，NK细胞的抗肿瘤功能独立于MHC分子，并且不需要抗原启动。NK细胞表达一系列激活受体（aNKRs）和抑制受体（iNKRs）；取决于aNKR和iNKR信号之间的协调是倾向于NK细胞激活还是抑制，分别导致目标细胞的裂解或免疫自我耐受。当肿瘤细胞下调自身MHC I类分子，创造出“缺失自我”的状态，或者通过aNKRs识别肿瘤相关的压力配体时，NK细胞的脱颗粒和目标细胞裂解就会发生。NK细胞的细胞毒性也可以通过FasL与肿瘤细胞上的相应受体结合发生，通过抗体依赖性细胞毒性（ADCC）发生，涉及NK细胞上的CD16与抗体结合的目标细胞的结合，或者间接通过释放免疫原性细胞因子。免疫系统与实体瘤的战斗涉及一个复杂的先天和适应性免疫细胞网络。这些细胞在肿瘤内的丰度和它们的信号协调影响肿瘤进展或控制的命运。在新转化的实体瘤中，NK细胞可以检测到肿瘤细胞亚群上的压力配体。 CAR NK细胞相对于CAR T细胞的优势  CAR NK细胞相对于CAR T细胞具有几个优势，可以用来治疗实体瘤。例如，CAR NK细胞可以利用NK细胞的先天抗肿瘤能力，同时更倾向于目标特异性的杀伤。这使得CAR NK细胞能够杀死表达目标的癌细胞（CAR介导的杀伤）和缺乏目标的癌细胞。 (CAR独立/先天NK细胞毒性介导的)，这一优势对于治疗实体瘤尤为重要，对于治疗实体瘤来说尤其重要，因为这些肿瘤通常以抗原异质性和逃避免疫细胞毒性为特征。由于大多数NK细胞的细胞毒性能力在癌症患者中在肿瘤进展过程中以及在如手术等治疗性方案后会降低，大多数CAR NK细胞需要同种异体来源。迄今为止，对接受同种异体CAR NK细胞治疗的患者进行的临床研究记录显示，由于缺乏MHC I类限制，没有发生移植物抗宿主病(GvHD)。 尽管可逆，细胞因子释放综合征(CRS)是一种危及生命的状况，通常发生在接受CAR T细胞治疗的患者中，这是由于效应免疫细胞的过度激活和血清细胞因子水平的放大分泌，无论是由CAR T细胞还是CAR T细胞激活的巨噬细胞分泌的，包括干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞炎症蛋白-1(MIP-1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1，也称为CCL2)和白细胞介素-6 (IL-6)及IL-10。然而，在接受CAR NK细胞治疗的患者中，CRS的发生率非常低。虽然原因尚未完全理解，但在CAR NK细胞治疗后CRS病例的罕见可能部分归因于NK细胞激活后不同的细胞因子谱，包括干扰素γ、肿瘤坏死因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和趋化因子CCL1、MCP-1、MIP-1α（也称为CCL3）、MIP-1β(CCL4)、CCL5和CXCL8，以及与CAR T细胞试验相比完成的CAR NK细胞临床研究的数量有限。 此外，从脐带血、干细胞分化、外周血或NK细胞系大量生产CAR NK细胞的前景对于未来的现成生产是有希望的。例如，在一项研究中，通过在70天内进行五轮刺激，从脐带血中获得的NK细胞扩增了大约1100万倍，从外周血中获得的NK细胞扩增了超过2500亿倍。在另一项研究中，使用辐照的自体外周血单核细胞、IL-2和抗CD3抗体的混合物，可以获得高达15000倍的高活性外周血衍生NK细胞扩增。 CAR与典型T细胞和NK细胞免疫突触的比较  CAR淋巴细胞与目标肿瘤细胞之间形成的免疫突触的类型和特征对CAR淋巴细胞抗肿瘤效果至关重要（图1）。CAR T细胞与肿瘤细胞的第一次接触涉及通过形成免疫突触，在T细胞上的CAR分子与肿瘤细胞上的目标抗原之间进行识别和稳定结合；然而，由CAR分子形成的免疫突触与典型TCR在许多方面都有所不同。一个经典的成熟的免疫突触由三个同心的超分子激活簇(SMACs)区域组成，这些对于TCR细胞毒性功能是必不可少的。在溶解性免疫突触中，中央SMAC由Lck激酶-TCR微簇组成，参与启动激活信号级联和释放溶解颗粒。外围SMAC控制LFA-1整合素与目标细胞表面的ICAM-1粘附分子的结合，被认为是稳定突触的，远端SMAC主要是一个含有如CD43和CD45等糖萼蛋白排斥因子的肌动蛋白环，这些因子保护T细胞，并由CD2的冠与目标细胞上的CD58结构域相互作用，从而实现额外的共刺激信号。然而，在某些情况下，单个受体的参与或膜微簇的形成就足以触发T细胞激活，无需成熟的突触形成。