SARS-CoV-2 vaccine (Sanofi Pasteur)

摘要：为应对由大流行引起的紧迫性，COVID-19疫苗被迅速开发并获得批准。当时市场上没有特定的法规。因此，监管机构紧急适应了这些疫苗。现在大流行的紧急情况已经过去，是时候考虑与这种快速批准相关的安全问题了。COVID-19 mRNA疫苗的作用机制应将其归类为基因治疗产品（GTPs），但监管机构已将其排除在外。作为疫苗，它们已经接受的一些测试在纯度、质量和批次均质性方面产生了不符合标准的结果。由于它们被归类为疫苗，mRNA及其蛋白质产品的广泛和持久的生物分布尚未完全研究，这引发了安全问题。上市后研究表明，mRNA能够进入母乳，可能对母乳喂养的婴儿产生不良影响。鉴于药物警戒数据库中报告的不良事件，应研究长期表达、基因组整合、向生殖细胞系的传递、精子、胚胎/胎儿和围产期毒性、遗传毒性和致癌性。还应对潜在的水平传播进行评估。应进行深入的疫苗警戒。我们期望这些控制措施对于在非大流行背景下开发的未来的mRNA疫苗是必需的。 1.引言 药品和疫苗的监管是一个鲜为人知但非常重要的课题。事实上，作为一项原则，健康产品必须经过非常严格的控制，以控制其有效性和安全性。抗COVID-19 mRNA疫苗是市场上的首批mRNA疫苗。mRNA疫苗代表了一类新型疫苗，应该比传统疫苗接受更多的控制，因为它们基于几种新技术。尽管定义不完全，mRNA疫苗的作用机制应该将它们归类为基因治疗产品（GTP）。但是，作为针对传染病的mRNA疫苗已被美国和欧盟法规排除在GTP监管之外。2020年之前没有针对mRNA疫苗的具体法规。“当前的指南要么不适用，要么没有提及RNA治疗，要么没有广泛接受的定义”。因此，监管机构不得不采取紧急程序来监控这些产品的测试，即滚动审查。在滚动审查中，数据在完整数据包可用之前就可以提交和审查，并且已经要求对这一新平台进行特定控制。本研究的目的是将GTP法规要求的控制措施与实际应用于mRNA COVID-19疫苗的控制措施进行比较。一些GTP所需的控制措施可能没有用于mRNA COVID-19疫苗，可能是因为需要迅速开发SARS-CoV-2疫苗的大流行紧急情况。将讨论由于缺少这些控制而可能出现的潜在安全问题。这一点尤为紧迫，因为制造商计划用mRNA疫苗替换某些“经典”疫苗，从流感疫苗开始。事实上，赛诺菲正在启动首个基于mRNA的季节性流感疫苗候选产品的临床试验，Moderna正在进行多项mRNA疫苗的临床试验（COVID-19、流感、人类偏肺病毒、副流感、RSV、HCoV、CMV、EBV、HSV、水痘、疱疹、HIV、寨卡病毒、尼帕病毒），特别是流感疫苗的3期试验。正在进行一项针对mRNA-LNP流感疫苗的1期临床试验。对于这些流感疫苗，不应适用紧急批准，也不应超出这些额外研究的要求。此外，正在宣布癌症“疫苗”（例如，Moderna和默克正在合作试验mRNA-4157/V940，一种与Keytruda——一种针对程序性细胞死亡受体PD-1的单克隆抗体结合使用的抗黑色素瘤“疫苗”）通过增强人体免疫系统检测和抗击肿瘤细胞的能力，通过阻断PD-1与其配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用，从而激活抗T细胞反应，特别是抗肿瘤反应。我们必须对与治疗药物相关的疫苗一词非常警惕，特别是关于适用于它们的法规。这些治疗药物不是针对传染病的疫苗，因此必须继续遵守GTP法规。 2.抗COVID-19 mRNA的当前监管 2.1. mRNA抗COVID-19的作用机制将它们定义为GTP及其作为疫苗的命运 尽管定义不完全，mRNA疫苗的作用机制应该将它们归类为基因治疗产品（GTP）；它们是核酸，旨在使疫苗接种者的细胞产生抗原，诱导产生抗体。这种作用机制与监管机构对GTP的定义完全对应。根据EMA CHMP报告（人类用药产品委员会）：“活性成分由mRNA组成，翻译成SARS-CoV-2的刺突蛋白抗原；LNP保护RNA并在肌肉注射后使宿主细胞转染；S蛋白诱导适应性免疫反应”。