Nature 新药发现：一种膜蛋白配体和纳米抗体结合策略

2022-06-01

抗体抗体药物偶联物小分子药物蛋白降解靶向嵌合体创新药

Cheloha团队通过将C端熔合，开发了一种由一个纳米抗体和一个G蛋白偶联受体（GPCR）的肽配体组成的新型结合物。本文主要研究了甲状旁腺激素受体-1（PTHR1）的激活机制，并通过将其与识别PTHR1的纳米抗体（VHH）结合，提高了活性较差的PTH N端肽 PTH N端肽片段的信号活性和特异性。这些C-to-C结合物在体外显示出优于亲本片段肽的生物活性。在小鼠的探索性实验中，VHH-PTH肽结合物显示出了生物活性，但相应的游离肽则没有。这种被称为“膜蛋白的配体和抗体结合”（CLAMP）的设计方法可以产生具有高效力和特异性的配体。 1►膜蛋白配体和纳米抗体的结合应用01膜蛋白的配体和抗体结合策略的提出抗体和细胞毒性药物之间的结合物（抗体-药物结合物或ADC）可以选择性地杀死显示抗体靶标的癌细胞。但利用抗体传递在细胞表面具有作用位点的生物活性化合物的研究要少得多。在保持适当的空间限制的情况下，表面受体的配体与识别同一受体的抗体的结合能增加配体的有效浓度，从而提高其效力和特异性。理想情况下，该方法可与直接针对感兴趣受体的抗体一起使用，在无需对目标细胞或生物体进行遗传修饰的情况下实现应用。G蛋白偶联受体（GPCR）家族的蛋白质是应用这种方法的理想靶点。02纳米抗体的融合应用靶向GPCR的分子占所有获批药物的25%以上。抗体和骆驼类纯重链抗体的可变片段（VHHs或纳米抗体）越来越多地用于调节GPCR信号。G P C R s 和他们的配体显示出相当程度的简并性，但配体与GPCR的配对关系并非一一对应。甲状旁腺激素受体就是一个典型例子：甲状旁腺激素（PTH，残基1-34）的生物活性N末端片段，以特立帕肽的名义用于治疗骨质疏松症，可有效激活1型和2型PTH受体（PTHR1 \/PTHR2）。PTHR1 \/2是GPCR B类的一部分，由大量（>25个残基）肽自然激活。尽管业界对此有浓厚兴趣，但尚未发现具有与天然配体相当效力的B族GPCR小分子激动剂。为了解决PTHR信号传导和选择性问题，作者制备了PTH和纳米抗体片段的偶联物。2►P T H（1-34）双位点相互作用机制用于靶向的受体结构和结合物。P T H（1-34）通过双位点相互作用机制与PTHR1相互作用，PTHR1胞外区与PTH残基之间的关联为这种相互作用提供了大部分结合能和特异性。PTHR1的跨膜结构域和PTH的残基之间的关联诱导受体的构象变化，从而启动细胞内信号级联。这种相互作用模式得到了大量构效关系数据的支持，最近已被PTHR1配体配合物的结晶学和低温电子显微镜证实。为了模拟PTH（1-34）所显示的受体关联，作者使用野生型PTHR1或PTHR1变异体修饰，以携带纳米抗体选择识别的胞外区表位。虽然没有任何与PTHR1结合的纳米抗体结构信息，但作者设想了受体和VHH-PTH结合物之间的相互作用模式，如图1c所示。图1 VHH介导的PTHR配体传递示意图 3►实验结果由外显子2编码的PTHR1部分在结构研究中未被解析（图1d），对配体结合并不重要，并且在过去的工作中被定位为受体修饰位点，作者构建了一个编码PTHR1变体的结构，其中来自外显子2的残基片段被来自细胞内蛋白UBC6e的残基表位标签替换（PTHR16E，图1d），作者还使用了一种受体结构，其中pH敏感的绿色荧光蛋白变体（GFP）插入到由外显子2编码的受体部分，还使用了另一种版本的PTHR1，其中黄色荧光蛋白（YFP）取代整个N端胞外结构域。为了靶向这些受体，作者构建了由PTH和VHHs的N末端片段组成的缀合物。