mRNA递送系统开发：植物来源细胞外囊泡口服递送mRNA疫苗

2024-03-02

疫苗信使RNA

导读：新冠mRNA疫苗采用脂质纳米颗粒（LNP）作为递送系统，选择肌肉注射作为免疫途径。肌肉注射的不足在于其只能触发低效的黏膜免疫反应，在控制病毒复制和病毒上呼吸道鼻腔脱落方面效果不佳。因此，研究者们一直在探寻更高效触发机体产生黏膜免疫的新型递送载体和给药途径。植物来源的细胞外囊泡是一种天然的、丰富的且可靠的无毒提取物。2023年6月30号，都灵大学Giovanni Camussi教授在 Cells发表文章：《Oral Delivery of mRNA Vaccine by Plant-Derived Extracellular Vesicle Carriers》，他们使用来自使用植物的细胞外囊泡作为递送载体，包封新冠mRNA疫苗，制成易于口服胶囊，免疫大鼠，对其稳定性和免疫原性进行了评估。一、mRNA疫苗递送方式研究背景关于mRNA疫苗的疗效，粘膜免疫反应也是需要考察的一点，且受递送系统和给药方式的影响。目前上市的新冠mRNA疫苗采用脂质纳米颗粒（LNP）作为递送系统，选择肌肉注射作为免疫途径，仅能触发低效的黏膜免疫反应。2023年，韩国学者采用沙门氏杆菌作为递送载体，编码新冠病毒抗原，证实通过沙门氏杆菌递送的多价可变抗原或者保守抗原均能刺激强烈的细胞和体液免疫，能够抑制新冠病毒感染仓鼠体重降低程度，降低肺部病毒载量，缓解肺部充血和炎症反应。尤其是，在血清、肺部以及肠道中检测到非常明显的IgA抗体分泌。藻类是非常有前景的低成本生产抗原的平台，并且可以将它们用作口服递送载体，因为藻类是可食用的（不需要复杂的纯化和配制过程）。2002年，Dania O. Govea-Alonso等人用携带“新冠病毒RBD”表达载体的农杆菌菌株感染藻类培养物，筛选出表达新冠病毒RBD抗原的藻类，发现藻类生产的RBD通过口服途径免疫小鼠后可诱导针对新冠Spike抗原的全身和黏膜体液免疫。这是第一份对藻类生产新冠抗原免疫原性进行评估的报告。最近，细胞分泌到胞外的囊泡（EVs），例如，外泌体（exsomes）开始逐渐成为一种非常有前景的核酸药物递送载体。这些分泌的 EVs 直径在 40-150nm，有着良好的生物相容性，天然镶嵌跨膜或者膜结合型蛋白。细胞外囊泡在真核生物中最初被描述为细胞间的通讯机制，随后，科学家发现这种通讯机制广泛存在于各种生命体中，包括原核生物和植物中。有意思的是，细胞外囊泡可介导核酸的水平转移，并且其脂质双层膜可保护核酸免予降解。科学家已经证实含有编码绿色荧光蛋白的外源 mRNA 的工程化细胞外囊泡能够在靶细胞中实现靶标蛋白质翻译，还有学者利用源自工程化哺乳细胞的细胞外囊泡来表达新冠Spike蛋白，高效刺激CD8+T细胞反应。二、植物源细胞外囊泡口服递送mRNA疫苗2.1 mRNA疫苗口服胶囊的制备和检测为了生产含有 mRNA 疫苗的口服胶囊，研究人员将编码新冠病毒S1 抗原的 mRNA 装载到橙子来源的细胞外囊泡（oEV）中，并在胶囊填充和包衣之前将混合物冻干。使用未加载的、不含 mRNA 的 oEV 作为对照样本。对不同存贮时间的细胞外囊泡进行完整性和形态分析。光散射分析显示，在所有储存条件下：新鲜制备；冻干处理；胶囊室温存放2个月；胶囊室温存放12个月，未装载的 oEV和装载新冠S1 mRNA (oEV-S1) 的 oEV 中的尺寸分布曲线相似。使用 TEM 技术检测颗粒形态，证明在所有储存条件下颗粒构象均未改变，具有圆形形态和电子致密核心。最后，颗粒数量和尺寸的定量分析并未显示冻干、封装和室温储存后发生显著变化。对oEV包封的S1 mRNA进行分析，在新鲜制备的、冻干处理的或者胶囊中保存的（2个月或者12个月）oEV中的S1 mRNA均未出现损失。2.2 mRNA疫苗口服胶囊的疗效用包封有新冠S1-mRNA的橙源细胞外囊泡口服胶囊免疫大鼠，连续三天给大鼠口服 1 粒含有载有 100 µg S1 mRNA 的 oEV（oEV-S1）的胶囊，并在 3 周后重复加强治疗。两周后，处死免疫大鼠并进行分析。作为对照治疗，用含有空载 oEV（oEV）的胶囊对大鼠进行免疫。在整个试验过程中，大鼠体重持续出现增加，说明免疫胶囊的安全性是非常可靠的，不存在明显的毒性。与未包封 S1 mRNA 的 oEV胶囊相比，口服oEV-S1胶囊疫苗在大鼠体内诱导产生了S1特异性的IgM、IgG和IgA。