Nat Rev Cancer. 多重蛋白质成像：了解肿瘤细胞丰富多彩的世界

2024-03-27

免疫疗法

在过去的十年中，随着光学和蛋白质分析方法的提高，组织成像变得更加丰富多彩，这使得对组织样本中的蛋白标记物进行多重成像成为可能。多重成像技术使单细胞甚至是亚细胞同时分辨40-50 个标记物成为可能。本文总结了多重蛋白质成像方法在肿瘤生物学研究中的应用，并将这些方法与其他空间组学相结合对阐述肿瘤生物学的意义。01 为什么需要多重蛋白质成像肿瘤的持续生长、扩散和治疗反应不仅取决于恶性细胞的特性，还取决于它们与其他细胞的相互作用。免疫细胞、基质细胞、血液和淋巴内皮细胞及脂肪细胞都可能具有环境相关的、促进肿瘤生长功能或抑制肿瘤生长功能。肿瘤的许多特征很可能直接或间接受到肿瘤细胞与其微环境相互作用的影响。如果要充分了解肿瘤如何发展、扩散和死亡，以及如何更好的治疗，我们必须了解肿瘤细胞与其他细胞的多向相互作用。肿瘤细胞具有异质性和非静态性，即使在同一个患者或瘤种内也是如此。肿瘤细胞的异质性和可塑性可使肿瘤逃避免疫系统，扩散到其他组织或器官，并对治疗产生耐药性。在疾病进展的每一步，肿瘤细胞可视为具有“自主学习的系统”，通过直接接触或与可溶性因子的结合，与微环境中的其他细胞类型进行连续、相互的通讯来处理信息。这种信息交换，以及营养物质、代谢物的梯度，形成肿瘤细胞特有的群落和环境，促使肿瘤细胞发生免疫逃逸或肿瘤细胞迁移。因此，必须了解肿瘤细胞存在哪些异质表型，以及肿瘤细胞如何与其他细胞进行物质、能量交换以及能量串联，以便更深入了解疾病的病因、进展以及治疗对策。02 可测量的肿瘤特征多重蛋白质成像技术能够靶向多种标记物，分析亚细胞位置、细胞表型、细胞内的活性信号传导或其他过程（状态）、细胞与细胞之间的相互作用或与细胞外基质（ECM）或更大规模的空间组织结构。因此，可以使用多重蛋白质成像技术研究肿瘤特征（图1a）。图1 使用多重蛋白质成像技术研究的肿瘤特征。03 肿瘤中的细胞表型、状态和功能要系统理解肿瘤生态系统，第一步是识别存在的细胞表型。单细胞多重成像（图1b）具有此功能，单细胞多重成像可以区分几十个标记物（通常是10-50个）。如此大的标记组为充分表征细胞表型提供条件，因为人们通常希望同时定义细胞类型（例如 CD3+ T 细胞、CD68+ 巨噬细胞、CD31+ 内皮细胞和肿瘤细胞）、亚型（例如 CD4+或 CD8+ T 细胞或叉头盒蛋白 P3 (FOXP3)+ 调节性 T (Treg) 细胞），以及功能状态。图2来自组织的成像质量细胞计数数据的性质的示例图像。在临床研究中，细胞表型和状态可以根据研究者感兴趣的特性而进行样本之间的比较。例如，原发肿瘤和转移瘤、具有不同基因组图谱的样本或者根据病原体感染或免疫浸润状态（图2）。细胞表型和状态（或其他成像特征）也可以与肿瘤分级、临床亚型、治疗反应和患者预后等临床特征相关。例如，患者生存率与肺腺癌中的 B 细胞频率、胶质母细胞瘤中的内皮细胞频率呈正相关，在非小细胞肺癌中与溶酶体相关膜糖蛋白 (LAMP)+ 树突状细胞和 CD66B+ 中性粒细胞的组合呈正相关。在对充分表征的临床队列研究中，通过多重蛋白质图像分析（例如细胞表型、相互作用或空间模式）量化的肿瘤微环境（TME）特征可以与性别或年龄等人口特征建立关联，并与临床诸如肿瘤细胞亚型、治疗反应或总体生存率等特征进行关联分析。具体描述见图2。图3多重蛋白成像在临床样本检测中的应用04 肿瘤细胞的空间成像目前大多数研究肿瘤及其周围免疫细胞的技术，往往都无法保留细胞的原位空间分布信息。这些位置信息，包含肿瘤和免疫细胞相互作用的重要关系。而基于原位的成像检测手段，通常只能检测1-2个蛋白表达,很难完全系统地研究肿瘤组织中的多种蛋白。为了突破这一技术障碍，斯坦福大学Garry Nolan lab在2014年开发了多路复用离子束成像技术。简单来说，就是利用不同的同位素标记不同的抗体，然后通过离子束激发，产生的对应的离子信号，来获得多个蛋白在单细胞水平上的信息。