Cell Research｜西湖大学高晓飞团队开发红细胞载药平台用于治疗血栓性疾病

2023-09-23

临床研究

血栓性疾病的治疗一直是临床实践中的难点。据估计全世界每4例死亡中就有1例是由血栓栓塞性疾病造成。在血管内血栓形成的疾病中，动脉中的血栓会导致缺血性心脏病和缺血性卒中等，而静脉中血栓会引起深静脉血栓和肺栓塞等。当前在临床中针对血栓性疾病的标准治疗方案中包括多种纤溶酶原激活剂（plasminogen activators），例如尿激酶纤溶酶原激活剂（urokinase-type plasminogen activator, uPA）和组织纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogen activator, tPA）。uPA分泌时的形式为酶原（pro-urokinase, pro-uPA），在血栓形成的过程中经过蛋白酶水解后激活纤溶酶原形成纤溶酶。然而，当前的溶栓方案面临很多问题。例如，由于体内药物分布局限与半衰期短，现有基于tPA, pro-uPA的药物在治疗急性心梗中可以紧急使用，但是在治疗其他血栓疾病，例如深静脉血栓时效果并不理想。其次，治疗的窗口期较短，需要在短时间内进行大量的注射给药，可能产生严重的副反应；最后，这些药物对新生血栓和陈旧血栓没有选择性，可能会增加出血风险。因此开发新的药物递送系统是改进血栓性疾病治疗方案的要点。红细胞是人体中数量最多的细胞，并且具有多种独特的生理特性，包括无细胞核，良好的组织相容性，较高的表面积-体积比和120天的循环寿命等，这些生理特性都使得红细胞可以作为一种理想的载体，用于开发体内药物递送系统。并且红细胞在血管中循环，是新生血栓的重要组成成分，因此采用红细胞作为药物递送载体治疗血栓具有天然的优势。北京时间2023年9月4日，西湖大学生命科学学院高晓飞团队在Cell Research上在线发表题为"Development of a highly-efficient erythrocyte-drug covalent conjugation platform and its use in treating thrombotic disorders"的研究论文。该团队开发了红细胞载药平台，实现在红细胞表面高效稳定偶联小分子和蛋白。这项研究应用了改造过的红细胞平台，并在红细胞表面搭载了pro-uPA以治疗血栓性疾病。体外和体内的溶栓试验结果表明，与单纯的pro-uPA蛋白相比，偶联在红细胞表面的pro-uPA更安全，并且其短期和长期溶栓药效都具有显著优势。这项研究验证了红细胞载药的优越性，为血栓性疾病的临床治疗提供了新方向。分选酶（Sortase）是一种来自于细菌并能够对蛋白质进行位点特异性共价修饰的转肽酶。来自于金黄色葡萄球菌的野生型Sortase A（wt SrtA）可以识别底物结构中的LPXTG基序，切割苏氨酸和甘氨酸残基之间的肽键形成一个共价的酰基-酶中间体，这个中间体被细胞表面的亲核的N端3×甘氨酸残基分解后，在细胞和底物之间形成肽键。然而，由于红细胞缺少N端携带3×甘氨酸序列的膜蛋白，wt SrtA在红细胞工程化上的应用受到极大限制。因此，对底物基序要求相对宽松的变体Sortase A（mg SrtA）得到了研究者的关注。mg SrtA可以识别N端带有1个甘氨酸的多肽，实现底物和红细胞表面的共价连接。实验结果表明，相对于识别3×甘氨酸的wt SrtA，mg SrtA可以大幅提高将生物素偶联到红细胞表面的效率。在接下来的将蛋白质偶联到红细胞表面的实验过程中，研究者发现，由于转肽反应的可逆性，mg SrtA催化蛋白质的连接效果较低。为了解决这个问题，研究者在LPETG基序中的苏氨酸和甘氨酸之间引入了一个酯连接的2-羟基乙酸进行修饰，成功降低了mg SrtA催化的转肽反应的可逆反应。一系列实验结果证实，引入2-羟基乙酸修饰的连接体可以显著增加小分子与蛋白偶联到红细胞表面的效率。与此同时，长达4周的体内稳定性的检测试验的结果表明，偶联小分子（biotin）或绿色荧光蛋白质的红细胞在小鼠体内的生存期与未改造的天然红细胞基本一致，这表明本团队开发的红细胞工程化方法高效并且稳定。图1a-b. 工程化红细胞搭载药物方案利用该新型红细胞工程化方法，研究者对搭载pro-uPA的红细胞溶栓能力展开研究。由于目前溶栓药物缺乏对新旧血栓的选择性，临床上会造成对保护性血栓的溶解并可能造成致命性出血。可以预期，将药物固定在红细胞表面后，pro-uPA分子无法进入致密的固有血栓内部，可以确保药物不会溶解固有的保护性血栓并降低不可控的出血风险。本团队首先利用改进的工程化红细胞方法，在每个红细胞表面搭载了超过3万个拷贝的pro-uPA。研究结果表明，在相同剂量条件下，游离的pro-uPA可以完全溶解新旧血栓，而pro-uPA-RBCs只溶解新生血栓，对保护性的陈旧血栓溶解效果较差，从而起到保护作用。同时，对比pro-uPA在体内极短的半衰期，pro-uPA-RBCs在回输入小鼠后24天，细胞表面依然能够检测到pro-uPA-RBCs蛋白信号。这表明红细胞极大延长了药物的血管内存留时间。据此，研究者预期搭载pro-uPA的红细胞可被用于初次血栓发生以后的长期治疗，用于预防严重的血栓复发以及并发症。图h-j,l. 红细胞搭载pro-uPA的溶栓功能随后，本研究评估了pro-uPA-RBCs在体内条件下预防内源性血栓形成的功能。在电损伤血栓形成大鼠模型和氯化铁诱导静脉血栓形成小鼠模型中，pro-uPA-RBCs组预防内皮损伤诱导的血管内血栓的效果均显著优于pro-uPA组。另外在大鼠肺栓塞的模型中，可以观察到pro-uPA-RBCs具有溶解肺间质中的微血栓的作用，而pro-uPA无明显助益。这些结果表明，将药物搭载在红细胞表面可有效地延长药物在体内的分布以及延长药物的作用时间，pro-uPA-RBCs可以进一步开发作为预防和治疗肺栓塞的疗法。图1n. 血栓性疾病动物模型中pro-uPA-RBCs的治疗效果本研究开发了稳定高效的工程化红细胞平台，实现在红细胞表面搭载溶栓药物，提出了血栓性疾病治疗的新方案，同时这个方法有望推广应用于多种疾病的治疗。原文链接：https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41422-023-00868-2