根据FDA，基因治疗是基于改变活细胞的遗传物质的医疗干预。细胞可以通过直接给予受试者的基因疗法在体内改变。根据EMA 2009，GTP：(a)包含一种活性成分，该成分包含或由用于或施用于人类的重组核酸组成，目的是调节、修复、替换、添加或删除遗传序列；(b)在其治疗、预防或诊断效果中，直接与其所包含的重组核酸序列或该序列的遗传表达产物有关。但mRNA也符合疫苗的定义；然而，在某种程度上存在不兼容性。2005年WHO指南授予基于核酸的疫苗疫苗地位（“在接种活载体或核酸或体外化学合成的抗原后，在接种宿主内体内产生的抗原”）。根据法国国家药品安全局（ANSM，Saint-Denis，法国）的定义，疫苗是一种预防性药物，由一个或多个称为抗原的生物来源活性成分组成，用于预防疾病。根据CDC，疫苗是一种用于刺激身体对疾病的免疫反应的制剂。根据欧洲法规，疫苗是能够产生主动免疫的产品，包含能够诱导对传染病原的主动免疫的抗原。根据EMA，COVID-19辉瑞疫苗的活性成分是mRNA：它不是抗原。因此，根据欧洲和法国药典，mRNA不应被视为疫苗，因为它们不包含抗原。 此外，根据它们的作用机制，mRNA疫苗可以被视为前药；这是模仿前药一词的新词，前药指的是一种药物，经过给药后，会被生物体转化为药理活性药物。事实上，根据mRNA的原理，它必须被接种疫苗者的细胞翻译成蛋白质（注射的物质不是引起主动免疫的物质）。根据FDA，mRNA疫苗对应于前药的第一类，即被细胞转化为活性药物的物质。这种前药属性可能意味着除了疫苗外还需要额外的控制措施。然而，FDA和EMA都没有对mRNA抗COVID-19疫苗的这些资质做任何引用。 2.2. 作为针对传染病的疫苗，mRNA已被美国和欧盟法规排除在GTP监管之外 1998年，FDA已经声明，用作预防性疫苗的重组DNA材料不包括在基因治疗指导中。2007年，FDA根据DNA质粒疫苗是否用于预防传染病来区分它们；没有用于传染病预防的DNA质粒受到基因治疗产品的监管，而针对传染病的DNA质粒疫苗则受到另一套法规的监管，该法规受到GTP法规的启发。2013年，FDA确认基因治疗产品的监管不适用于针对传染病的疫苗。在1996年关于用于预防传染病的DNA质粒的文件中，明确指出（与所有FDA指南一样）没有建立后续要求：这些是非约束性的建议。因此，本研究将主要基于EMA文件；尽管EMA指南没有法律约束力，申请者需要为任何偏离提供理由。 根据EMA，自2009年以来，“基因治疗药品不应包括针对传染病的疫苗”。这一排除在2015年得到确认。有关预防传染病的核酸法规的历史，见表1。这种排除带来了一个逻辑问题，因为并非所有基于RNA的产品都具有相同的监管地位，正如Guerriaud和Kohli所指出的。 2.3. 需要强调立法的矛盾 根据欧盟（EU）立法，基于RNA的药物目前可以根据不同的监管地位进行分类，对于疫苗来说，取决于它们的目标（是否针对传染病），对于其他药物，则取决于它们的获取方式（化学或生物学）。这种分类决定了为获得市场授权必须进行的控制和研究。因此，针对传染病的mRNA疫苗不被视为基因治疗产品（第162页）和，而用于治疗癌症的mRNA疫苗是GTMPs（基因治疗药品，是ATMPs，先进治疗药品的一部分）；事实上，根据CAT（先进疗法委员会），mRNA是GTMPs，因此必须进行完整的药代动力学研究。 因此，Moderna和BioNTech期望它们的产品被监管为基因疗法是令人惊讶的。Moderna公司在其2020年第二季度证券交易委员会（SEC）文件中承认，“目前，FDA认为mRNA是基因治疗产品”。此外，BioNTech创始人Ugur Sahin在2014年的一篇文章中表示，“可以预期mRNA药物的分类是生物制品、基因疗法或体细胞疗法”。因此，COVID-19 mRNA疫苗的地位制造商自己也没有很好地理解。 EMA法规必须参考WHO关于疫苗非临床评估的指南。根据EMA，“与欧盟指南不同，WHO指南还包括含有活载体或核酸的疫苗。这被认为是适当的，因为许多需要解决的非临床方面对于传统疫苗和含有活载体或自由DNA的疫苗是共同的”。