诺奖得主Katalin新作: 减弱mRNA疫苗免疫原性，改变适应性免疫。

2023-10-12

疫苗信使RNA

自新冠 mRNA 疫苗获得巨大成功后，Katalin Kariko 一直奔波在领奖路上，各个国家的不同结构争先恐后地扔奖给她，就怕她不愿意接。她也终于集齐所有的福气，召唤出最为耀眼的诺贝尔奖章，为自己多年的不懈坚持画上圆满的句号。在十一游玩排队的人群中，刷到 Katalin Kariko 获得诺贝尔奖，那一刻的感觉就像看到权游里二丫归来血洗弗雷家族一样将整个人的情绪瞬间点燃，没有什么比历经坎坷后，收获命运馈赠的荣耀更让人为之雀跃欢欣的事情了。不过，令人遗憾的是，获奖的人里缺少了 Peter Cullis 老爷子。图片源自 X自 1989 年起，Katalin Kariko 开始了在宾夕法尼亚大学郁郁不得志的学术之路。当时人们认为 mRNA 极其不稳定，没有什么应用的潜在价值，导致她无法募集到足够的资金启动 mRNA 相关的科研项目。1995 年情况变得更加糟糕，宾夕法尼亚大学将她从研究助理教授降职为高级研究研究员。幸运的是，她遇到贵人相助，与 Drew Wissman 的一次邂逅，开启了两人的合作，这才勉强在宾大有了个稳定的容身之所。事业上长年的不见起色和突如其来的疾病始终没有浇灭她开发 mRNA 疗法的信念。2005 年，对于她来说是柳暗花明，迎来转机的一年，这一年她发现修饰碱基能够有效降低外源合成 mRNA 的免疫原性（关于修饰碱基发现的详细梳理见回溯|N1- Methyl-Pseudouridine破除Moderna公司前进障碍）。这项研究清除了外源合成 mRNA 免疫原性的重大阻碍，说明 mRNA 疗法这条路是行得通的。然而，这个突破在当时并未能引起广泛的关注，她仍然需要不停地为 mRNA 疗法具备的无限潜能摇旗呐喊。图片源自 X2013 年，Katalin 陪身为赛艇运动员的女儿（2008 年和 2012 年连续两届奥运会赛艇比赛金牌获得者）前往欧洲参赛。在德国美因茨的一次会议上，Katalin 认识了一群 mRNA 发烧友学者，在那里，她再也不用费劲地给人解释唠叨 mRNA 有多么多么的好。Ugur Sahin 也在这场会议中，与 Katalin 热情交流分享后，他立即邀请 Katalin 到 BioNTech 工作。考虑到与宾大之间关系一直闹得很僵，留在学校也没有太大的出路，Katalin Karikó 同意了这个提议，于 2013 年加入 BioNTech 大家庭。此后，在 BioNTech 工作长达近十年，Katalin 于 2022 年重新回宾夕法尼亚州，同时仍然担任 BioNTech 的外部顾问。Ugur Sahin 是从开发肿瘤疫苗切入到 mRNA 疗法领域的。自 20 世纪 90 年代以来，他与妻子共同致力于优化 IVT-mRNA，想克服 IVT-mRNA 短暂和低效的蛋白表达能力，以便将其开发为一种高效的肿瘤疫苗。与 Katalin 的路径不同，Ugur Sahin 将侧重点放在优化构成 mRNA 的各个元件，例如，帽结构，Poly A 及 UTR 序列。经过多年的不断摸索，将这些优化后的元件组合可显著提升 IVT-mRNA 的稳定性和翻译效率，特别是在免疫细胞中。凭借这些成果 Ugur Sahin 称为首届 Go.Bio 竞赛的获胜者，这促使他们夫妻于 2008 年创立了 BioNTech 公司。随后的几年里，Ugur Sahin 团队发现了 DC 细胞选择性摄取 mRNA 的机制，并且利用脂质纳米颗粒靶向递送 mRNA。这些突破性的改进为 IVT-mRNA 的临床应用奠定了坚实的基础。图片源自 X步入本期内容的正题，10 月 5 号，Katalin 与 Ugur Sahin 共同在 Molecular Therapy Nucleic Acids 发表文章：Reducing cell intrinsic immunity to mRNA vaccine alters adaptive immune responses in mice。在小鼠体内，他们并行比较了机体对 3 种不同修饰类型的 HA-mRNA 流感 HA-mRNA 流感疫苗免疫反应的异同：1. cap0+尿苷-HA-mRNA ：D1-uRNA2. cap0+m1Ψ 修饰-HA-mRNA ：D1-modRNA3. cap1 +m1Ψ 修饰-HA-mRNA（同时利用纤维素柱去除 dsRNA）：cC1-modRNA 转录组学→炎症反应→适应性免疫反应这项研究分析 3 种不同修饰的 HA-mRNA 疫苗免疫小鼠后的引流淋巴结和血液中的转录组，结果显示，与其他两组修饰的 HA-mRNA 相比，小鼠机体在响应未修饰 D1-uRNA 的刺激时，表现出非常明显的基因表达差异，尤其是 Stat 1 基因和 RNase L 基因表达显著上调。