兔抗新型冠状病毒血清制备中佐剂对抗体效价的影响

2023-08-21

疫苗临床3期临床结果

中文摘要目的制备高效价兔抗新型冠状病毒血清并研究佐剂对抗体效价的影响。方法将9只新西兰兔随机分为a、b、c组，分别皮下注射新型冠状病毒混合弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂或单磷酰脂A佐剂进行免疫，0、28、42 d各免疫1次。每次免疫前及初次免疫后14 d于耳中央动脉采血，初次免疫后49 d经颈动脉采血，分离血清，进行中和抗体效价检测以及中和试验。结果经过整个免疫程序后，a、b、c组均能产生高效价抗血清，且a组（6 144.00）最终产生的血清中和抗体效价高于b组（4 437.33）和c组（3 754.67）；3组血清均可在中和试验中有效中和KMS2株新型冠状病毒，中和后培养细胞均未发生病变。结论 3种不同佐剂疫苗在新西兰兔体内均可产生高水平的免疫应答。正文2019年底由新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引发的COVID-19在全世界暴发，目前疫情仍在全球传播。SARS-CoV-2属于冠状病毒科β-冠状病毒属，基因组为单股正链RNA，编码4种结构蛋白：刺突蛋白、包膜蛋白、膜糖蛋白及核衣壳蛋白[1-2]。疫苗作为一种极为有效的预防手段，是预防控制COVID-19大流行时的重要手段，而灭活疫苗是一种十分成熟的技术平台。在目前全球范围内至少有9个COVID-19全病毒灭活疫苗已进入Ⅲ期临床试验[3-9]，2021年5月，由中国医学科学院医学生物学研究所生产的SARS-CoV-2灭活疫苗（Vero细胞）获批紧急使用。由于灭活疫苗在毒种选育和建库过程中可能会受外源因子的污染，因此需要对主种子批和工作种子批进行外源因子检测，在检测前需用非同源特异性血清中和病毒后再进行检测[10]。佐剂是能够增强机体对抗原免疫应答能力或调节机体产生特定类型免疫应答的物质[11]。弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂是使用较为广泛的佐剂，新型佐剂单磷酰脂A（monophosphoryl lipid A，MPLA）是Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）4的激动剂[12]。本研究通过在新型冠状病毒疫苗原液中添加3种不同佐剂来制备抗血清，以期找到适宜佐剂制备新型冠状病毒高效价中和血清。1材料与方法1.1疫苗原液、细胞与病毒SARS-CoV-2灭活疫苗原液、Vero细胞、指示病毒（经过标定已确定病毒滴度的SARS-CoV-2 KMS2株）均由中国医学科学院医学生物学研究所提供。1.2试剂与仪器弗氏不完全佐剂（批号：SLCB8702）和弗氏完全佐剂（批号：SLCC6223）均购自美国Sigma公司，氢氧化铝佐剂（批号：WB317588）购自美国Thermo公司，MPLA佐剂（批号：MPSU-41-03）购自美国Invitrogen公司，病毒稀释液、细胞生长液、细胞维持液及0.25%胰蛋白酶均由中国医学科学院医学生物学研究所质量检定室配制。DKB-600B水浴箱购自上海一恒科学仪器有限公司，3111 CO2培养箱购自美国Thermo公司，TS-100倒置显微镜购自日本Nikon公司。1.3实验动物无特定病原体级新西兰兔9只，雌性，体质量为2.0~2.2 kg，由昆明楚商科技有限公司提供，动物许可证号：SCXK（滇）K2018-0001。1.4免疫及抗血清制备将9只实验兔随机平均分为a、b、c组，采用皮下多点注射的方式进行免疫，均于0、28、42 d各免疫1次，0、28 d免疫剂量为300 μg/只，42 d免疫剂量为100 μg/只。