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摘要：病毒样颗粒（VLPs）是具有多种应用的纳米结构，包括治疗、免疫和诊断。随着生物医学工程技术的最新进展，商业化的基于VLP的疫苗正在被广泛用于抗击传染病，同时还有更多疫苗处于临床研究的不同阶段。由于它们在效果、安全性和多样性方面的期望特性，基于VLP的方法在未来几年可能会变得更加常见。然而，在基于VLP的方法能够广泛应用于治疗之前，必须解决一些生产和制造方面的挑战。这篇综述提供了对近期基于VLP疫苗开发情况的见解，重点介绍了它们的特性、表达系统以及作为理想候选者对抗新兴病毒病原体的潜在适用性。最后，详细阐述了基于VLP的疫苗作为可行且高效的免疫剂，诱导对包括SARS-CoV-2在内的病毒性传染病病原体以及基于蛋白质纳米颗粒的疫苗产生免疫的潜力。因此，VLP疫苗可能作为传统疫苗策略的有效替代品，用于抗击新兴的传染病。 1.引言 目前市场上的大多数疫苗主要基于灭活（杀死）或减毒活疫苗的方法。尽管这些传统疫苗已经有效地用于对抗各种传染病，但它们存在一些限制，包括较低的诱导更强免疫反应的潜力和较差的效力。最近传染病的爆发表明了开发强大疫苗以克服这些限制的需求。主要挑战在于开发新的技术方法，增强免疫力，同时不损害安全性、效力和耐受性。最近在DNA、mRNA和重组病毒载体疫苗方面的进展为针对难以靶向的病原体和控制传染病爆发的有效疫苗开发方法。 病毒样颗粒（VLP）技术为开发有效疫苗以抗击严重关注的传染病提供了一个替代平台，并且它与mRNA和病毒载体疫苗并行发展。与其他亚单位疫苗相比，VLPs在免疫原性方面也更强，因为它们在表面以更真实的确认形式呈现重复的抗原表位，免疫系统可以容易地检测到。另一方面，亚单位疫苗由于目标抗原的错误折叠或对免疫系统的呈现不足而具有较差的免疫原性。此外，它们需要佐剂和多次疫苗接种才能引发足够的免疫反应。Fraenkel-Conrat和Williams（1955年）首次通过从纯化的RNA和蛋白质组分重新组装烟草花叶病毒（TMV）颗粒来描述病毒样颗粒这一术语。这些纳米结构诱导强效免疫反应的潜力随后得到了进一步研究。VLP平台可以克服通常与传统疫苗相关的各种问题；具体来说，与减毒活疫苗相关的传染性、向毒株的逆转、突变风险、灭活疫苗的免疫原性降低、不稳定毒性、产量低和配方时间长（图1）。 图1: VLP疫苗与传统疫苗相关风险的比较。 这些生物启发的纳米结构具有来自不同病原体的重复和高度密集的抗原，有助于触发强烈的免疫反应。此外，这些高度免疫原性分子具有病毒蛋白的自组装特性。它们是生物相容的，并在其合成过程中具有结构灵活性的潜力。它们可以通过化学或遗传方式进行修改，具有更高的稳定性、均匀性和功能性，被认为是各种生物医学应用中的有效工具（图2）。它们根据是否存在脂质膜被归类为包膜或非包膜VLP。 图2: 不同类型VLPs的生产及其应用、特性和挑战。(A) 不同的人类致病病毒和寄生虫，(B) 识别形成病原体结构特征并能导致VLPs形成的基因，(C) 将识别的基因整合到质粒等表达载体中，(D) 允许载体在各种表达系统中表达，(E) 形成不同类型的VLPs，如包膜、非包膜和嵌合VLPs。非包膜VLPs可以有两种类型：单蛋白或多蛋白。在多蛋白VLPs中，可能存在单层、多层，并且有些也是马赛克式的。嵌合VLPs可以内部、外部修改，或者可以通过化学偶联进行修改。 然而，与VLPs相关的一些关键挑战包括较低的稳定性、下游处理困难、生产成本高和对环境条件的敏感性。已经在各种表达系统（ESs）中合成了许多不同的VLP，例如细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物。基于VLP的疫苗可能用于治疗包括HIV、流感、乙型肝炎、戊型肝炎、疟疾、埃博拉病毒、SARS-CoV-2、寨卡病毒、登革热和口蹄疫在内的各种传染病。 几种基于VLP的疫苗已经获得许可，并在市场上商业化，包括Engerix-B R（GlaxoSmithKline）和Recombivax HB R（Merck & Co）针对HBV，Gardasil R（Merck & Co）和Cervarix R（GlaxoSmithKline）针对HPV，Hecolin R（厦门万泰生物技术有限公司）针对HEV，以及MosquirixTM（GlaxoSmithKline Inc.）针对疟疾。这篇综述着重于VLP疫苗开发的基础知识和技术方面的高级技术。此外，还讨论了用于VLP生产的不同ESs以及针对各种传染病，尤其是SARS-CoV-2的潜在疫苗的开发。最后，详细阐述了作为疫苗开发中承载抗原的蛋白质纳米颗粒的支架。 2. 病毒样颗粒的特性 病毒样颗粒（VLPs）通常因其独特特性（图2）而被视为有效的疫苗候选物。它们是强效的免疫刺激分子，展现出高度密集的病毒表面蛋白，以适当的构象和高度重复的方式呈现，引发强烈的T细胞和B细胞获得性免疫反应。大多数VLPs来源于病毒的衣壳或包膜蛋白，尽管核心蛋白也可以使用。VLPs天然生物相容且不具传染性，因为它们缺乏病毒遗传物质，因此无法复制。它们还被认为是比传统减毒活疫苗更安全的（不会恢复到野生型）。此外，它们是高度多功能的分子，大小从20到200纳米不等。这种大小范围是最优的，可以自由地将它们排入淋巴结，并被抗原呈递细胞（APCs），特别是树突细胞（DCs）更容易地摄取，然后通过主要组织相容性复合体（MHC）II类分子进行抗原处理和呈递。