ADC抗体设计：精心选择靶点、高效分离抗体

2022-07-30

抗体抗体药物偶联物免疫疗法

摘要：在以靶点优先的抗体生成方法中，需要对靶点特质、试剂质量、宿主选择等各方面因素进行综合考虑。同时也有以噬菌体展示技术为代表的各种抗体分离技术，本文详述了靶点选择中需要考虑的各个因素以及各种抗体分离方法的优缺点，继续讨论为生产ADC药物研发理想抗体的高效策略。靶点在抗体筛选中的考虑因素（1）高质量试剂高质量试剂对抗体生产至关重要。许多用于靶点验证的试剂（如靶DNA、表达质粒、天然和重组细胞系、纯化蛋白和对照或参考抗体）在抗体生成和筛查过程中也同样可能有用。当生产筛选试剂时，平行生成可用于检测抗体hits物种交叉反应的靶同源基因至关重要。（2）靶点性质选择用于ADC干预的靶点性质和固有特性大相径庭。在肿瘤细胞和肿瘤血管中，几乎所有的基因都能在细胞表面表达。它们是完整的膜蛋白，通常含有一个或多个跨膜α螺旋，并会永久附着在细胞膜上。这种蛋白质只能用洗涤剂、非极性溶剂或变性剂从生物膜上分离。出于这个原因，绝大多数用于抗体产生和筛选的蛋白质抗原会被分解成较小的可溶性亚区，或细胞表面受体的胞外区。这些片段可以作为免疫原或选择试剂进行重组表达设计。精确确定结构域边界通常至关重要，因为表达结构中任何微小变化都可能对表达量产生巨大影响。（3）宿主选择可以用原核或真核宿主重组生产目的抗原。宿主选择可能取决于靶点性质。最重要的是，产物应该是均质、适当折叠的抗原，以便获得关键表位。为了快速生成，最好在HEK293或CHO细胞中瞬时表达。许多蛋白质标签（如流感血凝素(HA)、FLAG或His6），能从复杂的细胞培养液中轻松纯化。因为Fc结构域可以独立折叠，在体内外都能改善配对分子的溶解性和稳定性，同时也为蛋白A/G亲和层析提供了一个方便的纯化手柄。所以也可以使用由基因上融合到靶抗原的免疫球蛋白Fc结构域组成的基于Fc的融合蛋白。（4）考虑使用过表达细胞系进行筛选表达肿瘤学靶点的转化细胞系通常易于生产。这些细胞系是抗体生产的有效免疫原，在动物中能产生强烈的免疫反应。整个细胞都是由许多细胞表面蛋白组成的复杂抗原，每个蛋白都是一种潜在的抗原。因此，需要通过广泛筛选来生产靶向单一抗原的特异性抗体。在基于细胞的筛选过程中，为了降低复杂性，可以使用重组过表达细胞系。全长靶抗原可以在常用的细胞系统中表达，如HEK293或CHO细胞。非转基因、低表达或不表达靶点的亲本对照细胞可用于反筛选。（5）小鼠细胞系表面过表达为了最大化增强小鼠在全细胞免疫时的特异性抗体反应，也可以在来自与免疫宿主同源的菌株的小鼠细胞系的表面过表达人类靶抗原。与人类细胞不同，表达重组抗原的小鼠细胞背景反应降低，因为它们的整个细胞表面成分（除转染靶分子和表达靶分子外）都源于小鼠，因此在动物体内是耐受的。可能使用自然表达的肿瘤细胞系和重组蛋白，以及不同背景下的工程细胞系来生产理想抗体。抗体分离的几种方法（1）杂交瘤技术目前市场上的许多治疗性抗体是使用Kohler和Milstein开发的传统杂交瘤技术生成。杂交瘤细胞系是由永生化的骨髓瘤细胞与产生免疫球蛋白的B细胞稳定融合而产生的，这本身效率不高。尽管存在局限性，杂交瘤在历史上一直是最广泛使用的抗体生成方法。但最近，已采用能更有效识别抗体的方法，包括使用CD40/CD40L培养和扩增免疫啮齿动物产生抗体的B细胞。以及基于流式细胞术的抗体产生细胞(APC)的分类，使用荧光标记的抗原，然后从细胞中进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。（2）转基因技术上述每一种方法都依赖于对啮齿动物或其他动物的免疫，并将此作为产生抗体的免疫细胞的来源。小鼠由于其世代周期短,遗传标记(genetic markers)丰富和饲养管理成本低，经常被用于免疫。使用靶向缺失特定基因的基因敲除小鼠，可以更容易地提高对某些蛋白质靶标的免疫反应，这些蛋白质靶点在物种间高度保守。当没有基因敲除小鼠时，可以使用大鼠或其他物种来促进人/鼠交叉反应抗体的产生。转基因啮齿动物可以在不需要人源化的情况下，相对快速地生成靶向已验证靶点的抗体。但转基因技术成本较高和转基因动物数量有限，所以大多数研究人员更偏好非转基因动物。