另一方面，CAR T细胞中的免疫突触不涉及成熟的突触形成，而是包括复杂的Lck微簇，对LFA-1的依赖性较小，并且缺乏粘附环。这种较不组织的突触使得CAR介导的参与更快，随后比TCR更快地释放信号级联，并且与更快的细胞毒性颗粒分泌和随后CAR从目标细胞上的脱离有关。 肿瘤激活的NK细胞释放XCL1、XCL2和CCL5趋化因子，吸引传统的1型树突状细胞（cDC1s），导致炎症活跃的微环境，通常被称为“热肿瘤”。新抗原呈递或肿瘤相关抗原（TAA）呈递的cDC1s在肿瘤引流淋巴结中启动CD8+ T细胞，使进一步的T细胞浸润和MHC I类介导的肿瘤细胞裂解成为可能。多克隆的CD4+和CD8+肿瘤浸润性淋巴细胞，包括一个能够通过MHC II类介导的肿瘤杀伤的细胞毒性CD4+ T细胞亚群，具有多样化的TCR库和不同的记忆分化和耗竭表型，响应于这种启动而浸润实体瘤。免疫逃逸可以通过肿瘤细胞分泌前列腺素E2来促进，它不仅阻断了CD8+的细胞毒性，还降低了NK细胞的存活率、活性以及趋化因子CCL5和XCL1的分泌，这削弱了NK细胞介导的cDC1s到肿瘤微环境（TME）的招募。肿瘤细胞内在的对干扰素-γ（IFNγ）的敏感性，由活化的TAA特异性CD8+ T细胞分泌，促进肿瘤细胞上PD-L1和其他免疫检查点配体的表达，通过与T细胞上的相应检查点受体（如PD-1）结合，使肿瘤细胞对T细胞细胞毒性产生抗性。在这种情况下，免疫检查点阻断（ICB）可以是一种有效的免疫疗法；然而，肿瘤也可以通过减少抗原呈递来逃避T细胞细胞毒性并获得对ICB的抗性，从而使肿瘤内的T细胞通过CXCL12-CXCR4介导的趋化作用进入邻近的淋巴结。由于iNKR与自身MHC I类复合物的结合有利于NK细胞的抑制，ICB耐药肿瘤细胞中MHC I类复合物的丢失通过限制iNKR的结合，重新使肿瘤内的NK细胞敏感，从而恢复NK细胞的细胞毒性。然而，并非所有肿瘤内的NK细胞都具有细胞毒性。一项研究发现，在三阴性乳腺癌患者中存在一个促进肿瘤发生的亚群Socs3hiCD11b−CD27−未成熟NK细胞，这与预后不良相关，并可能促进肿瘤进展和阻碍异种移植小鼠模型中ICB的效力。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和髓源性抑制细胞被肿瘤细胞招募以创造一个缺氧和免疫抑制的TME。抗炎M2样巨噬细胞通过释放抑制性的转化生长因子-β（TGFβ）并推动NK细胞上CD85j抑制性受体的上调来抑制NK细胞的脱颗粒和功能。根据肿瘤类型、恶性阶段和TME的状态，TAMs可以通过向CD4+ T细胞交叉呈递新抗原来增强抗肿瘤功能，这些T细胞获得细胞毒性能力。TAMs也可以帮助肿瘤逃逸。最近的研究显示，TAMs是TME内主要的葡萄糖消耗者；通过细胞内在的持续糖酵解作用导致TME内乳酸积累，TAMs有利于调节性T（Treg）细胞的招募和CD8+ T细胞的驱逐。髓源性抑制细胞表达NK抑制性配体，分泌活性氧，有助于抑制性的腺苷和TGFβ的积累，并激活Treg细胞释放更多的TGFβ，这些协调作用对NK和T细胞功能有严重影响。TME中丰富的Treg细胞和表达PD-1的滤泡调节性T（TFR）分化细胞，具有强大的免疫抑制能力，可以减少肿瘤浸润性淋巴细胞的细胞毒性，并可能进一步抑制抗PD-1 ICB的效力。因此，持久的免疫抑制TME和克服肿瘤免疫逃逸机制对于成功的CAR T或CAR NK细胞疗法至关重要。 图1 | T细胞和NK细胞中的典型免疫突触与CAR免疫突触。辅助T细胞-APC相互作用代表了TCR和MHC之间典型的免疫突触。这种免疫突触由中心TCR-Lck复合体（中心SMAC）构成，但不包含溶解颗粒，周围是由外周LFA-1/ICAM-1组装（外周SMAC）和伴随CD45和CD2结合的远端肌动蛋白聚合环（远端SMAC）所环绕。CTL-肿瘤细胞溶解突触具有类似的SMAC簇，但也涉及MTOC极化后的中心SMAC内溶解颗粒释放。NK溶解免疫突触包括aNKR配体结合以及CD16介导的ADCC，抑制性NK细胞受体-自身MHC I类结合的丰度低或缺失，并由LFA-1/ICAM-1的外周组装所环绕。NK细胞在静息阶段含有溶解颗粒，并且只有在涉及MTOC极化的时空有序的信号级联发生后，才会经历“定向分泌”。CAR T细胞中的免疫突触包括卷曲的CAR-Lck微簇，对LFA-1的依赖性较小，并且缺乏粘附环。同样，CAR NK细胞的免疫突触涉及溶解颗粒释放和多个CAR-抗原聚集，但在突触裂隙处的肌动蛋白组织较少。PDZ CAR NK细胞-肿瘤细胞溶解突触与CAR NK细胞相比具有更好的突触组织，其特征是Scribble的积累以及浓缩的突触区域和激活的ZAP70与溶解颗粒的增强聚集。