它们高度有序，可以自组装成不同的几何对称性，通常以二十面体、螺旋对称性、杆状结构或球形的形式出现，这取决于病毒的来源。 VLPs已在广泛的表达系统（ESs）中合成，包括原核（细菌）和真核（昆虫细胞、哺乳动物细胞系、植物细胞或酵母）。可以通过肽偶联、遗传融合和化学交联等不同方法，在它们的外部或内部表面展示感兴趣的异源表位，从而增加VLPs的功能。VLP技术提供了一个重要优势，因为它是一种更快的疫苗合成方法。在特定菌株测序后12-14周内就可以制备出针对该菌株的新VLP疫苗，而传统疫苗通常需要24-32周的制造过程。这些疫苗不含卵白蛋白，这对容易过敏的个体来说是巨大的缓解，并且比传统疫苗提供更强的疾病保护。 3. 基于结构的病毒样颗粒类型 根据它们的结构复杂性，VLPs可以分为两组：包膜和非包膜VLPs。两组都展示外来抗原（图2）。 3.1. 非包膜病毒样颗粒 这些VLPs通常由目标病原体或病毒蛋白结构的单个或多个自组装组分构成。这些新形成的VLPs中没有宿主细胞膜（脂质包膜）。主要病毒核衣壳蛋白的表达主要负责这些VLPs的形成。非包膜VLPs仍在作为开发针对几种病原体疾病的亚单位疫苗的首选候选物进行研究，因为它们更容易生产和纯化。此外，这些VLPs体积更小，使它们能够轻松穿过组织屏障并排入淋巴结。病毒粒子的主要结构组成部分是由单个病毒编码蛋白形成的，来源于病原体，如杯状病毒、乳头瘤病毒和小病毒，而多蛋白非包膜VLPs则更为复杂，包含多个相互作用的衣壳蛋白。它们展示了几个显著的结构特征，如多个不同衣壳蛋白的复杂同心层。它们比仅由一个主要衣壳蛋白（CP）构成的VLPs更难制造，来源于传染性腺胃炎病毒、脊髓灰质炎病毒和逆转录病毒。 3.2. 包膜病毒样颗粒 与非包膜VLPs相比，包膜VLPs（eVLPs）的组成要复杂得多。这些纳米结构由来自宿主细胞的细胞膜称为包膜，外表面有病毒蛋白存在。它们的脂质双层中嵌入了一个或多个糖蛋白刺突，作为产生中和抗体的靶抗原。这些eVLPs显示出更高的灵活性，因为它们针对相同或异源病毒的抗原表位。例如，已经开发了包含SIV的Gag蛋白和HIV的Env蛋白的eVLPs。尽管这可能会影响下游应用，因为存在宿主蛋白。eVLPs已被用于开发针对病毒疾病，如汉坦病毒、丙型肝炎病毒（HCV）、流感A和逆转录病毒的疫苗。这些大型eVLPs的尺寸大于100纳米，因此它们可能会在注射部位聚集，并且不会到达淋巴结，这限制了它们的应用。相比之下，携带mRNA疫苗的脂质纳米颗粒尺寸范围在100纳米或更小，并在将疫苗高效传递到目标部位方面显示出高效性。 3.3. 嵌合病毒样颗粒 嵌合病毒样颗粒（cVLPs）被认为是开发提供更广泛、更强大、更全面保护以应对新兴传染病的有效工具。这些复杂的多蛋白宏观结构包含不同病毒的表位。cVLPs可以通过构建编码相关病毒蛋白和外来肽或蛋白的重组DNA分子来创建。这些基因工程cVLPs在其表面展示大量重复序列，可以通过化学偶联或遗传融合从其他病毒加载外源抗原。不同的嵌合疫苗已经进行了临床试验，包括针对乙型肝炎的基于VLP的疫苗（M2–HBcAg）、抗疟疾疫苗（MalariVax）、抗流感A、抗HIV和减少吸烟者血液中尼古丁水平的尼古丁-Qb VLP疫苗。这些嵌合颗粒有利，因为它们显著增加了对外国抗原的免疫反应和抗体滴度。cVLPs给药后，它们诱导强烈的细胞溶解性T淋巴细胞免疫反应。这些疫苗还针对非传染性疾病，如高血压、阿尔茨海默症、尼古丁成瘾、过敏和糖尿病。cVLPs的上游和下游处理产量通常较低，其体内稳定性也相当不确定。 4. 病毒样颗粒作为免疫原 已经证明，与亚单位疫苗相比，VLPs具有潜在的高免疫原性和抗原性。这些颗粒的效力有可能显著诱导细胞和体液免疫（图3）。在对VLPs的反应中，各种成熟标志物如CD40、CD80和CD86在树突细胞表面表达，这些标志物负责激活树突细胞。在第一步中，树突细胞通过与树突细胞表面存在的特定模式结合，称为模式识别受体（PRRs），即Toll样受体（TLR2），来激活VLPs。随后，VLPs在树突细胞的细胞质中发生内化，并通过MHC I类和II类分子分别呈递给细胞毒性T细胞和辅助T细胞。VLPs不仅可以刺激B细胞介导抗体反应，还可以刺激CD4+和CD8+细胞增殖。一些研究表明，外源性抗原也可以通过一种称为交叉渗透的过程到达MHC I类途径。 图3: VLPs诱导先天和适应性免疫反应（A）体液免疫；（B）细胞介导的免疫），（1）基于VLP的抗原通过树突细胞等抗原呈递细胞（APCs）增强吸收和呈递，这些细胞向T细胞通报潜在风险，（2）VLP有效运输到淋巴结，这是适应性免疫反应的关键场所，（3）改善B细胞、T细胞和APCs之间的细胞通信，以及（4）基于VLP的抗原有效交联并激活B细胞受体，这些受体在抗原暴露后发展成记忆细胞和长期及短期存活的浆细胞。 此外，B细胞的激活可以通过Toll样受体（TLR）信号或同源相互作用诱导Th细胞的扩增和分化，这些相互作用控制细胞因子的产生。为了提高VLPs的效力，还可以将不同的分子如Toll样受体配体、生物活性介质或其他细胞受体附加到VLPs上。 5. 基于病毒样颗粒的商业批准疫苗 第一种重组VLP是从病毒衣壳蛋白合成的，来自乙型肝炎病毒（HBV）的两个基因（HBsAg和HBcAg）和烟草花叶病毒（TMV）。