举例：CELL上发表的一篇论文，研究者利用肿瘤细胞空间成像技术，同时检测了三阴乳腺癌的肿瘤和免疫细胞中具有代表性的36个蛋白，系统地描述了肿瘤细胞和不同种类的免疫细胞在空间分布上的特征。研究人员发现，不同的病人的免疫细胞浸润程度大不相同，并且浸润的免疫细胞种类也不尽相同（图3）。多重肿瘤空间成像分析方法（图4）可以根据同时分析的细胞类型的数量进行广泛分类。图4通过多路复用离子束成像技术鉴定的36中肿瘤和免疫细胞相关蛋白图5多重蛋白质成像数据的空间分析方法概述。如图4（a）所示，每个样本的顶部一行是一阶分析，确定单个细胞类型（浅蓝色）的空间分布（左）或感兴趣的空间结构（例如，肿瘤间质边界，右）。二阶分析，确定了两种确定的细胞类型（蓝色和橙色）的空间分布（图4（b）），以及定义两种或两种以上细胞类型的空间模式的高阶分析（图4（c-f））。05 多重蛋白质成像方法多重单细胞蛋白成像或图谱分析方法根据所使用的探针可分为四类（图5）。具体的，可以通过质谱、荧光或显色成像、寡核苷酸的荧光成像或测序进行分析。图6单细胞多重蛋白成像方法的原理1）质谱读数：MIBI和IMC依赖质谱检测与抗体耦合的金属同位素，通过离子束（MIBI）或耦合到电离等离子体源（IMC）的激光实现电离（图5a）。该技术可针对40-50 个标记物的抗体同时染色，也与 RNA 和 DNA 检测兼容。IMC已通过连续切片成像扩展到三维。2）荧光读数：多重荧光方法大致可分为两类。多光谱成像采用一种计算光谱分离的方法来分离重叠的荧光团发射光谱，并已实现了高达20倍的成像。PhenoImager HT和 Orion 都可用于多重免疫荧光检测（图 5b）。3）染色体读出：经典 IHC 是一种成熟的临床病理学技术，以迭代模式用于实现多重蛋白质成像（图5b)。每种抗体均通过基于辣根过氧化物酶 (HRP) 的色原沉积和成像进行检测，然后用有机溶剂脱色。在单玻片上的多重免疫组化连续染色 (MCSSS) 中，有效的染色和脱色需要封闭先前的表位以对抗不完全脱色。多重 IHC 已应用于患者临床样本的检测。4）基于寡核苷酸标记抗体的荧光或测序：通过序贯检测的多重成像也已通过 CODEX 中的寡核苷酸标记抗体实现（图 5c），其原理是DNA由于其组合聚合物的性质，为设计分子标签提供了一个理想的底物。设计一种可索引标记系统，通过逐步枚举过程迭代显示标记。抗体（或其他基于亲和的探针）用独特设计的寡核苷酸双链标记，带有50个悬垂物，可以实现迭代的逐步可视化。06 空间多组学空间多组学方法可以在其天然组织背景下以亚细胞分辨率研究不同的分子分析物，通常空间组学测量还辅以相同或相邻组织切片的组织学染色，如H&E染色，从而与形态学注释相结合。空间多组学的方法示意见图6。空间ATAC&RNA-seq 和空间CUT&Tag-RNA-seq分别描述了在同一组织冷冻切片上同时无偏分析染色质可及性或特定组蛋白修饰和基因表达的可能性；或者，基于显微镜的方法可以通过以高达亚细胞分辨率直接成像单细胞内的DNA位点、染色体和核结构以及转录物，实现基因组或表观基因组信息以及基因表达的空间分析；目前，允许对转录组和蛋白质组进行平行空间询问的方法仍然有限，通常基于两种模式的系列表征，大多只允许对有限数量的蛋白质进行共同表征，并且通常缺乏单细胞分辨率。图7 空间多组学方法07 总结像所有的方法一样，多重蛋白质成像方法也有其固有的局限性，如果这些实验方法产生的结果有意义，就必须考虑到目前多重蛋白成像的限制。在使用多重蛋白质成像方法之前，我们需要考虑对肿瘤标记物的选择、抗体的验证、细胞分割的范围、选择细胞表型的意义、识别与临床相关的空间特征等因素。如果同时需要包含标记细胞外和细胞内的生物标志物，甚至可以绘制整个信号通路之间的关系。由于缺乏对肿瘤组织进行单细胞和深层表型分析的可靠方法，还需要对此项技术进行更深入的研究与探讨，尤其是对于人类样本的分析。我们期待单细胞分辨、多重蛋白质和多模态成像综合应用，可以让我们更深入的了解肿瘤发生、发展的机制，为提供更多的潜在治疗方法提供有力参考。关注我，更多资讯早知道↓↓↓