使用BioRender.com创建。 NK细胞的功能取决于aNKRs和iNKRs之间的信号平衡。抑制性受体，如人类杀手免疫球蛋白样受体（KIR）和小鼠Ly49，在维持自身MHC I类耐受对内源性健康细胞的同时，在促进NK细胞激活对抗低MHC I类表达细胞的过程中也起着关键作用，这一过程被称为“教育”。在NK细胞激活过程中，NK溶解免疫突触的形成始于含有SH2结构域的磷酸酪氨酸磷酸酶-1（SHP-1）形成小的中心簇，周围环绕着LFA-1，随后是细胞毒性颗粒在中心SMAC中的聚集，而LFA-1重新定位到外围，这一步骤使得NK细胞激活突触对低MHC I类表达目标的教育成为可能。有趣的是，在未受教育的自耐受小鼠Ly49A+ NK细胞（来自MHC I类敲除小鼠）与经过MHC I类分子H2Dd教育的自耐受Ly49A+ NK细胞（来自H2Dd转基因小鼠）中，SHP-1在NK细胞激活突触中的聚集模式不同，包括SHP-1在激活免疫突触中的积累程度以及SHP-1与F-肌动蛋白和SLP-76信号适配器的共定位。研究表明，激活突触中SHP-1的积累导致下游信号蛋白的去磷酸化，以维持“自我耐受”。一旦激活突触通过iNKRs接受“教育”，SHP-1就被排除在激活突触之外，从而解除抑制，激活下游信号，并提高NK细胞的响应性。 一般而言，免疫突触形成的多步骤过程对于许多免疫细胞相互作用都是成立的，包括辅助T细胞-抗原呈递细胞（APC）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）-肿瘤细胞，以及NK细胞-肿瘤细胞或NK细胞-健康细胞。对于溶解突触，它始于抗原识别和受体信号，并随后是效应器激活、微管组织中心（MTOC）极化和脱颗粒，并以从溶解目标细胞的解离结束，使免疫稳态和串行杀伤级联成为可能。然而，研究表明NK和CTL溶解突触之间存在一些动力学和机械转导差异。与T细胞不同，T细胞是在激活后诱导溶解颗粒，NK细胞在静息阶段就含有溶解颗粒，因此在激活和突触形成期间遵循精确的空间时间机制的溶解颗粒分泌，这一过程称为“定向分泌”。NK细胞也可以通过聚集iNKRs，例如与健康细胞上的自身决定因素结合的KIR，形成抑制性突触，形成超分子抑制簇，阻止SMAC形成并保护健康细胞不受溶解。NK细胞膜突出物有助于抑制性突触形成和细胞间蛋白转移。在一项研究中，从肝癌患者体内分离的肿瘤内NK细胞与肿瘤周围NK细胞或健康供者的外周NK细胞相比，膜突出物较少。肿瘤诱导的丝氨酸代谢改变降低了肿瘤内NK细胞膜中的鞘磷脂水平，导致膜突出物调节异常，损害了溶解突触形成和细胞毒性。阻断鞘磷脂代谢增加了解离自膜突出物的突触数量，并在体外以及在肝癌人源化小鼠模型中恢复了肿瘤内NK细胞的溶解活性。 由于CAR溶解突触需要比典型免疫突触更高的抗原识别阈值才能启动杀伤，并且更容易受到磷酸酶诱导的失活，科学家们假设通过靶向细胞极化并引发CAR免疫突触的更有序组装，可能会实现更好的CAR实体瘤细胞毒性。通过将细胞毒性和调节性T细胞分子（CRTAM）的突触后密度-95、discs large和紧密连接蛋白-1结合基序（PDZbms）插入到称为CAR PDZ NK的CD28z CAR的C末端，生成了突触调节的CAR NK细胞。与传统CAR NK细胞相比，这些发现表明体外增强了亲和力、抗原敏感性、细胞毒性、突触强度和CAR PDZ NK细胞极化，以及在实体瘤小鼠模型中延长了CAR PDZ NK细胞的存活和持久性。同样，当在T细胞中测试时，CAR PDZ构建物与传统CAR T细胞相比，在体外和异种移植小鼠模型中都有增强的效应功能。 CAR T细胞与CAR NK细胞工程 CAR设计的相似之处、差异和进展 与传统的T细胞受体（TCR）相比，CAR是一种合成受体，它赋予CAR T细胞以非MHC限制性机制的靶向特异性细胞毒性。第一代CAR由一个细胞外的单链可变片段（scFv）构成，通过一个铰链域和跨膜域连接到C末端的CD3ζ激活域，该激活域将非TCR外部-内部激活信号传递到T细胞。然而，第一代CAR T细胞的临床效果有限，可能是由于有限的植入和细胞毒性。为了提高CAR T细胞的细胞毒性、产生细胞因子和对目标刺激的增殖能力，后来对CAR分子进行了修改，包括插入一个（第二代）或两个（第三代）细胞内共刺激（ICS）域在CD3ζ上游（见图2a）。值得注意的是，CAR模块化域或链接结构的任何遗传改变都可能影响CAR T细胞的亲和力、效力和持久性。