此外，接种 oEV-S1 胶囊的大鼠体内产生的血清抗体具有抗病毒中和活性，可阻断 S1 蛋白与 ACE2 受体的结合。用S1抗原刺激从免疫大鼠中分离的脾脏细胞以评估疫苗触发的免疫反应。oEV-S1 胶囊免疫大鼠可诱导 Th1（IFN-γ、IL-2）而不是 Th2（IL-10、IL-4）细胞介导的免疫反应。与对照组 (oEV) 相比，从oEV-S免疫大鼠体内分离的脾细胞中，通过 ELISPOT 可检测到强烈的 IFN-γ 分泌，并通过 ELISA 得到确认。此外，oEV-S免疫大鼠体内分离的脾细胞分泌的IL-2水平增加，但是，分泌IL-10水平未发生变化，而使用ELISA测定法未检测到IL-4的分泌。接着，使用细胞荧光分析研究S1抗原刺激或者不刺激的从大鼠分离到的脾脏细胞。当用 S1 抗原体外刺激时，与 oEV 免疫大鼠的脾脏细胞相比， oEV-S1 免疫大鼠的脾脏细胞中CD3+ 淋巴细胞数量增加。oEV-S1 免疫还诱导了适应性反应，促进总 CD3+ 淋巴细胞以及 CD3+CD4+ 和 CD3+CD8+ 细胞中 CD25+ 的表达。此外，接种疫苗后检测到 CD3+CD4+ 细胞水平增加及其激活标记 CD44+ 的表达，还促进了 CD138+ 浆细胞的形成。最后，细胞荧光分析证实了 oEV-S1 免疫大鼠脾脏中分泌的 IL-10 水平没有变化，而 IL-4 的分泌减少。三、小结目前的研究表明，植物源性细胞外囊泡可以有效地用作 mRNA 疫苗递送载体，并且可简单配制为易于使用的口服胶囊。这种新型的递送策略极具吸引力，因为植物源性细胞外囊泡是一种可大规模生产且产量极高的提取物，它们不具有毒性，可保护核酸免予降解，具有良好的胃肠道耐受性、稳定性以及没有免疫原性。科学家认为植物源性的细胞外囊泡不仅可以用于递送 miRNA、siRNA、mRNA以及DNA，还可以用于递送难溶性的化合物。在这项研究中，都灵大学Giovanni Camussi教授首次验证了使用橙子来源的细胞外囊泡作为口服胶囊新冠mRNA 疫苗的递送系统的可行性。研究人员发现将包封有S1-mRNA的橙子来源的细胞外囊泡冻干后封装到胶囊中，可在室温稳定存放1年，不会影响细胞外囊泡以及mRNA的稳定性。口服胶囊制剂诱导大鼠免疫，高效触发细胞和体液免疫反应，产生中和抗体和特异性 IgM、IgG 和 IgA。IgA 代表着适应性免疫反应中的第一个粘膜屏障，其刺激是粘膜疫苗的基础。然而，粘膜疫苗接种不仅能刺激IgA产生，还能刺激高水平的抗原特异性的IgM和IgG，从而提供全身保护。他们还发现，口服胶囊制剂免疫大鼠诱导的是 Th-1 型细胞免疫反应，增加了 IFN-γ 和 IL-2 在脾脏细胞中的释放，但 IL-10 或 IL-4 的分泌不会增加。口服给药代表了一种无针免疫，可以提高便疫苗接种的便利性和速度，并减少与疫苗接种相关的成本和痛苦，对大规模疫苗接种活动有着明显的促进作用。为了更好地明确植物来源细胞外囊泡的临床转化潜力，未来还需要将植物来源细胞外囊泡与目前用于 mRNA 疫苗递送的LNP的递送效率和免疫效果进行直接比较，将有助于确定其作为递送系统的真正价值潜力。耀海生物RNASci平台介绍耀海生物依托开创性的技术创新能力，搭建了成熟完善的RNASci平台，为广大科研及企业用户提供IVT RNA（circRNA、mRNA和saRNA）定制化合成服务。我们的一站式服务从序列设计、模板制备、体外转录、体外环化、RNA纯化、LNP包封到样品检测，贯穿mRNA设计至成品的全生命周期。此外，我们提供各类预制型mRNA/circRNA产品，编码蛋白涵盖报告基因、免疫抗原、细胞因子、基因编辑酶等，具体包括eGFP、mCHERRY、luciferase、OVA、IL-12、IL-2、Cas9等，以满足不同的实验或项目需求。欢迎垂询：13380332910（微信同号）表1: 耀海生物mRNA/circRNA产品列表参考文献[1] Pomatto MAC, Gai C, Negro F, Massari L, Deregibus MC, De Rosa FG, Camussi G. Oral Delivery of mRNA Vaccine by Plant-Derived Extracellular Vesicle Carriers. Cells. 2023 Jul 11;12(14):1826. doi: 10.3390/cells12141826. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。