这与EMA在2016年同一份文件中指定的从GTP法规中排除核酸疫苗相矛盾，因为EMA指出，核酸疫苗的特定方面必须根据GTP法规进行研究。 2020年，WHO指出了管理mRNA疫苗法规的不明确性。为解决这一监管问题，WHO于2020年12月20日发布了一份指导文件草案，用于评估mRNA疫苗的质量、安全性和有效性，其中包括疫苗的制造和控制以及它们的非临床评估。WHO承认，COVID-19 mRNA疫苗的生产详细信息尚不可用。此外，基于基因的生物制品的安全性和有效性控制尚未标准化，一些细节仍然是专有的，并未公开披露。鉴于这些不确定性，WHO认为不可能制定具体的国际指南或建议，需要一些监管灵活性。 2.4. 为什么mRNA疫苗被排除在基因产品监管之外？ 根据Guerriaud和Kohli，“很难确切回答为什么针对传染病的疫苗被排除在外。疫苗的定义自1975年以来没有改变，那个时期还没有针对癌症的‘疫苗’”；它们是能够产生针对传染病的主动免疫的药剂。当时，唯一存在的疫苗是针对传染病的疫苗，目前对疫苗的定义仅限于针对传染病的免疫药物。因此，一种抗癌药物绝不能被称为“疫苗”。值得注意的是，基于慢病毒的治疗性艾滋病疫苗，作为基因疗法，因为它们整合到基因组中，也被排除在基因疗法之外。可以假设申请人认为该产品既有治疗作用又有预防作用，但文件在EMA网站上不可用。 从公共卫生的角度来看，并且知道被视为疫苗的抗COVID-19 mRNA没有经过GTP所需的所有严格控制（见下文），人们可能会反对说，针对世界上大多数健康人群的产品应该比针对少数罕见疾病或癌症患者（这次涉及数百万人）的GTP受到更严格的监管。此外，根据EMA，“由于疫苗在大多数情况下是给予大量健康个体的，因此需要进行扎实的非临床安全评估”。 这种排除可能有监管解释；这个决定部分是因为疫苗的作用机制与其他药品非常不同，部分是为了确保所有疫苗都由同一个委员会审查（人类用药产品委员会—CHMP），EMA的疫苗专家（疫苗科学咨询小组（SAG-V））和疫苗工作组。 2.5. 作为疫苗考虑的mRNA所需的控制措施 疫苗通常属于EMA定义的人用药物，因此必须经过这些产品的相应控制；药品的监管涉及良好生产规范（GMP）。这些GMP在2001年的EMA文件中详细说明，并在2012年更新，适用于包括疫苗在内的所有人用药物（第117页）。这些GMP涉及，除其他外，对于临床前研究的环境风险评估、产品和原料的特性（纯度和质量）、它们的控制和稳定性、生产方法、药理学研究（例如，定量组成、生产过程描述、药典中未列出的原料、活性物质的鉴定和检测、作用机制、生物活性的体外或体内测试—如果成品中无法检测—毒性、致癌性、生殖和胚胎/胎儿毒性、药代动力学、药效学—药物对生理学的修改—有效性和产品安全性）。对于新的辅料，化学、制药和生物学信息应与活性物质提供的信息相同（第135页）。WHO对一般疫苗推荐相同类型的控制。 有关产品质量、纯度、稳定性、生产方法、生殖和胚胎/胎儿毒性以及致癌性的GMP将在下文讨论。尽管这些GMP适用于所有人用药物，但通常不适用于疫苗。 药代动力学是生物体对药物的作用，即药物的命运，从其进入生物体到离开，其吸收、生物利用度、分布、代谢和排泄随时间的演变。“通常不需要对疫苗进行药代动力学研究。然而，当使用新的给药系统或疫苗含有新型佐剂或辅料时，可能适用此类研究”。根据2016年的文件，对于EMA，规定应遵循WHO的规定。WHO指南明确指出，药效学研究也可能扩展到佐剂的药理学，并且在新配方的情况下必须考虑分布研究。当使用新的添加剂时，如果其毒理学数据不可用，则应首先对单独的添加剂进行毒性研究，并将结果按照新化学实体的指南进行记录。 EMA还要求对使用新配方的疫苗进行额外研究；2006年的文件适用于“表达外来抗原的DNA疫苗”，指出“通常不需要对疫苗进行药代动力学研究。然而，当使用新的给药系统或疫苗含有新型佐剂或辅料时，可能适用此类研究”。这份文件是在将针对传染病的核酸疫苗从GTP法规中排除之前制定的。