a组初次免疫时将SARS-CoV-2灭活疫苗原液与等量的弗氏完全佐剂充分混匀乳化后进行免疫，后续2次加强免疫时将疫苗原液与等量的弗氏不完全佐剂充分混匀乳化后进行免疫；b、c组每次免疫时分别将等体积SARS-CoV-2灭活疫苗原液与氢氧化铝佐剂、MPLA佐剂混合均匀后进行免疫。在每次免疫前及初次免疫后14 d于耳中央动脉采血用于效价检测，初次免疫后49 d经颈动脉采血，收集血液于多个无菌小方瓶中，分离血清，进行中和抗体效价检测。1.5血清中和抗体效价检测将分离出的血清置于56 °C水浴箱中，灭活30 min。在生物安全3级实验室中用病毒稀释液将原倍血清预稀释10倍，在96孔细胞培养板第1行加入混匀的初始稀释度血清样品，每个血清样品2孔，100 μl/孔，2倍稀释至所需稀释度后吹打混匀，后吸出50 μl丢弃。在待检样品对应孔中加入50 μl浓度为100 CCID50/50 μl的病毒液，将96孔细胞培养板胶带固定后，采用样品转运箱转运至（37.0±0.5） ℃、5% CO2培养箱中和2 h。中和完成后每孔加入100 μl新鲜制备的Vero细胞悬液，混匀后将96孔细胞培养板胶带固定后采用样品转运箱转运至（37.0±0.5） ℃、5% CO2培养箱中培养7 d，于倒置显微镜下观察Vero细胞病变情况。对所用指示病毒进行回滴，通过Karber法计算指示病毒滴度，应在32~320 CCID50/50 μl范围内，将能抑制50%细胞病变的最高血清稀释度作为抗新型冠状病毒血清中和抗体效价，以稀释倍数的倒数表示。1.6中和试验将3组血清分别与KMS2株SARS-CoV-2进行中和试验，KMS2滴度均为6.50 lgCCID50/ml。将3组特异性抗血清倍比稀释，然后加入细胞培养液中进行观察是否出现细胞毒性。根据KMS2滴度和血清效价进行毒株和血清的稀释：取5 ml KMS2加入45 ml病毒稀释液中后充分混合，完成毒株10倍稀释；将特异性抗血清按照不产生细胞毒性并过量中和的原则进行稀释。将稀释后的50 ml毒株和50 ml特异性抗血清充分混合，于37 °C水浴中和2 h。中和完成后取3 ml样品加入到成长为致密单层的Vero细胞T25培养瓶中，补加9 ml细胞维持液；各组血清对照直接加入3 ml稀释后的相应组血清及9 ml细胞维持液于致密单层的Vero细胞T25培养瓶中。两者于37 ℃、5% CO2培养箱中培养14 d，第7天更换维持液1次，14 d后在倒置显微镜下观察细胞病变情况。1.7统计学分析采用SPSS 18.0统计软件对3组实验数据进行统计学分析，显著水平为ɑ=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。 2结果2.1血清中和抗体效价随免疫时间的变化对3组实验血清中和抗体效价检测结果如图1所示。初次免疫后，a、b、c组血清中和抗体效价在14 d内升高，14至28 d内缓慢升高，第28天a组血清中和抗体效价高于b、c组；经过第28天第2次免疫后，a组血清中和抗体效价呈缓慢升高趋势，b、c组快速升高，第42天b、c组血清中和抗体效价高于a组，经过第42天第3次免疫后，在第49天a组血清中和抗体效价升高且高于b、c组，而b、c组血清中和抗体效价有所下降。随着免疫时间的增加，a、b、c组佐剂均能刺激实验动物产生高效价抗血清。2.2血清中和抗体效价差异比较3组实验血清中和抗体效价差异比较如图2所示。初次免疫后第14天，a组血清中和抗体效价均值（832.00）高于b组（112.00）、c组（56.00）（t值：2.25、2.42，P>0.05）；初次免疫后第28天，a组血清中和抗体效价（1 024.00）高于b组（448.00）（t值：2.30，P>0.05）和c组（96.00）（t值：3.70，P<0.05）；初次免疫后第42天，b组（6 826.67）、c组（6 826.67）血清中和抗体效价均高于a组（1 600.00）（t值：6.29、6.29，P<0.05）；初次免疫后第49天a组血清中和抗体效价（6 144.00）高于b组（4 437.33）、c组（3 754.67）（t值：1.37、1.92，P>0.05）。