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摘要：基于mRNA的疫苗概念出现在三十年前。过去20年的开创性发现和技术进步解决了最初阻碍这种新型疫苗模式应用的主要障碍。快速开发的含核苷修饰的COVID-19 mRNA疫苗表明，这种免疫平台易于开发，具有可接受的安全性，并可大规模生产。抗原设计的灵活性和简便性使得mRNA疫苗进入了针对多种病毒以及各种细菌和寄生虫的开发。然而，我们知识上的空白限制了下一代mRNA疫苗的开发，这些疫苗具有增强的效力和安全性。对mRNA疫苗作用机制的更深入了解，应用新技术以实现合理的抗原设计，以及创新的疫苗递送策略和接种方案，可能会产生针对广泛病原体的强大新疫苗。 1.引言 疫苗在减少由各种病原体引起的发病率和死亡率方面产生了显著影响。在二十世纪下半叶，许多国家引入了全面的疫苗计划，这标志着与致命病原体斗争的转折点，几乎完全根除了几种严重的儿童疾病，并减轻了许多其他危险的病毒或细菌疾病。然而，一些目前许可的疫苗无法诱导出强大、广泛保护、持久的免疫反应，生产耗时且困难，或安全性配置亚优，凸显了改进的需求。此外，目前缺乏针对多种相关难以靶向的病原体的人类疫苗，例如人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）或丙型肝炎病毒，以及许多其他病毒和人类致病细菌、真菌和寄生虫，这些病原体合计每年在全球造成数百万人死亡。 mRNA疫苗是疫苗学领域的新来者。数十年的工作现在已解决了体外转录（IVT）mRNA的基本障碍，包括其高度炎症的特性以及安全高效体内递送和大规模生产的困难。关键进展包括在mRNA中引入修饰核苷，利用可电离脂质纳米颗粒（LNPs）进行mRNA递送，以及优化IVT反应，允许无细胞、快速、可扩展的mRNA疫苗生产。值得注意的是，这种疫苗平台比其他模式有几个关键优势。首先，抗原设计的灵活性（mRNA序列可以快速修改）使mRNA疫苗成为针对快速进化病原体（如流感病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2））的理想选择。其次，mRNA生产的简便性允许快速迭代筛选过程，以识别针对病原体的优化免疫原。第三，可以制作多组分（组合）mRNA疫苗，以针对单一病原体的几种不同抗原。例如，预临床流感病毒疫苗中包括了同一抗原的不同版本，以及双价许可的2019年冠状病毒病（COVID-19）疫苗，以及其他疫苗则用单一疫苗配方针对多种病原体。第四，mRNA疫苗可以在短时间内大规模生产，这对于季节性（例如，流感）疫苗或大流行情况非常理想。第五，mRNA疫苗是设计针对具有多个跨膜域的复杂蛋白的疫苗的理想平台。这些mRNA疫苗的一些关键特性使它们成为对COVID-19大流行有效响应的理想选择。事实上，Moderna和辉瑞-BioNTech迅速开发了含核苷修饰的mRNA-LNP疫苗，并在短时间内生产了数十亿剂。最重要的是，这两种配方在预防死亡和严重COVID-19方面都非常有效，并在全球SARS-CoV-2大流行期间挽救了数百万人的生命（方框1）。 过去10-15年，在疫苗研究方面取得了巨大进展，产生了新的免疫平台，对多种病原体的生物学有了更深的理解，对人类免疫学有了新的见解，对登革热、呼吸道合胞病毒（RSV）和疟疾（除了COVID-19）等疾病的新疫苗，以及重要的是，开发了新技术，使合理的抗原设计能够诱导出最佳的免疫反应。本综述概述了基于mRNA的疫苗平台，包括mRNA设计和递送技术的原则，评估了对mRNA疫苗作用机制的当前理解，并强调了新的临床前和临床传染病疫苗配方。讨论了mRNA疫苗研究中最重要的挑战、限制和机会，以及将mRNA平台技术与反向疫苗学结合起来，实现针对多种病原体的新型、安全有效的人类疫苗的潜力。 2.mRNA疫苗技术概述 大多数临床前和所有直接注射的临床mRNA疫苗有两个主要组成部分：编码抗原的mRNA和保护它免受RNases快速降解并促进大型、负电荷RNA分子细胞摄取的递送平台。mRNA疫苗的两个组成部分影响引起的免疫反应的质量和大小。 2.1.RNA格式和RNA设计原理 在过去25年中，几种RNA格式已在临床前和临床研究中开发和评估（图1）。非复制性（线性）mRNA，无论是否含有修饰核苷，以及自扩增mRNA（saRNA）是经过最广泛研究和改进的主要平台。其他新兴的RNA平台包括跨扩增mRNA和环状RNA（方框2）。 图1 | RNA疫苗平台。该图展示了目前正在使用或探索的用于疫苗接种的RNA格式。值得注意的是，环状RNA由内部核糖体进入位点（IRES）和编码抗原的区域定义。未翻译区域（UTRs）可以改善环状RNA，因此在图中显示。(A)n，聚(A)尾；m7G，7-甲基鸟嘌呤帽；nsP，非结构蛋白。 非复制性mRNA疫苗。非复制性（线性）IVT mRNA已在疫苗研究中测试了数十年，可以含或不含修饰核苷。未修饰的格式主要由CureVac AG开创，它在临床前研究中被证明是一种有效的传染病mRNA疫苗格式。然而，该平台在COVID-19 mRNA疫苗临床试验中的表现不如其含修饰核苷（N1-甲基假尿嘧啶）的对应物。未修饰的CureVac COVID-19疫苗（CVnCoV）性能不佳的一个潜在原因是，即使在相对较低的剂量（12.5微克）下，其在人体内也具有高度炎症性。这种未修饰mRNA的更高反应原性阻止了测试高剂量CVnCoV mRNA（如辉瑞-BioNTech（BNT162b2）和Moderna（mRNA-1273）配方中使用的30微克和100微克）的可能性，而12.5微克剂量在IIb-III期试验中未能诱导出足够强大的保护性免疫反应。在开创性研究中，2023年诺贝尔奖得主Karikó和Weissman证明，将某些修饰核苷引入mRNA序列可以增加IVT mRNA的蛋白产量，重要的是，减少其先天免疫感应。修饰核苷mRNA的这一特性使得BNT162b2和mRNA-1273能够在足够高的剂量下用于诱导对COVID-19的保护，同时将疫苗诱导的不良事件保持在可接受的水平。 IVT mRNA的关键考虑因素包括其半衰期、稳定性、可翻译性和炎症能力；这些特征影响mRNA疫苗的效力和安全性，可以通过优化mRNA的结构元素（5'帽，5'-非翻译区（UTR），编码区，3'-UTR，聚（A）尾）和/或使用适当的mRNA化学和生产程序进行微调。5'帽和聚（A）尾都有助于mRNA的稳定性，并在翻译启动中起关键作用。目前，cap1（m7GpppNm）是最广泛使用的修饰，可以共转录使用cap1类似物或转录后使用病毒封顶酶添加到IVT mRNA上。使用cap1而不是cap0（m7GpppN）通过克服干扰素诱导的蛋白四聚体重复序列1（IFIT1）引起的翻译抑制，增加了蛋白产量。哺乳动物或病毒序列的UTR也已包含多年，以增加mRNA的稳定性和翻译。最近，高通量报告基因测定和计算机引导的方法使得选择优化的UTR和密码子组成以提高mRNA稳定性和翻译成为可能。增加基因中的鸟嘌呤和胞嘧啶含量通常与更高水平的表达相关，但最近的发现揭示mRNA二级结构也是mRNA稳定性和可翻译性的关键预测因子。有趣的是，最具结构化的mRNA通常（但并非总是）具有最高的鸟嘌呤和胞嘧啶含量，密码子使用和二级结构通过增强IVT mRNA的溶液稳定性来明显调节其翻译能力。将某些修饰核苷，如假尿嘧啶或N1-甲基假尿嘧啶，引入IVT mRNA可以通过抑制替代残基的mRNA水解来增加溶液稳定性。N1-甲基假尿嘧啶替代促进了真核生物翻译启动因子2A（eIF2a）的磷酸化减少，从而增加了来自mRNA的蛋白产量。这些发现至少部分解释了为什么在早期研究中发现含有假尿嘧啶的IVT mRNA与其未修饰的对应物相比，蛋白产量增加。 减轻IVT mRNA的免疫激活能力是开发安全传染病疫苗的关键。这可以通过至少四种方法实现。首先，在mRNA序列中用假尿嘧啶或其衍生物N1-甲基假尿嘧啶替代尿嘧啶，减少了IVT mRNA的尿嘧啶依赖性免疫感应。其次，RNA聚合酶生成的短中止转录本可以在IVT mRNA制剂中形成强烈的免疫刺激性双链RNA（dsRNA），通过被多种传感器（例如，TLR3, OAS, PKR, RIG-I和MDA5）在各种细胞区域识别，诱导炎症和翻译阻断。因此，通过纯化或RNase III处理从IVT mRNA制剂中去除dsRNA污染物，进一步提高其可翻译性并减少炎症能力。开发一种在转录过程中产生较少dsRNA的RNA聚合酶，可能允许在“单罐”反应中生成IVT mRNA，简化疫苗生产。第三，cap0被细胞内RNA传感器RIG-I识别，诱导炎症反应。因此，使用含有甲基基团在第一个帽近端核苷上的5' cap1（在高阶真核生物中的“自我”标志）是减少IVT mRNA诱导的免疫识别的关键。第四，某些密码子优化策略增加了IVT mRNA内的dsRNA形成，因此可能增加了其被细胞dsRNA传感器的识别。尽管许多上述关于最佳IVT mRNA生产的考虑因素已在一系列体外和体内实验中进行了检查，但关于它们对疫苗免疫原性的临床前模型的影响的细节不足。 自扩增mRNA疫苗。使用IVT mRNA的saRNA疫苗已经研究了十多年。这种模式通常使用来自α病毒的序列，其中非结构蛋白（编码RNA依赖性RNA聚合酶的复制酶基因）是完整的，而结构蛋白被感兴趣的抗原所取代。与非复制性mRNA疫苗相比，saRNA疫苗有可能以较低的剂量给人类接种，以诱导保护性免疫反应，减少疫苗诱导的不良事件和成本。与非复制性mRNA类似，saRNA也包含5′帽、5′-UTR、编码区、3′-UTR和聚(A)尾（图1）；因此，这些元素的病毒骨架特异性优化可以产生改进的疫苗设计。在saRNA摄取后，病毒复制酶产生多个编码抗原的RNA副本，导致持续的抗原生产。在RNA自扩增过程中，通常会生成dsRNA中间体，这些中间体通过激活各种细胞RNA传感器（例如TLR3、OAS、PKR、RIG-I和MDA5）来引发强烈的免疫激活，特别是通过激活I型干扰素反应15。这种强烈的炎症反应有利于免疫细胞的激活，但限制了来自saRNA的蛋白生产并降低了耐受性。saRNA疫苗在临床前模型中显示出早期的希望，即使在低疫苗剂量下也能诱导出强大的抗体和T细胞反应。相反，它们在早期COVID-19疫苗试验中在人类中的表现并不好。然而，最近的一项临床研究报告称，与用作加强剂量的BNT162b2核苷修饰mRNA配方相比，ARCT-154（Arcturus）COVID-19 saRNA-LNP疫苗的非劣性，用于以前接种过任何两种批准的COVID-19 mRNA疫苗的个体。ARCT-154和BNT162b2诱导的不良事件是可比的。值得注意的是，与BNT162b2（30微克）相比，ARCT-154的使用剂量要低得多（5微克）。由于这些有希望的发现，ARCT-154在日本获得许可，成为第三种获得批准的基于mRNA的药物。 saRNAs由于兼容性问题，通常使用传统的未修饰核苷酸生产，但最近的一项开创性出版物报告称，将某些未修饰核苷酸完全替换为修饰核苷酸，可以产生具有增加的翻译能力和显著降低的炎症能力的功能性saRNAs。具体来说，含有5-羟甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5-甲基尿嘧啶修饰的saRNAs在体外细胞转染效率方面优于其N1-甲基假尿嘧啶修饰的线性mRNA对应物。最重要的是，当以低剂量（10纳克RNA）使用时，含有5-甲基胞嘧啶的SARS-CoV-2 saRNA-LNP疫苗在小鼠中诱导出比N1-甲基假尿嘧啶修饰的线性mRNA-LNP疫苗更高的刺突抗原特异性IgG滴度和更高水平的保护。如果这些发现可以转化为人类，这可能为saRNA疫苗领域开辟新的道路。最近对saRNA疫苗的研究工作产生了创新的双组分载体系统，其中感兴趣的抗原和复制酶分别编码在不同的mRNAs上（图1）。分割载体系统是有利的，因为saRNA的长度可以减少，减轻RNA不稳定的问题，简化疫苗生产，并允许对双组分平台的两个组成部分进行单独优化。值得注意的是，与这种模式的成功使用相关的挑战是，两个RNA组分应该在同一细胞中存在，否则载体系统将无法工作。到目前为止，这两个组分的saRNA模式只在小鼠中进行了测试；因此，有必要在更高阶物种中进行研究。 2.2.mRNA疫苗的递送材料 mRNA疫苗递送的主题最近已经回顾了；因此，下面只讨论最关键的考虑因素和最新的发现。由于mRNA是一个大的、带负电荷的分子，它通过细胞膜的被动转移是一个低效的过程。早期的mRNA疫苗研究使用了物理方法（例如，基因枪和电穿孔）、精氨酸或聚合物复合mRNA，或者给药载有RNA的树突细胞来诱导保护性免疫。尽管这些方法在临床前研究中显示出一些希望，但它们在更高级的临床前和人类试验中并未显示出足够的效力和/或被证明是不切实际的。几十年来，永久带正电荷的脂质已被用于体外mRNA递送，但由于与带负电荷的血清蛋白的广泛相互作用，它们主要用于体内用途的次优选择；然而，这主要是在静脉注射纳米颗粒递送的背景下进行的，对于肌肉内给药的传染病mRNA疫苗可能具有有限的相关性。2010年代通过开发含有“可电离”脂质的LNPs解决了递送问题，它们通常由四个组成部分：磷脂质（辅助脂质）、胆固醇、聚乙二醇（PEG）缀合脂质和阳离子可电离氨基脂质（pKa通常为6.0-6.8），与封装的核酸一起，可以形成通常为50-150纳米的稳定颗粒。可电离脂质在生理pH下不带电荷，这使它们比永久带正电荷的替代品更安全。它们促进mRNA的细胞摄取，并通过在内体酸化后变得带正电荷来破坏内体膜，从而将核酸货物从内体释放到细胞质中。此外，它们为mRNA疫苗提供了强大的佐剂活性。mRNA-LNP疫苗的这种固有免疫刺激性活动允许在不添加进一步佐剂的情况下诱导出强大的保护性免疫反应。将可电离LNPs作为有效的核酸载体和强大的免疫佐剂的发现是偶然的和开创性的创新，它允许开发成功的COVID-19 mRNA疫苗mRNA-1273和BNT162b2。核苷修饰的mRNA-LNP疫苗平台的成功在于使用最少的免疫原性mRNA来最大化蛋白（抗原）生产，结合LNPs有效递送货物和促进强烈抗原特异性免疫反应的能力。 可电离LNPs的高度炎症性质可以被认为是一把双刃剑：虽然它对于诱导强烈的免疫反应至关重要，但它也可以限制它们可以如何被管理。通过鼻内疫苗管理来诱导粘膜免疫反应特别具有挑战性。然而，Moderna的一项研究最近证明了通过鼻内给药的SARS-CoV-2 mRNA-LNP疫苗在仓鼠中的效力，这表明优化可能会克服鼻内给药LNPs的低耐受性和安全性。