（3）DNA免疫图1 尾静脉注射流体动力法DNA免疫及其免疫应答特征（来源于：Hazen et al 2014)）最近对该技术的改进表明，DNA免疫能够产生靶向G蛋白偶联受体(GPCRs)和离子通道等抗原的免疫反应，这些抗原通常更难产生抗体。一般来说，DNA免疫所产生的免疫反应比其他方法所产生的免疫反应需要更长的时间，但对于更传统的方法来说，延迟的反应时间通常能抵消产生免疫原所需时间。（4）快速免疫方法--RIMMS能快速生成一组针对多个靶点的抗体对于ADC靶点验证非常有效。对啮齿动物免疫通常需要两个月或更长时间，才能获得足够的抗体效价。但利用快速免疫方法，如重复免疫多个部位(RIMMS)， RIMMS即多位点重复免疫(repetitive immunizations multiple sites)意思是在相同的地方低剂量短间隔重复免疫，一般是在小鼠背上皮下选择四五个点，每三天左右在这些点进行低剂量免疫，一般十几天就可以完成免疫。这种方法可以在不影响质量的情况下，缩短免疫时间。RIMMS主要依靠次级淋巴组织中早期发生的快速超突变和亲和力成熟来对抗抗原。2-3周内，分别在几个皮下部位注射低浓度抗原，每周三次。在抗原攻击后，收集每个注射部位的引流淋巴结，并用于融合或基于B细胞的抗体筛选。（5）噬菌体展示技术噬菌体展示技术为将抗体引导到具有特定特征的抗体群体，例如，靶向结合到一种肿瘤细胞，靶向与已知靶点上的已知表位结合的抗体、或二者兼具。噬菌体来源的抗体通常比免疫动物来源的抗体亲和力低。但由于上述结合部位屏障的考虑，以及中等亲和力抗体可能会避免被内化到低表达的正常细胞，虽然仍可能在高表达的肿瘤细胞中内化，但纳米摩尔数较低抗体很可能适用于ADC。图2 亲和力与抗原内化率有关，决定了抗体在体外分解代谢的程度。将450 ng~(125)I标记的抗HER2抗体与5×105个SK-OV-3细胞孵育，进行内化试验。在未结合的免疫球蛋白从细胞中清洗后的1、2、4、8、24小时后立即采集样本相对于表面结合的时间，表示总抗体的百分比（A），解离(B)，内化(C)，抗体降解（D）三份样品的平均标准偏差为±1。降解与抗原内化的相关性(E)。灰色区域表示由其他人确定的内化率(Ke)范围1固液选择使用纯化或重组抗原在溶液或固相中进行噬菌体选择。随后筛选与表达在工程细胞或肿瘤细胞表面的抗原结合的抗体。这种方法的优点在于抗体靶点特异性是已知的，而与更复杂的细胞表面抗原结合只是用于确认。此方法主要的缺点在于需要产生高质量的蛋白质试剂。即使在成功选择之后，被选择与纯化抗原结合的抗体经常无法识别肿瘤细胞背景下的靶点。选择与细胞结合的噬菌体，包括肿瘤细胞系、肿瘤组织样本或过表达特定靶点的哺乳动物表达系可降低克隆与细胞表面靶标结合失败的风险，但随着细胞表面复杂性的增加，分离与靶点结合的克隆与不与靶点结合克隆难度也会逐渐提高。图3 固液筛选原理 2细胞筛选对过表达蛋白进行细胞选择也是分离已知特异性抗体的可行途径。这种方法有利于分离与已知靶点的细胞表面形式特异结合的抗体。建立稳定的哺乳动物细胞系可能非常耗时，但通常转基因的细胞系及其未转基因的亲本可用于抗体的选择和筛选，并为靶标特异性提供明确的证据。重组细胞系可能高估了低亲和力抗体与表达较低靶标的细胞结合的能力，并可能改变了内化机制、糖基化或与其他蛋白质的结合，因此验证肿瘤细胞上的抗体属性是必要的。图3 不同筛选体系中表位暴露示意图通常，可以结合各种方法优势。如果靶点已知，在纯化的蛋白质和细胞上交替进行噬菌体筛选可以提高所产生的克隆与肿瘤细胞上呈现的所需靶点特异结合的可能性。同样利用对纯化蛋白的选择和对肿瘤细胞的内化选择，可以将选择的池集中在所需表型的克隆上。很难预测展示在噬菌体上的Fab单链抗体的哪些特征将转化为免疫球蛋白G(IgG)形式的特征。基于这个原因，通常推荐分离物转换成免疫球蛋白来确认它们的结合和内化特征。结语在ADC药物研发过程中，抗体是核心也是灵魂。靶点优先的抗体生产方法基于对靶点的先验知识在抗体生产过程中拥有更大的独立性和新颖性，也更容易设计楚理想受体。同时以噬菌体展示技术、重复免疫和DNA免疫为代表的各种抗体分离技术也为高效获得理想抗体，提高免疫效率等进行了有益尝试。