“内卷”下的单抗发现王者：噬菌体展示技术

2023-01-14

微生物疗法

在过去几十年中，单抗在癌症治疗、自身免疫病等疾病治疗中得到了广泛应用。临床使用的单抗超过25种，其中七种是通过噬菌体展示技术分离出来的。即使“杂交瘤技术”、“转基因、重组DNA”技术珠玉在前，但噬菌体展示技术仍逆流而上，在经典技术“百花齐放”的“内卷”斗争中脱颖而出，必有其独特之处。有对比才有差距，在走近噬菌体展示技术前，首先要理性分析各大抗体分离技术。本文主要介绍以下四大板块内容，聚焦于噬菌体展示技术在单克隆发现中的优势。单抗发现技术回顾.Mab isolation噬菌体展示技术优势. Phage Display Advantages三种噬菌体展示文库.Phage display library筛选注意事项.seclection01.Classic technology经典技术回顾杂交瘤技术杂交瘤技术是抗体发现绝对的“昨日之星”，早在上世纪七十年代就已出现。杂交瘤技术是将骨髓瘤细胞与免疫动物的脾细胞相结合，从而得到既能产生抗体又能无限增殖的杂交瘤细胞的技术。使用杂交瘤技术分离抗体时，会在宿主体内会经历一个体细胞超突变和亲和力成熟的自然过程，所以通过这种技术分离的双价全长抗体具有高亲和力结合潜力。但是由于杂交瘤技术生产的单抗来自小鼠杂交瘤，单抗的免疫原性往往较强。同时需要用靶点免疫宿主，这从伦理角度讲，在人类身上是行不通的。由此促进了人源化技术的产生。重组DNA技术和人源化上世纪八十年代，用于生产含有人类恒定区和小鼠可变区基因的嵌合抗体的重组DNA技术出现，这种技术很大程度上降低了HAMA（人抗鼠抗体）反应出现的风险。为了进一步降低针对嵌合抗体中靶向小鼠可变区基因的抗独特型抗体产生的风险，将鼠源互补决定区(CDR)嫁接到人可变区(人源化)来进行抗体人源化，人源化可以有效降低ADA反应发生的风险。此外，鼠源单抗与人Fc受体的结合力较差，而这种结合主要和抗体的间接保护机制有关，如ADCC、CDC作用。从鼠源到人源(小鼠-嵌合-人源化-全人源），单抗的免疫原性逐渐降低，半衰期逐渐增加。鼠源单抗的半衰期较短是因为它们对(FcRN)的亲和力较差，因此这些免疫球蛋白分子的循环能力较差。转基因动物在过去的十年里，转基因技术同样得到了很大的发展，这些转基因动物携带基因导入的人免疫球蛋白基因座，他们自己的抗体基因则被敲除。这种动物在免疫后，由人类生殖系抗体基因序列产生抗体，因此经免疫的转基因动物是发展杂交瘤技术和构建免疫噬菌体文库的潜在来源。B细胞分离技术B细胞分离技术是单抗开发的另一种先进技术，通过这种技术开发了许多单抗。但B细胞分离技术需要高端仪器和专业知识（比如流式细胞仪、NGS测序等），这限制了该技术的普及。而展示技术如噬菌体展示技术、核糖体展示技术和酵母展示技术是其他分离单抗的技术，这些技术最大的优势在于不需要高端仪器，在普通的实验室中就可完成，这对中小型企业非常友好。噬菌体展示技术表1 FDA批准的利用噬菌体展示技术分离的抗体噬菌体展示技术是一种快速、低成本、高通量的多肽抗原筛选方法。该技术是将外源多肽或蛋白质DNA插入到噬菌体外壳蛋白的结构基因的适当位置上，外壳蛋白表达后，能直接在噬菌体表面表达出来，从而直接将基因型和表现型联系起来。该技术可以针对所有靶点开展筛选，包括免疫原性较弱的靶点。表2总结了各种抗体分离方法的优点和局限性；在下一节中还详细描述了使用噬菌体展示文库相对于其他方法的优点。表2 抗体分离方法的优点和局限性02.phage display technology聚焦优势：噬菌体展示技术噬菌体展示文库在1985年由乔治史密斯首次引入，于1990年在重组蛋白生产中应用。从那时起噬菌体展示技术在全世界范围内都得到了广泛应用。直接联系基因型和表现型噬菌体展示技术可以从一个文库中鉴定出许多抗体，并在原核表达系统中进一步表达和生产。噬菌体展示技术最大的优势在于能将单个噬菌体的抗体基因型和表现型联系起来。噬菌体性质稳定由于噬菌体高度稳定，能耐高温、pH环境、变性剂、紫外线照射等极端条件以及非水溶液、蛋白水解酶等试剂。这些性质允许利用噬菌体展示技术分离稳定的各种类型的抗体，因此，在噬菌体展示技术中，可以通过设置不同的定制条件，更好的控制抗体生产进程。比如抗原的完整性，这为其预先设定抗体的生化、物理特性提供可能。识别免疫原性较弱的靶点无论靶点免疫原性如何，都可以识别靶抗原的结合物。这是其它任何单抗分离技术难以做到的。噬菌体展示技术同时可以用来发现构象差异微小的抗体。比如用来发现靶向马尔堡病毒的纳米抗体。可以用噬菌体展示文库配合蛋白质组学技术来鉴定细胞特异性蛋白质标记物。克服免疫耐受机制许多生物体内都会发生翻译后修饰，以独立于蛋白质序列的方式识别翻译后修饰进程会面临一些困难。