尽管可电离LNPs是最先进的配方，但其他材料也用于实验性RNA疫苗中，可能会为给药途径提供更多的灵活性。一种新型纳米载体，称为脂质无机纳米颗粒（LION，一种阳离子油包水乳液），被优化用于saRNA的递送，然后在临床前和临床研究中用于mRNA疫苗开发（NCT04844268，NCT05132907）。 阳离子聚合物与mRNA形成复合物，可以通过目标细胞的内吞作用被摄取。早期研究使用聚乙二烯亚胺-saRNA复合物在小鼠中诱导针对流感病毒的免疫反应。由于聚乙二烯亚胺可能显示出高水平的毒性，它不是广泛使用的RNA递送材料。树状分子（超支化聚合物树状结构）也在针对埃博拉病毒、流感病毒、寨卡病毒（ZIKV）和弓形虫的临床前saRNA疫苗研究中显示出效力，但尚未报告使用该平台在大型动物或人类中的研究。 最近的一项开创性研究表明，阳离子可生物降解聚合物纳米颗粒（聚（胺-共-酯）(PACE)）可用于通过鼻内途径在啮齿动物中进行粘膜（肺部）免疫接种，以接种针对SARS-CoV-2 mRNA疫苗，以引发保护性免疫。优化含胺端基增强了mRNA从内吞颗粒中的内质网逃逸，PEG含量的修改进一步提高了PACE颗粒的mRNA传递。该平台证明了其安全性，因为在将PACE-mRNA传递给小鼠后，未发现肝脏酶水平升高或肺部有任何损害。最重要的是，作者证明了通过气管内传递的PACE-mRNA复合物被小鼠肺部的上皮细胞和抗原呈递细胞吸收，并表明他们的SARS-CoV-2 spike编码疫苗能在仓鼠中诱导保护性免疫。总体而言，新颖的PACE-mRNA平台对于引发粘膜免疫反应非常有价值，这对于限制呼吸道病原体的传播至关重要。大型动物研究和临床试验将很重要，以确认在啮齿动物中PACE-mRNA的令人印象深刻的发现是否能转化为更高阶物种。 3.mRNA疫苗的作用机制 从高层次上看，传染病mRNA疫苗的作用机制相当简单：编码一个或多个外来抗原的mRNA-LNPs（在大多数情况下）通过肌肉注射，被表达编码抗原的各种细胞类型吸收，然后被免疫系统识别并触发免疫反应。然而，许多关键问题仍然没有答案。哪些细胞正在表达抗原？它如何到达淋巴器官？先天免疫受体是如何被触发的？LNPs在mRNA疫苗接种后诱导免疫反应中的作用是什么？这些主题已经在27中广泛讨论；因此，下面将简要总结最关键的发现。 3.1.抗原表达和运输的位置 在肌肉注射mRNA-LNPs后，可以在脾脏、淋巴结和血浆中发现编码抗原的mRNA，如在非人类灵长类动物（NHPs）和人类的临床前模型中所示。mRNA在体内持续数天或更长时间，这取决于剂量和LNP的类型。更重要的是，肌肉注射的mRNA-LNPs的蛋白表达发生在注射部位，但血浆（血液）、肝脏中也检测到一些蛋白，可能还有其他器官，包括二级淋巴器官。在NHPs中进行的研究发现，许多浸润的免疫细胞以及成纤维细胞和脂肪细胞在注射部位翻译蛋白。虽然一些研究报告了mRNA-LNP的摄取和蛋白在肌细胞中的表达，但其他研究显示肌细胞没有参与。早期使用saRNA的研究表明，肌细胞是表达和呈递抗原的主要细胞类型。观察到的差异可能是由于LNP配方、细胞分析协议或mRNA平台（非复制mRNA与saRNA）的差异（图2）。根据这些主要在NHPs中进行的研究，很可能是表达疫苗抗原的巨噬细胞和单核细胞迁移到引流淋巴结（dLN）以向适应性免疫细胞呈递抗原；然而，也有可能是其他情况。使用saRNA疫苗的小鼠研究报告称，来自骨髓的浸润性抗原呈递细胞，包括树突状细胞，可能从转染的肌细胞中获取抗原，然后将其呈递给适应性免疫细胞，包括CD8+ T细胞。同样非常可能的是，LNPs可以通过淋巴系统通过被动运输到达dLNs（图2）。在NHPs中，可以在巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞以及组织细胞、网状细胞和内皮细胞中检测到mRNA或抗原，无论是通过肌肉注射还是皮内免疫。在NHPs的dLN中的B细胞和T细胞中也观察到mRNA或抗原的存在，但水平较低。在人类中，mRNA和/或抗原有效地运输到淋巴结并启动长达数月的生发中心反应。 抗原表达的位置高度相关，因为它可能直接影响适应性免疫反应。例如，在SARS-CoV-2血清阳性的个体中，即使这种反应并不强烈，也在肌肉注射COVID-19 mRNA疫苗后观察到上呼吸道诱导粘膜分泌IgA87。人们认为，只有在粘膜表面局部存在抗原时，才能诱导这种反应。可能是少量的mRNA和/或抗原通过血液运输到上呼吸道表面，正如在血浆中存在编码抗原的mRNA的研究支持的那样。 图2 | 肌肉注射后mRNA-LNP疫苗的转运。a. mRNA和由mRNA表达的抗原被渗透的巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、成纤维细胞和邻近的脂肪细胞以及内皮细胞吸收。肌肉注射mRNA疫苗后肌细胞吸收mRNA或表达抗原的程度尚不完全清楚。b. 抗原（可能通过迁移的巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞）和mRNA-脂质纳米颗粒（LNPs）随后被运输到淋巴结，在淋巴结中巨噬细胞、单核细胞、组织细胞、不同的树突状细胞亚群和与皮质窦、髓窦、副皮质窦和 trabeculae 相关的内皮细胞表达抗原。引流淋巴结中的B细胞和T细胞也表达低水平的抗原（未描绘）。尽管大多数疫苗抗原和/或mRNA在免疫后几天内变得不可检测，但在超过1个月的时间内可以在生发中心检测到疫苗mRNA，并且生发中心反应可以在人类中维持数月。暂时地，mRNA也可以在血浆、肝脏、脾脏中找到，并且根据LNP配方可能在其他地方找到。该图基于非人灵长类动物和人类的发现。 3.2.mRNA和LNP的先天感应 疫苗成分的先天免疫信号是启动强大的适应性免疫反应所必需的。然而，非常强大的免疫激活（特别是I型干扰素的产生）可能是有害的，因为它可以关闭mRNA的抗原表达并引起副作用。如上所述，未修饰和未纯化的IVT mRNA可以激活许多免疫传感器，但用N1-甲基假尿嘧啶修饰mRNA并纯化以去除dsRNA显著降低了mRNA感应。 除了编码抗原的mRNA外，LNP载体的组成部分，特别是离子化脂质，也触发先天免疫反应。研究表明，含有重组蛋白的空的、可电离的LNP比与重组蛋白一起使用的商业MF59样佐剂具有更强的佐剂活性，并且这种佐剂活性高度依赖于可电离的脂质。在另一项研究中，用含有可电离脂质SM-102和核苷修饰的mRNA处理的人外周血单核细胞产生了许多炎症细胞因子，包括IL-1β、IL-6、TNF、CCL5、VEGFA和G-CSF62。IL-1β特别值得关注，因为它是宿主防御反应对感染或损伤的关键介质，其释放意味着炎症体的形成。尽管还不完全了解LNP中的脂质如何触发先天免疫激活，但一个新兴的假设是内质网膜的破坏可能起作用。内质网逃逸是mRNA进入细胞质的重要步骤，并由LNP中的脂质促进。然而，最近，这种内质网损伤也被证明可以直接通过galectin识别和结合触发炎症。抑制galectins或使用更可生物降解的可电离脂质结构可能为未来减少免疫激活提供策略。 在小鼠中评估BNT162b2发现它通过激活dLN中的自然杀伤细胞和CD8+ T细胞触发干扰素反应，并且根据敲除小鼠研究，这种反应依赖于MDA5信号。由于RIG-I和MDA5都通过线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）信号传导，这一发现与报道的mRNA-LNPs的MAVS独立免疫激活形成对比。在人类中进行的一项开创性研究评估了对BNT162b2的先天免疫反应，发现先天免疫被强烈激活，包括强大的抗病毒签名，具体来说，是I型干扰素反应和RIG-I样信号的上调。在人类中诱导干扰素途径与这些疫苗的观察到的反应原性一致，认为这是由干扰素反应触发的。这些研究的部分不同发现可能反映了疫苗制剂（mRNA设计和生产，不同的LNPs）之间的差异以及小鼠模型和人类之间的免疫反应激活差异。 4.临床前和临床mRNA疫苗 由于COVID-19 mRNA疫苗的成功，近年来发表的关于mRNA疫苗的研究数量显著增加。不仅针对多种病毒，还针对某些细菌和寄生虫，包括蜱虫，其中一些已经进展到临床研究（表1）。下面总结了mRNA疫苗的最新临床前和临床工作。由于SARS-CoV-2 mRNA疫苗已经被广泛审查，这里将只突出COVID-19疫苗报告中具有高临床相关性的方面（方框1，下面讨论）。将集中讨论“主动”免疫工作，而mRNA编码单克隆抗体的最新发现总结在方框3和表2中。 4.1.流感病毒 季节性流感病毒疫苗通常显示出次优的保护水平；因此，基于mRNA的流感病毒疫苗受到了显著关注。与广泛使用的鸡蛋生产疫苗相比，mRNA-LNP平台技术有两个重要优势。首先，基于mRNA的季节性流感病毒疫苗可以快速设计和大规模生产。与基于鸡蛋的疫苗不同，在mRNA疫苗生产过程中没有引入不需要的突变的风险。此外，制造的便利性和大规模生产在大流行情景中可能是至关重要的。多价mRNA疫苗（针对多个抗原）可以诱导广泛的免疫。早期流感mRNA疫苗研究，通常使用单一抗原作为疫苗目标，展示了令人信服的临床前发现。在过去的5年中，下一代流感病毒mRNA疫苗已经使用了合理设计的抗原和/或多个抗原来增加保护性免疫反应的广度，并且，重要的是，临床试验的结果已经发表。Moderna在2015年开始了第一阶段的试验，使用单价核苷修饰的mRNA-LNP疫苗，编码H10N8和H7N9流感病毒的血凝素。当以50 µg或100 µg剂量肌肉注射时，这些疫苗具有适度的免疫原性和良好的耐受性，但抗体滴度相当快地下降。Moderna和其他公司在过去几年中也开始了临床试验——也使用了多价方法——一些发现最近已经公开。例如，在一项I-II期试验中，肌肉注射单剂量的mRNA-1010，一种四价季节性mRNA-LNP疫苗候选物，编码四种全长血凝素（世卫组织推荐用于2020-2021年流感季节的流感疫苗），在所有测试剂量（20 µg、50 µg和100 µg）下，针对疫苗匹配的流感A型病毒株诱导了更高的血凝素抑制（HAI）滴度，与灭活的季节性流感疫苗相比，针对流感B型病毒株的滴度相当。有趣的是，mRNA-1010的III期试验的中期结果不那么令人鼓舞；mRNA疫苗比季节性流感病毒疫苗诱导了更多的不良事件（分别为70%和48%），并且针对流感A型病毒显示出类似的免疫原性，针对流感B型病毒株的免疫原性较差。这些结果表明，可能需要改进的mRNA平台技术或合理设计的免疫原，以诱导优于当前许可的流感病毒疫苗所诱导的免疫。此外，添加其他抗原，如神经氨酸酶，可能有助于增加所诱导免疫的效力和广度。神经氨酸酶免疫原包含在mRNA-1020和mRNA-1030（Moderna）中，以及正在人类试验中测试的其他几种mRNA疫苗中（表1）。最后，值得一提的是，mRNA-LNP疫苗试验（例如，NCT05375838、NCT05596734、NCT05585632），使用联合配方，不仅针对流感病毒，还针对SARS-CoV-2和RSV，正在进行中，并且在人类中显示出前景（表1）。 4.2.呼吸道合胞病毒 RSV在婴儿、幼儿、老年人和免疫受损个体中引起严重的呼吸道疾病。RSV疫苗开发面临的一个主要障碍是未能诱导针对RSV融合（F）糖蛋白的强大中和抗体（nAbs），该蛋白介导病毒和目标细胞膜的融合。随着对RSV F的原子结构、构象变化和免疫原性的更好理解，可以合理设计针对F的预融合构象的抗原，并诱导强大的nAb反应。基于预融合F蛋白的疫苗针对老年人和孕妇（以保护新生儿）已于2023年获得FDA批准。Moderna在临床开发中有几种RSV mRNA-LNP疫苗候选物，并且一些结果已经发表。在成功地对mRNA-1777（参考文献103）进行临床前评估后，这是一种预融合稳定的RSV F编码的核苷修饰的mRNA-LNP疫苗，它在I期临床研究中进行了评估。疫苗在所有疫苗剂量（18-49岁成人25-200 µg和60-79岁成人25-300 µg）后单次肌肉注射耐受性良好，并以剂量依赖性方式诱导针对RSV A型和B型nAbs。此外，mRNA-1777诱发了可测量的抗原特异性CD4+ T细胞反应。一种改进版本称为mRNA-1345在一项大型III期试验中进行了测试，有35,541名60岁及以上的参与者。总体而言，疫苗在单剂量50 µg mRNA-LNP后耐受性良好，并对至少有两个症状的RSV相关下呼吸道疾病显示出83.7%的效力，对至少有三个症状的疾病显示出82.4%的效力。其对RSV相关急性呼吸道疾病的效力为68.4%。重要的是，mRNA-1345（以mRESVIA的名义）最近获得了FDA的批准，成为Moderna第二个获批的产品。该疫苗目前正在5-24个月大的儿童（NCT05743881）和12-59个月大的RSV血清阳性儿童（NCT04528719）中进行I期试验。 4.3.其他呼吸道病毒 人类偏肺病毒（hMPV）和副流感病毒（PIV）都会引起呼吸道疾病，主要影响婴儿、幼儿、老年人和免疫受损个体，目前没有获得许可的疫苗。Moderna开发了一种双价疫苗候选物mRNA-1653，编码hMPV和PIV3的全长膜结合融合蛋白。在I期研究（NCT03392389）中，两次肌肉免疫接种（间隔4周）使用相对较高的疫苗剂量（75 µg、150 µg和300 µg）针对两种疫苗目标诱导了强大的中和抗体（nAb）反应107。有趣的是，在给予更高疫苗剂量后检测到类似的nAb滴度，但不良事件是剂量依赖性的。在大多数初次加强剂量组中，针对hMPV A和B的nAb滴度在首次疫苗剂量给药后13个月仍高于基线，而针对PIV3的这种情况仅在300 µg组中观察到。还进行了另一项试验mRNA-1653（NCT04144348），包括12-59个月大的成人和儿童，但结果尚未发表。 总体而言，mRNA-LNP平台可以成功用于针对呼吸道病毒，因为这样的疫苗可以快速开发和生产，并且基于显著的临床经验（表1）——它们通常耐受性良好，可以诱导强大的nAb反应，并且可以根据需要调整以针对快速变化的病毒。然而，需要克服一些限制，例如人类中缺乏足够的抗体持久性或保护性粘膜免疫。 4.4.人类免疫缺陷病毒1 HIV-1感染影响着数千万人口，每年约有150万新感染者登记。HIV-1是最具有挑战性的疫苗目标之一，因为它的遗传多样性、复杂的免疫逃避机制和包膜（Env）糖蛋白的免疫原性差，这是抗HIV-1 nAbs的唯一靶标。因此，即使在40年的积极研究之后，也没有HIV-1疫苗可供人类使用。最近使用mRNA-LNP编码的合理设计的免疫原在各种动物模型中发表的研究显示出一些希望。