目前美国食品药品监督管理局（FDA）批准的六种靶向CD19或BCMA的CAR T细胞疗法已经在许多血液恶性肿瘤患者中实现了持久缓解。然而，为了创造下一代CAR T细胞以治疗实体瘤并增强CAR T细胞的细胞毒性、持久性、渗透性和安全性，已经实施了额外的工程策略。 CAR NK细胞采用了用于CAR T细胞工程的CAR骨架，但在跨膜和ICS域方面有更多的变化[7]（见图2a）。将scFv替换为aNKR的细胞外域，如NKG2D CAR T细胞和CAR NK细胞，可以增加对传统NK细胞靶标的效力。纳米抗体是单域骆驼抗体片段，由于更高的稳定性、改善的TME渗透性和更容易的遗传工程，比传统的单克隆抗体表现更好。对于CAR T细胞和CAR NK细胞，将CAR scFv域替换为纳米抗体在临床前对血液和实体瘤都显示出有效性。CAR NK细胞的一个主要特点是缺乏MHC依赖性细胞毒性，这使得来自健康捐赠者的异体NK细胞可以耐受MHC I类分子在供体和受体之间的差异。然而，从健康捐赠者异体CAR T细胞中遗传删除TCR以及MHC类-I相关和MHC类-II相关基因，以及在诱导的多能干细胞（iPS）细胞衍生的CAR T细胞中过表达HLA-E，允许生成通用CAR T细胞，这些细胞可以承受受体宿主免疫系统而不会诱发GvHD。尽管供体细胞中MHC类I的遗传删除提供了来自受体异体T细胞的保护，但它创造了一个“缺失自我”信号，使供体细胞暴露于受体NK细胞攻击。因此，规避受体NK细胞细胞毒性的策略包括额外过表达HLA-E、HLA-G或CD47，以生成低免疫原性CAR T或CAR NK细胞。 图2 | CAR设计和工程策略以克服实体瘤逃避CAR T和CAR NK细胞。a，典型TCR信号涉及Lck、CD3ζ和ZAP70的顺序激活，以及SLP76和LAT的磷酸化，它们与GADS和PLCγ形成信号复合体，导致T细胞激活。第一代CAR通过一个重组细胞外（Exc）域通过一个铰链和TM域连接到细胞内CD3ζ作为主要激活信号，以促进CAR细胞激活。在第二代和第三代CAR中，信号由一个或两个ICS域支持。LINK CAR T细胞使两个scFv CARs的门控激活成为可能，其信号取决于SLP-76与LAT作为ICS域的复合，仅当肿瘤细胞上呈现两种认知抗原并且与scFv CARs结合时。b，通过工程DN-TGFβ-RII单独或与IL-15受体激动剂（HCW9218）复合；DN-PD-1作为ICB；或者通过遗传删除T细胞或NK细胞中的负调节因子来阻断CAR细胞功能障碍。增强CAR T细胞细胞毒性的方法包括工程化TRUCK CARs，这些CARs使CAR诱导的细胞因子分泌，插入细胞因子受体作为额外的ICS，工程化组成型活性IL-7受体（C7R），或者通过过度表达orthoIL-2/orthoIL-2Rβ。增强CAR NK细胞细胞毒性的方法包括增加细胞因子载荷或使用K562/4-1BBL/膜结合IL-21（mbIL-21）或K562/膜结合IL-15（mb15）/4-1BBL饲养细胞，或补充IL-2、IL-15和/或IL-21的培养基，体外扩增CAR NK细胞。通过与IL-12、IL-15和IL-18的刺激，可以产生具有改善持久性和代谢适应性的类似记忆的CAR NK细胞。多靶向CAR设计的例子以克服抗原异质性和丧失包括IL-13/抗EphA2 Tan-CAR T细胞或一种多靶向CAR NK细胞，该细胞共表达肿瘤可切割的抗CD73 scFv连接到抗GD2 CAR以及NKG2D CAR。抗CD73 scFv与CD73的结合阻止了从腺苷酸（AMP）产生免疫抑制腺苷。通过过度表达趋化因子受体或肝素酶，可以增强CAR T细胞的渗透和持久性，肝素酶降解蛋白聚糖和其他细胞外基质（ECM）蛋白，与CAR一起。αFAP-scFv CAR T细胞靶向癌症相关成纤维细胞上的FAP，以减轻FAP诱导的ECM重塑。将scFv替换为FAP在CAR NK细胞上改善了ECM降解，并增加了NK细胞的渗出和渗透。癌症相关成纤维细胞（CAF）、成纤维细胞激活蛋白（FAP）、髓源性抑制细胞（MDSC）。使用BioRender.com创建。 成功实施CAR T和CAR NK细胞疗法的另一个主要挑战是，由于正常组织共享抗原识别，存在严重的肿瘤外毒性风险。为了缓解这个问题，已经开发了几种逻辑门控和开关受体CAR T细胞[1]。最新的是一种可逆的布尔逻辑AND门控细胞内网络(LINK) CAR，其中CD3ζ被替换为细胞内近端下游信号分子LAT和SLP-76，以产生CD19-28TM-LAT和HER2-8TM-SLP-76 CAR T细胞(图2a)。