我们将看到，为抗COVID-19 mRNA提供的药代动力学研究是不完整的。 2.6. 作为前药所需的控制 FDA指出，前药因其或多或少完全转化为活性物质以及毒性问题而带来的特殊问题。根据FDA，需要定义前药如何显著地为活性药物的毒性概况做出贡献，特别是作为转化和作用部位的函数。 对于mRNA疫苗，生物学转化发生在许多细胞类型和所有器官中（见下文），而期望的目标，即免疫，只会在免疫细胞中发生。然而，mRNA疫苗没有被归类为前药，因此不必经过有关转化和作用部位的控制。 2.7. 基于GTP法规的额外控制 鉴于大流行紧急情况，疫苗审查流程已被修改和加速，以滚动审查的形式进行。在滚动审查中，数据在完整数据包可用之前就可以提交和审查。这种方法需要赞助商和卫生当局之间更紧密的合作和更密集的互动。从EMA报告中可以推断，EMA已经调整了疫苗法规，并要求某些特定于基因治疗产品的控制。这是从Moderna的EPARs和辉瑞的滚动审查的分析中得出的。 尽管没有针对mRNA疫苗的具体法规，EMA还是增加了以下产品质量控制：通过RT-Sanger测序确定身份（对于Spikevax）和下一代测序（对于Comirnaty）；总RNA含量（UV）、纯度（RP-HPLC）；产品相关杂质（RP-HPLC）；50%盖帽的百分比（RP-UPLC）；PolyA尾RNA的百分比（Spikevax的RP-HPLC，Comirnaty未完全描述）和残留DNA模板（qPCR）。 然而，根据2021年的报告，第一份报告中报告的一些特定义务（例如，未描述的作用机制）尚未完成。关于杂质，应指定细菌内毒素的测定方法。在澳大利亚监管机构TGA的文件中未指定发现的内毒素水平，一些批次在批次发布时仍在评估中。接受的限制是12.5 EU/mL。 关于产品质量，体外转录方法描述不足，mRNA的特性不令人满意；评估截短和修饰mRNA的方法必须更详细。效力测试不满意，体外表达测试需要更新。如果Poly(A)尾的长度和百分比部分保持不变，REC20未完成。如果提供了3个月的稳定性数据，期望6个月的数据，截短的mRNA和截短的蛋白表达的存在没有得到充分的探索。EMA要求澄清作用机制。 因此，根据EMA报告，EMA要求的GTP所需控制的结果不充分。 3.抗COVID-19 mRNA未受GTP法规约束所需的控制  3.1. 产品质量 关于产品质量，基因治疗产品（GTPs）需要经过特定控制，这些控制对于非基因药物并未提及。在这些控制中，内毒素水平没有具体提供（见上文），并且核酸与载体的相互作用也没有被研究。应通过适当的方法确认特定特征的存在/缺失，例如CpG序列：这一点没有提供。产品相关杂质（删除、重排、杂交或突变序列、氧化、脱聚）的研究和定量没有提供。在最终的基因治疗药物产品（GTMP）中应尽可能避免使用抗生素抗性基因，如果不可避免，应提供理由（这一点没有理由）。“如果不可避免，在首次临床研究之前，应进行研究，以解决抗性基因在人体细胞中的非预期表达”；这些研究尚未进行。 关于美国FDA，应参考负责监管这些产品的CBER（生物制品评估和研究中心）指南，它只发布非约束性建议，以及2013年的指导，总体上，它对EMA施加了相同的标准。 3.2. 药代动力学 根据欧盟，GTMP需要特定的测试或试验来评估基因组整合和生殖系传播的风险，即使这种整合不太可能，就像RNA的情况一样。GTMP需要特定的测试或试验来评估插入性突变、致癌性、胚胎/胎儿和围产期毒性以及长期表达的风险，这些测试尚未进行。 对于GTMP，EMA要求对核酸和载体颗粒/输送系统进行广泛的研究，包括生物分布、剂量研究、潜在目标毒性、确定获得生物活性的目标器官、与结构改变蛋白表达相关的毒性、生殖毒性（对于这些研究，测试必须遵循ICH M3文件）、重复毒性和环境中的排泄。这些研究对于含有DNA的产品是必需的，因为该文件是在2006年起草的，当时没有考虑mRNA疫苗。重复毒性没有得到充分的研究，因为只计划了两次疫苗剂量。必须强调药代动力学研究，这些研究通常对疫苗不是必需的，除非它们基于新配方或疫苗含有新型佐剂或辅料。