这些报告证明了在小鼠中使用镶嵌免疫原诱导针对HIV-1蛋白质组保守区域的多功能T细胞反应，在使用saRNA编码的纳米粒子免疫原的转基因小鼠中诱导体细胞超突变到广泛中和抗体谱系，以及在NHPs中使用各种工程Env mRNA-LNPs产生多功能抗体。此外，在转基因小鼠模型中的研究表明，铁蛋白纳米粒子mRNA-LNP疫苗可以诱导具有中和异质HIV-1分离株能力的抗体，并且针对mRNA-LNP编码免疫原的种系抗体成功地启动了广泛中和抗体前体。一项开创性的NHP研究表明，一种共同表达膜结合Env和猴免疫缺陷病毒gag蛋白、产生类似病毒颗粒的mRNA-LNP疫苗，刺激了针对二级异质猴-人类免疫缺陷病毒的nAbs。 总体而言，使用合理设计的免疫原的有前景的临床前发现为临床发展铺平了道路。事实上，Moderna正在进行的I期临床研究（NCT05001373）评估上述纳米粒子免疫原（mRNA-1644）编码为mRNA-LNP以及第二个纳米粒子构建物mRNA-1644v2-Core。第二项试验（NCT05217641）使用mRNA编码（mRNA-1574）合理设计的Env三聚体在健康个体中（表1），美国国立卫生研究院还开始了一项I期研究（NCT05903339）利用mRNA编码的基于铁蛋白纳米粒子的免疫原。 4.5.黄病毒 黄病毒代表了一个多样的家族，主要是通过节肢动物传播的病原体，具有显著的流行潜力。已经开发了针对某些类型的黄病毒的许可疫苗，如日本脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、黄热病毒和登革热病毒（DENV），使用的是活减毒病毒、化学灭活病毒或病毒载体。人类还需要开发针对其他可能在人类群体中迅速传播的黄病毒成员的疫苗。新疫苗需要解决现有疫苗的一些缺点，如保护性免疫的广度不足（DENV）或可能引起不良事件的潜力，如抗体依赖性增强。能够诱导针对多种黄病毒的保护性免疫的多组分疫苗也将非常理想。疫苗的持久性也很关键，因为nAb水平的下降可能会增强疾病。有趣的是，2017年发表的首次突破性研究（使用核苷修饰的mRNA-LNP疫苗）证明了该平台能够诱导小鼠和NHPs对ZIKV的保护性免疫反应。在随后的几年中，针对黄病毒抗原的mRNA或saRNA平台在针对一系列目标的临床前研究中显示出希望，如ZIKV、DENV、波瓦桑病毒和黄热病毒。Moderna开发了第一代和第二代ZIKV mRNA-LNP疫苗，分别称为mRNA-1325和mRNA-1893。两种疫苗都编码ZIKV的前膜和Env糖蛋白，它们只在编码序列中相差五个氨基酸，并使用不同的前导序列。mRNA-1893在1/20的剂量下诱发了与mRNA-1325相当的nAb滴度，可能由于mRNA-1893能够形成类似病毒颗粒，并且在NHPs中提供了完整的针对ZIKV挑战的保护。两种疫苗都在I期临床试验（NCT03014089和NCT04064905）中以引导增强设置（两次注射之间4周）在黄病毒血清阴性或血清阳性的健康个体中进行了测试。总的来说，这些试验的发现与其他I期安全性和免疫原性mRNA疫苗试验相似；疫苗在广泛的剂量范围（10-250 µg）内耐受性良好，并且在更高剂量和第二次免疫后发现更多的不良事件。虽然mRNA-1325诱导了较差的nAb反应，但mRNA-1893表现良好，所有剂量在黄病毒血清阴性和血清阳性个体中都诱导了长期存活的（>13个月的初次免疫后）nAb反应。 4.6.其他病毒 针对多种其他相关的人类致病病毒开发了mRNA疫苗候选物。几个RNA病毒家族的成员可以引起人类的病毒性出血热，如沙粒病毒、布尼亚病毒、丝状病毒和黄病毒，大多数这些病原体没有疫苗可用。虽然大多数出血热病毒（HFVs）被认为是被忽视的热带疾病，但所有这些病原体的公共卫生影响是显著的。像2014-2016年西非埃博拉病毒这样的大规模爆发，以及潜在的大流行，是主要关注的问题。由于这些病毒组中的一些潜在疫苗抗原（例如，布尼亚病毒糖蛋白）具有复杂的折叠，并且使用标准方法难以表达，mRNA平台非常适合针对这些病原体的疫苗开发。尽管针对最相关的埃博拉病毒之一，扎伊尔埃博拉病毒，有两种病毒载体疫苗可用，但对载体平台的安全性的担忧证明了使用替代技术开发新的埃博拉病毒疫苗的合理性。针对埃博拉病毒糖蛋白的自复制和非复制mRNA疫苗在啮齿动物中诱导了保护性免疫，这为将来在大型动物中，可能在人类中进行研究提供了理由。同样有希望的结果也在使用mRNA疫苗针对其他HFVs，如拉沙病毒、克里米亚-刚果HFV和严重发热伴血小板减少综合征病毒，在啮齿动物疫苗研究中获得。 针对具有大流行潜力的其他病毒，如尼帕病毒和猴痘病毒（MPXV），已开发了mRNA疫苗候选物。两项针对尼帕病毒的临床前研究——一项针对可溶性亨德拉病毒糖蛋白，另一项针对与尼帕病毒糖蛋白单体共价连接的预融合稳定融合蛋白——分别在叙利亚仓鼠和 mice 中证明了保护性免疫。后者的疫苗候选物（mRNA-1215）正在由Moderna在I期临床试验（NCT05398796）中进行测试。针对2022年病毒爆发，迅速生成并测试了针对MPXV的mRNA疫苗。Moderna开发了一种针对四种高度保守的MPXV表面蛋白（M1, A29, A35 和 B6）的疫苗候选物，这些蛋白参与病毒附着，并在 mice 中证明了对相关牛痘病毒（VACV）的感染保护。该公司已开始对其MPXV mRNA疫苗候选物mRNA-1769进行I期试验（NCT05995275）。采用类似方法——针对病毒融合蛋白——在 mice 中证明了对VACV挑战的保护性免疫。BioNTech还开发了MPXV疫苗候选物，四价BNT166a针对M1, A35, B6 和 H3，以及不含H3组分的三价疫苗BNT166c。这两种疫苗都保护了 mice 免受VACV、MPXV I型和IIb型感染，BNT166a保护了NHPs免受致命的I型MPXV感染。BNT166a已进入临床试验（NCT05988203）。 针对狂犬病病毒的许可疫苗，使用灭活病原体，已经挽救了过去几十年中无数的生命。然而，现有配方的限制包括生产成本相对较高以及在流行区域需要多次剂量。多个针对病毒糖蛋白的mRNA疫苗候选物在小型和大型动物中显示出希望。CureVac在其I期试验（NCT03713086）中测试了其未修饰的mRNA-LNP疫苗候选物CV7202，发现疫苗在人类中诱导了nAbs，但只有低疫苗剂量（1 µg和2 µg）在引导增强计划中被良好耐受。转向这种疫苗的核苷修饰版本可能会允许使用更高的疫苗剂量来增加诱导的免疫反应，而不会诱发更多的不良事件。 人巨细胞病毒（HCMV）会导致常见的先天性感染，在免疫受损个体中尤其危险。已经投入了大量精力开发针对HCMV的安全有效的疫苗。几个临床前mRNA疫苗候选物使用核苷修饰的mRNA-LNP来针对病毒融合糖蛋白B和/或五聚体复合物，这些复合物对于进入是必要的，并在 mice、兔子和NHPs 中诱导了nAbs和细胞免疫反应。Moderna在I期试验中测试了mRNA-1647（一种多价HCMV mRNA-LNP疫苗，针对糖蛋白B和五聚体复合物），在0、2和6个月时肌肉注射180 µg剂量，发现在两种血清阴性和血清阳性试验参与者中，HCMV特异性抗体反应多功能且持久，与对照组相比，糖蛋白B特异性IgG反应较低，但总体nAb和抗体依赖性细胞毒性反应更高，后者是MF59佐剂糖蛋白B蛋白疫苗。 针对生殖器疱疹——一种由单纯疱疹病毒类型1（HSV-1）和HSV-2引起的非常常见的性传播疾病——的核苷修饰的mRNA-LNP疫苗开发也已有报道。理想的抗HSV疫苗将预防痛苦的生殖器病变，并减少或消除病毒脱落，这会危及传播给伴侣和新生儿。一种针对进入分子糖蛋白gD2和两种免疫逃避分子，糖蛋白gC2和gE2的三价HSV-2 mRNA-LNP疫苗，保护了 mice 和豚鼠免于发展成生殖器病变，并减少了病毒脱落。在后续研究中，该疫苗保护了 mice 免受HSV-1生殖器病变和潜伏感染，并为新生 mice 提供了保护。该配方，名为BNT163，目前正在由BioNTech在I期剂量递增、免疫原性和安全性试验中进行测试（NCT05432583）。Moderna还在进行I期试验（NCT06033261），使用HSV-2 mRNA-LNP候选物mRNA-1608，作为肌肉注射的引导增强疫苗。其他几个针对重要人类病毒病原体的有前景的mRNA疫苗候选物正处于临床前或临床开发中，数据有限或没有公开发表，如针对乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、Epstein–Barr病毒（EBV）、水痘-带状疱疹病毒和诺如病毒的候选物。Moderna正在研究临床EBV疫苗候选物mRNA-1189（针对gp42、gp220、gH和gL糖蛋白，NCT05164094）和mRNA-1195（NCT05831111），以预防传染性单核细胞增多症和EBV感染罕见但有时危及生命的后果或长期后遗症，如多发性硬化症。Moderna还在I期试验（NCT05992935）中研究针对诺如病毒感染的mRNA疫苗mRNA-1403（三价）和mRNA-1405（五价）。最后，Moderna（mRNA-1468，针对糖蛋白E）和BioNTech–Pfizer（BNT167，针对糖蛋白E）都有针对水痘-带状疱疹病毒的临床候选疫苗，处于I期（NCT05701800和NCT05703607）。 4.7.细菌 鉴于许多人类病原细菌中抗微生物耐药性的上升，开发安全有效的细菌疫苗是有必要的。然而，与病毒相比，针对细菌的疫苗开发通常更具挑战性，因为潜在的疫苗目标数量众多（细菌基因组通常比病毒基因组大得多），非蛋白质疫苗目标（糖；mRNA疫苗不能用于针对碳水化合物）和高度抗原变异。此外，与病毒疫苗相比，细菌疫苗所需的疫苗诱导免疫反应通常在质量上有所不同。诱导nAbs通常足以保护免受病毒侵害，但细胞外细菌（例如，肺炎链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等）通过补体介导的杀伤和抗体介导的吞噬作用等免疫机制有效靶向。此外，虽然大多数病毒目标并非绝对需要，但诱导强大的CD8+ T细胞反应通常对于有效靶向细胞内细菌至关重要。 研究表明，mRNA疫苗可能适合针对细菌。通过鼻内递送的未修饰裸mRNA已用于诱导针对结核分枝杆菌（结核病）的免疫反应，该感染影响全球超过十亿人。目前可用的结核病疫苗，卡介苗，效果低，持久性差，经常引起不良事件；因此，生成更安全、更有效的结核病疫苗是一个未得到满足的临床需求。编码四种结核病抗原（esxV、RpfD、PPE60和Ag85B）融合蛋白的saRNA-脂质无机纳米颗粒平台在 mice 中展示了一定程度的针对M. tuberculosis感染的保护。saRNA平台也被用于开发针对A组和B组链球菌的临床前疫苗。 最近，一种核苷修饰的mRNA-LNP疫苗，编码经过工程改造的环状置换F1（cp-caf1）耶尔森氏菌抗原，被证明在小鼠中单剂量接种后能诱导强烈的体液反应和对致命瘟疫感染的保护。一种优雅的基于免疫肽组学的方法被应用于识别理想的疫苗靶点，并为单核细胞增生李斯特菌——一种食源性细胞内细菌开发mRNA疫苗。通过在mRNA-LNPs中编码高度呈现的抗原（从多种细菌蛋白中选择），在小鼠挑战研究中实现了对李斯特菌感染的强大CD8+ T细胞反应和保护性免疫。铜绿假单胞菌，一种具有多重耐药菌株的关键人类病原体，也是通气相关肺炎的重要原因，也已成为研究目标。一种包含融合蛋白膜孔F（OprF）-脂蛋白I（OprI）和V抗原（PcrV；铜绿假单胞菌类型I分泌系统的一部分）的mRNA-LNP疫苗，在系统感染小鼠模型中诱导了保护性免疫反应。此外，一种针对莱姆病（美国最常见的媒介传播疾病）的mRNA-LNP疫苗，使用伯氏疏螺旋体的外表面蛋白（OspA）作为疫苗靶点，证明了在小鼠中诱导强烈的细胞和体液免疫反应，并对细菌挑战提供保护。针对蜱唾液蛋白的mRNA-LNP疫苗，用于预防莱姆病等媒介传播疾病，也在啮齿动物中进行了研究。Moderna和BioNTech正在进行针对莱姆病和结核病的mRNA疫苗的临床试验。Moderna的mRNA-1975（七价配方）和mRNA-1982（单价疫苗），都针对OspA，正处于I-II期开发（NCT05975099）。BioNTech的BNT164a1和BNT164b1是处于I期试验（NCT05547464）的结核病疫苗候选物。 4.8.寄生虫 致病寄生虫是影响数亿人、每年造成超过100万人死亡的多样化的真核生物群体。然而，针对这些病原体的疫苗开发极其困难，主要是因为真核细胞作为疫苗靶点的复杂性，以及它们逃避先天和适应性灭菌免疫反应的能力。越来越多的临床前研究表明，mRNA疫苗能够提供针对寄生虫病的保护。例如，针对弓形虫——弓形虫病的致病因子，以及利什曼原虫——利什曼病的原生动物致病因子，开发了具有保护性的临床前mRNA疫苗。针对疟疾的mRNA疫苗候选物也已经产生并进入临床开发。 疟疾感染是世界主要的健康问题之一，每年造成数亿例临床病例和数十万人死亡。疟疾疫苗可以分为三类：针对孢子体或肝期寄生虫的红前期疫苗，针对滋养体或感染红细胞的血液期疫苗，以及针对配子体和蚊子期寄生虫的阻断传播疫苗。一种针对恶性疟原虫（PfCSP）的环孢子体蛋白（CSP）的佐剂蛋白基础红前期疟疾疫苗已被批准用于人类，尽管它显然提供了公共卫生利益，但仍有改进其有效性的余地。近年来，多项临床前研究为核苷修饰的mRNA疫苗能够引发对由P. falciparum和P. vivax引起的疟疾的保护提供了概念验证。疫苗抗原包括PfCSP、P. falciparum的谷氨酸富含蛋白（PfGARP），以及针对P. falciparum的P. falciparum ookinete表面（Pfs）25和230D1蛋白，分别针对红前期、血液期和传播期的P. falciparum病原体。重要的是，BioNTech在2022年开始了一种编码PfCSP的mRNA疫苗候选物BNT165b1的临床开发（NCT05581641）。 一种编码疟原虫巨噬细胞迁移抑制因子（PMIF）的saRNA疫苗，该因子调节宿主对疟疾的炎症反应，改善了对肝期和血液期疟原虫感染的控制，并在致命的小鼠模型中提供了对再感染的完全保护。在一项机制研究中，静脉注射α-半乳糖神经酰胺-佐剂脂质复合物基mRNA疫苗，编码核糖体蛋白L6（RPL6）疟疾抗原，诱导了肝驻留记忆T细胞，并在小鼠中提供了保护。 虽然P. falciparum疟疾比P. vivax疟疾造成更多死亡，但后者影响更多人（超过30亿人）在全球范围内，并且目前没有批准的疫苗。