a、b、c组经过整个免疫程序后，均能产生高效价抗血清，且a组最终产生的血清中和抗体效价高于b、c组。2.3抗血清在中和试验中的应用效果a组血清经倍比稀释后，20倍稀释后的血清未产生细胞毒性；b组与c组血清经倍比稀释后，10倍稀释后的血清未产生细胞毒性。经过以上稀释度稀释的血清与KMS2进行中和试验，3组血清均未引起细胞病变（见表1），说明3组血清均可以在不产生细胞毒性的稀释度下完全中和KMS2。在之后的应用中，3组血清均可以用于疫苗毒种的外源因子检查。3讨论弗氏佐剂作为经典的佐剂，在实验动物制备抗血清方面应用十分广泛，但会形成难以吸收的包块，对实验动物产生较大伤害；氢氧化铝是目前中国药典中规定的唯一可用于人用疫苗的佐剂，可吸附抗原，能产生良好的免疫应答；MPLA为一种成熟的TLR4激动剂，含有MPLA的HBV和HPV疫苗已经在全球多国获得许可。本研究探讨弗氏佐剂、氢氧化铝及MLPA佐剂制备COVID-19灭活疫苗的特异性血清的效果，以期找到快速制备高效价特异性血清的合适佐剂及动物免疫程序。为了对比3种不同佐剂的效果，本实验选取SARS-CoV-2疫苗原液作为抗原，混合不同佐剂后对新西兰兔于0、28、42 d各免疫1次，并对初次免疫前及后14、28、42 d进行兔耳采血、第49天时进行颈动脉采血，收集血样后分离血清并进行抗血清效价测定。通过对抗血清效价测定结果的对比，我们可以看出，弗氏佐剂作为经典的抗血清制备佐剂，其作用明显，兔抗血清效价在初次免疫后49 d内均在上升，至49 d处死实验动物时，其抗血清效价仍然未到达顶点，这与弗氏佐剂与抗原混合乳化的过程中，含有抗原的液滴被油所包裹，形成稳定的颗粒[13-14]，在注射到实验动物体内后可使抗原持续释放有关；而氢氧化铝及MPLA佐剂混合抗原进行动物初次免疫后42 d时，抗血清效价到达峰值，而后又慢慢降低，这表明使用这2个佐剂进行2次免疫后，已经可以在新西兰兔体内产生高水平的免疫应答，并可获得高效价的抗血清。本实验为了能快速、高效地制备抗血清，在最后1次免疫后7 d就进行了最后的血清分离，未考虑抗体效价在实验动物体内的长期趋势，之后的研究中可以进行长期的血清抗体效价检测，以达到更高效价获取血清抗体的目的。3种不同佐剂参与制备的抗血清，均可以在中和试验中有效中和KMS2毒株SARS-CoV-2，将在毒种检定方面起到重要作用。作者胡云光1，2 英志芳3 张玉平1，2 殷安国1，2 李亚东1，2 常亚军1，2 段男1，2 易力1，2 宋杰1，21中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所，昆明 650031；2国家药品监督管理局疫苗及生物制品质量控制与评价重点实验室，成都 611731；3中国食品药品检定研究院，国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京 102629胡云光和英志芳对本文有同等贡献通信作者：宋杰，Email：songjie@imbcams.com.cn引用本文：胡云光，英志芳，张玉平，等. 兔抗新型冠状病毒血清制备中佐剂对抗体效价的影响 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(3):146-150. DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20220927-00063