第一种通过重组DNA方法生产的商业VLP疫苗在1986年获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准。这些是在酵母中生产的HBsAg疫苗，被命名为Recombivax HB R。后来，在2006年，第二种基于VLP的疫苗Gardasil R针对人类乳头瘤病毒（HPV）的疫苗获得了FDA的许可。此后，几种针对HPV和HBV的VLP疫苗已经获得批准，其中一些在临床和临床前试验中显示出效力。研究表明，至少有110种VLP已经从35个不同家族的病毒中生产出来。针对不同病毒的几种VLP疫苗，包括诺如病毒、HIV、埃博拉病毒、SARS-CoV-2病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、流感病毒仍在不同的临床试验阶段。然而，只有少数VLP疫苗进入市场，显示出它们的商业可行性，其中大多数针对非包膜病毒有效。 6. 特定于基于病毒样颗粒疫苗平台的挑战 目前，VLPs与传统疫苗一样有效，还有更安全的额外好处。然而，在成功开发基于VLP的疫苗方面需要解决几个障碍。主要挑战是确定与下游处理有关的问题，以生产临床可行的VLPs，以便及时管理并具有经济可行性。 6.1. 包膜病毒样颗粒的稳定性 VLPs通常被认为比亚单位疫苗更稳定。然而，当环境条件发生变化时，特别是在下游处理过程中，VLPs可能变得非常不稳定，因为它们缺乏病毒的遗传物质。尽管市场上已经有多种VLP疫苗可用，但一些候选疫苗的稳定性存在问题。通常，eVLPs通常比非包膜VLPs更容易受到外部环境条件的影响。温度变化、剪切应力、溶解氧、流体动力学、搅拌速率和化学处理等条件的变化都可能影响颗粒的完整性和稳定性。此外，这种结构破坏显著降低了eVLPs的免疫原性。它还干扰细胞生长和代谢蛋白的产生，这影响了VLP的生产。这一直是将它们作为疫苗制造中活病毒替代品使用的关键障碍之一。然而，已经进行了几种修改以增加它们的热稳定性。一种典型的程序是插入稳定突变。Marsian等人进行的一项研究表明，当在3型脊髓灰质炎病毒VLP的衣壳蛋白中诱导稳定突变时，它比野生型VLP更稳定。它修改了衣壳前体和病毒蛋白酶，而不影响其抗原表位和结构确认。Schumacher等人的另一项研究通过添加C末端连接体-六组氨酸肽增加了嵌合体（HBcAg-VLP）的稳定性。 6.2. 高生产成本 一些基于VLP的疫苗在结构上更为复杂，因此生产成本更高。与eVLPs相关的众多杂质带来了巨大的挑战。在下游处理（DSP）过程中，会像包膜杆状病毒颗粒的情况一样，共同纯化各种杂质，如宿主细胞碎片（HCD）、宿主细胞蛋白（HCP）和宿主细胞DNA（HCD）。如果这些污染物在DSP期间没有正确去除，它们可能会在疫苗中引起不良副作用。大规模生产和纯化VLPs需要不同的工艺，如密度梯度或甚至色谱法，以制造最终配方产品。这些复杂工艺成本高昂且耗时。这也导致了在工业规模生产上的困难，并需要进行多项质量控制措施，因为不同的下游加工步骤可能会降低VLPs的质量。需要更健壮和更好的分析方法来确保产品的质量和数量，以便促进它们在临床和制药领域的应用。在VLPs的上游和下游加工过程中，已经实施了不同的策略，如克隆筛选、高通量筛选、生物反应器工程、材料/基质筛选、过滤、流穿或尺寸排除色谱和抛光，以实现可扩展和成本效益高的工业制造。 6.3. 组装困难 将表位序列遗传融合到VLPs中有时可能具有挑战性，因为VLPs可能会失去自我组装属性或导致颗粒错误折叠。将抗原遗传融合到病毒的衣壳蛋白通常会阻碍抗原组装或VLP，使技术变得繁琐。因此，需要耗时的规划和优化，以单独测试每个单一抗原。 7. 病毒样颗粒生产的表达宿主系统 已经使用了不同的表达系统（ESs）来制造VLP疫苗，包括植物、哺乳动物、昆虫、酵母和细菌（图4）。 图4:不同表达系统在病毒样颗粒开发中的优缺点。 7.1 细菌 大多数细菌系统都集中在大肠杆菌（Escherichia coli）的工业菌株和表达载体上，这些已经得到了深入研究。细菌细胞培养作为VLP开发的平台进行了研究，具有成本和可扩展性方面的优势。使用细菌系统生产VLP的其他有利特点包括（a）易于操作，（b）高水平表达，（c）快速生长速率，（d）遗传稳定性，以及（e）表达的简单性。 Huo等人使用pCold表达载体在大肠杆菌菌株（BL21）中表达和纯化诺如病毒（NoV）VLPs，并展示了在大肠杆菌中组装的VLPs与在Sf9细胞中组装的VLPs具有相似的结合模式。类似地，在最近的一项研究中，表达全长CP的2型猪圆环病毒和猪小病毒的VP2蛋白在大肠杆菌中表达，它们自我组装成VLPs。研究表明，大肠杆菌中CP和VP2的表达可以用于大规模开发VLP疫苗。Yazdani等人研究了利用葡萄扇叶病毒（GFLV）的VLPs作为呈现HPV L2表位的潜在载体的可能性。抗原因子决定簇序列被遗传地结合到GFLV衣壳蛋白的“αB-αB”域C中，然后在大肠杆菌和毕赤酵母中过度表达。在大肠杆菌中观察到最高的表达产量。对于戊型肝炎病毒（HEV），ORF2蛋白区域368-606 aa从大肠杆菌不溶性分数中纯化体外组装成VLPs。这种HEV VLP在临床试验中对症状性HEV有100%的效果，并已在中国作为疫苗批准商业使用。在另一项研究中，从重组IHHNV的CP重建的传染性皮下和血胞坏死病毒（IHHNV）VLPs在大肠杆菌中显示出出色的物理稳定性。 