P. vivax疟疾也更难控制和消除，因为它的休眠肝期可以潜伏数月至数年，然后重新激活。最近的一项小鼠研究开发了使用Pvs25作为疫苗抗原的阻断传播疫苗，并证明了一种优化的全长Pvs25编码核苷修饰的mRNA-LNP疫苗候选物优于对照佐剂Pvs25蛋白疫苗，并激发了更强大和持久的功能性免疫。 总的来说，mRNA基础的疟疾疫苗领域取得了显著的进展，为这类疫苗在可预见的未来将可用于人类提供了希望。 5.挑战、限制和机遇 尽管核苷修饰的mRNA-LNP平台技术在COVID-19大流行期间被证明非常有效，并且是我们大流行病准备的重要部分，但当前一代mRNA疫苗的局限性需要克服，以进一步提高这种疫苗方式的价值。值得注意的是，这些挑战中的许多并不特定于mRNA疫苗，也适用于其他疫苗平台。 5.1.临床前模型的局限性 免疫原性。包括mRNA-LNP疫苗在内的疫苗开发的一个普遍问题是，临床前模型对人类免疫原性的预测价值次优。一个明显的例子是Moderna开发的H10流感病毒疫苗候选物。基于血凝素的H10疫苗在雪貂中诱导了非常高的HAI滴度，达到约1:3,000，这通常很难用传统疫苗平台诱导。同样的疫苗在人类中诱导了短暂的，大约1:100的HAI滴度，在6个月内消退。同样，基于mRNA-LNP的季节性流感病毒疫苗在不同的动物模型中诱导了非常高的中和抗体滴度，但似乎与常规季节性流感病毒疫苗（具有更好的耐受性）在人类中相当——在某些情况下甚至不如——在人类中。对COVID-19 mRNA-LNP疫苗的类似发现；它们在小鼠中诱导强烈和持久的免疫反应，但在人类中免疫反应和动力学较差。NHP模型似乎更能反映人类中的疫苗诱导免疫反应；然而，它们昂贵，其使用引发伦理关注，并且在某些情况下，由于NHPs对某些感染（包括季节性流感病毒）有抵抗力，无法评估疫苗诱导的保护。 安全性和反应原性。在人类中，mRNA-LNP疫苗触发了系统性炎症反应，这在小鼠和其他动物模型的研究中并未预测到。这一发现至少部分是由于不同物种间IL-1受体信号传导的差异62所造成的。这些不良事件（称为反应原性）有时相对较强，包括发热、不适、头痛、身体疼痛等。反应原性在年轻人中更普遍，并且在第二次接种mRNA疫苗后通常更强，这表明不仅先天免疫反应，适应性免疫也有所贡献。有趣的是，有报道称mRNA-1273比BNT162b2引起更强的反应原性，可能由于剂量、mRNA生产程序和LNP配方的差异。疫苗诱导的不良事件可能严重到导致工作小时数的损失，这不仅可能对个人未来接种疫苗的意愿产生负面影响，还会造成经济负担。一些非常罕见的副作用，包括过敏性反应（也见于其他疫苗）和心肌炎，主要见于12至24岁的男性，更为麻烦。mRNA-1273也观察到延迟的大局部反应，最近在HIV-1 mRNA-LNP疫苗（Moderna）的临床试验中报告了皮疹。为了使mRNA-LNP疫苗在常规、非大流行环境中更易被接受，应提高这种疫苗方式的安全性和反应原性。修改LNP配方和改进mRNA设计及生产可能减少先天免疫对mRNA的识别。然而，必须指出反应原性和免疫原性通常相伴出现，具有改进安全性概况的疫苗可能诱导较弱的免疫反应。 一个关键挑战是缺乏评估疫苗诱导副作用的相关动物模型。不同物种间先天免疫受体的微妙差异使得很难基于动物模型中获得的数据来预测人类的反应原性。此外，人类对许多病原体的预先存在的免疫和各种免疫激活状态可能影响反应原性，而在动物中模拟这些条件是具有挑战性的。识别和调查非常罕见的副作用，如心肌炎或过敏性反应，更是复杂，因为它们的流行率通常非常低（每100,000剂接种疫苗的事件数很少）。因此，即使是III期临床试验，也不太可能足以在这方面获得相关信息。 5.2.诱导期望的免疫反应 粘膜免疫。肌肉注射或皮内注射的疫苗通常在上呼吸道（URT）中诱导粘膜免疫的能力较差。然而，URT中的局部免疫对于抵抗呼吸道病毒感染很重要，因为这是这些病原体的入口以及传播的场所（图3）。在COVID-19疫苗开发的早期就已注意到，注射的mRNA疫苗可能会很好地保护人类免受有症状疾病的侵害，但可能不会有力地保护免受感染本身，这在这些疫苗的临床前开发中已在动物模型中观察到。现在已清楚，这一预测是准确的。尽管COVID-19 mRNA疫苗可以在以前感染过SARS-CoV-2的个体中引起一定程度的粘膜免疫，但与SARS-CoV-2感染相比，它们通常不会在URT中诱导强大的抗体反应。这是有问题的，因为URT中的粘膜免疫与免受SARS-CoV-2和其他呼吸道病毒的感染有关。一个关键挑战是制定mRNA疫苗的配方，通过诱导分泌型IgA和驻留记忆T细胞（图3），安全地在URT中引起强烈的粘膜免疫反应。解决这个问题的一个策略是开发可以通过鼻内或口服给药安全有效地递送到粘膜表面的mRNA配方。大多数当前基于LNP的mRNA配方对这种递送途径来说并不理想，因为吸收差和毒性。其他类型的mRNA递送分子，如聚合物，可能更适合此目的。事实上，通过各种递送方式的改变，已经取得了粘膜mRNA疫苗配方的首次成功尝试，这些有希望的研究将为这一重要的疫苗途径提供前进的道路。第二种策略可能是使用注射的mRNA疫苗，除了编码抗原外，还编码驱动B细胞和T细胞反应到粘膜部位的因素或甚至是归巢分子。然而，这种方法首先需要阐明URT的归巢机制200。在粘膜表面针对细菌感染的免疫方面，共表达驱动Th17 T细胞反应的细胞因子或转录因子也可能有益。 图3 | 粘膜免疫、呼吸道病毒和mRNA疫苗接种。a. 上呼吸道的表面是呼吸道病毒的主要入口点，而下呼吸道的病毒复制通常与严重疾病相关。人们认为，局部产生的分泌型IgA1（sIgA1）是保护上呼吸道的主要抗体类型，而血清IgG1被认为是保护下呼吸道的主要抗体类型。b. 通过肌肉注射接种mRNA-脂质纳米颗粒疫苗可以诱导强烈的系统性IgG反应；这些IgG的一部分也会短暂地出现在上呼吸道。然而，局部sIgA1反应并未被强烈诱导，因此病毒传播未被有效阻断。c. 开发粘膜mRNA疫苗，例如，使用新的传递载体，如聚合物或较少炎症的脂质纳米颗粒，可能允许安全地在上呼吸道诱导局部抗体和细胞免疫反应。d. 共同传递编码在B细胞和T细胞中表达的上呼吸道归巢分子的mRNA，可能即使在肌肉注射mRNA疫苗后也能激发有效的粘膜免疫反应。c和d部分中的免疫反应也可能在突破性感染的情况下阻断进一步传播。 预先存在的免疫和印记。COVID-19 mRNA-LNP疫苗在大多数接种个体中引起了强大的保护性免疫反应。对一个完全未接触过的群体进行疫苗接种是一个罕见的场景，主要涉及新出现的大流行病原体。人类通常对病原体有广泛和复杂的预先存在的免疫，包括流感病毒、RSV，现在还有SARS-CoV-2，这种预先存在的免疫将以积极和消极的方式影响疫苗接种的免疫反应。在对SARS-CoV-2 spike蛋白有广泛预先存在的免疫的个体中，额外的mRNA疫苗加强剂量的增强效果要小得多（预先存在的抗体对疫苗接种的免疫反应的抑制作用也已描述过流感）。此外，预先存在的免疫可能影响免疫反应的质量和特征。由于病毒发生了抗原变化，因此在2022年引入了基于SARS-CoV-2变体的mRNA疫苗。当更新后的疫苗用于以前接触过原始SARS-CoV-2 spike的个体时，大多数反应是与原始SARS-CoV-2 spike蛋白交叉反应的，并且几乎未诱导针对变体的特定新生免疫。这让人想起背boost或原始抗原罪行型现象，描述了流感病毒，其中暴露于新变体病毒引起一个交叉反应反应，针对新毒株和生命早期遇到的毒株，以牺牲对新毒株的新生株特异性反应为代价。虽然这些与预先存在的免疫和缺乏强大的新生反应的问题是一个普遍现象，也是所有疫苗平台的问题，但测试mRNA疫苗在具有预先存在免疫的动物模型中将是有益的，以促进它们的成功部署。此外，由于mRNA配方也可以设计为共表达细胞因子和趋化因子，该平台可能特别适合开发专门针对原始B细胞而非记忆B细胞的疫苗，以驱动更好的新生变体特异性反应。这不仅对SARS-CoV-2很重要，对流感病毒疫苗也很重要。 疫苗诱导的免疫反应的持久性。mRNA-LNP疫苗诱导的免疫反应的持久性一直是讨论的重要问题。针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗在SARS-CoV-2未接触过的个体中引起了强烈的浆细胞反应，导致针对SARS-CoV-2的抗体滴度显著增加。浆细胞是短期存活的B细胞，它们在外围循环并产生抗体，但只活跃约2周。然后抗体水平开始下降，IgG的半衰期约为30天。由于mRNA疫苗最初诱导的针对SARS-CoV-2的高抗体水平，这种下降看起来很戏剧性，通常在免疫后6个月内抗体滴度减少10-20倍。与此相比，腺病毒载体疫苗平台观察到的抗体衰减速度较慢；然而，这些疫苗并没有诱导最初的高抗体峰值。实际上，尽管由COVID-19 mRNA疫苗诱导的针对SARS-CoV-2的特异性抗体滴度最初开始下降，但最终会变得稳定。这些稳定的长期滴度由骨髓中不同的B细胞亚群产生，称为长期存活的浆细胞，它们通常可以持续一生。还观察到mRNA-LNP疫苗在接种疫苗的人类的淋巴结中引发惊人的长期（数月）生发中心反应。这些可能有助于增加长期存活的浆细胞的频率，但这些持久的生发中心反应的重要性仍然不清楚。总体而言，尽管mRNA疫苗诱导的抗体反应有显著的初始下降，但这可能更多是最初诱导的高抗体峰值的效果，而不是mRNA疫苗实际上无法诱导持久免疫。然而，保持mRNA疫苗接种后的高抗体水平以保证长期保护是可取的。通过优化疫苗配方，将更多的B细胞从生发中心反应引导到骨髓，这可能是可行的。例如，下一代合理设计的LNP可能允许精确靶向关键的免疫细胞类型，并最终诱导所需的免疫反应。其他可能性包括在LNP中加入具有额外佐剂活性的分子，以进一步增强其效力，或共表达转录激活因子、细胞因子或归巢分子，引导B细胞成为长期存活的骨髓浆细胞。 CD8+ T细胞反应。虽然中和和结合抗体作为许多病毒疫苗的保护相关因素，细胞毒性T细胞反应也可能与保护相关（例如，对于流感病毒）。人们认为，当抗体反应未能中和病毒时，CD8+ T细胞反应可以保护免受SARS-CoV-2引起的严重COVID-19进展（通常在抗原漂移变体中看到）。因此，核苷修饰的mRNA疫苗的另一个重要目标是在人类中诱导强大的CD8+ T细胞反应。流感病毒核苷修饰的mRNA疫苗在小鼠中诱导了强大的CD4+ T细胞（和抗体）反应，但CD8+ T细胞反应中等。这些观察在一定程度上适用于人类中的基于mRNA的COVID-19疫苗，其中通常比强大的CD4+ T细胞诱导引起较弱的针对Spike蛋白的CD8+ T细胞反应（尽管CD8+ T细胞似乎足够初始化，可以通过突破性感染被强烈激活）。这与未修饰的非复制mRNA和saRNA疫苗形成对比，这些疫苗已知可以驱动强大的CD8+ T细胞反应，可能由于它们能诱导更高水平的I型干扰素，这有助于诱导更强大的细胞免疫反应。目前尚需探索如何通过核苷修饰的mRNA疫苗更好地激活CD8+ T细胞，以及共表达特定细胞因子或改变mRNA设计和生产或LNP化学是否是解决这一限制的关键。 针对递送载体的抗体产生。mRNA-1273和BNT162b2不仅针对编码的疫苗抗原，而且有些令人惊讶地也针对LNP载体引起了适应性免疫反应。LNP表面的PEG成分被确定为主要的非目标抗体反应的原因。与BNT162b2配方相比，mRNA-1273配方诱导了更高水平的抗PEG抗体，可能由于疫苗配方的不同组成。尽管尚不清楚这些反应是否总是有害的，但重要的是进一步监测这一现象并探索潜在后果。对LNP的抗体可能会影响LNP的摄取，通过移除它们或将它们导向不同的Fc受体承载细胞类型；这可能导致使用相同基于LNP的平台进行重复剂量的效率问题。此外，抗PEG抗体水平的增加可能会导致某些患者群体中使用的其他聚乙二醇化药物的更快清除（因此效果较低）。总的来说，LNP不是免疫学上无活性的分子，并且可以成为适应性免疫反应的目标。然而，存在可能具有较低免疫原性的PEG替代品。 5.3.疫苗配方和选择 多组分疫苗配方。多价mRNA-LNP疫苗的一个有趣但尚未充分研究的方面是mRNA编码的抗原异源多聚体化（hetero-multimerization）的潜在问题。例如，当两种（或更多）不同的SARS-CoV-2变异株刺突蛋白在同一细胞中由mRNA疫苗表达时，可能形成由不同变体单体组成的三聚体。类似的问题可能也出现在含有四种不同类型的血凝素（H1、H3和两种B型血凝素）的基于mRNA-LNP的流感病毒疫苗中。异源三聚体的形成可能导致结果蛋白的错误折叠，从而可能不准确地反映糖蛋白表面的中和或保护性表位。这种理论上的担忧尚未通过实验验证，但可能是原始株-BA.5二价COVID-19 mRNA疫苗相比XBB.1.5单价疫苗表现较差的原因之一，也可能在临床测试的基于mRNA的流感疫苗中流感B病毒组分的较低免疫原性中发挥作用。此外，多价或多组分疫苗的一个组分可能对其他组分产生免疫优势。这在其他疫苗类型中已有描述，并且可能通过调整疫苗中各种mRNA的比例来克服，例如，减少编码优势组分的mRNA量和/或增加亚优势组分的量。 剂量选择。mRNA疫苗临床开发的一个重要方面是剂量选择。最初的SARS-CoV-2 mRNA疫苗临床试验包括100微克或更高剂量的mRNA。mRNA-1273的第一个版本剂量为100微克mRNA，但后来用于加强剂量的版本将剂量减少到50微克，可能是为了减少不良反应。50微克mRNA剂量似乎是当前人类预防性疫苗的耐受性上限（改变mRNA和LNP化学可能有助于改善这一点），这限制了多价mRNA-LNP疫苗中包含的抗原组分的最大数量。例如，目前正在开发的八价mRNA-LNP流感病毒疫苗候选物，包括四种血凝素和四种神经氨酸酶构建物，假设不同组分以相同量使用，为了不超过50微克总疫苗剂量，每个构建物只能使用6.25微克mRNA。目前尚不清楚这些低剂量是否能在人类中诱导足够强大和持久的免疫反应。在未经免疫的人群中，10微克SARS-CoV-2 mRNA剂量比30微克剂量诱导的免疫反应明显较低，这表明mRNA疫苗在临床使用中至少对当前配方存在价数限制。克服这些障碍对于包含流感病毒、RSV、SARS-CoV-2、hMPV和不同副流感病毒以及季节性冠状病毒抗原的泛呼吸道病毒疫苗的开发至关重要。更简单的多价配方，例如包含流感病毒和SARS-CoV-2（甚至RSV）抗原的mRNA-LNP疫苗，已经在开发中（表1）。 对抗原变化的响应。mRNA疫苗的一个关键优势是它们的灵活性，特别是对于那些需要频繁更新的疫苗，如流感病毒疫苗和SARS-CoV-2疫苗。