加速和强化腺病毒载体疫苗生产，实现快速疫情应对

2024-01-10

疫苗信使RNA临床研究

本文节选自来自牛津大学等的研究人员发表的文章“Accelerated and intensified manufacturing of an adenovirus-vectored vaccine to enable rapid outbreak response”，详细内容，请参考原文。流行病防范创新联盟的“100天登月计划”希望在病原体鉴定后的100天内推出新疫苗，然后在“第二个百天内”大规模提供疫苗。这里，我们将介绍通过最小化临床试验和首次大规模供应之间的时间以及最大化可用生产设施的产出来优化腺病毒载体生产，以实现快速响应的工作。我们将介绍一种快速病毒种子扩增工作流程，允许在抗原序列鉴定后 60 天内将疫苗提供给临床试验，然后在接下来的 40 天内从分布在全球的站点提供疫苗。我们还将介绍一种基于灌流的上游生产工艺，旨在最大限度地提高产量，同时保持现有生产设施的简单性和适用性。这将 ChAdOx1 nCoV-19 的上游单位体积生产率提高了约四倍，并与现有的下游工艺保持兼容，每升生物反应器体积产生足以制备 10,000 剂药物的药物底物。这种加速的生产过程以及热稳定性等其它优势支持腺病毒载体疫苗作为快速适应且可部署的应急响应平台的持续价值。在病原体鉴定后 100 天内推出新疫苗已成为全球疫苗研发的关键目标，流行病防范创新和大流行防范伙伴关系联盟（CEPI，2021）已将其列为核心目标。实现这一目标需要具有已知安全性、免疫原性和生产特性的疫苗平台技术，例如信使 RNA (mRNA) 和腺病毒载体。腺病毒载体疫苗的优点包括适合冷藏、强大的免疫原性（包括单剂接种）以及易于使用的生产技术。这些功能使该平台对低收入和中等收入国家特别有吸引力。2021 年至 2022 年供应了超过 30 亿剂“牛津/阿斯利康”腺病毒载体 COVID-19 疫苗 ChAdOx1 nCoV-19（AZD1222、Vaxzevria）。该产品已在全球 177 个国家使用，预计在 2021 年挽救了约 600 万人的生命，比任何其它 COVID-19 疫苗都多。这是通过将平台生产流程快速转移到多个生产设施来实现的，从而使生产分布在五大洲的 12 个国家。尽管取得了这一成功，但与其它疫苗平台（包括 mRNA）相比，生产速度仍然是腺病毒载体的一个明显限制。这里，我们将介绍寻求优化疫苗平台技术对新兴病原体和变异株紧急响应的适用性的三个衡量标准的工作：从病原体序列识别到提供疫苗进行临床试验的时间，到首次大规模产品放行的时间，以及放行 10 亿剂疫苗的时间。腺病毒生产“启动”所需的两项活动是宿主细胞的扩增和感染这些细胞的病毒种子的产生（假设设施、设备、人员和材料已经到位）。这些活动可以并行进行，而后者速度较慢，使得符合良好生产规范 (GMP) 的病毒种子制备成为启动试验规模和大规模生产的限制因素。病毒种子的制备需要合成编码抗原的DNA，将该转基因插入到腺病毒基因组构建体中，将基因组构建体转染到生产细胞中以“拯救”病毒，有限稀释以分离克隆病毒，并进行连续扩增。GMP 要求在种子生产过程中的多个点进行耗时的质量控制测定，但根据我们的经验，对于最耗时的测定（外来微生物的检测和遗传稳定性的确认），失败的可能性很低。因此，只要在疫苗放行之前获得所有必需的结果，就可以在获得检测结果之前“冒着财务风险”进行后续步骤，从而缩短种子制备时间。生产启动后，产能的提升受到生产过程的批次生产率和设施循环时间（批次之间的间隔）的限制。这些因素决定了每月每升生物反应器体积或每平方米设施占地面积可以生产的剂量数量。ChAdOx1 nCoV-19 的全球供应采用了基于我们在 COVID-19 大流行之前开发的方法构建的工艺流程，以便能够快速应对新出现的病原体爆发。这是专门设计的，旨在快速、直接地用于在任何合适的设施（包括低收入和中等收入国家的设施）生产任何腺病毒载体疫苗。使用符合 GMP 要求的悬浮 T-REx-293 细胞库 (ThermoFisher) 能够在生产过程中抑制转基因表达，从而克服了转基因产品损害病毒生长的潜在问题。整个生产过程仅使用一次性、现成的组件，包括上游补料分批搅拌罐生物反应器工艺和下游切向流过滤 (TFF) 以及基于膜的阴离子交换层析工艺。商业 ChAdOx1 nCoV-19 生产工艺的单位体积生产率约为每毫升生物反应器培养物 1.5 × 10^11 个药物底物 (DS) 病毒颗粒 (VP)，或约 2,000 最终剂量/L。生产最终剂量 5 × 10^10 VP 需要上游生产约 1.5 × 10^11 VP，因为 DS 纯化过程（约 50% 损失）、灌装/完成以及从小瓶中提取（另外约33% DS）时会发生损失，但提高这些阶段效率的空间相对较小。因此，产量的大幅提高需要上游单位体积生产率的提高。单位体积生产率 (VP/mL) 是病毒载体在生产细胞系中复制期间的活细胞密度 (cell/mL) 乘以单位细胞生产率 (VP/cell)（即，单位体积生产率 = 活细胞密度 × 单位细胞生产率）。“细胞密度效应”是限制腺病毒载体单位体积生产率的主要因素。在搅拌罐生物反应器中，未感染的生产细胞系的补料分批生长中，可以轻松实现高于 10^7 cells/mL 的细胞密度。