CD19+ HER2+ 目标细胞诱导的LINK CARs刺激在体外和体内效应功能改善以及限制肿瘤外靶向毒性方面，优于以前开发的逻辑门控平台。同样地，对于CAR NK细胞，SENTI-202是一种新型的“或门和非门逻辑门控”CAR NK细胞候选物，它被设计成通过一个或门激活CAR靶向急性髓系白血病(AML)相关靶标FLT3或CD33，同时通过一个非门EMCN靶向抑制性CAR，避免健康造血干细胞受到肿瘤外毒性的影响。这最终将增强AML白血病干细胞/母细胞肿瘤清除，同时减少对骨髓移植的需求。 针对血液肿瘤的CAR T和CAR NK细胞的临床试验已在其他地方讨论。这里我们关注以实体瘤为靶标的CAR T或CAR NK细胞的临床试验，从Clinicaltrials.gov截至2023年7月1日提取，胶质母细胞瘤、乳腺癌和卵巢癌是目标肿瘤列表中的首选。对于CAR T细胞，针对实体瘤的试验总数为340（23项已完成，23项正在进行/不招募，165项积极招募或邀请注册，67项状态未知，33项暂停/终止/撤回，29项尚未招募）。与此同时，已报告19项针对实体瘤的CAR NK细胞试验（9项积极招募，6项状态未知，4项尚未招募）。表1列出了所有CAR NK细胞试验和已完成的针对实体瘤的CAR T细胞试验。虽然来自CAR T细胞疗法的临床数据未能再现血液肿瘤的持久反应率，但CAR NK细胞的数据仍在等待中。对于CAR T和CAR NK细胞来说，肿瘤内归巢和在实体瘤环境中的持久性是尚待克服的主要障碍。缺乏关于CAR NK细胞在实体瘤中的归巢的临床数据；然而，从第一个CAR NK细胞试验中推断出的投入，该试验利用了携带人类IL-15的CD19 CAR NK细胞，证明了输注的CAR NK细胞在患者外周血中至少持续1年，尽管水平较低。在NK细胞中过表达DNAM-1和/或NKG2D是增强NK细胞肿瘤内渗透的提议策略之一，并已在体外对患者衍生的肉瘤标本显示出有效性。 增强CAR T和CAR NK细胞特别是对实体瘤的抗肿瘤细胞毒性是一个不断增长的研究领域。研究人员使用的策略包括工程化共刺激域，增强CAR修饰细胞的激活细胞内信号。尽管TCR是介导T细胞细胞毒性的唯一主要受体，但许多跨膜共刺激分子，如CD28、4-1BB、ICOS和OX-40，可以放大TCR下游的信号能力，以获得优越的细胞毒性效果。这些分子中的每一个都有利于不同的信号通路，一旦包含在CAR构建物的ICS域中，就会影响CAR T细胞的细胞毒性、增殖和持久性。与此同时，NK细胞有各种激活和抑制受体，它们招募不同的下游信号介导者，其信号线索的微调控制了NK细胞的激活与抑制作用。研究表明，使用NK特异性信号域，如2B4和DAP10或DAP12，作为ICS域，定制NK细胞的CAR工程，可以增加CAR NK细胞抗肿瘤功效和IFNγ分泌，与T细胞定制的CAR构建物相比（图2a）。 克服实体瘤逃逸是CAR基础细胞工程中另一个积极扩展的领域。克服CAR T和CAR NK细胞功能障碍的方法包括过表达TGFβ（DN-TGFβ-RII）或PD-1（DN-PD-1）的优势负性受体(DNRs)，或遗传删除包括PD-1和二酰甘油激酶在内的负面CAR细胞调节器。正交和/或膜结合细胞因子/细胞因子受体工程策略也已被用于增强CAR T或CAR NK细胞的抗肿瘤功能。通过CAR T或CAR NK细胞对TAAs进行多靶向和串联靶向可以提高对实体瘤及其相关抗原异质性或丢失的功效，与单一CAR相比。改善CAR T或CAR NK细胞通过基质屏障的运输和渗透的策略包括过表达趋化因子受体，生成FAP-scFv CAR T或过表达FAP的CAR NK细胞，或过表达肝素酶。图2b总结了已经研究的突出工程方法。 增强抗肿瘤效果的联合免疫疗法 癌症免疫疗法是一系列旨在动员并增强免疫细胞效应功能以消灭肿瘤的治疗方式。图3a描述了CAR T和CAR NK组合免疫疗法的主要模型。 重组单克隆抗体或作为替代品的纳米抗体可以用多种方式增强CAR T和CAR NK细胞的功能[57]。激活性单克隆抗体作为特定激活受体或共刺激分子（如CD28、4-1BB和SLAMF7）的激动剂，对T细胞或NK细胞的扩增和持久性很重要。肿瘤特异性单克隆抗体单独使用或与高亲和力CD16的过表达结合，通过抗体结合的肿瘤细胞的Fc部分的包被作用，将CAR表达细胞重定向至肿瘤细胞和/或增强ADCC功能。阻断性单克隆抗体（如ICB中使用的）通过阻断免疫检查点受体或配体（如TIM3、CTLA4和PD(L)-1）靶向免疫抑制性的TME。