基于灭活病毒的流感疫苗每年更新一次，以反映流通的毒株。为即将到来的北半球季节选择疫苗配方的组分，这一过程每年二月进行，基于监测和预测（南半球疫苗的生产也有类似的过程）。更新疫苗的生产大约需要6个月的时间，在这段时间里，有时变得清楚的是，选择的疫苗株不是最优的，可能与流通的毒株不匹配，对疫苗的有效性产生重大负面影响。SARS-CoV-2 mRNA疫苗在大约2个月内进行了更新和生产。因此，使用mRNA平台进行季节性流感病毒疫苗的潜在可能允许更晚的毒株选择，并且能够开发出比使用传统平台生产的疫苗更匹配流通毒株的疫苗。 反向疫苗学3.0。当新疫苗进入临床开发时，通常只测试一种疫苗抗原，因为Good Manufacturing Practice生产过程的高成本和复杂性通常需要为所选抗原专门设计（框4）。这种抗原可能在不同剂量下进行测试，或与不同的佐剂结合使用，但包含额外版本的抗原通常成本过高。mRNA疫苗克服了这一限制，因为即使抗原序列不同，也可以使用相同的流程进行制造（框4）。mRNA疫苗技术还允许针对大型多亚基抗原或病毒表面抗原，这些抗原由于存在多个跨膜域而难以作为重组蛋白生产（例如，布尼亚病毒GnGc蛋白）。与临床测试几种候选疫苗同时进行的预临床试验中测试许多不同版本的抗原或许多不同的病原体抗原也是现实的。然后可以根据人类试验中获得的数据选择最佳疫苗候选物。这一过程在辉瑞-BioNTech COVID-19疫苗的选择过程中被利用，其中BNT162b2在临床测试几种不同版本后被选为领先候选物。未来，mRNA疫苗的这一重大优势可能导致对表达许多不同蛋白质且最佳疫苗靶标未知的病原体的疫苗开发取得突破，包括结核病、不同的单细胞和多细胞寄生虫，包括疟原虫和锥虫种类，甚至DNA病毒具有大基因组和未知保护性抗原，如非洲猪瘟病毒。这一“反向疫苗学3.0”过程（图4）可以类似于用于开发B型脑膜炎奈瑟菌疫苗的“反向疫苗学”过程，但将显著更快，并且具有更高的吞吐量（“反向疫苗学2.0”被定义为基于免疫系统与抗原之间相互作用的结构分析的合理疫苗设计）。重要的是，最终的疫苗配方可能在确定正确的保护性靶标抗原后基于另一种疫苗平台（例如，重组蛋白疫苗）。 图4 | mRNA疫苗生产的简单和速度：反向疫苗学3.0。a. 对于大多数传统疫苗平台，需要为每个单独的抗原分别开发包括上游处理、下游处理以及放行标准和测试的流程，并且不同流程之间通常存在显著差异。mRNA生产主要是序列独立的；相同的生产程序可以用来生产任何编码蛋白质抗原的mRNA。这使得Good Manufacturing Practice生产非常灵活，成本效益更高。b. 生产编码许多不同抗原的mRNA疫苗的简便性和灵活性使得“反向疫苗学3.0”成为可能。例如，一个复杂病原体的所有开放阅读框（ORFs），其保护性抗原未知，可以作为mRNA疫苗生产并在动物挑战模型中进行测试，然后可以快速鉴定出具有保护性的抗原，这些抗原随后可以作为疫苗候选物进行更详细的临床前研究，甚至可能进行临床研究。 5.4.疫苗公平和全球获取 mRNA疫苗的一个重要挑战是全球疫苗公平。在COVID-19大流行期间，低收入和中等收入国家（LMICs）获得mRNA疫苗的机会不佳且被延迟。低收入国家通常获得病毒载体和基于灭活病毒的SARS-CoV-2疫苗（或根本没有疫苗）；这是由于定价、获取、超冷存储分销网络的可用性、疫苗民族主义和疫苗外交。mRNA疫苗需要冷冻长期储存的要求即使在高收入国家也可能对疫苗推广造成问题。目前正在开发在4°C甚至室温下稳定的mRNA疫苗，这些热稳定的mRNA疫苗可能会进一步增加mRNA疫苗技术的全球影响。为了让mRNA疫苗技术在全球范围内可用，建立全球各区域的开发和生产能力也很重要。许多传统疫苗生产商和LMICs的初创公司已经开始开发自己的mRNA疫苗配方和设施，这是有希望的。已经开始了一些加强这一努力的倡议，但一些mRNA疫苗制造商已经在缩减他们向LMICs转移技术的努力。同样还有待观察的是，mRNA和LNP技术的潜在知识产权问题是否可以解决，以促进LMIC疫苗生产商的获取。全球分布的mRNA疫苗开发商和生产商将无疑增加大流行病的准备，并允许LMICs依赖自己的疫苗，而不是依赖高收入国家及其疫苗外交。 6.结论和展望 尽管基于RNA的疫苗，特别是核苷修饰的mRNA-LNP配方，多年来显示出巨大的希望，但正是COVID-19大流行使它们成为焦点，并导致了首批获得许可的mRNA疫苗。然而，我们远未实现基于RNA的疫苗的全部潜力，需要进一步的优化来解决当前的限制。在这方面，有机会开发具有增强免疫原性和降低反应原性、更大的稳定性以及能够诱导粘膜免疫反应的新型RNA疫苗配方。除了病毒，还需要针对人类致病细菌、真菌和寄生虫的mRNA疫苗，以及能够同时保护免受几种不同病原体侵害的疫苗。mRNA疫苗设计和制造的灵活性和简便性可能会彻底改变抗原选择和疫苗开发，并可能使得为以前难以捉摸的病原体设计疫苗成为可能。对mRNA疫苗作用机制的更深入理解将指导下一代mRNA疫苗的设计。mRNA疫苗技术为疫苗开发、免疫接种和大流行病准备的未来持有巨大希望，并已经为疫苗学的新的黄金时代做出了贡献。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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蛋白质替代疗法是一种医疗手段，用于治疗因基因突变导致特定蛋白质缺失或功能失常的疾病。传统的治疗方法通常涉及复杂的体外蛋白质生产和纯化过程，成本高昂。然而，随着mRNA药物技术的发展，尤其是在SARS-CoV-2疫情期间，mRNA药物的快速体内抗原生产能力得到了验证，为蛋白质替代疗法提供了新的治疗途径。这项技术的发展，包括体外转录mRNA和纳米脂质载体的应用，为临床前和临床应用中的mRNA作为治疗工具提供了新的可能性。 在这篇综述中，我们将探讨mRNA在蛋白质替代疗法中的应用，包括其在临床前和临床研究中的使用，以及生产修饰mRNA、细胞内递送系统和成品相关的关键质量属性。我们将详细讨论体外转录mRNA的优化、纳米脂质载体的设计，以及如何提高mRNA的稳定性和翻译效率，以实现更有效的蛋白质替代。此外，我们还将探讨如何通过改进mRNA的化学修饰和递送策略来最小化免疫反应，从而提高治疗效果。 在面对遗传缺陷和先天性代谢疾病时，传统的治疗方法往往集中于缓解症状而非根治病因。因此，能够针对疾病根本原因的治疗策略，如DNA疗法和新兴的RNA疗法，成为了科学界研究的热点。尽管基因编辑技术在基因治疗领域备受关注，但其他具有潜力的治疗手段，例如RNA疗法，也已经开始展现其独特的优势，相比侵入性或永久性手术，它们可能提供更为安全和可逆的治疗方案。 RNA疗法主要基于RNA分子的两大核心功能：调控和编码。在调控方面，反义寡核苷酸（ASO）技术通过与目标RNA转录物的互补序列结合，实现对其表达的精细调控。目前，已有多种ASO药物获得FDA批准，用于治疗包括杜氏肌营养不良症、家族性淀粉样多发性神经病、脊髓性肌萎缩症和家族性乳糜微粒血症综合征在内的多种疾病。 除了ASO，小干扰RNA（siRNA）也是通过RNA干扰（RNAi）机制发挥作用的分子，它通过与RNA诱导沉默复合物（RISC）结合，特异性地降解目标mRNA，从而阻断特定基因的表达。基于siRNA的药物已经成功上市，用于治疗TTR淀粉样变性和肝卟啉症等疾病。 microRNA是另一类调控RNA分子，它们通过与RISC结合，抑制目标mRNA的翻译或促进其降解，从而调控基因表达。RNA适体则代表了一种不同的调控机制，它们通过特定的三维结构与异源靶标（如蛋白质和碳水化合物）相互作用，这种结构上的多样性赋予了RNA适体广泛的应用潜力。 RNA疗法的这些调控功能为治疗遗传性疾病提供了新的策略，它们通过精确调控基因表达，有望为患者带来更为精准和有效的治疗方案。随着RNA技术的进步，未来可能会有更多的RNA疗法被开发出来，以应对各种遗传性和代谢性疾病。 信使RNA（mRNA）的编码潜能，即其指导肽或蛋白质合成的能力，已经开辟了一种全新的治疗途径，即mRNA蛋白质替代疗法。这种疗法的核心在于利用mRNA分子瞬时表达特定的蛋白质，以补充或替代体内因基因缺陷而缺乏的功能蛋白。mRNA的这一特性源于其在细胞内的基本生物学功能，即作为基因表达的中间产物，将遗传信息从DNA转录并传递给细胞的翻译机制，以合成蛋白质。 在实验室中，科学家们通过将外源mRNA直接注射到生物体内，并观察其能否诱导目标蛋白质的表达，从而验证了mRNA作为治疗手段的潜力。这种技术最初被用于研究和治疗罕见的单基因遗传疾病，这些疾病通常由单个基因的突变引起，导致相应的蛋白质功能失常或完全缺失。 尽管这些所谓的“孤儿病”在人群中的发病率较低，但它们的种类繁多，累加起来影响着全球相当数量的人群。为了鼓励制药公司开发治疗这些疾病的药物，许多国家出台了特别的立法措施，提供市场独占权和其他激励措施，以促进孤儿药的研发。这些药物虽然可能价格昂贵，但对于患者来说，它们提供了治疗罕见疾病的唯一希望。 mRNA蛋白质替代疗法的另一个重要应用是mRNA疫苗的开发。这种疫苗通过提供编码病毒抗原的mRNA，使得接种者的细胞能够产生病毒蛋白，从而激发免疫系统产生针对该病毒的免疫反应。这种方法在COVID-19疫苗的开发中取得了巨大成功，展示了mRNA技术在现代疫苗学中的潜力。 随着mRNA技术的不断进步，未来可能会有更多的mRNA蛋白质替代疗法和疫苗被开发出来，以治疗各种遗传性疾病和预防传染病。 蛋白质替代方案——为什么选择 mRNA？ 除了利用mRNA技术，还有其他几种策略可以用于蛋白质替代治疗。基因治疗是一种方法，它通过将健康的基因拷贝传递到患者体内，以补偿或纠正缺陷基因，从而恢复蛋白质的正常功能。这种方法的目的是直接在细胞内修复遗传错误，以期达到治疗遗传性疾病的效果。 另一种直接的方法是将蛋白质本身直接输送到患者体内，这种方式可以避免细胞内翻译过程的复杂性，允许更精确的剂量控制，并能够在目标组织中实现较高的蛋白浓度。这种方法已经被用于多种疾病的治疗，包括激素、酶、凝血因子和干扰素的替代疗法。然而，这种方法也有其局限性，包括蛋白质的半衰期可能较短，稳定性可能不足，以及可能引发免疫反应，这些因素都限制了其广泛应用。 此外，直接蛋白质替代疗法并不适用于所有类型的蛋白质替代，特别是那些位于细胞内的蛋白质，如转录因子和其他调节分子，因为这些蛋白质无法通过简单的递送方式进入细胞。 即使存在这些挑战，蛋白质替代治疗仍然是治疗某些遗传性疾病的有效手段，并且随着生物技术的进步，未来可能会有更多创新的方法被开发出来，以克服当前的局限性并扩大治疗范围。 利用核酸作为蛋白质替代治疗的手段，确实规避了直接蛋白质递送所面临的一些挑战，提供了治疗上的灵活性。然而，核酸治疗策略同样不是没有缺点。基因治疗的插入机制既赋予了其独特的优势，也带来了一定的局限性。 病毒载体在基因治疗中的应用能够确保目标基因被有效地整合进宿主细胞的基因组中，从而实现持久的基因表达。但这种整合可能会引起基因组的不稳定，存在潜在的致癌风险，这是一个不容忽视的问题。尽管并非所有病毒载体都会整合进基因组，它们对特定组织的选择性使得它们成为有吸引力的基因传递工具。但这种方法也可能引发其他问题，比如可能产生针对病毒载体的中和抗体，药代动力学特性可能不理想，以及在病毒载体上包装所需基因的难度。 与病毒载体相对的是非病毒递送方法，如脂质体、树状聚合物、固体脂质纳米颗粒和聚合物胶束等，它们被用来递送质粒DNA。这些非病毒方法具有较低的免疫原性和致癌风险，以及更高的组织特异性，但在转染效率上通常不如病毒载体，这是它们的主要缺点。 因此，在选择基因治疗的递送策略时，需要权衡各种方法的利弊，考虑到治疗效果、安全性和可行性等多方面因素。随着基因编辑技术的进步，未来可能会开发出更安全、更有效的基因治疗策略，以解决当前面临的挑战。 在对蛋白质替代治疗的不同方法进行比较评估后，我们可以得出结论：基于mRNA的治疗方法相较于基于蛋白质或DNA的方法，确实拥有一些显著的优势。这些优势包括： 避免细胞核插入和转录过程：mRNA治疗不需要将遗传物质插入细胞核或进行转录，这简化了治疗机制，并可能减少潜在的副作用。 增强的安全性：由于不与宿主基因组整合，mRNA治疗降低了长期基因突变的风险，提供了一种相对安全的替代方案。 作用的短暂性：mRNA在体内的半衰期有限，其表达的蛋白质水平随时间自然下降，这种短暂性有助于减少长期治疗可能带来的风险。 从监管角度来看，mRNA蛋白质替代疗法不会引起基因组的改变，因此可能比DNA疗法更容易获得立法支持和监管批准。 然而，mRNA疗法也可能引起一些副作用。例如，mRNA分子在细胞内可能会被RNase酶切割，或者通过激活内体膜上的Toll样受体（TLR）3、7和8，引发先天免疫反应，这可能导致细胞因子诱导的毒性。为了解决这一问题，研究人员开发了修饰mRNA（modRNA）技术，通过使用假尿苷替代尿苷，改变了mRNA的二级结构，从而抑制了TLR和核酸酶对mRNA的识别。这种改良的mRNA在提高蛋白质表达水平的同时，显示出了更低的免疫原性，减少了干扰素编码基因和视黄酸诱导基因的激活。 随着mRNA技术的发展，从其最初的发现到如今以COVID-19疫苗形式在全球范围内的推广，这一领域已经取得了巨大的进步。如图1所示的时间线，mRNA技术的发展经历了多个阶段，最终在疫苗开发中发挥了关键作用，为未来治疗多种疾病提供了新的可能性。 图 1. mRNA 历史上主要事件的时间表。Clin：临床，Preclin：临床前，iPSC：诱导多能干细胞，Inj：注射，CAR：嵌合抗原受体，DC：树突状细胞。 蛋白质替代疗法中 mRNA 生产的考虑因素 在现代生物技术中，用于蛋白质替代疗法的mRNA可以通过体外转录反应（IVT）在无细胞系统中高效生产。这一过程通常在严格控制的生物反应器中进行，以确保反应条件如pH值和温度的稳定性和一致性。 IVT的主要组成部分包括： 线性化DNA质粒：作为转录mRNA的模板，提供了转录所需的遗传信息。 DNA依赖性RNA聚合酶：负责从DNA模板转录出mRNA。 dNTP（脱氧核苷酸三磷酸）：作为mRNA构建的基本单元，是转录过程中不可或缺的原料。 5'帽类似物：在某些情况下，为了提高mRNA的稳定性和翻译效率，会在转录过程中添加5'帽结构。 缓冲液：如HEPES/Tris，用于维持反应环境的pH值和离子强度，为酶活性提供适宜的条件。 镁离子和氯化钠：作为辅助因子，对RNA聚合酶的活性至关重要。 RNAse抑制剂：防止RNA分子在生产过程中被降解，确保产物的完整性。 