他们选择使用纳米抗体识别绿色或黄色荧光蛋白（VHHGFP）、来自细胞内蛋白UBC6e（VHH6E）20的肽片段或PTHR1（VHHPTHR）。作者使用sortase a介导的标记（Sortaging）在细菌中表达C末端His标记的纳米抗体，其形式可在Cterminus处进行随后的位点特异性功能化，对于这些纯化的纳米抗体，作者分别连接了一个三甘氨酸修饰的荧光团用于细胞荧光测定，或一个带有叠氮化物和生物素部分的肽用于双正交化学和共轭追踪（图2）。作者通过流式细胞术确定纳米抗体是否会与活细胞上的预期靶点结合。对稳定转染上述PTHR1变体、大鼠PTHR1（rPTHR1）或PTHR2的HEK293细胞系进行染色。rPTHR1已被广泛研究，与小鼠PTHR1（mPTHR1）在外显子2外的胞外区。与rPTHR1结合的纳米抗体也应与mPTHR1结合，并可用于小鼠研究。除VHHGFP-PTHR1GFP以外，每个纳米抗体染色细胞系均符合预期。VHHPTHR结合所有保留PTHR1 ECD的结构，包括大鼠PTHR1，但不包括PTHR1YFPΔECD。这将VHHPTHR的结合位点置于PTHR1胞外区（ECD）。只有表达PTHR1YFPΔECD的VHHGFP染色细胞与其结合YFP的能力一致。所有受试纳米抗体均未对表达PTHR2的细胞系进行染色，为了评估所选纳米抗体对其靶点的相关性，作者使用流式细胞术测量结合。VHHGFP对PTHR1YFPΔECD的染色和VHH6E对PTHR16E的染色在<10 nM处显示出半最大染色，然而，表达每种PTHR1受体结构并保留ECD的细胞的染色在100–200 nM处达到最大染色的一半。VHHPTHR的精确半最大染色浓度未知，因为染色强度（MFI）在测试的最高浓度下不会稳定，结合强度是根据其他实验估计的。作者使用显微镜补充流式细胞术，并可视化PTH（1-20）作用后PTHR1或PTHR16E的分布，用荧光素功能化，并用四甲基罗丹明标记VHHPTHR或VHH6E。在冰上染色后立即固定的细胞成像显示纳米抗体和PTH在细胞表面共定位。在室温下培养15分钟后，作者观察到点状和共定位荧光信号，对应于内吞受体PTH VHH复合物。未转染PTHR1的细胞显示弱染色。这些数据表明，所示VHH和PTH（1-20）可同时与受体结合。 01PTHR1肽配体和抗体片段结合为了测试通过结合VHHs将PTH片段传递到其作用位点是否会影响其信号活性，作者合成了PTH的N末端片段（图2，表1）。表1 VHH-PTH结合物刺激PTHR1及其变体这些片段通过常规固相多肽合成制备为C末端酰胺，并进行纯化。大多数这些肽含有M-PTH系列PTH肽中发现的几种修饰，包括位置3处的非标准残基氨基异丁酸（Aib），增强了短PTH片段的生物活性（图2）。这些肽中的每一个都含有一个C末端半胱氨酸（Cys）。使用Cys马来酰亚胺，附加了二苄基环辛炔（DBCO）手柄，以实现叠氮化物官能化纳米抗体的C端和DBCO修饰的合成肽之间的叠氮化物炔共轭。图2 合成肽与结合策略然后，他们使用表达相关纳米抗体靶向PTHR变体的HEK293细胞和基于荧光素酶的cAMP反应报告，来评估这些肽和缀合物刺激产生环磷酸腺苷（cAMP）的能力。来自PTH（1-34）的C末端残基的逐渐截断导致野生型PTHR1和其他具有完整ECD的PTHR1变体的效力与PTH（1-14）相比显著降低（表1），在PTH（1-14）的N端添加三甘氨酸附件会导致效力降低。G3-PTH（1-14）使用排序酶连接到纳米抗体C-末端的共轭物完全无活性，这证明了游离N-末端对PTH及其片段的重要性。