靶向SERT-nNOS互作的抗抑郁药设计

2022-11-14

基因疗法核酸药物

重度抑郁障碍（Major Depressive Disorder, MDD）是一种常见的精神疾病，严重影响患者的正常生活。抑郁症的发病机制尚未完全阐明，目前主流观点是“单胺假说”,即抑郁由5-羟色胺（5-HT）为主的神经递质缺失致使单胺能神经元活动不足而引起。传统抗抑郁药物也是基于该假说而开发的。以异丙嗪为代表的单胺氧化酶抑制剂是第一代抗抑郁药物，因其肝脏毒性较强已退市。1956年第二代抗抑郁药物丙米嗪被发现可以靶向单胺类递质再摄取转运子，如5-HT转运体（serotonin transporter, SERT）、去甲肾上腺素转运体（Norepinephrine transporter,NET）。但该类非选择性单胺再摄取抑制剂有很多副作用。1987年，美国礼来公司开发的第三代抗抑郁药物选择性SERT抑制剂氟西汀 SERT抑制剂氟西汀重磅上市，但氟西汀可以作用到外周SERT，对心血管系统，消化系统起到抑制效果，并且其起效慢，服用早期甚至加剧抑郁行为，诱发自杀等极端行为，存在广泛副作用。因此，寻找新的抗抑郁靶点并设计快速抗抑郁药物具有重大意义。中缝背核（Dorsal Raphe Nucleus，DRN）是中枢神经系统中最主要的5-HT神经元核团，也是5-HT的主要来源。抑郁患者服用氟西汀这类SERT抑制剂时，5-HT浓度确实可以升高，但主要激活突触前神经的5-HT1A自受体（5-HT1ARauto），DRN中5-HT1A自受体过度活跃会强烈抑制5-HT的重合成，降低5羟色胺能神经元放电频率，加剧抑郁样行为。SERT可以通过其C末端基序与DRN中的神经元型一氧化氮合酶（Neuronal Nitric Oxide Synthase，nNOS）的PDZ蛋白结构域结合。南京医科大学周其冈等研究团队发现，在小鼠的DRN中观察到nNOS和SERT高度共定位，该复合物在海马区（HPC）、前额皮层（PFC）等脑区却没有富集，透射电镜结果显示HPC、PFC中5-HT能神经元突触前部分缺乏nNOS，表明nNOS-SERT复合物在DRN中高度特异性表达。在抑郁症模型(Chronic mild stress,CMS)小鼠中，nNOS表达和活性与正常小鼠无明显区别，但nNOS-SERT复合物是富集的，提示该复合物与抑郁的联系。他们选择性敲除了DRN的5-HT能神经元中的nNOS，发现细胞膜表面的SERT显著增加。通过悬尾实验（Tail suspension test, TST）、强迫游泳实验 (Forced Swimming Test,FST)、旷场实验(open field test,OFT)发现nNOS敲除鼠表现出抗抑郁样行为。进一步，他们从自建文库中筛选出能够增强nNOS-SERT互作的Sakura-6和Sakura-8，分子对接提示Sakura-6可能作为nNOS的PDZ结构域和SERT的C末端之间相互作用的增强子，诱导了小鼠的抑郁样行为。通过突变nNOS底物催化位点使其丧失催化酶活性，发现并不影响nNOS-SERT复合物的形成，nNOS突变体过表达小鼠也会表现出抑郁样行为，说明nNOS 对 SERT 的抑制作用不依赖于nNOS的催化活性。因此，破坏nNOS的PDZ和SERT的C端互作或许就可以对抑郁产生治疗效果。SERT的15个C-末端氨基酸（SERT-15C，TPTEIPCGDIRMNAV）介导了其与nNOS的相互作用，于是他们截取了SERT-15C，并在其N端融合穿膜肽Tat，合成了名为Tat-SERT-15C的肽。Tat-SERT-15C给药2小时后细胞表面的 SERT 显著增加，且剂量依赖性地减少nNOS-SERT复合物，DRN 中细胞间5-HT 浓度显著降低，并产生类似抗抑郁药的作用。5-HT1AR 的选择性激动剂8-OH-DPAT 显著阻断 Tat-SERT-15C 诱导的抗抑郁样作用，5-HT1AR拮抗剂Way-100635使5-HT1A自受体失活诱发抗抑郁样作用，表明 SERT-nNOS 相互作用最终通过 DRN 的5-HT1A自受体来调节抑郁。接着他们检测了Tat-SERT-15C对DRN中5-羟色胺能神经元放电活性的影响，利用光遗传技术记录DRN中5-HT能神经元电生理活动，Tat-SERT-15C给药2h后提升了5-HT能神经元的放电频率。作者利用DREADDs技术（designer receptors exclusively activated by designer drugs，只由特定药物激活的受体）沉默了5-HT能神经元，这抵消了Tat-SERT-15C治疗的小鼠所表现出的抗抑郁样行为。说明了Tat-SERT-15C 对抗抑郁行为的影响依赖于5-HT能神经元的放电活性。他们还发现与氟西汀不同的是，Tat-SERT-15C减少了DRN中5-HT浓度，但增加vHPC和mPFC中5-HT浓度，逆转了 CMS 小鼠的5-HT自受体激活和5-HT能神经元放电活性削弱。并且Tat-SERT-15C仅在DRN中发挥作用，且不影响其他神经递质如去甲肾上腺素、多巴胺。证明了特异性阻断nNOS-SERT相互作用以治疗抑郁症具有独特机制、更高的安全性和可行性。最后，他们尝试设计新型nNOS-SERT互作抑制剂。在分析SERT的C末端结合nNOS的PDZ结构域的化学机制后，设计合成了一系列二肽分子，筛选出ZZL-7作为先导化合物，Ac-Ala-Val-OH 的化学结构可以紧密结合在 nNOS PDZ 结构域的αB螺旋和βB折叠之间的沟槽中。对ZZL-7进行了体内和体外的药效评价，ZZL-7降低了nNOS-SERT复合物水平，并且给药2h后5-HT能神经元放电频率显著增加，具有快速抗抑郁样行为的良好效果。此外，ZZL-7药效至少可以持续24h，具有良好透膜性，易通过血脑屏障，对小鼠正常活动、记忆、认知能力无明显影响，也不会诱发小鼠攻击性行为、成瘾行为和异常脑电波。上述结果表明ZZL-7具有被开发成为新一代快速起效的抗抑郁药物的潜力。参考文献1. Sun, Nan et al. “Design of fast-onset antidepressant by dissociating SERT from nNOS in the DRN.” Science vol. 378,6618 (2022): 390-398.2. Chanrion, B et al. “Physical interaction between the serotonin transporter and neuronal nitric oxide synthase underlies reciprocal modulation of their activity.” PNAS vol. 104,19 (2007): 8119-24.