焦磷酸酶：去除反应中产生的焦磷酸盐，避免其抑制RNA聚合酶的活性。 二硫苏糖醇（DTT）：作为一种还原剂，有助于维持酶和其他蛋白质的还原状态，防止氧化。 多胺：如精胺和亚精胺，对mRNA的稳定性和细胞内处理有积极作用。 通过这些精确控制的IVT条件和辅助试剂的使用，可以显著提高mRNA的产量和质量，从而为蛋白质替代疗法提供高效、稳定的mRNA产品。这些mRNA产品在经过进一步的纯化和质量控制步骤后，可以用于开发治疗各种疾病的疗法，包括罕见遗传疾病和某些癌症。随着mRNA生产技术的不断进步，未来可能会有更多创新的治疗方案被开发出来，以满足临床需求。 成功蛋白质生产的 mRNA 架构 所得 mRNA 的翻译效率取决于其结构和化学成分，这取决于接受 IVT 的质粒的设计和反应中使用的 IVT 试剂。适合蛋白质替代疗法的 mRNA 必须具有适当的 5' 帽以及 5'–3' 非翻译区 (UTR) 和一个开放阅读框，旨在最大限度地提高蛋白质产量。用于优化 mRNA (modRNA) 的修饰如图2所示。 图 2. modRNA 的架构。对序列（质粒水平）和化学（IVT 水平）的修饰可以提高 mRNA 的翻译效率并将细胞先天免疫机制的激活降至最低。 在生产用于蛋白质替代疗法的mRNA时，5'端加帽是一个关键步骤，它对mRNA的稳定性和翻译效率至关重要。5'帽不仅保护mRNA免受细胞内核酸酶的降解，还参与mRNA的核糖体识别和翻译过程。目前，有两种主要的加帽方法用于IVT反应：共转录加帽和转录后加帽。 共转录加帽：这种方法是在mRNA的转录过程中同时进行加帽的。在IVT反应中，RNA聚合酶（如T7 RNA聚合酶）在转录mRNA的同时，将帽类似物（如“Cap 1”类似物）直接添加到新合成的mRNA分子的5'端。市面上有现成的产品，如Trilink的“Cleancap”，可以用于共转录加帽。这种方法的优点是操作简单，加帽效率高，通常可以达到90%以上。 转录后加帽：这种方法涉及两个独立的步骤。首先进行IVT反应生成mRNA，然后在后续的加帽反应中使用牛痘病毒加帽酶（vaccinia virus capping enzyme）将帽结构添加到mRNA的5'端。转录后加帽的优点是能够实现100%的加帽率，确保每个mRNA分子都具有5'帽。然而，这种方法需要额外的步骤和纯化过程，可能会增加生产成本和复杂性。 选择哪种加帽方法取决于多个因素，包括所需的mRNA质量、生产规模、成本效益以及最终应用的具体要求。共转录加帽因其操作简便和高效率而被广泛采用，而转录后加帽则适用于对mRNA质量要求极高的应用场景。在实际生产过程中，研究人员会根据实验目的和资源情况来选择最合适的加帽策略。 5'和3'非翻译区（UTR）是mRNA上位于编码区两侧的核苷酸序列，尽管它们不直接编码蛋白质，但在基因表达调控中扮演着重要角色。这些区域通过多种机制影响mRNA的稳定性、定位、翻译效率以及降解过程。 5' UTR的设计： 5' UTR区域应该避免含有起始密码子（AUG）和终止密码子，以防止过早的翻译起始或终止。 应尽量减少能够形成二级结构的序列，这些结构可能会阻碍核糖体的扫描和启动翻译过程，从而降低蛋白质的产量。 优化5' UTR的序列可以提高mRNA的翻译效率，从而增加蛋白质的产量。 3' UTR的设计： 与5' UTR不同，3' UTR区域可以包含能够形成二级结构的序列，这些结构可能有助于提高mRNA的稳定性和翻译效率。 利用已知高表达基因的3' UTR序列，如α-和β-珠蛋白的3' UTR，可以提高mRNA的稳定性和蛋白质的产量。 使用多个3' UTR拷贝或设计融合UTR，如将氨基末端增强子（AES）3' UTR与线粒体编码的12S rRNA（mtRNR1）3' UTR相结合，可以进一步提高mRNA的稳定性和翻译效率。 在设计mRNA用于蛋白质替代疗法时，对5'和3' UTR的精心设计至关重要，因为它们直接影响mRNA的生物学功能和治疗效果。通过优化这些区域，可以提高mRNA的稳定性，增强其翻译效率，从而在临床上实现更好的治疗效果。此外，随着对mRNA生物学的深入了解，未来可能会发现更多可以优化的序列特征，以进一步提高mRNA治疗策略的效率和安全性。 开放阅读框（ORF）是mRNA上的一部分，它包含了编码蛋白质的遗传信息。在质粒中，ORF通常被设计为不含内含子的连续序列，以确保mRNA能够高效地被翻译成蛋白质。以下是一些用于提高mRNA稳定性和翻译效率的策略： 密码子优化：通过选择与人类细胞中tRNA更为丰富的同义密码子，可以提高mRNA的翻译效率。这种优化有助于减少翻译过程中的停顿，从而增加蛋白质的产量。 GC/AU比率调整：通过增加GC含量，可以减少mRNA的转录后调控，使得mRNA更加稳定，不易被细胞内的降解机制识别和降解。 修饰核苷酸的使用：使用假尿苷（Ψ）和N1-甲基假尿苷（m1Ψ）等修饰核苷酸替代尿苷，可以提高mRNA的稳定性，并减少其被细胞内TLR识别的可能性。这种修饰有助于mRNA逃避细胞的先天免疫反应，从而减少mRNA的降解，增加可用于翻译的mRNA数量。 IVT反应中的修饰：在体外转录（IVT）过程中，可以通过添加含有修饰核苷酸的dNTP混合物来实现mRNA的修饰。这种方法可以在mRNA合成的同时引入所需的修饰，从而提高mRNA的质量和功能性。 通过这些策略，可以设计出更加稳定和高效的mRNA分子，用于蛋白质替代疗法。这些优化措施有助于提高mRNA的翻译效率，减少免疫反应，从而在临床应用中实现更好的治疗效果。随着mRNA技术和合成生物学的不断发展，未来可能会有更多创新的方法被开发出来，以进一步提高mRNA治疗的安全性和有效性。 Poly(A)尾巴是mRNA分子的一个重要特征，它对mRNA的稳定性和翻译效率起着至关重要的作用。以下是关于Poly(A)尾巴的一些关键点： 稳定性：Poly(A)尾巴有助于保护mRNA分子免受细胞内核酸酶的降解，从而增加其在细胞内的稳定性。 翻译效率：Poly(A)尾巴与翻译启动因子的结合有助于促进核糖体对mRNA的识别和绑定，从而提高翻译效率。 长度优化：通常认为，100-120个腺嘌呤的Poly(A)尾巴长度对于蛋白质替代疗法中的mRNA分子是优化的，可以提高翻译效率。 聚腺苷酸化过程：在细胞内，聚腺苷酸化是由聚腺苷酸聚合酶（poly(A) polymerase）催化的，而在体外转录（IVT）过程中，可以通过不同的策略来添加Poly(A)尾巴。 IVT中的聚腺苷酸化：使用T3、T7或SP6等RNA聚合酶进行IVT时，这些酶可以在mRNA的3'端添加Poly(A)尾巴。然而，这种方法可能导致Poly(A)尾巴长度不一，影响mRNA的一致性和功能。 质粒编码Poly(A)尾巴：为了避免IVT过程中的复杂性和成本增加，可以通过在质粒中编码Poly(A)尾巴序列来实现一致的Poly(A)尾巴长度。这种方法可以确保所有转录的mRNA分子都具有相同长度的Poly(A)尾巴，从而提高产品的质量和一致性。 设计策略：在质粒设计时，可以在ORF的3'端添加一个Poly(A)信号序列，如AAUAAA，这是真核生物mRNA聚腺苷酸化的信号。随后，可以添加一个或多个连续的腺苷酸序列，以形成Poly(A)尾巴。 通过这些策略，可以有效地控制mRNA分子的Poly(A)尾巴长度，从而优化其在蛋白质替代疗法中的应用。随着对mRNA生物学的进一步研究，可能会发现更多关于Poly(A)尾巴长度和功能之间关系的新见解，从而为mRNA治疗提供更多的优化机会。 IVT 反应后，必须纯化所得 mRNA，以去除污染物并获得药物级 mRNA。广泛采用的纯化程序是层析法，例如离子交换、亲和聚（dT）和离子对反相层析法。这些层析技术通常与切向流系统步骤配合。图 3总结了直到纯 mRNA 产生为止的过程。然后，产品就准备好进入下一步，即掺入构成细胞递送载体的所选递送载体中。 图 3. 基于质粒体外生产 mRNA。编码内含子缺失优化mRNA序列的质粒首先被线性化，然后与RNA聚合酶、dNTPs、缓冲系统和补充试剂一起添加到反应器中。然后通过层析和过滤技术纯化所得产物，并准备封装到递送载体中。 将 mRNA 递送至细胞的载体 为了确保mRNA能够安全有效地到达目标细胞并发挥其治疗潜力，研究人员已经开发了多种递送策略。这些方法的核心目标是保护mRNA不被降解，并确保其能够快速且精确地进入目标细胞。主要的递送方式可以分为病毒载体和非病毒载体两大类，后者进一步细分为聚合物载体、脂质载体以及聚合物-脂质混合载体。 病毒载体：利用病毒的自然能力将遗传物质递送到细胞内，但这种方法可能引起免疫反应，并存在潜在的安全性问题。 非病毒载体： 聚合物载体：使用合成或天然的高分子材料，如聚乙烯亚胺（PEI），来包裹和保护mRNA。 脂质载体：通常指脂质纳米颗粒（LNPs），它们通过形成脂质双层包裹mRNA，提高其稳定性并促进细胞摄取。 聚合物-脂质混合载体：结合了聚合物和脂质的优点，以提高mRNA的递送效率和减少副作用。 每种递送方法都有其独特的优势和局限性，选择合适的递送系统取决于治疗目标、所需mRNA的稳定性和所需的细胞类型。随着递送技术的进步，未来的mRNA疗法有望实现更精准、更高效的药物递送。 病毒疗法，特别是利用基因改造病毒的策略，已经成为研究和临床实践中的一个重要领域。这些病毒载体通常由蛋白质外壳、关键基因和控制基因整合及表达的必需元件构成，可以是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒，以及其他种类。尽管病毒载体在转导效率和靶向性方面表现出色，且生产规模可以扩大，但它们在临床应用中的成功仍受到多种因素的限制，包括目标群体中可能存在的对病毒载体的预存免疫力。尽管如此，病毒载体的研究和开发仍在持续进行，以克服现有挑战并提高治疗效果。 非病毒载体技术在纳米科技领域开辟了新的可能性，特别是在 COVID-19 疫情期间，它们在两款商业化的 mRNA 疫苗中的应用尤为突出。这些载体利用阳离子聚合物纳米颗粒的静电作用，与 mRNA 分子的负电荷相结合。天然存在的聚合物如壳聚糖，以及合成聚合物如 PLL、PAMAM、PEI 和 PAA，都是构建这类载体的候选材料。在挑选合适的纳米颗粒时，需要综合考虑其电荷密度、分子量、潜在毒性以及药代动力学特性，如在体内的分布、生物降解性和清除速率。为了优化性能，这些纳米颗粒可能需要经过特定的修饰和调整。 脂质纳米颗粒（LNP）或脂质双层壳是实现mRNA有效封装和递送的另一种技术。这些LNP通常由具有水性中心的阳离子脂质构成，辅以胆固醇或聚乙二醇（PEG）等其他分子，形成最终的递送系统。阳离子脂质如1,2-二油酰基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷（DODMA）或1,2-二油酰基-3-二甲基丙烷铵（DODAP）的使用，有助于在血液循环中减少电荷相互作用，从而延长LNP的半衰期。 LNP的关键特性，如粒径、ζ电位（聚集性）、内体释放倾向和体内分布，对其行为和稳定性至关重要，并且可以通过精心选择LNP成分来调控。例如，PEG脂质的加入可以影响颗粒的ζ电位和尺寸，提高结构稳定性，而PEG的比例和结合方式也会影响LNP的特性。高PEG比例可能导致较小LNP的形成。 此外，LNP中使用的脂质链长度也会影响其行为。例如，携带C14烷基链的1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基偶联物相比于C18链的类似物，可能在血液中循环时间更短，但细胞递送率更高。胆固醇及其衍生物的加入可以改善LNP的形态和性质，通过尾部修饰的胆固醇类似物可以改变LNP的形状，并可能赋予其特定的细胞趋向性。 最后，DODMA和DODAP这类脂质由于其低ζ电位，形成的LNP尺寸较小，且倾向于在脾脏中积聚，这使得它们在靶向该器官的疫苗或治疗剂递送中可能特别有用。通过这些策略，LNP技术在mRNA递送领域展现出巨大的潜力和灵活性。 鉴于 SARS-CoV-2 大流行，LNP 的生产已得到简化，以满足全球对 mRNA-LNP 疫苗前所未有的需求。因此，微流体等技术已被引入“战场”，以可重复地提供具有统一质量的 mRNA-LNP 物质。图 4展示了最广泛使用的 mRNA-LNP 生产技术的示意图。 图 4. 脂质纳米颗粒的形成。如今，LNP 是利用微流体技术生产的，可产生均匀且表征良好的最终产品。封装材料（各种天然或改性脂质）与 mRNA 一起被送入设备中。由此产生的 mRNA-LNP 被进一步纯化，以确保适合人类使用。 结合聚合物和脂质纳米颗粒（LNP）的方法为mRNA的封装和递送提供了一种新策略，这种方法既保持了稳定性，又具备了显著的热力学特性，能够实现在目标细胞中高效地递送mRNA。这种混合载体的设计考虑了细胞膜主要由脂质构成的特性，使其能够与细胞膜融合，并将核酸直接释放到细胞质中。通过精心选择和调整聚合物和脂质的比例，可以优化这种混合载体的性能，以提高其在体内的递送效率和生物相容性。 基于 mRNA 的蛋白质替代疗法的关键质量属性 质量分析在药品生产过程中起着至关重要的作用，它确保了不同生产批次的药品在质量上的一致性、安全性和有效性。随着全球对封装mRNA产品需求的增加，例如mRNA-LNP COVID-19疫苗，建立这些产品的关键质量属性（CQA）变得尤为重要。这些CQA同样适用于用于蛋白质替代疗法的封装mRNA产品。 封装mRNA产品，无论是作为治疗性药物还是从药学特性的角度来看，都是一种创新而独特的医疗产品。其关键质量属性的开发和标准化是一个持续进行的过程，涉及到多个方面的考量，包括但不限于： 纯度和杂质水平：确保产品中活性成分的纯度，并控制污染物和杂质的水平。 生物活性：确认产品在生物学上的有效性，包括其诱导免疫反应的能力。 物理和化学稳定性：评估产品在不同条件下的稳定性，以保证其在储存和使用过程中保持有效。 封装效率和均匀性：对于封装mRNA产品，封装材料和封装过程的效率及均匀性是关键。 递送系统的特性：评估递送系统的有效性，包括其保护mRNA不被降解和促进目标细胞吸收的能力。 关键质量属性（CQA）是确保药品质量的关键因素，对于mRNA-LNP产品，如COVID-19疫苗，CQA可以分为以下三个主要领域： 与mRNA分子相关的CQA： 序列准确性：确保mRNA分子的序列与目标治疗或疫苗的序列完全一致。 纯度：mRNA分子应该足够纯净，不含有任何非目标序列或其他杂质。 完整性：mRNA分子应无断裂或降解，保持其完整的结构以确保功能。 