尽管FDA批准的ICB作为单一疗法为一些实体瘤患者提供了持久缓解，但在许多其他患者中失败是因为肿瘤特异性的一级和二级抵抗机制。NK抑制性受体阻断单克隆抗体通过模仿通常在抑制配体下调或丢失时发生的“缺失自我”信号，促进NK功能。其他阻断性单克隆抗体靶向炎症性细胞因子受体。例如，tocilizumab是一种FDA批准的阻断性单克隆抗体，靶向IL-6受体（IL-6R），用于管理CAR T细胞诱导的CRS。免疫结合剂，如BiTE和TriTE（对T细胞）以及BiKE、TriKE和TetraKE（对NK细胞），是双特异性或多特异性T细胞或NK细胞结合剂，结合了scFv、纳米抗体和/或其他分子如细胞因子，以促进CAR表达细胞有针对性地消灭肿瘤。 Lenalidomide是E3泛素连接酶途径的免疫调节剂，具有多种免疫效应。除了诱导肿瘤细胞周期停滞外，lenalidomide可以通过阻断血管生成和抑制Treg细胞来调节TME，以及介导恢复与淋巴瘤相关的免疫突触缺陷。与T细胞结合使用时，lenalidomide是一种共刺激剂，增强了抗CD133或抗HER2 CAR T细胞对实体瘤的细胞毒性和细胞因子分泌。在I期临床试验中，lenalidomide促进了NK细胞的扩增，与抗抑制性KIR疗法结合使用，增强了对多发性骨髓瘤的类固醇节约细胞毒性。 溶瘤病毒是一组经过工程改造的病毒，可以增强肿瘤免疫原性和树突状细胞诱导的NK细胞活性，以及实现转基因的肿瘤靶向传递。溶瘤病毒表达截断CD19（OV19t）和抗CD19 CAR T细胞的联合瘤内治疗导致实体肿瘤消退。同样，溶瘤病毒表达人类IL-15/IL-15受体α sushi结构域融合蛋白（IL-15–suIL-15Rα）复合物（OV-IL15C）和抗EGFR CAR NK细胞的组合，在胶质母细胞瘤小鼠模型中引发了协同抗肿瘤细胞毒性和CAR NK细胞的持久性，并改善了生存率。 对于所有这些组合疗法，正在进行血液和实体瘤的临床前和临床评估。虽然ICB与CAR T细胞结合使用的临床评估看起来很有前景，但它在CAR NK细胞毒性中的作用还有待商榷。基于纳米抗体的疗法可能很快会在针对实体瘤的免疫疗法时代占据主导地位，因为它们能够穿透密集的基质；然而，纳米抗体从循环中的快速清除需要额外的工程化。增强两种CAR基础疗法的细胞毒性和持久性的细胞因子装甲已被证明是有效的，还有更多灵活的机会有待探索。最终，由不同癌症免疫疗法介导的多模式机制在增强CAR基础疗法时，考虑到可能的肿瘤外毒性，对未来选择与CAR T和CAR NK细胞一起的最佳组合免疫疗法至关重要。 这些数据来源：https://clinicaltrials.gov。DLL3，类DLL3配体3；CLDN6，紧密连接蛋白6；ROBO1，漫游导向受体1；MUC，粘液蛋白；Meso，间皮素；CIR，嵌合免疫受体；GPC3，糖蛋白聚糖3；CEA，癌胚抗原；CD133，蛋白I；CLDN18.2，紧密连接蛋白18.2；GD2，二唾液酸神经节苷脂；HCC，肝细胞癌；PSMA，前列腺特异性膜抗原；TNBC，三阴性乳腺癌；Cytoxan，环磷酰胺；Fludarabine，抗代谢物；Pembrolizumab，针对PD-1的单克隆抗体；Ezabenlimab，针对PD-1的人源化单克隆抗体；Aldesleukin，重组人类IL-2；AP1903，一种通过交联FKBP结构域发挥作用的化学二聚体剂。NA，不适用。 影响实体瘤中细胞毒性和持久性的挑战 用于体外扩增的T细胞来源包括外周血和iPS细胞衍生群体，很少有文献报告使用脐带血扩增的T细胞，因为这些细胞在扩增后往往富含Treg细胞。尽管CAR T细胞治疗在对抗血液恶性肿瘤方面取得了显著成功，但在对抗实体瘤方面却表现不佳[1]。除了长期体外扩增后诱导的CAR T细胞产品耗竭，影响记忆表型、寿命和增殖能力外，阻止CAR T细胞成功治疗实体瘤的第一障碍是由癌症相关成纤维细胞形成的密集基质，这抑制了CAR T细胞渗透到肿瘤部位。绕过这一障碍的肿瘤内CAR T细胞在持续刺激目标抗原和/或免疫抑制性肿瘤和相关TME后可能会变得耗竭。肿瘤逃逸可能发生，因为肿瘤试图通过突变逃避有效的肿瘤内CAR T细胞毒性，导致抗原丢失或抗原异质性。肿瘤内CAR T细胞也可能因内在和外在因素的复合作用而被驱逐到淋巴结，导致增殖能力降低和持久性丧失。 与可以存活数月的T细胞不同，NK细胞的寿命很短，年轻成人的半衰期不到10天，这一限制因素强调了需要反复输注NK细胞产品以维持体内的有效性和持久性。此外，扩增的NK细胞对冷冻和解冻的敏感性影响了输注后的细胞毒性和存活率。