由于几个因素，细菌系统并不总是VLP开发的最佳策略，包括（a）免疫原性差，（b）无法发展具有类似哺乳动物的翻译后修饰（PTMs）的重组蛋白，（c）蛋白质溶解度问题，（d）无法形成正确的二硫键，以及（e）在重组蛋白的制备中存在细菌内毒素/或脂多糖。 Brito和Singh强调了各种类型疫苗的可接受内毒素水平。有各种方法可以在纯化步骤中去除内毒素，如固定化琼脂糖、表面活性剂、活性炭、超滤和阴离子交换色谱。然而，使用这些技术通常会导致产量显著降低、成本增加或目标蛋白的生物活性缺乏。因此，开发了ClearColiTM，这是一种基因工程大肠杆菌菌株，具有基因修饰的LPS，不会在人类中引起内毒素反应。 7.2 酵母 真核表达系统是原核系统的有力替代品，特别是当涉及到解决疫苗生产中细菌内毒素问题时。通过在酵母细胞中重组表达蛋白，可以更具成本效益地生产VLPs。酵母中的基因操作相对简单，转化细胞可以生长到极高的密度，直到诱导重组蛋白的表达。这允许商业规模的发酵罐大规模生产VLPs。一些哺乳动物病毒的结构基因在酵母中表达可以形成VLPs。 美国食品药品监督管理局（FDA）已经批准了一些基于酵母衍生的VLP疫苗，包括针对人类乳头瘤病毒（HPV）的Gardasil®和Gardasil9®，以及针对恶性疟原虫（P. falciparum）的MosquirixTM。一些研究已经使用酵母作为表达系统（ES）来研究VLP的生产。Wetzel等人建立了一个健壮且成本效益高的酵母模型，用于生产嵌合VLPs。选择了鸭乙型肝炎病毒膜整合小表面蛋白（dS）作为VLP的支架，以及安全且工业上应用的Hansenula polymorpha酵母作为异源表达宿主。从感染动物的四种病毒中获得了8种不同的高分子量抗原，并将它们与蛋白dS遗传链接，然后鉴定并纯化了重组分离物。在所有情况下，融合蛋白都高度表达，并且与蛋白dS共产后，可以生成包含两种蛋白的嵌合VLP。基于酵母的生产系统允许生产成本低廉的产品，且不仅限于小规模基础研究。在另一项研究中，Alireza等人通过将HPV-16 L2的交叉中和表位插入到HPV-16 L1基因中，首次在P. Pastoris系统中生产了嵌合蛋白L1/L2 VLPs。随后，将HPV-16的嵌合L1/L2引入质粒（pPICZA）并在P. pastoris中表达。L1-HPV-16 Ab和L2-HPV-16 Ab检测的ELISA结果表明，与商业测试套件的灵敏度相当的阳性反应。同样，在P. pastoris ES中，Gupta等人生产了一种针对HEV的重组VLP，包括蛋白ORF2的112-608 aa区域。结果表明，对于112-608 aa VLP的开发，P. pastoris ES似乎是比杆状病毒（Bv）ES更优越且更安全的选择。在病毒感染期间，像脊髓灰质炎病毒这样的肠道病毒会产生与成熟病毒粒子在抗原上无法区分的空衣壳。通过异源系统（如酵母）的帮助，这种衣壳的重组合成作为VLP疫苗候选物具有巨大的潜力。Sherry等人通过共表达病毒蛋白酶3CD和结构前体蛋白P1，在P. pastoris中展示了VLP的生产。构建酵母ES比细菌ES更具挑战性，特别是Pichia和Hansenula菌株。此外，VLP产量低于大肠杆菌。酵母ES的另一个缺点是它在蛋白质翻译后修饰（PTMs），特别是糖基化方面与哺乳动物ES的相似性不足。它们的糖型主要是高甘露糖型，这对大多数制药糖蛋白（GPs）来说是不受欢迎的。 7.3. 昆虫细胞 基于杆状病毒的昆虫细胞系蛋白表达已成为开发复杂基于蛋白质的生物制剂的有效工具，用途多样，从多蛋白复合体到用于治疗用途的蛋白质开发，如VLPs。Bv在能够容纳大量异源DNA并将其忠实地传递到目标宿主细胞的能力方面，与其他广泛使用的病毒载体不同寻常。Gopal和Schneemann详细描述了生产重组杆状病毒（rBVs）、筛选昆虫细胞系中VLP表达以及纯化VLPs的程序。 Bv-昆虫细胞系统是一个两步程序，首先将昆虫细胞培养到所需的细胞浓度，然后感染rBVs以表达蛋白质。使用Bv表达载体系统（EVSs）的重组蛋白和VLP生产是快速、多功能的，并提供大量的产量。该系统可以产生异常高的蛋白质产量，结合复杂的真核蛋白质PTMs，这对于某些VLPs的正确自组装和释放可能至关重要。 MultiBac是一个创新的Bv EVS，它由一个已经被设计用于特定目的的病毒基因组组成。最近，一组科学家描述了基于MultiBac的VLP工厂的开发，该工厂依赖于流感病毒的CP（M1）及其在生成具有流感病毒血凝素（HA）功能修饰的流感衍生VLPs中的利用，这些修饰预计将调节VLP衍生的免疫反应。 昆虫细胞-Bv EVSs已被证明与流感病毒疫苗生产的常规鸡蛋和基于细胞的方法一样有效，具有高产量和短生产时间的额外特点。此外，rBVs构建变得更快、更容易、更灵活，允许在相同的表达载体中融合不同类型和/或亚型的流感病毒基因。Sequeira等人成功创建了一个强大的High Five基于昆虫的细胞平台，该平台结合了稳定的表达和Bv介导的表达，以产生多价流感VLPs。通过用两种不同的H3亚型HA蛋白（称为HA2和HA1）感染High-Five细胞系，并用表达M1和三种额外的H3亚型HA蛋白（称为HA5、HA4和HA3）的Bv，这种方法的模块化能力得到了证明，以产生五价VLPs（H3）。 扎伊尔埃博拉病毒血清型（ZEBOV）是所有血清型中最有毒的，并且具有最高的死亡率。