加帽效率：mRNA分子的5'加帽对于其稳定性和翻译效率至关重要。 磷酸化程度：mRNA分子的3'端磷酸化程度影响其在细胞内的稳定性和翻译效率。 与递送系统相关的CQA： 粒径分布：mRNA-LNP的粒径大小和分布对其在体内的分布和细胞摄取有重要影响。 封装效率：确保mRNA分子被有效封装在LNP中，以保护其不被降解并确保递送至目标细胞。 物理稳定性：LNP应保持物理稳定性，避免聚集或沉淀，以确保其在储存和使用过程中的有效性。 化学稳定性：LNP中的化学成分应保持稳定，避免氧化或其他化学反应。 表征mRNA-LNP整体特征的CQA： 包封率：mRNA分子被LNP封装的效率，这直接影响产品的疗效。 批间一致性：不同生产批次之间的mRNA-LNP产品应具有高度的一致性。 免疫原性：评估mRNA-LNP可能引起的免疫反应，确保其安全性。 热稳定性：产品在不同温度条件下的稳定性，这对于疫苗的运输和储存尤为重要。 长期稳定性：产品在长期储存后仍能保持其疗效和安全性。 这些CQA的确立和监控对于确保mRNA-LNP产品的质量和疗效至关重要，它们是药品开发和生产过程中不可或缺的部分。随着mRNA技术的发展，这些CQA可能会随着新的科学发现和生产经验而不断更新和优化。 在mRNA疫苗或治疗产品制备过程中，确保体外转录（IVT）产物的纯度至关重要。在进行封装之前，必须确保mRNA产品中不含有双链RNA（dsRNA）、截短的mRNA分子以及由DNA残留物与RNA形成的DNA-RNA杂合体。这些污染物可能会触发细胞内的外源RNA感应机制，影响产品的疗效，甚至可能激活细胞凋亡途径，增加受试者体内发生细胞因子风暴的风险。 除了确保mRNA的5'端加帽效率和Poly-A尾长度符合标准外，还应通过适当的分析方法验证mRNA的序列准确性和数量。这些质量控制措施对于确保mRNA产品的安全性和有效性至关重要。 递送载体的关键质量属性（CQA）涵盖了对其制备过程中所使用的脂质的全面分析，包括以下几个方面： 脂质的鉴定和比例：确保所使用的脂质种类正确，并验证它们在递送载体中的比例是否符合预定配方。 纯度检查：检测脂质中是否存在杂质，这些杂质可能会影响递送载体的性能和安全性。 粒径分布：递送载体的粒径大小及其分布对药物的递送效率和体内分布有重要影响。 电荷特性：脂质纳米颗粒（LNP）的表面电荷（zeta电位）可以影响其与细胞的相互作用和稳定性。 等电点：了解LNP的等电点有助于预测其在不同pH值环境下的行为。 形态学：通过电子显微镜等技术检查LNP的形态，确保其结构完整且一致。 转染效率：评估LNP将mRNA递送到目标细胞并实现基因表达的能力，这是衡量其功能性的重要指标。 在mRNA-LNP产品的开发和生产过程中，对其物理特性进行全面的表征是至关重要的。以下是一些关键的质量属性（CQA）： 粒径：LNP的粒径大小对于其在体内的分布、细胞摄取以及最终的疗效都有显著影响。 zeta电位：这是一个衡量LNP表面电荷的参数，它影响LNP在体内的稳定性和与细胞膜的相互作用。 释放属性：这涉及到mRNA从LNP中释放出来的效率，这对于确保mRNA能够在细胞内正确表达目标蛋白至关重要。 封装效率：这是指在LNP制备过程中成功封装进LNP的mRNA比例，它直接关系到产品的疗效和剂量。 储存条件：由于mRNA-LNP COVID-19疫苗对温度和其他储存条件非常敏感，因此合理的CQA设计必须考虑产品的稳定性和在不同储存条件下的稳定性。 物理和化学稳定性：LNP在储存和使用过程中的稳定性，包括防止聚集和降解，是保证产品质量和疗效的关键。 免疫原性：评估LNP可能引起的免疫反应，以确保其安全性。 图 5（此处假设存在一个图表）可能会展示上述CQA的总结，包括它们的定义、接受标准以及如何通过分析方法进行测量。这些CQA的确立和监控对于确保mRNA-LNP产品的质量和一致性至关重要，它们是药品开发和生产过程中不可或缺的部分。随着mRNA技术的发展，这些CQA可能会随着新的科学发现和生产经验而不断更新和优化。 图 5. 用于人类蛋白质替代疗法的封装 mRNA 产品生产的关键质量属性。所检查的质量与编码目标蛋白的 mRNA 分子、递送系统以及成品（在本例中为 mRNA-LNP 制剂）有关。 临床前和临床阶段基于 mRNA 的蛋白质替代疗法 mRNA基的蛋白质替代疗法为多种疾病提供了治疗潜力，包括一些至今未有有效治疗方法的疾病。这种治疗策略已在临床前和临床研究中得到验证，并已产生一些积极的研究结果。接下来，我们将探讨一些mRNA替代治疗的例子，这些例子主要关注单基因疾病在小鼠模型中的应用。 苯丙酮尿症（PKU）是一种由苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因突变引起的常染色体隐性遗传性疾病，这种突变导致苯丙氨酸代谢受阻。PAH基因编码的酶在肝脏中负责将苯丙氨酸转化为酪氨酸。若该酶功能缺失，将导致体内苯丙氨酸水平升高，可能在血液中和/或大脑中积累，进而引发不可逆的智力损害。PKU患者需要遵循严格的低苯丙氨酸饮食，并可能需要药物治疗以控制病情。 然而，严格的饮食控制对于患者来说是一个挑战，尤其是对于需要高蛋白饮食的个体。此外，现有药物可能存在给药困难和副作用的问题。因此，研究者正在探索替代疗法，如基于mRNA的蛋白质替代疗法，以期为PKU患者提供更有效、更安全的治疗选择，从而改善他们的生活质量。这种新型治疗方法通过提供功能性PAH酶的mRNA，有可能恢复酶活性，减少血液中苯丙氨酸的积累，为PKU治疗提供新的希望。 在针对苯丙酮尿症（PKU）的小鼠模型的研究中，我们探索了mRNA替代疗法的潜力。具体来说，我们制备了编码人类苯丙氨酸羟化酶（PAH）的全长mRNA，并将其封装在脂质纳米颗粒（LNP）中，以实现向小鼠模型的肝脏细胞递送。这些小鼠模型携带有PAH基因的错义突变，模拟了人类PKU患者的遗传缺陷。 通过这种治疗，我们成功地在小鼠的肝脏细胞中表达了高水平的人PAH蛋白，有效恢复了苯丙氨酸的正常代谢过程。令人鼓舞的是，无论是在单剂量还是多次剂量的治疗后，观察到血浆中苯丙氨酸水平显著降低，且未伴随任何不良的临床症状，这表明了治疗的安全性。 这些研究成果不仅证实了mRNA替代疗法在治疗PKU方面的有效性，也为未来开发针对PKU以及其他单基因遗传疾病的新型治疗方法提供了有力的证据。随着mRNA技术和递送系统的不断进步，基于mRNA的蛋白质替代疗法有望成为治疗这类疾病的有力工具。 在另一项研究中，科学家们探索了使用脂质纳米颗粒（LNP）封装的ARG1 mRNA治疗ARG1缺陷小鼠模型的潜力。ARG1 mRNA编码的精氨酸酶是尿素循环中的关键酶，负责将氨转化为尿素，从而帮助排泄。精氨酸酶缺乏症（AD）是一种由ARG1基因突变引起的常染色体隐性遗传病，患者会出现精神运动功能障碍、痉挛性四肢瘫痪、腱反射亢进、癫痫发作和生长迟缓等症状，严重时甚至可能导致肝脏疾病。 目前，AD患者的治疗手段包括限制蛋白质摄入、使用药物降低血液中精氨酸水平，以及在某些情况下进行肝移植。Truong等人的研究显示，通过重复给予AD小鼠LNP-ARG1 mRNA治疗，可以防止体重下降，改善疾病相关的生物标志物，且未观察到肝毒性。最重要的是，这种治疗策略能够显著延长小鼠的存活时间，其中每3天接受一次治疗的小鼠在研究期间存活了77天，而每周接受一次治疗的小鼠存活了62天。 这些研究成果为遗传性代谢疾病患者及其医疗团队带来了新的希望，预示着未来可能开发出更多分子层面的治疗方法。 法布里病是一种由于α-半乳糖苷酶A（α-Gal A）缺乏引起的溶酶体贮积症，这种酶的缺失会导致脂质分子在细胞内积累，进而引发心肌病变和肾功能障碍。最近的研究表明，通过使用封装在脂质纳米颗粒（LNP）中的α-半乳糖苷酶A mRNA，可以有效改善小鼠模型和非人灵长类动物的病理状况。 此外，临床前研究也在探索mRNA蛋白替代疗法在其他代谢性疾病治疗中的应用，这些疾病目前尚缺乏有效的治疗方法。例如，Crigler-Najjar综合征、肝肾酪氨酸血症和急性间歇性卟啉症等疾病，都可能通过mRNA治疗得到改善。这些研究通常涉及将编码关键酶或蛋白的mRNA递送到患者体内，以补偿缺陷基因的功能，从而缓解或治疗疾病。 这些进展表明，mRNA治疗技术在代谢性疾病的治疗中具有广泛的应用潜力，为患者提供了新的治疗选择和希望。随着研究的深入和技术的成熟，未来可能会有更多的mRNA治疗产品被开发出来，用于治疗各种遗传性和获得性疾病。 在一篇综述文章中，作者探讨了基于mRNA的转录疗法在治疗某些肝脏疾病方面的潜力。这些临床前研究集中在使用脂质纳米颗粒（LNP）封装的mRNA分子，这些分子能够在体内翻译成治疗所需的特定蛋白质。通过这种方式，研究人员观察到，接受mRNA治疗的小鼠模型的健康状况得到了显著改善。 尽管文章中提到了mRNA替代疗法在技术实现上存在的一些挑战，比如如何确保mRNA分子有效递送到靶组织而不引起非靶组织的非特异性表达，作者仍然对这种疗法的未来持乐观态度。他们认为，随着递送技术的进步和治疗方法的优化，基于mRNA的肝脏疾病治疗策略有望在未来进入临床试验阶段，并为患者带来新的治疗选择。 这种乐观的前景基于以下几个因素： 递送技术的进步：随着LNP和其他递送系统的发展，mRNA分子的靶向性和递送效率正在不断提高。 治疗设计的创新：研究人员正在设计更精确的mRNA分子，以确保它们能够特异性地在肝脏中表达，减少潜在的副作用。 临床前研究的积极结果：在小鼠模型中观察到的治疗效果为进一步的临床研究提供了科学依据。 治疗范围的扩大：mRNA疗法的潜力不仅限于肝脏疾病，它也为其他遗传性和获得性疾病的治疗提供了新的可能性。 尽管存在挑战，但mRNA替代疗法在治疗肝脏疾病及其他领域的潜力是巨大的，值得我们持续关注和期待。 在另一篇综述文章中，探讨了修饰RNA在心脏疾病治疗中的应用。研究者们在心脏疾病动物模型中，例如缺血性心力衰竭的小鼠、猪和猴子，通过RNA蛋白替代疗法的方式，评估了mRNA作为促进心脏血管化和再生的潜在治疗工具。研究表明，这种技术在提高治疗的安全性和可扩展性、开发经济高效的临床级材料、建立稳健的递送方法和降低成本等方面具有潜力，有望成为促进心脏再生和改善心脏功能的有效治疗手段。 此外，血液疾病也成为mRNA蛋白替代治疗的另一个目标领域。例如，血友病A和B，这两种疾病分别是由于凝血因子VIII和IX缺乏引起的出血性疾病。在小鼠模型中，通过体内测试编码这些因子变体的mRNA分子，已经显示出在稳定和持久表达相应缺失因子方面的高效能。 这些研究进展表明，mRNA治疗技术在心脏疾病和血液疾病的治疗中具有广泛的应用前景，为患者提供了新的治疗选择和希望。随着mRNA治疗技术的不断发展和优化，未来可能会有更多的疾病可以通过这种创新疗法得到有效治疗。 在囊性纤维化的治疗研究中，mRNA替代疗法也展现出了积极的临床前研究成果。囊性纤维化通常被视为一种主要影响肺部的疾病，它是由囊性纤维化跨膜电导调节器（CFTR）基因的常染色体隐性突变引起的。CFTR是一种蛋白质通道，负责调控水（H2O）和氯离子（CI-）进出肺部细胞，维持肺部粘液的适宜湿度。当CFTR因突变而功能失常时，这些离子无法正常流出细胞，导致肺部粘液积聚，进而引起严重的肺部功能障碍。 研究表明，通过将CFTR mRNA递送到CFTR功能缺失的小鼠模型中，可以改善肺功能指标，效果与美国食品药品监督管理局（FDA）批准的囊性纤维化治疗药物相似。然而，为了使这种疗法在临床上具有实际应用价值，需要确保mRNA递送后CFTR蛋白的长期表达。这是因为频繁地重新给药可能会增加高剂量递送载体的毒性风险。 因此，研究人员正在探索更有效的mRNA递送系统和策略，以实现CFTR蛋白的持续表达，并减少给药频率，从而提高患者的治疗依从性和生活质量。随着mRNA技术和递送系统的进步，未来可能会开发出更安全、更有效的囊性纤维化治疗方法。 就临床试验而言，为了证明 mRNA 蛋白替代疗法的潜力，已经启动了几项临床研究。值得注意的是，大多数临床试验候选 mRNA 在其制剂中使用脂质纳米颗粒，这表明合适的载体的重要性。 Translate Bio公司正在进行一项针对囊性纤维化的治疗临床试验。该公司开发了一种新型产品，该产品包含封装在脂质纳米颗粒（LNP）中的mRNA，用于编码CFTR蛋白。在这项研究中，12名囊性纤维化患者通过雾化吸入的方式接受了不同剂量的mRNA治疗或安慰剂。初步结果显示，治疗在低剂量和中等剂量下具有良好的耐受性，并且患者的肺功能指标有所改善。 据研究估计，恢复细胞溶胶中5%的野生型CFTR mRNA水平可能足以缓解囊性纤维化的症状，尽管可能需要更高的水平来预防后期的并发症。这项研究的结果为囊性纤维化患者提供了新的治疗希望，并展示了mRNA治疗技术在遗传性疾病治疗中的潜力。 Translate Bio公司也曾开展一项针对鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症（OTC）的临床试验，该试验采用脂质纳米颗粒（LNP）封装的OTC编码mRNA。然而，由于药物的安全性和药代动力学特性未达到预期，该试验被迫中止。投资者和研究人员将这一结果与所使用的LNP的性能不足联系起来，这进一步凸显了开发更高效、更安全的新一代LNP载体的必要性。 这一经历强调了在mRNA治疗领域，递送系统的优化是实现治疗效果的关键因素之一。随着新型LNP技术的发展，未来可能会有更安全、更有效的mRNA药物载体问世，以满足临床治疗的需求。 Moderna公司与阿斯利康（AstraZeneca）合作，针对II型糖尿病患者和心力衰竭患者的溃疡治疗，开展了两项使用裸露mRNA的临床试验。此外，Moderna还启动了两项临床试验，评估mRNA药物的安全性和药代动力学/药效学特征，这些药物旨在治疗两种常染色体隐性遗传疾病：丙酸血症和分离性甲基丙二酸血症。这些研究中使用的是封装在LNP中的mRNA，编码治疗性酶。目前，这些临床试验正在进行中，结果尚未公布。这些研究的进展展示了mRNA治疗技术在治疗多种疾病方面的潜力和应用前景。 在mRNA治疗领域，除了针对遗传性疾病的蛋白质替代疗法外，还有针对心血管疾病的mRNA疗法也显示出了潜力。其中一种是基于编码血管内皮生长因子A（VEGF-A）的mRNA药物，VEGF-A是一种能够促进血管生成的因子，有助于刺激心肌再生和血管新生。 在阿斯利康支持的EPICCURE 2a期临床试验中，这种mRNA疗法（AZD8601）正在接受血运重建手术的心脏病患者中进行测试，这些患者左心室功能有中度损伤。