PECAM1

在过去的十年中，随着光学和蛋白质分析方法的提高，组织成像变得更加丰富多彩，这使得对组织样本中的蛋白标记物进行多重成像成为可能。多重成像技术使单细胞甚至是亚细胞同时分辨40-50 个标记物成为可能。本文总结了多重蛋白质成像方法在肿瘤生物学研究中的应用，并将这些方法与其他空间组学相结合对阐述肿瘤生物学的意义。01 为什么需要多重蛋白质成像肿瘤的持续生长、扩散和治疗反应不仅取决于恶性细胞的特性，还取决于它们与其他细胞的相互作用。免疫细胞、基质细胞、血液和淋巴内皮细胞及脂肪细胞都可能具有环境相关的、促进肿瘤生长功能或抑制肿瘤生长功能。肿瘤的许多特征很可能直接或间接受到肿瘤细胞与其微环境相互作用的影响。如果要充分了解肿瘤如何发展、扩散和死亡，以及如何更好的治疗，我们必须了解肿瘤细胞与其他细胞的多向相互作用。肿瘤细胞具有异质性和非静态性，即使在同一个患者或瘤种内也是如此。肿瘤细胞的异质性和可塑性可使肿瘤逃避免疫系统，扩散到其他组织或器官，并对治疗产生耐药性。在疾病进展的每一步，肿瘤细胞可视为具有“自主学习的系统”，通过直接接触或与可溶性因子的结合，与微环境中的其他细胞类型进行连续、相互的通讯来处理信息。这种信息交换，以及营养物质、代谢物的梯度，形成肿瘤细胞特有的群落和环境，促使肿瘤细胞发生免疫逃逸或肿瘤细胞迁移。因此，必须了解肿瘤细胞存在哪些异质表型，以及肿瘤细胞如何与其他细胞进行物质、能量交换以及能量串联，以便更深入了解疾病的病因、进展以及治疗对策。02 可测量的肿瘤特征多重蛋白质成像技术能够靶向多种标记物，分析亚细胞位置、细胞表型、细胞内的活性信号传导或其他过程（状态）、细胞与细胞之间的相互作用或与细胞外基质（ECM）或更大规模的空间组织结构。因此，可以使用多重蛋白质成像技术研究肿瘤特征（图1a）。图1 使用多重蛋白质成像技术研究的肿瘤特征。03 肿瘤中的细胞表型、状态和功能要系统理解肿瘤生态系统，第一步是识别存在的细胞表型。单细胞多重成像（图1b）具有此功能，单细胞多重成像可以区分几十个标记物（通常是10-50个）。如此大的标记组为充分表征细胞表型提供条件，因为人们通常希望同时定义细胞类型（例如 CD3+ T 细胞、CD68+ 巨噬细胞、CD31+ 内皮细胞和肿瘤细胞）、亚型（例如 CD4+或 CD8+ T 细胞或叉头盒蛋白 P3 (FOXP3)+ 调节性 T (Treg) 细胞），以及功能状态。图2来自组织的成像质量细胞计数数据的性质的示例图像。在临床研究中，细胞表型和状态可以根据研究者感兴趣的特性而进行样本之间的比较。例如，原发肿瘤和转移瘤、具有不同基因组图谱的样本或者根据病原体感染或免疫浸润状态（图2）。细胞表型和状态（或其他成像特征）也可以与肿瘤分级、临床亚型、治疗反应和患者预后等临床特征相关。例如，患者生存率与肺腺癌中的 B 细胞频率、胶质母细胞瘤中的内皮细胞频率呈正相关，在非小细胞肺癌中与溶酶体相关膜糖蛋白 (LAMP)+ 树突状细胞和 CD66B+ 中性粒细胞的组合呈正相关。在对充分表征的临床队列研究中，通过多重蛋白质图像分析（例如细胞表型、相互作用或空间模式）量化的肿瘤微环境（TME）特征可以与性别或年龄等人口特征建立关联，并与临床诸如肿瘤细胞亚型、治疗反应或总体生存率等特征进行关联分析。具体描述见图2。图3多重蛋白成像在临床样本检测中的应用04 肿瘤细胞的空间成像目前大多数研究肿瘤及其周围免疫细胞的技术，往往都无法保留细胞的原位空间分布信息。这些位置信息，包含肿瘤和免疫细胞相互作用的重要关系。而基于原位的成像检测手段，通常只能检测1-2个蛋白表达,很难完全系统地研究肿瘤组织中的多种蛋白。为了突破这一技术障碍，斯坦福大学Garry Nolan lab在2014年开发了多路复用离子束成像技术。简单来说，就是利用不同的同位素标记不同的抗体，然后通过离子束激发，产生的对应的离子信号，来获得多个蛋白在单细胞水平上的信息。举例：CELL上发表的一篇论文，研究者利用肿瘤细胞空间成像技术，同时检测了三阴乳腺癌的肿瘤和免疫细胞中具有代表性的36个蛋白，系统地描述了肿瘤细胞和不同种类的免疫细胞在空间分布上的特征。研究人员发现，不同的病人的免疫细胞浸润程度大不相同，并且浸润的免疫细胞种类也不尽相同（图3）。多重肿瘤空间成像分析方法（图4）可以根据同时分析的细胞类型的数量进行广泛分类。图4通过多路复用离子束成像技术鉴定的36中肿瘤和免疫细胞相关蛋白图5多重蛋白质成像数据的空间分析方法概述。