通过共表达3种病毒结构蛋白，核衣壳蛋白（NP）、基质结构蛋白（VP40）和糖蛋白（GP），已经在昆虫和哺乳动物细胞系中实现了ZEBOV-VLPs的开发。Pastor等人报告了一种在昆虫细胞系中生成ZEBOV-VLPs的技术，基本上包括使用高感染度（MOI）的bac-GP和bac-VP40，并限制NP表达，要么通过防止感染，要么通过降低bac-NP MOI，是开发VLP的最适当方法。 昆虫细胞ES的主要限制是（a）被包膜杆状病毒污染的蛋白质，（b）难以扩大规模，以及（c）比哺乳动物细胞更简单的N-糖基化。 7.4. 哺乳动物细胞 二十多年来，各种哺乳动物细胞系，如小鼠骨髓瘤（Sp2/0、NS0）、中国仓鼠卵巢（CHO）、小鼠C127、婴儿仓鼠肾（BHK21）、HT-1080和HEK293，由于它们能够正确折叠、组装和翻译后修饰蛋白质，已被建立为商业化蛋白质治疗剂的可能来源，用于医疗目的。基于哺乳动物细胞培养的系统提供了许多好处，包括在开发过程中的一致性和灵活性。它还有助于糖蛋白以与病毒宿主相似的脂质膜组成被恢复。据报道，将病毒基因稳定转染到哺乳动物细胞系中，包括293或Vero细胞，可以产生VLP。 多项研究报告了从哺乳动物细胞培养中高效生产VLPs。Hsin等人利用Huh7细胞作为表达系统，开发了一种MERS VLP系统，用于了解病毒感染和形态形成。在另一项研究中，通过瞬时转染在Vero、293 T或CHO-K1细胞系中表达了编码神经氨酸酶（NA）、血凝素（HA）和基质M1蛋白的流感VLPs。在BALB/c小鼠的临床前研究显示，当肌肉注射给药时，流感VLPs在低剂量下具有显著的免疫原性，诱导针对NA和HA的功能抗体。Wu等人设计了一种可扩展的方法，用于有效生产在哺乳动物细胞系中表达的各种亚型的流感VLPs。该研究表明，这些哺乳动物流感VLPs在粒径、结构、宿主因子组成和病毒抗原糖基化方面与原始病毒非常相似。同样，在另一项工作中，开发并利用了一种可诱导的人类胚胎肾HEK-293细胞系，表达NA和HA，以在用编码HIV-1 Gag的质粒进行瞬时转染后生成VLPs。为在哺乳动物细胞悬浮培养中通过瞬时基因表达合成HIV-1 Gag VLPs制定的协议表明，细胞培养上清中存在的大部分Gag-GFP完全组装成与HIV-1未成熟颗粒一致的预测形态和大小的VLPs。 基于哺乳动物细胞的表达系统需要大规模生产设施，如发酵生物反应器，这些设施建造成本过高。因此，生产成本高昂是细胞基础的哺乳动物ES的一个具有挑战性的部分。其他限制包括长时间的表达时间、产量低以及易受哺乳动物病原体感染的脆弱性。 7.5. 植物 “分子农业”是用来描述利用植物或植物细胞生产重组蛋白或其他生物药物的术语，这些药物用于作为化妆品、生物制药、治疗剂、疫苗和其他试剂。植物为VLP疫苗的生产提供了一个诱人的替代系统，因为它们有潜力以最小的成本生成大量的重组蛋白，它们具有正确的PTM和蛋白质折叠组装的真核生产机械，并且它们引入意外人类病原体的风险低。植物不需要安装昂贵的发酵设施来生产生物质，也不需要建立重复的设施来扩大生产规模。与微生物发酵不同，植物有能力进行N-糖基化作为糖蛋白PTM。在植物细胞中表达的工程VLP形成人类或动物病毒衣壳蛋白包括人类诺如病毒CP、HPV L1蛋白、乙型肝炎核心和表面抗原、HIV Gag多蛋白和流感病毒的HA蛋白。 多项研究已经广泛讨论了在各种植物ESs中构建VLPs的概念、在植物宿主中有效生长VLPs以及在植物中自组装多种病毒结构蛋白。Santi等人利用TMV衍生的瞬时ES，在烟草植物叶片中生产了正确组装的重组诺如病毒VLPs。Young等人生成了可追踪的基于血凝素的VLPs，使他们能够在植物中检查颗粒组装和VLPs在哺乳动物免疫系统内的相互作用。van Zyl等人通过农杆菌介导的瞬时表达，研究了在烟草植物中生产蓝舌病病毒VLPs，这是一个低成本系统。同样，Veerapen等人在烟草植物中瞬时表达了口蹄疫病毒的VLPs。Diamos和Mason使用改良的双生病毒载体在基于植物的系统中生产了诺如病毒VLPs。最近，Roales-Mendoza等人提出了一种针对SARS-CoV-2的基于植物的VLP疫苗开发的视角，SARS-CoV-2是导致COVID-19大流行的罪魁祸首。 用于VLP平台生产的植物并不完全可接受，因为与哺乳动物ESs相比，VLP的生产水平相对较低，以及植物特有的N-糖基化糖蛋白。然而，最近创造的新型植物ESs，以及植物糖工程的进步，都已经解决了这些挑战。植物糖工程的最新进展允许人类样的糖修饰，并优化所需的糖结构，以提高重组药物糖蛋白的功能和安全性。 8. 针对新发传染病的病毒样颗粒疫苗的开发 近年来，已经生产并使用了多种VLP疫苗来对抗不同的病毒和寄生虫感染（表1）。下面讨论了针对寨卡病毒、基孔肯雅病毒、流感病毒和人类乳头瘤病毒的VLP疫苗的开发。 表1: 针对不同病毒和寄生虫的VLP疫苗 8.1. 寨卡病毒 寨卡病毒（ZIKV）是一种小包膜蚊媒神经性正链RNA病毒，属于黄病毒科。ZIKV感染与急性产前异常有关，例如感染母亲所生的新生儿小头症，以及成人中的格林-巴利综合征（GBS）。目前，没有治愈方法或商业疫苗可用于有效治疗，因此开发针对ZIKV的疫苗非常重要。 ZIKV具有一个RNA基因组，只有一个开放阅读框，并形成一个单一的多蛋白。这种蛋白链被细胞和病毒蛋白酶切割成7种非结构蛋白（NS5、NS4B、NS4A、NS3、NS2B、NS2A和NS1）和3种结构蛋白（C、prM和E）。