这种研究的需求必须由监管当局逐案评估。此外，“标准的吸收/分布/代谢和排泄研究对GTMPs可能不相关”。例如，应考虑作为最坏情况的给药途径（例如，静脉注射，代表GTMP广泛传播的效果）。对于GTPs，预期进行脱落研究，解决在体内的排泄和传播，包括持久性、清除和动员的研究。生物分布研究还应解决转基因产品的药代动力学研究（例如，表达的蛋白）。从这个角度来看，制造商提供的研究似乎是不完整的（见第4节）。 3.3. 未进行生物药品控制 EMA和欧盟委员会一样，认为“RNA衍生产品应被视为生物产品，即使它们不是来自生物来源”。根据欧洲法规，对于生物药品，必须提供生物活性列表，并且必须考虑生殖功能、胚胎胎儿和围产期毒性以及突变和致癌潜力的研究。正如上文所见，这些测试尚未进行，并且活性成分—mRNA—的生物活性没有得到充分的描述。 3.4. 临床研究 在动物模型中进行脱落研究（通过分泌物和排泄）将用于估计人类脱落的可能性和程度，并指导设计临床脱落研究。如果基因产品是一种在血液循环中排泄的蛋白质，则应包括临床药代动力学研究。需要调查向第三方传播的可能性，或者提供不这样做的理由。应评估剂量反应效应。对于GTP，还必须解决精液中的脱落问题；监管机构的报告中没有提到这种可能的排泄。 应仔细评估遗传毒性问题，包括插入性突变和随后的致癌性，在相关的体外/体内模型中。免疫抑制，人类肿瘤发生的一个原因，必须进行调查。根据Spikevax EPAR，没有提交致癌性、插入性突变或体内研究中的肿瘤发生性。如果育龄期妇女将暴露于GTMP，则可能需要胚胎胎儿和围产期毒性研究。 3.5. 疫苗警戒 根据EMA，GTMP有义务在药品过期后30年内提供安全性和有效性数据，这超出了传统药物警戒的要求。根据FDA对GTP的法规，对于新的临床疾病，如新的恶性肿瘤、现有神经系统疾病的新发生或加重、先前风湿病或其他自身免疫性疾病的新发生或加重、血液疾病的新发生和新的感染（可能与产品相关），必须至少进行5年的长期不良事件跟踪。 根据欧洲法规，风险管理计划中应包括长期跟踪安全性和有效性的策略。关于传统疫苗，不良事件的观察期通常仅为几周。Brighton Collaboration负责监测疫苗的安全性和风险/效益比，已发布一般疫苗选定不良事件的监测指南。跟进时间有时会指定，但很少超过2个月，根据FDA COVID-19疫苗药物警戒研究，接种个体的跟踪时间长达42天。 4.讨论  4.1. 未进行的前药所需控制 如果抗COVID-19 mRNA被归类为前药，它们将不得不经过有关转化和作用部位的控制。因此，将检测到从mRNA翻译的刺突蛋白不仅存在于注射mRNA的肌肉的免疫细胞中。这一点将在第4.3.1节中讨论。 4.2. 一般疫苗所需的某些测试结果不满意 4.2.1. 药物物质纯度 这不是讨论mRNA控制结果的地方，但仅就产品纯度而言似乎很重要。EMA要求人用产品的纯度为95%；根据EMA，辉瑞最终产品的纯度因生产过程而异。根据通过FOIA获得的“评估员滚动审查关键评估报告”（第81页和第102页），详细说明了先前文件，产品纯度在上市时远低于95%，接受标准为50%。在另一份通过FOIA获得的文件中，这一阈值为58%（第38页）。在2022年针对奥密克戎变体的Moderna疫苗报告中，EMA再次要求重新评估是否需要调整活性物质的纯度规格限制。对于新配方，这些产品纯度缺陷是值得质疑的。 值得注意的是，OCABR进行的批次放行程序没有检测到任何批次异质性。OCABR提供的文件没有指明参考实验室对产品的身份、效力和完整性进行的控制。然而，已经发表了批次毒性的异质性，这可能源于成分的异质性。 4.2.2. 药物物质杂质 残留DNA模板的规格是基于WHO的建议：每剂不超过10纳克DNA。这一限制最初由FDA在1985年设定为每剂疫苗10皮克，后由WHO在1986年提高到每剂100皮克，然后在1996年提高到每剂10纳克。WHO指出，在设定此限制时应考虑要给予的总剂量数。基于这些考虑，并假设最大剂量为30微克，商业放行标准为每毫克RNA ≤330纳克DNA（第103页）。