在三维肿瘤模型中，解冻后迁移NK细胞的比例下降了六倍，对细胞毒性效果有严重影响，这可能部分解释了冷冻保存的CAR NK细胞在体内的持久性受损。目前正在研究优化冷冻保存方案，包括使用替代二甲基亚砜的替代品，二甲基亚砜是传统上用于冷冻细胞的保护剂，以保持CAR T和CAR NK细胞在解冻后的完整性、活性、功能和效力，并促进未来的现成生产和冷冻保存。 体外扩增NK细胞需要用细胞因子进行启动，以防止NK细胞耗竭和衰老。NK细胞可以从多种来源扩增用于临床测试，如外周血、脐带血、iPS细胞和不朽的NK细胞系，如NK-92细胞；每种来源都有特定的限制和优势。CAR NK细胞的产生反映了未经编辑的NK细胞的体外扩增方案，尽管后者需要额外的病毒或非病毒工程以表达CAR构建物。这些扩增方案依赖于持续的细胞因子刺激，有或没有饲养细胞的共激活。尽管扩增的CAR NK细胞在体外对目标细胞提供了显著的细胞毒性，但研究表明，它们对细胞因子和激活信号的依赖可能是输注到患者后功能失常和寿命缩短的原因，特别是当这些信号线索在TME内变得稀疏时。 NK细胞暴露于许多肿瘤诱导和TME介导的细胞因子和代谢物中，这可以减少NK细胞的持久性和功能。对患者的血液和实体瘤样本分析表明，肿瘤介导和TME介导的NK细胞功能障碍，以及细胞毒性、持久性和寿命受损，可以总结为五种主要机制：耗竭、抑制、无反应、可塑性和增殖缺陷。导致NK细胞耗竭的肿瘤相关因素包括肿瘤细胞持续激活NK细胞导致效应功能降低。肿瘤相关和TME相关释放的TG-β和其他抑制性代谢物诱导aNKR下调；溶解颗粒释放减少；细胞因子产生缺陷；以及iNKR过度表达。无反应可能是由于过度抑制性信号或在缺乏iNKR许可的情况下持续刺激aNKR所致。由于NK细胞属于第1组先天淋巴细胞（ILC1），肿瘤相关因素诱导的ILC1和ILC3亚类之间的可塑性可能允许将传统的细胞毒性NK细胞转换为细胞毒性较低的或ILC1样表型，具有促肿瘤潜力。NK细胞功能障碍还伴随着增殖能力受损和NK细胞浸润数量减少。 图3 | CAR T和CAR NK组合免疫疗法及CAR细胞工程方法。a，抗CD3和抗CD3/抗CD28激活单克隆抗体偶联珠增强CAR T细胞扩增。CAR NK细胞激活单克隆抗体(mAbs)和纳米抗体(Nbs)的靶标包括共刺激分子和aNKR，单独或与高亲和力CD16(ha-CD16)的过表达结合。阻断单克隆抗体和纳米抗体针对免疫检查点受体或配体(ICB)、iNKR或IL-6受体(IL-6R)。FDA批准的阻断单克隆抗体的例子包括托珠单抗、阿特珠单抗、尼伏单抗和伊匹单抗。来普尼增强了CAR T细胞的细胞毒性和增殖，并且通过在多发性骨髓瘤(MM)细胞上增加aNKR配体的表达，与KIR阻断单克隆抗体(IPH2101)联合使用时增强了CAR NK细胞的细胞毒性。OV19t溶瘤病毒通过实体瘤细胞诱导截短型CD19(CD19t)的表达，使其易于受到抗CD19 CAR T细胞的细胞毒性，而OV-15C诱导肿瘤细胞表达和分泌人类IL-15/IL-15受体α寿司结构域融合蛋白(IL-15–suIL-15Rα)，这提高了抗EGFR CAR NK细胞的抗肿瘤效果。免疫结合剂的例子包括BiHC(抗HER2-Nb/抗CD3-scFv BiTE)或布利纳图单抗(抗CD19-scFv/抗CD3-scFv BiTE)用于CAR T细胞，以及抗EGFR-Nb/抗CD16-Nb BiKE或抗CD16-Nb/重组IL-15/抗CLEC12A-Nb TriKE，后者结合了ADCC和TAA特异性杀伤CAR NK细胞。b，病毒CAR转导导致CAR在T细胞或NK细胞内的整合。c，非病毒CAR工程策略的例子包括通过电穿孔或脂质纳米颗粒传递的mRNA，DNA纳米载体平台和转座子以及CRISPR-Cas9和碱基编辑作为基因编辑工具。正在开发中的先进策略包括使用生物材料进行体内CAR传递和扩增，以及通过顺序磁声激活将抗CD3/抗CD28珠与CAR T细胞结合创建的CAR T细胞基活体微型机器人(M-CAR T细胞)的靶向传递和扩增。使用BioRender.com创建。 当前CAR T和CAR NK细胞高效开发的工程策略包括通过额外的遗传操作或组合疗法来增强这些细胞，以解决T和NK细胞功能障碍和持久性问题。 增强CAR-T和CAR NK细胞的传递技术  传统的CAR T细胞生成涉及病毒载体传递CAR构建体，以实现高转导效率和CAR的稳定表达。最广泛使用的载体是慢病毒、逆转录病毒或腺相关病毒载体。