3 种不同修饰的 HA-mRNA 疫苗免疫小鼠后均会出现系统性炎症反应，表现为体重的短暂下降，但是，转录组学上的差异会导致系统性炎症反应强度上的不同，表现为机体在面对未修饰 D1-uRNA 刺激时炎症反应更加迅速，更加强烈。有意思的是，HA-mRNA 修饰上的差异，还会导致小鼠引流淋巴结和注射肌肉部位细胞浸入数量的差异。cC1-modRNA 免疫小鼠时肌肉中会募集到更多数量的细胞，而未修饰 D1-uRNA 免疫小鼠时淋巴结中会募集到更多数量的细胞。不同类型的免疫细胞，例如，中性粒细胞、巨噬细胞、DC 细胞等，在肌肉和引流淋巴结中分布的数量有些会因为 HA-mRNA 修饰上的差异而发生变化。3 种不同修饰的 HA-mRNA 疫苗免疫小鼠，如果诱导的系统性炎症反应越强，则血清中 HA 中和抗体水平越低。阻断 IFN 信号通路对于 cC1-modRNA 诱导的细胞因子反应没有影响，然而，D1-uRNA 免疫小鼠诱导的 IP-10 和 TNF 以及 HA 特异性的 T 细胞免疫反应会发生显著下降。HA-mRNA 免疫小鼠的保护效果因修饰类型和剂量而不同。0.2μg 3 种不同修饰类型的 HA-mRNA 疫苗的免疫小鼠血清中检测不到任何 HA 抗体滴度。当免疫剂量提升至 10μg 或者 1μg 时，cC1-modRNA（更优）或者 D1-modRNA 免疫小鼠血清中的 HA 抗体滴度水平要明显比 D1-uRNA 免疫小鼠更高。在流感病毒攻毒后，所有 10μg 剂量的免疫小鼠体重均未出现减轻，而 1μg 或者 0.2μg 免疫剂量的小鼠体重均出现不同幅度的减轻。对于肺部病毒载量来说，在各个剂量范围下，不同修饰类型的 HA-mRNA 免疫引起的差异极小。关于 RNA 感应受体、干扰素信号及抗原表达这项研究在两种不同的细胞中比较了 3 种不同修饰 HA-mRNA 的抗原表达水平。一种是 HEK293T 细胞，称为干扰素信号通路缺陷细胞系；一种是小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），称为干扰素信号敏感细胞系。在 HEK293T 中，只有掺入 Cap1+移除 dsRNA 才能显著提升抗原表达水平，相比之下，在 MEF 中，仅仅掺入 m1Ψ便可实现对抗原表达水平的最强提升。不同的 RNA 感应受体识别外源 mRNA 的不同结构，诱导细胞分泌 I 型干扰素和促炎因子。反过来，I 型干扰素又会同细胞上特异性的受体结合，诱导相应的信号通路，抑制蛋白质合成过程。因此，机体对于 mRNA 疫苗的免疫反应强度一方面要足以激活和募集免疫细胞，另一方面又必须足够温和，确保不会对编码抗原的高效表达造成抑制。图片来源：RNA Therapeutics, the Evolving Landscape of Research, Challenges & Opportunities大概查了一下，HEK293T 细胞是不表达 TLR3、MAD5 及 RIG-I 的，或者说表达水平非常低。因此，大多采用 HEK293T 细胞对 IVT-mRNA 进行研究时需要瞬时转表达 RNA 感应受体的质粒。关于哺乳动物细胞内 RNA 感应受体和 IVT-mRNA 免疫原性的相关信息，我们在过往的文章中曾多次提及：Katalin 利用修饰核苷酸（m5C, m6A, m5U, s2U, or pseudouridine）体外转录合成 mRNA，转染能够稳定表达 TLR 受体的 293 细胞，通过检测细胞分泌的 IL8 水平来判断外源 mRNA 对于 TLR 的激活，试验数据表明，利用化学修饰核苷酸合成出来的 mRNA 能够避免被 TLR 受体识别，大幅减弱 IVT mRNA 的免疫原性（回溯|N1- Methyl-Pseudouridine破除Moderna公司前进障碍）。图片来源：Suppression of RNA Recognition by Toll-like Receptors: The Impact of Nucleoside Modification and the Evolutionary Origin of RNAIVT 反应产物中除目的条带 ssRNA 外，还存在 dsRNA 副产物；IVT 反应产物刺激 MDA5 触发下游抗病毒天然免疫信号通路，主要是由于其组分中存在的 dsRNA 副产物（探究IVT反应副产物dsRNA的形成和免疫原性）。小结CureVac 利用天然核苷酸合成的 CVnCoV 新冠 mRNA 疫苗临床试验得到的保护效率为 48.2%，远远低于 BNT162b2（95%）和 mRNA1273（94%），从临床应用的角度说明抑制体外合成 mRNA 免疫原性具备的显著优势。这项研究通过头对比较，进一步探讨了掺入 m1Ψ 和 Cap1 双重修饰对于 mRNA 疫苗免疫原性和保护效率的显著改善源自差异化的基因表达谱带来的炎症免疫反应的减弱和适应性免疫反应的增强。