然而，EMA请求提供有关线性DNA模板和定量方法的更多信息。在EMA报告中，残留DNA模板和ds-RNA检测结果在不同批次之间高度异质，尽管远低于接受限制。重新评估未来在非大流行期间评估的mRNA疫苗的检测方法和限制将是明智的。鉴于个人将接受的COVID-19 mRNA疫苗的最终剂量数尚不清楚，这一点尤其正确。 4.2.3. 抗生素抗性基因存在引起的问题 用于mRNA生产的DNA质粒包含一个卡那霉素抗性基因（第26页）。鉴于药物物质中DNA的显著和可变数量，人们担心抗性基因可能被整合到人体消化道细菌或体细胞中。如果抗COVID-19 mRNA受到GTP法规的约束，这些研究就已经进行了。因此，对所有药物和疫苗所需的控制没有给出关于产品纯度和质量的完全满意的结果。 4.3. 未执行的GTP所需控制：由mRNA药代动力学引起的安全问题 4.3.1. 抗COVID-19 mRNA的药代动力学 新疫苗配方所需的药代动力学控制没有完全执行。遗憾的是，没有完全进行完整的药代动力学研究，因为EMA指出，文献中的几份报告表明，LNP配方的RNA可以相当非特异性地分布到脾脏、心脏、肾脏、肺和大脑等多个器官[11]（第54页）。此外，独立的上市后研究表明，mRNA在许多器官中分布并持续数周。mRNA的产物，即刺突蛋白，也在血液中循环数周。在接种疫苗后3周死亡的人的大脑和心脏中发现了刺突蛋白。在接种疫苗后100天，发现刺突蛋白在皮肤病变中。因此，从药代动力学的角度来看，制造商提供的产品研究似乎是不完整的，因为它们未能检测到这种广泛的生物分布和持久性。 对于辉瑞，只研究了纳米颗粒的单独组分的生物分布。EMA指出，根据对GTP（Patisiran数据）类似组分的研究，可以预期人类半衰期为20-30天，纳米颗粒脂质完全消除需要4-5个月。应该在装载mRNA的完整纳米颗粒上研究生物分布，特别是因为临床前研究已经显示所有器官中的生物分布。根据Spikevax-EPAR，生物分布、遗传毒性和重复毒性研究是使用编码除SARS-CoV-2刺突外的蛋白质的mRNA进行的。这与GTP法规不兼容，因为EMA要求在GTMP中对转基因进行分布研究。这些生物分布数据本应加强某些基本GTP控制的需求。实际上，EMA要求，在出现长期表达迹象、非预期基因组整合和肿瘤发生的情况下，必须进行调查。持续时间和表达应通过RT-PCR和免疫学检测和/或检测功能性蛋白的检测来确定。必须监测转基因的过度表达。鉴于可以大量生产刺突蛋白，有时甚至超过严重COVID-19患者中循环的数量，这一点应该受到控制。疾病期间和疫苗接种后达到的刺突浓度比较表明，在严重COVID-19期间，观察到的中位浓度为50皮克/毫升，最高为1纳克/毫升。在严重的COVID-19感染期间，可以检测到高达135皮克/毫升的S1刺突蛋白水平，通常在6到50皮克/毫升之间。在mRNA疫苗接种后，通常观察到高达150皮克/毫升的浓度，但在疫苗诱导的血小板减少的个体中可能达到10纳克/毫升。 4.3.2. 这种广泛的生物分布本应使执行GTP所需的控制成为必需 生殖系整合 需要调查垂直生殖系的可能性（在性腺中的信号、在配子中的信号、精液分离研究和整合分析），特别是因为EMA强调了更广泛的生物分布模式，卵巢和睾丸中低度和可测量的放射性。GTMP需要基因组整合研究。2009年明确指出，对于预计无法整合的基因治疗药品，如果产品生物分布表明存在生殖系传播的风险，则必须进行整合研究。2005年的一份文件，专门针对基因转移载体和裸DNA的生殖系传播研究，明确指出只有DNA，而不是RNA，被假定为存在生殖系修改的风险。这一断言可以根据两篇出版物提出质疑，首先，SARS-CoV-2 RNA可以整合到基因组中；其次，疫苗mRNA可能能够整合到体外培养的人类细胞基因组中。尽管有争议，但这些结果可能会倾向于要求对mRNA进行基因组整合研究，特别是因为刺突mRNA也转移到细胞核。 遗传毒性 针对Moderna进行的大鼠临床前遗传毒性研究显示了不确定的结果（第21页）。