E蛋白参与病毒粒子的结合及其融合。E蛋白具有三个域结构，像包膜域-I也称为ED-I，然后是ED-II和ED-III。体液反应主要针对属于ED-II的融合环。针对融合环表位的抗体增强了通过Fcγ受体摄取DENV。因此，这种蛋白可能是疫苗开发的一个可能靶点。 已经开发了许多针对ZIKV的VLPs。Garg等人比较了小鼠中不同的ZIKV VLPs疫苗，并表明CprME-VLPs（衣壳前膜-包膜）比prME-VLPs（前膜-包膜）效果更好。由于需要共表达蛋白酶NS2B-3，无法使用CprME-生成细胞系。为了克服这个障碍，生成了一个双顺反子载体，利用IRES序列产生NS2B-3和CprME-VLPs。Alvim等人展示了HEK293细胞持续表达ZIKV-VLPs。简而言之，稳定产生寨卡VLPs的细胞系是开发疫苗的理想选择。 8.2. 基孔肯雅病毒 这是一种由携带蚊虫传播的CHIKV（基孔肯雅病毒）引起的严重和周期性传染病。症状包括高烧、皮疹等。目前没有可用的疫苗，但有许多VLP疫苗候选物处于不同的开发阶段。通过选择性表达CHIKV包膜和衣壳蛋白产生的自组装VLPs可以提供对这种病毒的多种菌株的保护。 Arévalo等人报告说，当使用无佐剂CHIKV VLPs时，成年小鼠对CHIKV感染实现了100%的保护。同样，Metz等人比较了在昆虫中由重组杆状病毒产生的三种不同疫苗，它们分别产生sE1、sE2 CHIKV和CHIKV（VLPs）。与VLP免疫的小鼠相比，E1和E2免疫的小鼠有一半存活，显示出不完全的保护。Akahata和Nabel发现，可变CHIKV结构蛋白表达产生的VLPs，模仿具有复制能力的α病毒。这种疫苗引起针对这种病毒的多种菌株的大量中和抗体的诱导，并提供完全保护。 与CHIKV-OPY-1菌株的VLPs相比，CHIKV 37997菌株的VLPs更容易产生，尽管它们具有高度的氨基酸序列相似性。了解CHIKV VLP生产的机制将有助于其他疫苗的开发，也扩大了它们对其他病原体的应用范围。此外，VLP生产受到E2的第234个氨基酸在酸敏感区域的影响。酸敏感区域的突变和pH变化也提高了VLPs的产量。 8.3. 流感病毒 流感病毒（Iv）感染是导致人类慢性呼吸道症状的主要原因，导致严重的公共卫生结果，包括流行性和季节性感染，甚至导致不可预测的大流行爆发。Iv是一种包膜的、分段的、负义RNA病毒，属于Orthomyxoviridae科。迄今为止，已经鉴定出四种类型的Iv，根据它们的核心蛋白存在情况分类：A、B、C和D。三种Iv类型，A、B和C对人类细胞具有致病性并引起严重感染，其中A型和B型是最普遍流行的类型。流感病毒的主要表面糖蛋白是神经氨酸酶（NA）和血凝素（HA）。 HA是参与感染的关键抗原，它附着在细胞膜表面的唾液酸残基上，促进Iv进入宿主细胞。与HA相比，NA在病毒表面上出现的频率较低，通常观察到的NA：HA比例为1：4。它的酶功能在切割唾液酸中至关重要，从而促进病毒从感染的宿主细胞表面释放。NA激活还使流感病毒能够通过涉及唾液酸切割的机制成功穿透粘液。 Kim等人研究了来自2009年H1N1流感病毒大流行的含NA（N1 VLP）的VLP的交叉保护效率和免疫原性，并将其与灭活分裂流感疫苗进行了比较。用N1 VLPs免疫的小鼠能够诱导病毒特异性抗体（Ab）反应以及交叉反应的NA抑制活性，而灭活分裂疫苗则诱导了株特异性的血凝抑制试验。用N1 VLPs免疫的小鼠导致对抗原多样化的Iv产生交叉保护免疫力，通过体重变化、肺病毒滴度、先天白细胞浸润、细胞因子和Ab分泌细胞、生发中心B细胞的测量。此外，在未处理的小鼠中，N1 VLPs的免疫血清提供了交叉保护。N1 VLPs诱导的免疫力在缺乏Fc受体γ链的小鼠中既没有受损也没有减少。这些发现表明，代表NA的VLPs，以及当前的流感疫苗，可能进一步改进并开发成为交叉保护疫苗的重要候选物。 最近，Kirsteina等人研究并检查了一系列广泛保护原型Iv疫苗的效力和免疫原性，重点关注流感三联矩阵蛋白2离子通道（3M2e）和并入噬菌体AP205 VLPs的三叉抗原。仅含3M2e抗原的VLPs在小鼠中刺激了对标准同源以及异源病毒挑战的保护。将流感病毒的两种保守抗原结合到一个单独的VLP中，可在小鼠中实现对高剂量同源流感H1N1感染的完全保护。 8.4. 人类乳头瘤病毒 人类乳头瘤病毒（HPVs）是Papillomaviridae家族的成员，是微小的、圆形的、双链DNA病毒，导致宫颈癌，这是继乳腺癌之后世界上第二致命的女性疾病。目前，有两种基于VLP的疫苗可供商业使用，用于抑制由HPV引起的疣和治疗宫颈癌。这些包括GlaxoSmithKline（GSK）制药公司的Cervarix和Merck制药公司的Gardasil。两种疫苗均由HPV 16和18的免疫原性主要衣壳蛋白（L1）VLPs组成，Gardasil还含有6和11 VLPs。 使用L1蛋白作为VLP疫苗的抗原的缺点是它在不同的HPV血清型中并不保守。相反，次要衣壳蛋白（L2）在所有HPV血清型中高度保守，长期以来一直被认为是开发具有广泛保护的HPV疫苗的主要潜在靶点抗原。与衣壳蛋白（L1）相比，衣壳蛋白（L2）不能用于VLP生产，因此免疫原性较低。L2蛋白免疫原性低的原因是由于其相对于L1的轻微表达，以及L2主要埋藏在衣壳表面下，在那里它在体外与细胞表面接触，或在体内与基底膜接触并诱导构象转变。 