如图4（a）所示，每个样本的顶部一行是一阶分析，确定单个细胞类型（浅蓝色）的空间分布（左）或感兴趣的空间结构（例如，肿瘤间质边界，右）。二阶分析，确定了两种确定的细胞类型（蓝色和橙色）的空间分布（图4（b）），以及定义两种或两种以上细胞类型的空间模式的高阶分析（图4（c-f））。05 多重蛋白质成像方法多重单细胞蛋白成像或图谱分析方法根据所使用的探针可分为四类（图5）。具体的，可以通过质谱、荧光或显色成像、寡核苷酸的荧光成像或测序进行分析。图6单细胞多重蛋白成像方法的原理1）质谱读数：MIBI和IMC依赖质谱检测与抗体耦合的金属同位素，通过离子束（MIBI）或耦合到电离等离子体源（IMC）的激光实现电离（图5a）。该技术可针对40-50 个标记物的抗体同时染色，也与 RNA 和 DNA 检测兼容。IMC已通过连续切片成像扩展到三维。2）荧光读数：多重荧光方法大致可分为两类。多光谱成像采用一种计算光谱分离的方法来分离重叠的荧光团发射光谱，并已实现了高达20倍的成像。PhenoImager HT和 Orion 都可用于多重免疫荧光检测（图 5b）。3）染色体读出：经典 IHC 是一种成熟的临床病理学技术，以迭代模式用于实现多重蛋白质成像（图5b)。每种抗体均通过基于辣根过氧化物酶 (HRP) 的色原沉积和成像进行检测，然后用有机溶剂脱色。在单玻片上的多重免疫组化连续染色 (MCSSS) 中，有效的染色和脱色需要封闭先前的表位以对抗不完全脱色。多重 IHC 已应用于患者临床样本的检测。4）基于寡核苷酸标记抗体的荧光或测序：通过序贯检测的多重成像也已通过 CODEX 中的寡核苷酸标记抗体实现（图 5c），其原理是DNA由于其组合聚合物的性质，为设计分子标签提供了一个理想的底物。设计一种可索引标记系统，通过逐步枚举过程迭代显示标记。抗体（或其他基于亲和的探针）用独特设计的寡核苷酸双链标记，带有50个悬垂物，可以实现迭代的逐步可视化。06 空间多组学空间多组学方法可以在其天然组织背景下以亚细胞分辨率研究不同的分子分析物，通常空间组学测量还辅以相同或相邻组织切片的组织学染色，如H&E染色，从而与形态学注释相结合。空间多组学的方法示意见图6。空间ATAC&RNA-seq 和空间CUT&Tag-RNA-seq分别描述了在同一组织冷冻切片上同时无偏分析染色质可及性或特定组蛋白修饰和基因表达的可能性；或者，基于显微镜的方法可以通过以高达亚细胞分辨率直接成像单细胞内的DNA位点、染色体和核结构以及转录物，实现基因组或表观基因组信息以及基因表达的空间分析；目前，允许对转录组和蛋白质组进行平行空间询问的方法仍然有限，通常基于两种模式的系列表征，大多只允许对有限数量的蛋白质进行共同表征，并且通常缺乏单细胞分辨率。图7 空间多组学方法07 总结像所有的方法一样，多重蛋白质成像方法也有其固有的局限性，如果这些实验方法产生的结果有意义，就必须考虑到目前多重蛋白成像的限制。在使用多重蛋白质成像方法之前，我们需要考虑对肿瘤标记物的选择、抗体的验证、细胞分割的范围、选择细胞表型的意义、识别与临床相关的空间特征等因素。如果同时需要包含标记细胞外和细胞内的生物标志物，甚至可以绘制整个信号通路之间的关系。由于缺乏对肿瘤组织进行单细胞和深层表型分析的可靠方法，还需要对此项技术进行更深入的研究与探讨，尤其是对于人类样本的分析。我们期待单细胞分辨、多重蛋白质和多模态成像综合应用，可以让我们更深入的了解肿瘤发生、发展的机制，为提供更多的潜在治疗方法提供有力参考。关注我，更多资讯早知道↓↓↓

本文为转化医学网原创，转载请注明出处 作者：Jerry 导读： 透明细胞肾细胞癌(ccRCC)具有独特的特征，即高度的血管生成和强健的血管化。了解这种异质性背后的机制对于开发有效的治疗策略至关重要。 3月11日，哈尔滨医科大学与中国科学技术大学研究人员共同在期刊《Oncogene》上发表了研究论文，题为“Downregulation of UBB potentiates SP1/VEGFA-dependent angiogenesis in clear cell renal cell carcinoma”。本研究中， 研究表明泛素B（UBB）过表达显著抑制了肾细胞癌细胞的增殖、肿瘤负荷和体内外血管生成。 研究结果证明了UBB在抗血管生成治疗中的关键作用，并揭示了UBB作为ccRCC治疗干预的潜在靶点。 