结论是“总体而言，由于肌肉注射后的系统暴露最小，暴露持续时间有限，体外结果为阴性，因此对人类遗传毒性的风险被认为很低”。鉴于暴露不仅限于肌肉，暴露持续时间也不限于，继续这些研究将是明智的。正如EMA对GTP的法规所指明的那样，“如果发现阳性结果，将需要进行额外的测试以确保产品的安全性”。 生殖和发育毒性 根据一份通过FOIA获得的有关Moderna疫苗非临床试验的文件，接种大鼠的胎儿中出现了骨骼变异（一个或多个肋骨结节和一个或多个波浪形肋骨，对F1代的存活或生长发育没有影响），但并未被视为不利。然而，强调它们出现在母体毒性的同时，与大鼠肋骨发育最敏感的时期相关。 根据从澳大利亚和日本监管机构获得的文件，辉瑞的临床前试验中也发现了骨骼畸形。腰椎肋骨增多的发生率在治疗组中高于对照组，但被认为与治疗无关。两种类型的mRNA疫苗胎儿异常的一致性本应导致更详细的研究。 根据FDA对纳米药物的药代动力学 对于新的辅料，化学、制药和生物学信息应与活性物质提供的信息相同（第135页）。此外，根据Hemmrich和McNeil[68]的说法，LNP组分的状态令人困惑，根据FDA的说法；它们被视为“起始材料”（因此不是辅料）或作为“非活性成分”（因此是辅料）的文件，然而，根据FDA本身的说法，它们应被视为活性成分。根据同一作者的说法，开发人员必须证明新成分的安全性，“长期使用的辅料可能需要6个月的重复剂量毒理学研究和2年的致癌性研究”。实际上，制造商只打算接种两剂疫苗，但一些人群目前正在接受多达六剂疫苗，间隔几个月。必须评估含有mRNA、活性物质的完整纳米颗粒的稳定性、毒性和生物分布，而不是隔离的脂质组分，与已经进行的相反（Moderna和Pfizer已经部分评估了纳米颗粒中脂质的生物分布，或含有用于抗COVID-19疫苗的mRNA的其他纳米颗粒）。 如果FDA将这些mRNA归类为GTPs，将解决这些模糊性，因为FDA建议评估GTP输送程序的风险（在临床前试验中评估血液、脑脊液、生殖系、心脏和大脑中的生物分布，载体的持久性）。FDA还要求评估可能的水平传播，即从患者传播到家庭成员和卫生保健提供者的具有复制能力的载体（即脱落）。即使载体不是具有复制能力的病毒，也应适用此要求。 4.4. 临床研究 如上所示，刺突蛋白已被证明在血液中循环良好，因此本应进行排泄研究。CHMP指出，没有关于疫苗通过胎盘转移或在乳汁中排泄的数据（第56页）。独立于制造商的研究表明，在注射后的第一周，疫苗mRNA进入了乳汁，根据FDA的报告，母乳喂养的婴儿的不良影响可能是由于这种传递。与COVID-19 mRNA疫苗中类似的纳米颗粒已被证明能够在小鼠中穿过胎盘屏障。应进行广泛的临床前和临床研究，探索这种在乳汁中和通过胎盘的传递。 应进行致癌性、肿瘤发生性和免疫抑制研究，因为有两项研究表明mRNA疫苗可能诱导免疫耐受。此外，刺突蛋白可能与肿瘤抑制因子相互作用（第53页）。因此，明智的做法是在体内探索肿瘤发生效应，并长期监测接种疫苗的个体是否发生癌症，特别是因为已有建议癌症可能被mRNA疫苗重新激活，或者可能在mRNA疫苗接种后发展。 4.5. 疫苗警戒 GTP法规要求对不良效应进行非常长期的监测。这对于mRNA疫苗来说很难实现，因为EMA已要求在疫苗接种后24个月对不良事件进行跟踪，指出安慰剂组中有相当数量的参与者接种了疫苗，这使得这种跟踪更加困难（第14、114和138页）。Moderna宣布，“截至2021年4月13日，所有安慰剂参与者都已提供Moderna COVID-19疫苗，其中98%的人已经接种了疫苗”。 EMA要求的药物警戒跟踪的最新日期是2024年3月31日，远低于FDA对GTP的不良事件长期跟踪5至15年，以及EMA的30年。除了EMA要求的广泛药物警戒计划外，我们可以要求加强监测。由于临床试验中的安慰剂组已接种疫苗，这些长期不良效应的监测可以通过回顾性观察性研究进行，比较参与者的疫苗接种状态的病理发生率。关于腺病毒载体的两篇出版物表明，基因治疗载体的长期效应，尽管它们不是特定的mRNA载体，清楚地说明了研究的缺乏和潜在的长期风险。 