已经应用了几种方法来提高和增强L2肽的低免疫原性，例如由多种HPV类型的L2表位组成的串联融合肽，结合免疫激活的TLR激动剂，或在颗粒免疫刺激平台（如TMV、MS2或PP7噬菌体、腺相关病毒、干酪乳杆菌或细菌硫氧还蛋白的VLP）上重复表面阵列的L2表位。 另一种提高L2低免疫原性的有前景的策略是通过由HPV L1-L2嵌合蛋白组装的VLPs在表面展示L2表位。通过将高度保守的B细胞表位RG1的HPV16 L2遗传插入到HPV16 L1蛋白的表面环（DE）中实现，导致其在VLP表面上多价（360倍）免疫原性展示，而HPV16 L1框架的构象中和抗原决定因素大多保留。用这种嵌合RG1-VLP免疫引起了高型特异性HPV16滴度和广泛的异源粘膜和远亲皮HPVs的交叉中和。 Pouyanfard等人描述了基于单一肽的热稳定硫氧还蛋白疫苗开发，能够携带多达11种不同类型HPV的L2多肽。L2多肽的抗原在免疫应答的稳健性和保护方面表现出色。为了进一步提高和增强免疫原性，将硫氧还蛋白的多肽抗原L2与七聚体化域融合。在疫苗的最终设计中，实现了对所有14种致癌型HPV，以及较低风险的HPV类型（6和11），以及一系列皮肤HPV的保护反应。 9. 病毒样颗粒对抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2 去年，全球有超过200万人的死亡和2亿多人受到影响，200多个国家受到严重影响，严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）已成为全球性的麻烦。由SARS-CoV-2引起的COVID-2全球大流行影响了数十亿人，并成为2009年H1N1大流行之后的第一个重大全球灾难。目前，一些商业上可用的抗病毒药物，包括Remdesivir®（吉利德科学公司）、Paxlovid®（辉瑞公司）、Molnupiravir®（默克公司）已获得FDA和WHO的批准，用于治疗感染SARS-CoV-2的患者。由于针对病毒的目标药物疗法在开发、成本和分发方面的限制，研究人员正将重点和努力放在开发疫苗上，以长期对抗COVID-19。针对SARS-CoV-2的VLPs可以帮助抗击广泛流行的大流行。VLPs可以作为治疗剂和针对这种病毒疾病的可行疫苗，此外还可以作为可行的诊断工具。SARS-CoV-2有一个缓慢的作用机制，因为病毒进入宿主后，一个人需要5到15天才会出现症状，因为病毒通过内体途径进入宿主细胞，并不擅长逃避免疫系统，而针对其他冠状病毒（CoVs）株的疫苗，这些株引起SARS和中东呼吸综合征（MERS），已被证明在动物模型中对SARS-CoV-2有效和活跃。像其他CoVs一样，SARS-CoV-2由四种在不同病毒血清型中结构保守的蛋白质组成：刺突（S）、核蛋白（N）、包膜（E）和膜（M）蛋白。上述蛋白质及其相关交互模式对VLPs的生产和组装至关重要。M、N和E对SARS-CoV-2的VLPs生产至关重要（图5）。S蛋白就是这样一种在不同冠状病毒株中常见的蛋白质，可能作为潜在的疫苗开发目标。通过在昆虫宿主细胞ES中展示S蛋白，已经生产了针对MERS-CoV的VLPs。 图5:提议的SARS-CoV2病毒样颗粒疫苗的生产系统和作用机制。编码SARS-CoV2的结构蛋白（S、N、M和E）的质粒可以转染到适当的哺乳动物细胞系中。然后收集、纯化组装的VLPs，并将其施用于人类。VLPs的施用刺激了先天和适应性免疫反应。如果原始的SARS-CoV2将来进入人体，记忆B细胞激活并释放针对它的抗体。同样，激活的CD8+ T细胞识别并杀死病毒感染的细胞。 在开发基于SARS-CoV-2 VLP的疫苗之前，必须首先考虑以前针对先前和密切相关的菌株的VLPs的工作。以前已经证明VLPs在通过rBV ES生产时，通过在小鼠中引起特定的体液和细胞免疫防御来有效对抗SARS-CoV。Ho等人报道了SARS-CoV的VLPs的合成。这些VLPs是通过rBV的共感染在昆虫ES中组装的。通过使用蛋白质冠层形成制备的VLPs在CoV感染的禽类模型中显示出有效的疫苗接种，并导致显著的免疫反应。同样，含有SARS-CoV的4种结构病毒蛋白（S、N、E和M）的质粒被转移到Vero E6细胞中以生产VLPs。这些VLPs可以作为研究SARS-CoV与宿主细胞病理机制的有效工具。最近，一种表达SARS-CoV-2 VLPs的COVID-19 mRNA疫苗在小鼠模型中显示了诱导强大的抗病毒免疫反应。 目前，NVX-CoV2372是唯一商业上可用的针对SARS-CoV-2的基于VLP的疫苗。这种疫苗是通过在rBV中展示SARS-CoV-2 S蛋白生产的，然后通过感染蛾细胞表达系统进行大规模生产。这种疫苗在不同国家的不同试验中显示出不同程度的有效性。目前，还有五个团队分别致力于针对COVID-19的基于VLP的疫苗，临床试验正在进行中，正在努力开发可行的基于VLP的疫苗。已经开发出生物计量VLPs，可以通过在RT-PCR过程中作为阳性对照来帮助准确诊断SARS-CoV-2。Ghorbani等人使用免疫信息学分析评估了各种SARS-CoV-2刺突衍生表位的免疫原性质，这些表位已被报道可诱导特定的免疫反应。最后，建议一组筛选出的表位，这些表位可以在不同植物物种中使用分子农业方法合成针对SARS-CoV-2的基于VLP的疫苗。 