相反，C-to-C-末端融合形成的共轭物是具有活性的（表1）。缺乏残基15–34（已知对ECD结合很重要）的PTH片段与结合到靶向受体的纳米抗体的结合显示出明显的效力增强（表1）。VHHPTHR结合还增加了PTHR1、PTHR1GFP和PTHR16E处PTH（1-11）和PTH（1-14）的效力，这与纳米抗体结合实验的结果一致。当与适当特定的纳米抗体结合时，即使是较短的PTH片段，信号持续时间也会明显延长。一些VHH-PTH片段诱导的cAMP信号动力学类似于PTH（1-34）。配体在PTHR1诱导延长信号传导的能力与内化到内体室后的持续信号传导相关，VHH-PTH结合物相对于相应的游离肽的延长信号表明，纳米抗体结合提供的附加亲和力使内切体信号传导成为可能。02体内活性作者测试了在基于细胞的分析中观察到的VHH-PTH结合物的有效生物活性是否会扩展到体内环境。作者在这些实验中使用VHHPTHR-PTH（1-14）结合物，因为它比VHHPTHR-PTH（1-11）更有效。VHH-PTHR增强了大鼠PTHR1的PTH（1-11）信号活性。由于VHHPTHR结合大鼠PTHR1（图3），作者确信它同样也会结合小鼠PTHR1，因为这些受体在其胞外区的相似度为99%。为了测量体内活性，作者向小鼠皮下注射等摩尔量的PTH（1-34）、M-PTH（1-14）、VHHPTHR-PTH（114）或生理盐水。根据PTH（1-34）治疗小鼠的先例选择剂量，以刺激急性血钙反应。PTH（1-34）诱导血液游离钙水平强烈增加，注射后1-2小时达到峰值，然后恢复到基线水平，而游离M-PTH（1-14）在本试验中几乎没有活性，这与过去的发现一致。实验表明，VHHPTHR-PTH（1-14）刺激血钙峰值，在注射后两小时达到峰值（图5）。因此，PTH（1-14）与VHHPTHR的结合增强了细胞检测和体内的生物活性。3►结果讨论作为常规抗体-药物缀合物的一部分，抗体传递通常针对细胞内蛋白质的细胞毒性化合物，使用抗体为GPCR等表面受体传递配体的研究较少。这可能是由于制备抗体和配体的同质和生物活性结合物时的复杂性，这些结合物依赖于抗体结合来增强配体与受体的结合。在用抗体-配体融合靶向GPCR的一个先例中，配备SNAP标签的VHHGFP与GPCR mGluR239的光激活配体相连。然后利用这种融合在配体光激活后激活GFP标记的受体。光激活纳米抗体配体共轭物的饱和浓度诱导的响应约为天然配体饱和剂量诱导的响应的40%，并且需要受体GFP融合的应用。这种方法禁止使用未经基因修饰的细胞或动物。在另一实例中，产生在重链或轻链的N末端与胰高血糖素样肽1（GLP-1）的类似物融合的全长抗PCSK9抗体。然而，大多数受试融合蛋白的表达率较低，在GLP-1片段中通过失活截短进行分离，在溶液中不稳定，或在体内迅速降解，这表明在表达由全长抗体和相关配体组成的融合蛋白时遇到了困难。在用抗体-配体融合靶向GPCR的一个先例中，配备SNAP标签的VHHGFP与GPCR mGluR239的光激活配体相连。然后利用这种融合在配体光激活后激活GFP标记的受体。光激活纳米抗体配体共轭物的饱和浓度诱导的响应约为天然配体饱和剂量诱导的响应的40%，并且需要受体GFP融合的应用。这种方法禁止使用未经基因修饰的细胞或动物。在另一实例中，产生在重链或轻链的N末端与胰高血糖素样肽1（GLP-1）的类似物融合的全长抗PCSK9抗体。然而，大多数受试融合蛋白的表达率较低，在GLP-1片段中通过失活截短进行分离，在溶液中不稳定，或在体内迅速降解。这表明在表达由全长抗体和相关配体组成的融合蛋白时遇到了困难。