与T细胞相比，NK细胞更难进行工程改造，这是由于其固有的抗病毒能力、对凋亡的高敏感性和有限的扩增潜力。由于慢病毒包膜直接影响原代NK细胞的转导效率，因此可以使用泡状口炎病毒G（VSV-G）、长臂猿白血病病毒包膜（GALV）、猫科内源性逆转录病毒包膜蛋白（RD114-TR）或狒狒包膜（BaEV）对慢病毒进行伪型化，后者显示出与逆转录病毒相当的转导效率。然而，增加的免疫原性、可能的插入突变、有限的插入大小、高昂的GMP级病毒生产成本和相关的监管复杂性是主要缺点，这些缺点激发了探索成本效益的非病毒传递途径。非病毒转座子平台Sleeping Beauty和PiggyBac能够更安全地整合CAR构建体，但效率低于病毒系统。通过电穿孔或脂质纳米颗粒传递的非病毒mRNA基CAR构建体产生高但短暂的CAR表达效率。科学家们还开发了一种简单、多功能、经济实惠、非病毒、非整合的DNA纳米载体平台，能够在体外和体内实现T细胞的非染色体CAR表达，且没有免疫原性或遗传毒性。其他的非病毒基因编辑平台包括CRISPR-Cas9，它能够实现CAR和其他有利基因的位点定向整合或免疫细胞负调节因子、TCR或MHC相关基因的删除。在一项研究中，通过结合T细胞相关基因的基础编辑和CAR-慢病毒转导，产生了抗兄弟细胞毒性的双重CAR T细胞。最后，生物材料传递车辆允许定向转移编辑或未编辑的免疫细胞，有病毒或非病毒编辑的选项，在体内，而无需事先的体外扩增，而基于CAR T细胞的活体微型机器人能够通过磁声激活实现CAR T细胞的靶向传递和激活。 结论  过去十年在CAR基础免疫疗法的工程方面取得了革命性的成功，已有六种FDA批准的CAR T细胞疗法使一些儿童和成人患者的血液恶性肿瘤实现了长达十年的缓解。然而，血液恶性肿瘤患者在接受CAR T细胞输注后的复发率是可变的，而且尚未实现对实体瘤有显著数量的完全缓解。CAR T和CAR NK细胞的耗竭、低反应性和被宿主免疫系统排斥被认为是许多患者肿瘤抵抗和复发的主要因素。因此，要实现CAR基础免疫细胞功能的最优化，需要解决这些细胞疗法面临的多重挑战，同时优化临床给药环境，并利用组合免疫治疗模式。 尽管一些CAR NK和CAR T细胞基础的临床前研究展示了对实体瘤的有效细胞毒性，但CAR NK细胞的临床数据很少，而CAR T细胞在临床上尚未成功。未来的治疗方案应该操纵工程策略和组合疗法，以解决阻碍CAR T和CAR NK细胞对实体瘤效果的挑战。这些挑战包括克服肿瘤诱导的抗原异质性或丧失；促进长期肿瘤内抗原遭遇，以实现有效的肿瘤细胞毒性；在肿瘤内维持更好的CAR表达细胞的持久性和保留；耐受缺氧和免疫抑制的TME；以及维持类似记忆的CAR细胞库，以实现更持久、更具肿瘤特异性的细胞毒性。与溶解性突触形成和稳定性相关的额外挑战，如免疫细胞-目标识别、结合动力学和效力，应该得到解决。应该继续研究消除受体中超活性或有毒CAR细胞的方法，包括逻辑门控和开关式CAR设计以及其他新方法，直到实现最佳平台。最终，成功开发针对实体瘤的高效CAR疗法可能需要一个全面的组合方法，而不是单独针对个别障碍。 未来需要从MHC不匹配的健康捐赠者那里生产“现成的”通用CAR T细胞产品，以促进在疾病关键阶段向患者、弱势社区或缺乏CAR T细胞开发设施的医疗机构提供已经FDA批准的产品。基于MHC非限制性细胞毒性、降低的肿瘤外靶向毒性和“现成的”生产便利性，我们预计未来十年将带来更多的研究结果，帮助优化NK细胞扩增工作流程；减轻NK细胞耗竭，改善解冻后恢复，并增强移植后的细胞毒性和持久性。然而，由于同种异体CAR NK细胞可能促进免疫原性并在后期被宿主免疫细胞排斥，因此需要进行额外的遗传操作，类似于应用于通用CAR T细胞的操作。也应该采用创造最佳无饲养层扩增的新型策略，以实现CAR NK细胞的大规模生产，并绕开监管和一致性问题。 关于CAR T或CAR NK细胞抗肿瘤效果的大多数临床可用数据都是从分析晚期癌症的重度预处理患者中推断出来的，同时缺乏作为早期肿瘤进展阶段的一线疗法的有效性证据。因此，进一步研究CAR基础疗法的最佳时间、剂量、途径和频率，将更好地指导临床决策，并扩大治疗适用患者的范围。CAR基础细胞疗法的另一个主要缺点是治疗成本的显著提高，包括对伴随副作用的症状管理。未来有助于降低成本的步骤包括优化“现成的”生产和冻存“通用”工程CAR产品，减轻肿瘤外靶向毒性，缩短体外扩增工作流程，优化非病毒CAR递送以及微调体内动力学和个别CAR设计的效力。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。