https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41388-024-03003-6#Sec9 研究背景 01 透明细胞肾细胞癌是一种常见的肾癌类型，具有侵袭性组织学特征。前期研究表明，肿瘤微环境是ccRCC的重要组成部分，分别在TCGA-KIRC、GSE53000和GSE53757数据库中分别发现了76、105和48个与ccRCC微环境相关的基因，并从这些基因中筛选出肿瘤微环境相关基因UBB。 ccRCC通常具有异质性组织学特征，如富含糖原的细胞质、嗜酸性细胞质、细血管网和增大的厚血管结构。这种异质性主要归因于von Hippel-Lindau(VHL)突变。因此，ccRCC细胞表现出以血管内皮生长因子(VEGF)激活为特征的假性缺氧表型，导致其独特的外观。鉴于在更晚期的ccRCC中观察到广泛的新生血管化，治疗方法主要围绕着使用特异性抑制VEGF的TKIs或单克隆抗体靶向VEGF信号通路。目前，许多TKIs作为转移性肿瘤的主要一线治疗选择，在延长无进展生存期方面表现出显著的疗效。然而，一组患者表现出固有耐药性，大多数患者最终获得耐药性，导致最终死亡结果。因此，需要一种新的抗血管生成治疗方案，作为一种可行的策略来优化治疗效果。然而，UBB是否通过调节ccRCC微环境中的SP1-VEGFA轴来调节血管生成过程仍然不为人所知。 研究进展 02 为了研究和验证UBB在体外肿瘤进展中的作用，研究人员使用转染UBB过表达慢病毒(UBB_OE)的肾癌细胞进行了细胞活力，细胞增殖，细胞迁移和细胞侵袭的实验。EdU实验和克隆形成实验结果显示，UBB过表达后肾癌细胞的活力和增殖能力显著降低。 此外，通过划痕实验和Transwell实验，研究人员发现UBB过表达抑制了肾癌细胞的迁移和侵袭。 研究人员还建立了裸鼠移植瘤模型，以验证UBB在体内的疗效。UBB过表达后，肿瘤生长明显受到抑制。称量肿瘤重量并切片进行病理分析。UBB_OE组Ki67和CD31的表达水平较UBB_NC组明显降低。 因此，UBB在ccRCC中起着肿瘤生长抑制基因的作用。 另外，通过对生理过程的全面分析，研究人员还揭示了UBB低表达和血管生成激活之间的潜在关联。大量文献表明，血管生成在ccRCC的发生和发展过程中异常激活。 本研究结果支持UBB通过诱导VEGFA表达的调节来调节血管生成的观点。 UBB抑制肾癌细胞体外血管生成 研究结论 03 总之，本研究揭示了UBB在通过SP1/VEGFA信号阻滞ccRCC生长和血管生成中的重要性。 UBB在增强抗血管生成治疗和克服帕唑帕尼耐药方面的潜力为缓解ccRCC提供了一种有前景的创新策略。 参考资料： https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41388-024-03003-6#Sec9 注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门·直播/活动 🕓 上海｜06月14日-16日 ▶ 第六届上海国际癌症大会将于6月14-16日在上海举办，学科交叉，共同推进肿瘤研究与诊治多模态！ 🕓 北京｜09月20日-21日 ▶ 第五届单细胞技术应用研讨会暨空间组学前沿研讨会欢迎您的参与！ 点击对应文字 查看详情

本文为转化医学网原创，转载请注明出处 作者：Sophia 导读： 转移是肺癌相关死亡的主要原因，但控制肺肿瘤转移的机制仍未完全阐明。SE 易位 （SET） 在肺肿瘤中过表达，并与不良预后相关。 2024年2月14日，中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所王冬来课题组在《Nature Communications》上发表题为“Oncoprotein SET-associated transcription factor ZBTB11 triggers lung cancer metastasis”的研究文章， 研究证明了 ZBTB11 是一种关键的转移调节因子，并揭示了 ZBTB11 调节肺肿瘤转移的多种机制。 https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41467-024-45585-5 研究背景 01 最新的全球癌症统计数据显示，虽然肺癌发病率已降至第二位，但仍然是癌症死亡的主要原因。