不幸的是，腺病毒载体的单位细胞生产率在中等细胞密度下急剧下降，感染时高于约 1–2 × 10^6 cells/mL（对应于感染后稍高的峰值活细胞密度）。因此，将细胞密度增加到超过这个适度水平并不能提高腺病毒载体的单位体积生产率。除了对单位体积生产率的影响之外，高单位细胞生产率还有一个重要的额外好处，即活性产物与细胞源性杂质的高比例有利于下游工艺处理。在我们大规模补料分批 ChAdOx1 nCoV-19 生产过程中，我们观察到单位细胞生产率约为 3–5 × 10^4 VP/cell，峰值活细胞密度在 4–6 × 10^6 cells/mL。该单位细胞生产率值与之前发表的 ChAdOx1 以及猿猴腺病毒载体和人类腺病毒载体的结果一致。细胞、抗原抑制、载体工程、培养基和补料的组合使得这种单位细胞生产率能够维持在比之前报道的稍高的细胞密度，从而提高单位体积生产率。尽管如此，克服细胞密度效应仍然是提高 ChAdOx1 nCoV-19 产量的核心挑战。细胞密度效应的生理学基础尚不完全清楚，但细胞废物对病毒复制的抑制作用可能是一个因素。腺病毒载体的生产基本上是一个批次过程，因为单个病毒复制周期会在 24-72 小时的时间内裂解生产细胞。这与单克隆抗体等其它生物产品的生产形成鲜明对比，在单克隆抗体中，组成型表达能够实现连续工艺。尽管病毒复制迅速增加细胞能量需求，但补充葡萄糖、维生素、氨基酸或核苷酸的营养物质不会将感染时的细胞密度效应屏障提高到超过约 1–2 × 10^6 cells/mL。单位细胞生产率会受到代谢废物的损害，例如氨（来自谷氨酰胺代谢）和乳酸（来自无氧葡萄糖代谢）。在腺病毒载体在生产细胞中复制之前或期间通过离心或TFF进行培养基置换既可以补充营养物又可以去除废物。交替式切向流过滤 (ATF) 和磁悬浮泵头系统可以通过低剪切力实现这一目标，这是脆弱的病毒感染生产细胞的一个重要考虑因素。与营养补充相反，据报道，在使用 B、C 和 D 种人类腺病毒载体的工艺中，通过灌流进行培养基置换可有效提高细胞密度效应屏障。然而，与补料分批工艺相比，灌流需要额外的设备以及使用和处理大量的额外培养基。一些人认为这是一项复杂的操作，一些生产工厂可能会发现这种技术难以实施。在这里，我们证明使用 ATF 进行培养基置换可以提高 ChAdOx1 nCov-19 生产的细胞密度效应屏障。使用最简单的灌流条件，我们证明，将感染时活细胞密度 (VCDI) 增加到 6 × 10^6 cells/mL 可将单位体积生产率提高约四倍，而不会损失单位细胞生产率。这里，我们还将提供快速生产工作病毒种子的工作流程，以支持我们在全球范围内的新工艺流程，从而能够在病原体序列鉴定后 100 天内大规模放行疫苗。从历史上看，与其它一些基于病毒的疫苗的生产相比，大多数腺病毒生产方法涉及“单次打击”感染所有生产细胞，感染复数 (MOI) 高于 1 感染单位 (IU)/cell，随后在单个病毒生命周期后，大约 2-3 天后收获。我们之前的工作在整个种子扩增过程中使用了这种“高 MOI”单生命周期工艺。经过有限稀释以分离克隆病毒后，我们通常使用贴壁细胞在 pre-GMP实验室中执行大约四个扩增步骤。在每个阶段，通过冻融介导的细胞裂解来回收病毒，并测量裂解物中的感染滴度，以确定用于后续步骤的 MOI。每个阶段通常允许较大的“安全系数”（即，扩大培养规模以允许产出不佳的可能性）。GMP 主病毒种子 (MVS) 和工作病毒种子的生产过程类似，但在搅拌罐生物反应器中并使用更有效的、基于去污剂的裂解策略。使用这种方法生产足够的工作病毒种子来满足全球工作的需求将是一项挑战，其中在生产过程中 MOI 高于 1 IU/cell。这是推动用于 ChAdOx1 nCoV-19 商业化生产的“双病毒生命周期”工艺开发的因素之一。使用远低于 1 IU/cell的 MOI，再加上延长的感染后培养期 5-6 天，可以在生产生物反应器内进行额外的病毒扩增周期，并大大减少对工作病毒种子输入的要求。据我们所知（也许令人惊讶的是，考虑到其它病毒已使用类似的方法）这种方法以前从未在腺病毒领域使用过。总而言之，我们之前使用高 MOI 工艺进行种子制备，使用低 MOI 工艺进行药物底物生产。这里，我们转变了上述方法，推断通过两个循环/低 MOI 培养实现的高病毒“扩增因子”对于以最少的扩增步骤制备病毒种子来说是理想的，因此降低了阶段之间的检测负担。通过促进比以前更大量的工作病毒种子的制备，这种新方法还可以实现高 MOI 生产过程。高 MOI 药物底物生产最大限度地减少了生产生物反应器中的时间，并且通过同步感染，可以提高产物一致性（避免因细胞感染和死亡时间的异质性而引起的复杂性，例如细胞碎片的积累和灌流滤液中产物的潜在损失）。原文：C.C.D.Joe, R.R.Segireddy, C.Oliveira, et al., Accelerated and intensified manufacturing of an adenovirus-vectored vaccine to enable rapid outbreak response. Biotechnology and Bioengineering, 2023.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。