C-to-C融合策略优势1保留活性尽管开展了多次筛查活动，但截至目前，尚未发现直接激活GPCR的纳米抗体。作者制备了纳米抗体和合成PTH肽的C-to-C末端融合文库。C-to-C融合的使用得到了相应N-to-C融合缺乏活性的支持。PTH肽与纳米抗体N端的遗传融合将可能同时保留纳米抗体结合和PTH活性。VHH-PTH PTH结合物的激动剂活性完全取决于纳米抗体与靶向受体的结合：纳米抗体的特异性与受体结构之间的失配导致结合物活性的丧失。作者鉴定了一种结合物VHHPTHR-PTH（1-14），在基于细胞的分析中具有非常强的信号活性（表1），在小鼠中具有生物活性（图5），并且PTHR1对PTHR2的选择性远远超过临床上使用的原型PTHR1激动剂PTH（1-34）的选择性。2蛋白水解稳定性增强与纯基因方法相比，作者的合成策略的另一个好处是易于将非天然残基（如Aib）并入结合物的肽部分，以提高蛋白水解稳定性。3有助于剖析受体生物学功能，设计理想配体PTHR1介导PTH治疗骨质疏松症的生物活性，而将配体传递给特定受体亚型或含有抗体识别标签的受体的能力应允许创建（模块化）版本的设计受体，这些设计受体仅由设计药物（DEARDS）激活。先前描述的GPCR的DRADDS是通过修饰天然存在的GPCR的配体结合位点来识别的，因此修饰后的受体对设计的小分子而不是原型受体的配体作出反应。这些设计分子选择性地激活设计受体，但没有任何内源性表达的替代物。一种类似的方法已被用于产生白细胞介素-2的正交受体-配体对。作者发现VHHGFP-PTH（1-11）能激活PTHR1YFPΔECD（EC50～0.15 nM），但在野生型PTHR1中不起作用。这表明了使用纳米抗体标记识别作为将所选GPCR转化为DRADD的途径。GPCR药理学的一个方面是配体结合动力学。对于某些受体，如PTHR1，配体结合的持续时间和由此产生的信号可以决定诱发的生理反应类型。PTHR1激活引起的cAMP反应的持续时间与体内钙离子反应的强度和持续时间相关。此处测试的几种VHH-PTH缀合物诱导的cAMP信号相对于游离肽延长，类似于PTH（1-34），表明纳米抗体结合提供的亲和力可作为调节配体结合和信号动力学的独立手段。结论结果表明，将PTHR1激动剂肽与靶向预期受体的纳米抗体结合，可大幅提高激动剂效力和受体选择性。在不改变用于激活信号的激动剂结构的情况下调节受体亲和力的能力应该能够进一步剖析配体亲和力、受体信号动力学和配体偏倚之间的联系。经初步分析，纳米抗体配体缀合物可以设计为具有不同于天然配体的信号特性（表1）。钳制平台应能够靶向其他GPCR，尤其是那些具有通过双位点机制与其受体结合的大肽配体的GPCR，如B族GPCR和趋化因子受体。目前正在努力将该平台扩展到其他GPCR配体系统。随着对细胞表面新目标结合的纳米抗体的逐步发现，该平台的适用性将继续扩大。参考文献1. Cheloha, R. W., Fischer, F. A., Woodham, A. W., Daley, E., Suminski, N., Gardella, T. J., & Ploegh, H. L. (2020). Improved GPCR ligands from nanobody tethering. Nature communications, 11(1), 2087. https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41467-020-15884-8识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。