大多数翻译后修饰进程在本质上是不具免疫原性的，而且由于翻译后修饰的先天免疫耐受机制，通过免疫分离抗体是非常困难的。天然噬菌体展示抗体库能通过对特异性翻译后修饰抗体的体外筛选进程来克服其内在的免疫耐受机制。目前在生产抗半抗原抗体方面已经取得了一定的进展，半抗原是只有在连接到蛋白质等载体上才会引起免疫反应的分子。通常，可以用结合单个半抗原分子上的不同载体蛋白来免疫动物，以消除针对载体蛋白表位的抗体。更好调控抗体库基因噬菌体展示技术让设计和调控抗体库基因成为可能。这是其他任何技术望尘莫及的。大肠杆菌表达系统是噬菌体展示技术常配合使用的表达系统，这种表达系统兼具经济和扩展性好的优势。此外，类似于淋巴细胞内质网的环境，细菌的周质间隙为VH和VL的配对提供了有利的条件，能产生全长抗体。这项技术同时被用来从稳定性差和生长缓慢的杂交瘤技术中复原抗体基因。03.Antibody formats重组抗体片段近年来重组抗体发展如火如荼，从噬菌体抗体库中筛选得到的scFv或Fab可以直接应用，也可以根据不同的应用，被设计改造为其他形式（图1）。图1 不同抗体形式的示意图，即scFv、Fab、Diabody、F(Ab)2、Ig G、Bi-s pc抗体、scFv-Fc和单域抗体表3 不同抗体片段大小scFv和Fab是噬菌体展示文库中最常见的两种抗体形式。scFv仅包含VH和VL区，因而体积较小，约为25-27Kda。而Fab含有VH, VL, CL和CH1 区，体积大约在50Kda左右。当Fab转化为scFv时可能会出现亲和力损失。Fab形式的主要缺点在于表达的产率较低，相比之下scFv在展示时稳定性更强。单域抗体也是噬菌体展示文库中常见的抗体形式，主要有人源单链抗体、驼源纳米抗体（VHH）、鲨鱼纳米抗体（VNAR）。在VHH中，控制VH和VL配对的界面被疏水性更强的残基替代。因此水溶性增加，形成聚集体的倾向也会降低。VHH中的互补决定区3（CDR3区）环比常规抗体更长，这有利于VHH到达常规抗体难以达到的表位。需要注意的是VHH和VNAR的Fr2-CDR2区缺失，他们只具有两个CDR环。最终的应用目的决定选择的抗体形式，如果是治疗性应用，则需具有较长的半衰期和效应细胞，scFv和Fab因为能更容易地与IgG匹配，是更适合的形式，而作为诊断试剂或考虑大规模生产的成本问题时，VHH更适用。04.phage display library噬菌体展示抗体库目前主要有三种噬菌体展示抗体库，i.免疫库 ii.天然库 iii.合成库，这些文库按照抗体基因序列(IgM或IgG)来源进行分类免疫库免疫库由mRNA和IgG基因组成，这些免疫文库富含某些靶点的抗原特异性抗体。可以从同一免疫库中分离出大量针对不同表位的特异性抗体。创建免疫库需要用相关抗原进行免疫，所以抗原必须具备免疫原性。创建针对人类抗原的免疫库通常需要使用同源物种，而出于治疗目的，这种异源抗体必须进行人源化。而人源化又会影响抗体效力，可以通过免疫人类免疫球蛋白转基因动物来构建全人源抗原库。建库方案一通过感染患者、感染恢复者或由外周血单核细胞(PBMC)为起点来构建免疫库（图2）。免疫库的一大优点在于能直接分离出亲合力较高的抗体，这些抗体能直接用于治疗。杨晓明研究员以新冠康复者PBMC为起点，建立了免疫文库，成功筛选出来对新冠病毒具有中和活性的单抗。图2 构建免疫噬菌体展示文库途径建库方案二另一种构建免疫库的方式是通过免疫动物进行。在获得良好的二次免疫应答后，就可获得良好的IgG滴度。这一文库以动物的PBMC为起点构建。由此生产的抗体可以直接用于治疗或进行人源化。美国德克萨斯州生物医学研究所在抗埃博拉病毒抗体的筛选的研究中取得进展，先用用埃博拉重组 NP 蛋白免疫羊驼，再利用噬菌体展示技术构建纳米抗体库，成功筛选出靶向 NP 的抗体。但免疫人类会带来伦理问题，可通过免疫转基因动物来解决这一问题。由此产生的B细胞分泌的抗体与人类相似，这些B细胞的mRNA可直接用于构建免疫文库。而得到的免疫文库主要优点是产生的抗体质量和亲和力都非常高。可在体外以免疫噬菌体文库的形式复现体内免疫应答。这些噬菌体文库可用于发现针对免疫原性较弱靶点的抗体。而免疫库的主要缺点在于需要免疫，但诱发的免疫反应难以预测，甚至可能会对动物造成毒副作用。天然库天然库是由未免疫者的PBMC、脾和骨髓B细胞的IgM/mRNA构建得到的（图3），大小通常在107 到 1010之间。图3：构建天然噬菌体展示文库途径病毒会不断变异，而为每一种新出现的病毒构建一个免疫库是不现实的。天然库可对所有靶点开展筛选，且无需免疫，较免疫库开发更为简便。但由于天然库中的抗体是由没有经历亲合力成熟过程的幼稚B细胞产生的，来源于天然库的抗体亲和力一般比较低，但能通过后期修饰来提高亲和力和稳定性。从天然库中分离得到的抗体与人抗体胚系基因非常相似，并经历了体内抗体的选择过程，因此免疫原性较低。