如何使用PNI（Precision Nano Systems）制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)

2024-04-04

信使RNA疫苗免疫疗法

导读：众所周知，Pfizer/BioNTech和Moderna开发的新冠疫苗新冠疫苗在疫情中大放异彩，因此mRNA在包括病毒疫苗、蛋白替代疗法、癌症免疫疗法和基因组编辑等一系列治疗应用中显示出潜力，其易生产、制备成本低，可通过简单的复制模板快速获得，但自身仍难以成药。原因如下：mRNA本身是一种呈负电（携带磷酸基团）的长链大分子，而细胞膜表面同样带负电，因此二者因静电作用相互排斥，mRNA难以进入膜内。同时，mRNA是单链分子，非常脆弱，容易被核酸酶降解或被免疫细胞吞噬，难以递送至细胞内编码蛋白，需要特殊的修饰或包裹递送系统才能实现mRNA药物的胞内表达。因此，递送技术是mRNA治疗成功与否的关键。01LNP组成脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticle，LNP) 是目前主流的载体递送方式，现阶段主要的mRNA疫苗都使用的是此项技术。LNP是一种多组分系统，通常由可电离脂质 (lonizable lipid) 、辅助脂质(Helper lipid) 、胆固醇 (cholesterol) 和聚乙二醇修饰脂质 (PEG-lipid) 组成，它们分工合作，将mRNA包裹在核中以避免降解，帮助其实现有效包裹和细胞递送。其中，可电离脂质是LNP的支架，也是mRNA递送和转染效率的决定性因素。其在低pH环境下带正电荷与mRNA络合，而生理pH下保持中性，降低潜在的毒性作用；辅助脂质一般为饱和磷脂，提高可电离脂质的相变温度，有助于脂双层结构排列的形成与稳定；胆固醇有较强的膜融合性，促进细胞对mRNA的胞内摄入；PEG化磷脂位于LNP结构的表面，改善其亲水性，避免被免疫系统快速清除，同事防止颗粒聚集，稳定性提高。四种组分的相对含量对脂质纳米粒的功效有着影响，因此需要针对特定的用药途径和应用进行优化。图1：脂质纳米颗粒（LNP）的结构示意图，Cationic lipid (阳离子脂质），Helper lipid (辅助磷脂）， Cholesterol (胆固醇），PEG-lipid （PEG修饰脂质）02LNP制备原理常见LNP制备方法包括乙醇注射法、脂质体挤出法、薄膜水化法、纳米沉淀法、冲击射流式混合法以及微流控混合法等，其中，微流控混合法由于其高包封率，LNP粒径、单分散度(PDI)等核心指标高度可控以及良好的重复性，同时相对简便快速，条件温和，同时容易实现生产放大，已经成为目前临床前研究的首选方法。基本原理：将脂质与核酸分别溶解在水相和有机相后，将两相溶液注入制备系统的两条入口通道，一端是RNA的酸性水溶液，另一端是溶解脂质的乙醇溶液，将两相快速混合，完成粒径均一的核酸脂质纳米颗粒的合成。控制注入的流体速率和比例，可以控制LNP的粒径大小，使其性能稳定。通过稀释乙醇相，脂质的溶解度降低，在混合溶液中逐渐析出凝固并形成脂质纳米颗粒，同时高效包载mRNA。再经缓冲液膜包超滤或者透析除去残留的乙醇，中和缓冲液的pH值。耀海生物采用的Ignite™作为mRNA脂质纳米颗粒制备系统，它是PNI（Precision NanoSystems）的Nanoassemblr®平台推出的微流控混合仪，适用于LNP、脂质体等纳米结构的制备，可以实现纳米颗粒组分在纳升水平以毫秒混合，保证混合效果。通过结合优化、精确的泵送和独特的微流体混合特性，能够快速和控制纳米药物。图2.Lgnite微流控装置实物图制备流程：原料分为水相和有机相。水相里面包含缓冲液和核酸，如柠檬酸钠缓冲液和 mRNA，有机相即为前面提到的各种不同比例脂质的混合物：阳离子脂质、中性脂质、胆固醇和 PEG 脂质。阳离子脂质被认为是最重要的组成成分，并以此来区分不同的mRNA-LNPs疫苗，PEG占总成分的组成比一般小于2.5%。流速比设定为3:1，N/P比通常为6（mRNA含大量磷酸根，阳离子脂质含可电离铵根，二者具有静电作用力，因此需要设定合理的比值防止粒径过大）。微流控混合制备LNP：分别将分别将水相溶液和有机相溶液吸入3 ml注射器中，并排出注射器中的空气。将注射器出口和样品导入管连接，并固定在注射泵上，甚至注射泵的流速和混合体积。在软件中设置排废体积，开始运行后，观察流出管流速待其稳定，用收集管收集样品。总体说来，目前先进的采用微流控混合技术制备核酸脂质纳米颗粒，该方法相对简便快速，条件温和，同时容易实现生产放大，NanoAssemblr IgniteTM可以较好的实现mRNA-LNP的良好制备，其结果一致性良好，粒径结果合适，且具有极低的PDI值，证实其分散性较好，并且包封效果极好。如上所述，脂质纳米颗粒LNP作为非常有前景的核酸药物载体，在制药行业已备受关注。尤其是现在，LNP是mRNA疫苗的关键技术，在有效保护mRNA并将其运输到细胞当中发挥着举足轻重的作用，而微流控技术则为它们的结合“保驾护航”，具有广阔前景。参考文献[1]李文娇,阎俊,杜娟,黄天娇,卢瑛.不同磁珠对过敏原蛋白纯化效果的比较研究[J].山东农业大学学报(自然科学版),2017,48(06):853-857.[2]任敬钢,程超,仲从浩,张丽,李荣秀.蛋白A-葡聚糖-Fe_3O_4纳米磁珠的制备及对IgG分离纯化[J].生物技术通报,2014(07):201-208.DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.07.035.[3]熊齐荣,牛瑞江,解泉源,熊勇华,赖卫华.磁珠离子交换吸附法纯化兔血清中多克隆抗体的研究[J].食品科学,2011,32(13):259-263.[4]陈毅.一种磁珠纯化分选系统的结构与原理[J].医疗装备,2014,27(05):1-5.[5] https://mp.weixin.qq.com/s/_EyC_zTM_iUDLtCvctGnuQ[6] https://mp.weixin.qq.com/s/aZQhTlR1wuTq4EoVGTbfFQ[7] https://mp.weixin.qq.com/s/P4xBkF-Yk1qUGiHOC1Jy_Q识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。