AZD8601在临床前的体内试验中表现出了积极的结果，它不仅能够增加动物模型的皮肤和心脏的血流，提高血管密度，还能改善实验性心肌梗死的猪的心脏功能。 这些研究结果为mRNA在心血管疾病治疗中的应用提供了初步证据，表明这种疗法可能有助于改善患者的心脏功能和血管健康。随着临床试验的进一步开展，mRNA疗法在心血管疾病治疗中的潜力将得到更全面的评估。 结论和未来应用 总体而言，最新的临床前研究和新兴的临床试验数据持续显示，mRNA治疗是一种充满潜力的方法，它有潜力补充甚至在某些情况下取代传统的治疗方法。mRNA治疗的优势在于其能够绕过与DNA或重组蛋白治疗相关的限制，提供瞬时性蛋白表达的好处，同时避免了基因组整合的风险。 尽管mRNA治疗技术具有这些优势，但在其快速发展的初期，也展现出了一些局限性，这些局限性在一定程度上限制了其在慢性疾病治疗中的应用。例如： 瞬时蛋白表达：mRNA提供的蛋白表达是暂时性的，可能需要频繁给药以维持治疗效果，这可能对慢性疾病管理构成挑战。 免疫原性：mRNA分子可能会引发免疫反应，这可能影响治疗效果和安全性。 靶向递送：尽管mRNA治疗提供了精准医疗的潜力，但目前仍缺乏专门针对特定组织的有效递送系统。 稳定性和制造：mRNA分子的稳定性和大规模生产也是实现其临床应用需要克服的挑战。 为了克服这些挑战，研究人员正在开发新的mRNA设计、递送系统和制造技术。随着这些技术的进步，mRNA治疗在治疗慢性疾病方面的可能性将进一步增加，为患者提供更多的治疗选择。 mRNA治疗技术在心血管疾病治疗中的应用已经显示出积极的迹象。例如，Moderna与阿斯利康合作开发的mRNA药物AZD8601，它编码血管内皮生长因子A（VEGF-A），用于治疗心力衰竭。在临床试验中，这种mRNA药物通过直接注射到心脏，显示出了改善心脏功能的潜力。 尽管mRNA治疗在蛋白质替代疗法中的应用可能面临一些挑战，如需要较高剂量和频繁给药，但这些挑战正在通过技术进步得到解决。例如，冻干技术的应用可以提高mRNA药物的稳定性，使其在室温下也能保持较长时间。 此外，为了提高mRNA药物的疗效和减少剂量需求，研究人员正在探索自扩增mRNA、环状RNA等新型mRNA形式。这些新型mRNA可以在细胞内自我复制或稳定存在，从而减少给药频率和剂量。 在蛋白质替代疗法中，mRNA治疗的另一个考虑因素是编码蛋白质的大小。例如，mRNA疫苗编码的全长刺突蛋白约为180 kDa，而治疗应用中使用的mRNA编码的蛋白质大小通常较小。这可能影响递送载体的设计和药物的递送效率。 mRNA治疗的长期应用还需要解决免疫原性和递送效率的问题。随着新型递送系统和mRNA修饰技术的发展，mRNA治疗有望在未来成为治疗多种疾病的有力工具。 在将这种生物分子应用于临床实践中仍存在一些挑战，但生物分子工程的最新进展已经克服了一些重要的障碍，为这项技术的更广泛应用奠定了基础。这些进步得益于我们对这些生物分子的更深入理解、通过结构改良增强其稳定性，以及开发了更安全有效的递送系统。 mRNA技术展现出巨大的潜力，它不仅有可能彻底改变现有的治疗和诊断方法，还可能通过其成本效益和广泛应用范围，重塑药品市场的格局。尽管如此，mRNA疗法的临床应用大多还在评估阶段，其在实际应用和大规模人群中的应用效果仍需进一步观察。不过，目前得到的初步结果是非常有希望的，预示着mRNA疗法在未来可能成为医疗领域的重要工具。 原文：T.Vavilis, E.Stamoula, A.Ainatzoglou, et al., mRNA in the Context of Protein Replacement Therapy. Pharmaceutics, 2023. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

导读：相比优化CD8+细胞毒性T淋巴细胞的抗肿瘤功能，激活自然杀伤细胞（NK 细胞）是另外一种新兴的肿瘤免疫治疗手段。迄今为止，工程化NK细胞主要是通过慢病毒载体和电穿孔进行制备。尽管它们效率高，但由于使用病毒成分、生产成本高以及电穿孔毒性高等限制因素，急需开发新的递送工具。采用mRNA-LNP技术在NK细胞表达任何感兴趣的靶蛋白是一种极具吸引力的非病毒递送方式。其中IL2是一种关键靶点，在激活、扩增NK细胞，增强NK细胞杀伤活性方面发挥非常关键的作用。 2024年6月24号，法国国家科学研究中心（CNRS）与赛诺菲公司团队合作在Molecular Therapy Nucleic Acids发表文章：Enhancing Natural killer cells proliferation and cytotoxicity using Imidazole-based lipid nanoparticles encapsulating interleukin-2 mRNA。他们开发了一种基于咪唑脂质的递送平台（ iCD-Lx和iD-LNP），可高效转染NK-92 细胞、KHYG-1 细胞和原代 NK 细胞，而不会产生细胞毒性。有趣的是，这种基于咪唑的脂质递送平台转染未修饰mRNA的翻译速率反而高于修饰mRNA。利用基于咪唑的脂质递送平台向NK细胞系和原代NK细胞递送IL2 mRNA，可延长存活期、维系激活标志物表达水平、增强细胞毒性。这项工作为构建工程化NK细胞提供了一种高效的非病毒载体方式。 01  研究背景：IL-2的免疫作用 IL2在激活、扩增NK细胞，增强NK细胞杀伤活性方面发挥非常关键的作用。IL2 主要由 T 细胞产生，与NK细胞表面存在由 IL2Rα和 IL2Rβ链组成的受体复合物结合，导致各种细胞内信号传导途径的激活，包括JAK-STAT途径，从而导致 NK 细胞的增殖和激活。通过增加激活受体的表达、释放细胞毒颗粒以及增强其他细胞因子的产生，IL2 能增强 NK 细胞对癌细胞和病毒感染细胞的细胞毒性。 IL2注射液是30 年前首次获批准的免疫疗法 。高剂量注射IL2会过度激活抑制性调节 T 细胞（Treg），展示出明显的毒性。在细胞移植治疗（ACT）中，低剂量IL-2与Treg耗竭策略结合使用，可降低毒性并维持转移细胞的活力。对于NK细胞疗法来说，寻找更加安全有效的IL2使用策略成为当务之急。 02  咪唑脂质递送平台的开发和优化 研究人员通过微流控设备制备了2种基于咪唑功能化脂质的递送系统：第一种称为iCD-Lx，由一种可电离咪唑脂质（IL）、携带咪唑鎓的阳离子脂质（CL）及不同的辅助脂质构成；第二种称为iD-LNP，由相同的可电离咪唑脂质和辅助脂质组成。 2.1 优化iCD-Lx递送系统 制备ARCA eGFP mRNA（无修饰） iCD-Lx制剂，转染NK-92细胞。当制剂配方中CL摩尔百分比从10%增加至20%时，转染细胞数量从20%增加到75%，荧光信号强度从400增加至800。一旦CL摩尔百分比超过20%，转染细胞数量会骤降。CL摩尔百分为10%时，对细胞毒性最强。随着制剂CL摩尔百分比增加超过10%，对细胞的毒性反而呈现下降趋势。 在ARCA eGFP mRNA（无修饰） iCD-Lx制剂配方中使用20%CL，用DMG-PEG替代DMPE-PEG后，转染细胞数量降低至50%，细胞毒性从5%上升至10%，荧光强度MFI无显著变化。 将iCD-Lx制剂配方中的胆固醇替换为β-谷甾醇后，细胞转染效率未发生改变，然而，如果iCD-Lx制剂配方采用β-谷甾醇和DMPE-PEG的组合，转染细胞数量会发生显著下降。 由20%CL，40%IL，胆固醇，DMPE-PEG制备的iCD-Lx制剂，其转染效率（75%）和mRNA翻译强度（MFE为800）是最佳的。 此外，当N/P比例为1时，iCD-Lx转染效率最高，而当N/P比例达到3:1时，不仅iCD-Lx转染效率发生骤降，细胞毒性也出现明显增加（20%）。 脂质体（iCD-Lip）与脂质体复合物（iCD-Lx）在PBS缓冲液中4℃条件下可稳定存放8周，脂质体尺寸大小和分散系数（PDI）均不会发生显著变化。4℃存放的iCD-Lx的转染效率与即时制备的iCD-Lx无显著差异。此外，iCD-Lx无论是否在血清中，在37℃条件均可稳定存放10h。 2.2 优化iD-LNP递送系统 根据不同比例的可电离咪唑脂质（IL）或者Dlin-MC3-DMA制备一系列LNP，包封0.2ug eGFP mRNA (5-MoU)，转染NK-92细胞。与IL-LNP相比，MC3-LNP转染NK-92细胞的效率极低。转染效率最佳（60%）的iD-LNP19制剂配方为：50% IL、39% β-谷甾醇、10% DOPE 和 1% DMG-PEG 以及 N/P 20。iD-LNP19制剂可在4℃条件下稳定存放8周。无论是否存在血清，在37℃条件可稳定存在10h。 03  mRNA修饰对咪唑脂质递送效率的影响 研究人员合成4种eGFP mRNA：ARCA UNR(未修饰)；UNR cap1（未修饰）；MNR 5-MoU cap1（5‘moU修饰核苷酸）；MNR PsiU Cap1(甲基甲尿嘧啶修饰核苷酸)，采用iCD-Lx或者 iD-LNP作为递送载体，转染NK-92或者KHYG-1细胞。对于未修饰的eGFP mRNA来说，携带Cap1结构要比ARCA表现出更高的转染效率和翻译效率。令人感到惊奇的是，与未修饰mRNA相比，修饰mRNA居然会表现出更低的转染效率和翻译效率。值得注意的是，iCD-Lx的翻译效率要高于iD-LNP，这与mRNA类型无关。在荧光显微镜下观察到，采用 iD-LNP或者iCD-Lx递送不同类型的mRNA均不会影响转染NK-92细胞的形态。 对于 iD-LNP或者iCD-Lx递送系统来说，转染效率均在3-4天达到平台期，但是，eGFP mRNA的翻译效率自转染后第一天开始后持续下降。与修饰eGFP mRNA相比，携带Cap1的无修饰eGFP mRNA（UNR）的转染效率和翻译效率均是最高的。 04  咪唑脂质与其他转染试剂或递送系统的比较 对于NK-92细胞来说。市售商业化转染试剂（ScreenFect,mRNA-Fect,Lipofectamine）的转染效率和翻译效率均明显低于 iD-LNP或者iCD-Lx。与SM102、ALC0315、MC3可电离脂质制备的LNP相比， iD-LNP转染NK-92细胞的翻译效率和转染效率明显处于最佳，相比之下， iD-LNP转染Jurkat细胞的效率与其他LNP类似，但翻译效率是最高。上述数据说明，可电离咪唑脂质（IL）非常有希望成为一种通用型的可电离脂质。 05  NK细胞靶向的IL2 mRNA咪唑脂质递送平台 NK-92细胞是一种IL-2依赖性的细胞系，培养基中需要添加IL-2以维持NK-92细胞的存活和增殖。当培养基中缺乏IL-2，培养3天后，NK-92细胞全数死亡。在培养基中加入IL-2重组蛋白后，NK-92细胞可存活6天。洗涤细胞，并且耗尽培养基中的IL-2，采用iD-LNP或者iCD-Lx向NK-92细胞中递送cap1 UNR IL-2 mRNA，NK-92细胞同样也可存活6天。有意思的是，iCD-Lx作为递送载体，可使得转染cap1 UNR IL-2 mRNA的NK-92细胞存活时间延伸至8天。此外，iCD-Lx共递送等量的UNR eGFP mRNA与IL-2 mRNA，可在NK-92细胞中实现IL-2与 eGFP的正常表达。 K562是一种人类慢性髓系白血病细胞系，对NK细胞杀伤极其敏感，激活Caspase-3/7可诱导K562细胞凋亡。与IL-2饥饿NK-92细胞相比，添加重组蛋白IL-2，IL-2 mRNA iCD-Lx，IL-2 mRNA iD-LNP均会增强K562癌细胞中Caspase3/7表达，同时，维持CD69、NKG2D或者NKP30、TNF-α水平不会发生下降。总的来说，在NK-92细胞中转染IL-2 mRNA可达到补充IL-2重组蛋白同样的效果。 06  咪唑脂质递送系统在原代NK细胞中的转染效率 对于eGFP mRNA转染原代NK细胞来说，iCD-Lx转染效率可达到80%，而iD-LNP转染效率大致在50%左右。同时，这两种咪唑脂质递送系统均不会对原代NK细胞的存活率造成不利影响。与NK-92细胞类似，缺乏IL-2会导致原代NK细胞相比转染IL-2 mRNA或者补充重组蛋白IL-2的细胞中的CD69、NKG2D、NKP30表达水平减少。转染IL-2 mRNA或者补充重组蛋白IL-2的原代NK细胞增殖能力类似，均高于缺乏IL-2的饥饿原代NK细胞。无论是添加重组蛋白IL-2还是转染IL-2 mRNA均会导致原代NK细胞中的TNF-α表达水平相比于饥饿细胞有所升高，这导致与原代NK细胞共同孵育的K562细胞中的caspase3/7表达显著提升，引发非常显著的细胞毒性反应。 07  总结 NK细胞免疫疗法的一般流程为：分离NK细胞，并在体外合适的条件下扩增NK细胞，然后，输送会患者体内，以此抑制或者杀死肿瘤细胞。工程化NK细胞表达靶向特定肿瘤抗原的嵌合抗原受体制备的CAR-NK细胞具有更低的潜在毒性和更广泛的抗肿瘤效果，近年来备受关注。随着CAR结构的不断升级，引入细胞因子或趋化因子受体结构的第四代CAR结构能够改善免疫细胞一些固有缺陷并赋予其额外的特定功能，从而促进肿瘤免疫治疗效果。 但是，要实现NK细胞的工程化改造，必须借助于递送载体。由于电穿孔和病毒递送载体的局限性，科学家希望借助正处于风口之上的mRNA-LNP技术，更加高效地对NK细胞实现基因改造。这项工作最为重要的贡献在于优化了基于咪唑脂质的递送系统：iCD-Lx和iD-LNP，使其高效转染NK细胞系和原代NK细胞。令人感到欣喜的是，咪唑脂质递送系统的在细胞水平的转染效率和翻译效率明显优于市售的转染试剂和已知的可电离脂质制备的LNP（SM102、ALC0315、MC3）。同时，利用iCD-Lx和iD-LNP向NK细胞系和原代NK细胞递送IL2 mRNA，可明显提升NK细胞的增殖能力和细胞毒性。未来，还需要再体内进一步验证咪唑脂质递送系统的效率和毒性。 参考文献  [1] Christophe Delehedde, Ivan Ciganek, et al. Enhancing natural killer cells proliferation and cytotoxicity using imidazole-based lipid nanoparticles encapsulating interleukin-2 mRNA. 2024, 35(3): 102263 DOI: 10.1016/j.omtn.2024.102263. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。