不同的哺乳动物ESs被用于合成SARS-CoV-2 VLPs。结果表明，来自Vero E6细胞系的SARS-CoV-2 VLPs比来自HEK-293T细胞的更耐用、更集成。最近，有报道称一种基于植物ESs的针对SARS-CoV-2的VLP疫苗。针对SARS-CoV-2的VLP疫苗（CoVLP）的临床I期试验结果表明，该疫苗在个体中显著发展了IL-4和IFN-γ免疫反应。CoVLP疫苗是通过在植物ESs（N. benthamiana）中短暂表达SARS-CoV-2的S蛋白生产的。三聚体S GPs展示在自组装VLPs的表面，模仿SARS-CoV-2的大小和形状。同样，针对SARS-CoV-2的组合小刺突VLP疫苗在小鼠中也显示出高水平的免疫，在单剂量后。疫苗引发了中和Abs的发展，并保护K18-hACE2小鼠免受COVID-19的侵害，类似于患有COVID-19的患者。 以衣壳VLP为中心的SARS-CoV-2疫苗（ABNCoV2）在小鼠模型中显示出有效的SARS-CoV-2中和。ABNCoV2疫苗是通过在昆虫（Drosophila）细胞中展示SARS-CoV-2 S蛋白的受体结合域生产的。研究人员还在致力于开发一种可以通过鼻腔输送到目标组织的基于DNA的疫苗，这将在个体中产生SARS-CoV-2 VLPs，从而在个体中产生强烈的免疫反应。 10. 蛋白质纳米颗粒在疫苗开发中的应用 蛋白质纳米颗粒（NPs）有助于开发针对免疫逃逸病原体的疫苗，如HIV、流感、疟疾，并通过单独作用或作为靶向药物传递的载体，帮助对抗新兴的毒株。利用NPs辅助的蛋白质分子工程进行抗原表达，用于疫苗开发以产生免疫反应，是治疗和药物开发中日益受欢迎和迅速发展的领域。基于蛋白质的病毒样颗粒（VLPs）作为天然NPs，因设计简便、自组装和高稳定性而在疫苗开发中得到广泛应用。有三种不同的方法用于将抗原附加到NPs上进行展示，（1）标签偶联，（2）化学偶联，以及（3）遗传融合。这些技术使平台能够装饰各种抗原，导致尺寸增加和展示效果增强。 大多数抗原通常不会自行组装成NPs，如在流感亚单位疫苗中使用的那些。在这种情况下，可以通过将这些抗原附加到多聚蛋白平台上来实现自组装。有许多天然存在的多聚蛋白，如蝶呤合酶（LS）、铁蛋白、二氢硫辛酸乙酰转移酶（E2p）、非结构蛋白10（nsp10）、包裹素和热休克蛋白（HSPs），这些已被开发用于设计靶向治疗的平台。使用NPs展示病毒糖蛋白在开发针对特定抗原的抗体方面是有效的。展示抗原的蛋白质NPs在产生针对特定抗原的免疫反应方面非常有效，可以单独使用或与疫苗结合使用。 在可用于展示抗原的广泛平台中，铁蛋白已成为一个主要的蛋白质复合物，可以与NPs结合用于疫苗开发。由于其高pH和热稳定性，它允许与表面分子容易结合。近年来，铁蛋白在临床前研究中作为针对多种病毒传染病的可行疫苗平台进行了研究，包括HIV、H1N1、HCV、HBV、HFMD、Epstein–Barr、轮状病毒和由冠状病毒引起的呼吸道疾病。 Kelly等人比较了体内展示流感HA的铁蛋白NPs与可溶性蛋白（HA）的免疫原性。与可溶性蛋白（HA）相比，HA-铁蛋白NPs显示出更高的免疫原性和对病毒挑战的更大保护作用。 最近，一种基于结构的自组装蛋白质NP免疫原的设计，针对SARS-CoV-2产生了保护性和强大的抗体反应，在小鼠的体内研究中展示了先天免疫的发展。同样，基于铁蛋白NPs的SARS-CoV-2疫苗在小鼠中诱导了有效的抗体反应，据报道这种反应至少在免疫后持续了7个月，有助于充分发展免疫。 尽管蛋白质NPs可以作为疫苗开发的可行候选物，但由于其有机性质，NPs的体内应用通常受到几个挑战的限制，包括细胞毒性、炎症反应和不足以递送到目标部位。“蛋白质冠层”形成这个术语被用来总结体内条件下蛋白质与NPs之间不利相互作用。附加到NPs表面的蛋白质影响其生物行为并改变其功能，有时导致功能增加或丧失。蛋白质冠层形成是一个复杂的过程，涉及两个相互作用实体之间的复杂动态和动力学。有些病例报告了在与NP表面相互作用后发生了结构变化，明显改变了NPs的原始功能。因此，为了克服这些挑战，了解蛋白质构象变化和展开过程对于加速NPs的生物医学应用至关重要。 11. 结论 在过去二十年中，一些病原体对商业化抗生素的耐药性急剧增加，主要是由于无监管的非处方销售、药物的滥用和过度使用以及遗传适应。药物开发是一个严格的任务，需要充足的时间、资金和重复试验，才能使一个可行的产品商业化，以帮助对抗众多新兴病原体。由于耗时的限制，特别是患者获得适当药物的机会受到阻碍，而病原体的耐药性却在持续增加。因此，预防措施对于解决传染病的紧急情况具有重要意义。在努力抗击这类疾病的过程中，VLPs在医疗行业中崭露头角，应用范围从疫苗开发、药物传递系统到分子诊断等多个领域。基于VLP的方法为疫苗开发提供了一种替代现有传统方法的选择。目前，一些针对危险病原体的基于VLP的疫苗已经商业化，如ZIKV、HCV、HBV和HPV。与此同时，正在努力生产和设计针对包括SARS-CoV-2在内的各种新兴毒株的有效VLP疫苗。然而，在基于VLP的治疗能够与传统药物疗法在成本和效果方面竞争之前，仍需要解决一些主要障碍。尽管如此，基于VLP的医疗策略未来可能会与药物制剂一起广泛使用，以帮助对抗众多传染病。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。