目前，人们为了分离单抗已经建立了大量的天然库。噬菌体展示抗体库的多样性对分离所需高质量抗体至关重要，库容大小与多样性通常呈正相关。成都仁域生物专注噬菌体展示技术和天然库构建，通过四次采血，目前已建成万亿级全人源库（1012）。库容大，免疫原性低，结合噬菌体展示技术最快只需一周就可筛选到针对特定靶点的治疗性抗体，目前仁域生物筛选的靶点包括B7-H3、CD3、CD8A等靶点，均获得了亲和力理想的抗体。图4 采集优质PBMC合成库与半合成库天然库和免疫库是从天然人源B细胞库中产生的(IgM或IgG)，而合成库或半合成库分别由合成序列和合成序列及天然序列混合物组成，抗体识别抗原的特异性主要基于抗体链基因中的CDR区。在所有CDR中，CDR-H3组成(1023)和长度(6-24个氨基酸)更加多样，它在抗原结合和识别中起着重要作用。在合成库中，随机的CDR区被插入到完全合成的序列中，而在半合成库中，随机化数量非常有限，通常局限于重链的CDR3区内。05.Selection关于噬菌体筛选图5：根据抗原类型和未来的预期用途选择最合适的筛选方案噬菌体展示技术的关键步骤是确定抗原展示的最佳途径。在细胞表面直接或间接固定抗原是最常用的抗原呈递方式。直接固定时，通过被动吸附直接在表面包被抗原，这是迄今为止最简单的抗原呈递方法。但这种方法并不适用于在吸附后天然构象会改变的抗原，尤其不适用于缺乏足够分子间引力的小分子抗原。对于这些抗原，可以使用间接固定法。在使用间接固定法时，可以用捕获分子将抗原捕获到表面上，目前最通用的方法是利用链霉素和亲和素之间的强结合力，这能让抗原稳定的附着在表面上。因为抗原来自细胞表面，最可能通过间接固定保持其天然构象，但要注意不要过度生物素化抗原，否则可能会掩蔽重要的表位或造成抗原聚集。但间接固定法在展示膜蛋白时并不理想。膜蛋白天然构象很难保持，为了保持膜蛋白构象，可以将整个细胞作为抗原来进行抗体文库筛选。但细胞表面包含大量的受体、蛋白质，容易对过表达抗原的细胞筛选形成干扰。改善筛选效果的思路主要有二：i.降低背景信号的干扰ii.提高选择的灵敏度和特异性基于细胞膜蛋白的筛选方法获得具有细胞结合活性的概率更高，以仁域生物筛选案例为例：图6 固相筛选抗体的FACS检测图7 细胞筛选抗体的FACS检测由结果可以看出基于细胞筛选得到的具有细胞活性的抗体概率更高。更多内容可参考：结语Challenges噬菌体展示技术面临挑战噬菌体展示抗体库的主要缺点在于筛选效率不及基于细胞的筛选，而另一个局限性在于难以保存抗体的天然配对，因为在抗体库中，重链可变区和轻链可变区基因会通过(PCR)随机重组，因此抗体自然结合是非常罕见的。但通过使用不同的方法，如测序(NGS)来克服这一局限性。通过使用NGS和数字筛选，已经识别出具有独特插入广谱的中和抗体变体。细胞表面抗原通常很难筛选，但噬菌体展示技术为筛选这些表面抗原提供了独特的机会。无论如何，噬菌体展示技术是单抗发现领域当之无愧的“王者”，善加利用，势必能够进一步促进单抗的研发。参考文献：1. Ledsgaard, L., Ljungars, A., Rimbault, C., Sørensen, C. V., Tulika, T., Wade, J., Wouters, Y., McCafferty, J., & Laustsen, A. H. (2022). Advances in antibody phage display technology. Drug discovery today, 27(8), 2151–2169. https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.drudis.2022.05.0022. Kumar, R., Parray, H. A., Shrivastava, T., Sinha, S., & Luthra, K. (2019). Phage display antibody libraries: A robust approach for generation of recombinant human monoclonal antibodies. International journal of biological macromolecules, 135, 907–918. https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.ijbiomac.2019.06.006识别微信二维码，添加生物制品圈小编，预约2023年直播分享！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。