肺癌在组织学上可分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC），后者可进一步分为腺癌（LUAD）、鳞状细胞癌（LUSC）、大细胞癌等。在所有类型的肺癌中，超过40%是腺癌，转移是恶性肿瘤晚期的标志，是患者肺癌相关死亡的主要原因。然而， 肺癌转移的调控机制仍不完全清楚。 癌蛋白 SET 最初是在急性未分化白血病 （AUL） 研究中发现的，在研究染色体易位引起的 DNA 断点时发现了一种新的致癌 SET-CAN 融合基因。条件基因敲除小鼠模型中 SET 表达的完全丧失揭示了胚胎致死表型，证明了 SET 在调节正常发育中的关键作用。更引人注目的是，SET过表达是包括肺癌在内的不同类型癌症中的常见事件，这表明SET在成体细胞中的异常表达有助于肿瘤的发生和/或进展。通过单独或联合策略靶向异常 SET 可能会触发细胞质和细胞核参与的肿瘤机制，包括肺癌，干预。然而， 决定 SET 用于肺癌转移调节的细胞核内的主要 TFs 仍然不明确。 据报道，ZBTB11 参与了长链非编码 RNA （lncRNA） DUBR 介导的肺癌细胞迁移和侵袭，这表明 ZBTB11 在肺癌进展过程中具有潜在作用。然而， ZBTB11 在肺癌中控制的精确转录谱、调控网络和生物学后果在很大程度上仍然未知。 研究进展 02 为了研究肺癌细胞中 SET 和 ZBTB11 之间的功能相互作用， 我们试图鉴定 SET 介导的 ZBTB11 直接靶基因的调控。 为此，我们首先在SET耗竭96小时后通过RNA-seq评估H1299细胞中的差异表达基因（图3a）。如图 3b 所示，我们鉴定了 164 和 145 个基因，它们在 SET 敲低时分别上调和下调。同样，大多数SET调节的基因也富集在蛋白质编码类别中（~67%，207，图3c）。基于这些数据集，我们发现了 35 个推定的 ZBTB11 直接靶基因，这些基因受 SET（图3d）的共调控。有趣的是，这些基因可以清楚地分为两组：18 个基因在 SET 和 ZBTB11 耗竭时被转录抑制，17 个基因在 SET 和 ZBTB11 耗竭时被转录激活（图3e）。SET/ZBTB11 共调控靶基因的转录谱表明 SET 可能与 ZBTB11 在转录调控方面具有功能协同作用。值得注意的是，GO分析显示，由共调控靶基因富集的顶级生物过程是“细胞外基质组织”，与ZBTB11调控基因富集的生物过程完全相同（图3f）。此外，使用靶标特异性引物的RT-qPCR测定进一步证实，参与细胞外基质组织的MMP9、MMP19、SPARC、PECAM1、SPP1和COL14A1基因确实在H1299细胞中受到SET和ZBTB11的共同调节（图3g）。在 H1975 肺癌细胞中，这些基因在 SET 和/或 ZBTB11 敲低时的类似转录调控也被概括。 SET与ZBTB11在转录调控方面合作 总的来说，这些数据表明 SET 与 ZBTB11 在转录调控中合作，并促使我们关注 SET-ZBTB11 蛋白复合物在肿瘤发生和进展时调节细胞外基质相关生物过程的潜在作用。 研究结果 03 在这项研究中，我们将 ZBTB11 确定为细胞核中癌蛋白 SET 的结合伙伴。对 ChIP-seq 和 RNA-seq 的综合分析表明，ZBTB11 在肺癌细胞中充当转录因子。SET通过作为辅因子与ZBTB11合作进行转录调控，SET和ZBTB11之间的相互作用在调节肺癌细胞的转移行为中至关重要。从机制上讲， 我们发现 MMP9 是有助于 SET-ZBTB11 复合物介导的转移调节的主要下游效应子。此外，ZBTB11 通过转录抑制 PRRG2 表现出一种作用模式，与 YAP1 的激活建立连接，以 SET-ZBTB11 复合物非依赖性方式促进肺肿瘤转移。更重要的是，ZBTB11的条件性敲除可显著抑制体内遗传病变诱导的原发性肺肿瘤的远端转移。 综上所述，我们的研究表明，SET结合伙伴ZBTB11在调节肺肿瘤转移中起着关键作用。 参考资料： https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41467-024-45585-5 注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门·直播/活动 🕓 上海｜3月01日-02日 ▶第三届长三角单细胞组学技术应用论坛暨空间组学前沿论坛将在上海召开，诚邀您的参与！ 点击对应文字 查看详情