FDA和EMA建议长期监测GTPs可能的不良效应，特别是对于某些疾病（癌症、血液学、神经系统、风湿病和感染）。正如上文所见，有报告称在抗COVID-19 mRNA疫苗接种后出现新的或重新激活的癌症。还有报告称在GTPs给药后特别要监测的疾病案例。这里只是一些例子，因为不可能全面。关于血液学疾病，有报道称骨髓抑制和再生障碍性贫血。对于神经系统疾病，有报道称脑炎、脑炎、脱髓鞘和自身免疫性神经系统疾病。风湿病、新的自身免疫性风湿病、类似自身免疫的肌病以及新的或加剧的炎症性疾病也有报道。 2021年，在大规模疫苗接种活动开始后，有报道称脑脓肿复发，以及mRNA疫苗后的非COVID肺炎。EMA指出，正在进行一项干预研究，以评估辉瑞疫苗在孕妇中的安全性和耐受性；尽管实际研究完成日期是2022年7月15日，但没有结果发表，这是不幸的。 5.结论  尽管COVID-19 mRNA疫苗的作用原理符合基因治疗产品（GTPs）的定义，但它们已被监管机构（美国FDA和EMA）从GTPs的监管中排除，并受到针对传染病的疫苗的监管。这种排除没有给出任何科学或伦理上的理由，并且法规中仍然存在不一致之处。例如，根据欧洲和法国法规，疫苗必须含有抗原，这对于mRNA疫苗来说并非如此。这些产品可以被视为“前疫苗”。实际上，mRNA疫苗不含有抗原，而是使接种疫苗的人产生抗原。因此，它们可以被归类为前药或“前疫苗”。应为这类产品制定特殊法规，强调效力控制，即感兴趣的抗原的质量、数量、持续时间和表达位点，以及这种抗原的毒性。 正如2020年初提出的，SARS-CoV-2刺突蛋白与肾素-血管紧张素系统相互作用，并具有公认的毒性，这种毒性在COVID-19之前就已知，并已得到确认。 根据欧洲法规，疫苗是人用药品，因此必须经过相同的控制，但并非所有这些控制通常都适用于针对传染病的疫苗。在应用到mRNA的控制方面，值得注意的是，产品的纯度低于任何药品的要求：这对于一种新的配方和作用原理来说是值得质疑的。此外，批次异质性可能没有通过批次放行程序被检测到。与这种新配方相关的杂质可能会带来安全问题；需要重新评估用于制造RNA的模板中污染DNA的存在和数量，以及ds-RNA。污染模板DNA中抗生素抗性基因的存在也引起了安全问题。 通常不需要对疫苗进行药代动力学研究，除非是新配方，这里就是这种情况。然而，在这个领域进行广泛的研究是必要的，因为它们没有检测到mRNA及其产品——刺突蛋白在疫苗接种者体内的广泛分布和持久性，mRNA在母乳中的传递，以及可能通过接种疫苗的母亲的胎盘传递。GTP法规要求对完整配方（装载mRNA的脂质纳米颗粒对应于药品）进行这些深入研究。 由于这种广泛和持久的生物分布，应该进行GTPs所需的基本测试，关于：遗传毒性风险、基因组整合和生殖系传播、插入性突变、致癌性、胚胎/胎儿和围产期毒性、长期表达、重复毒性和环境排泄（例如，在精液中的脱落）。 GTPs的长期安全性监测需要进行数年，而疫苗通常只进行几周。鉴于药品和表达蛋白的持久性，这应该是不可接受的。抗癌症疗法和mRNA疫苗的已知结果可能会让我们预见到安全性和有效性问题。在抗癌症mRNA的情况下，绝大多数开放标签临床试验是在极少数患者身上进行的，结果要么未公布，要么为负面。随机研究也显示出负面结果，报告治疗组中不良事件更频繁。关于传染病，两项封装在LNPs中的mRNA疫苗试验显示了显著的不良效应。一项针对狂犬病的mRNA疫苗试验显示了比经典疫苗更多的不良效应，经典疫苗已经很反应原性，特别是淋巴细胞减少（这种效应也发现在抗COVID-19 mRNA疫苗中）。一项流感疫苗试验在人类中显示了严重的不良效应（31名受试者仅观察了43天，至少发现了4起严重不良事件）。在一项针对HIV的非随机试验中，一些患者的反应出奇地不完整。根据另一项针对15名参与者的HIV试验对比安慰剂，免疫反应不满意且持续时间有限。BioNTech的创始人Ugur Sahin本人警告不要使用密码子优化，这可以改变翻译速度并导致错误折叠。他还强调了非自然核苷酸的潜在毒性。他还提到了肌肉注射mRNA的广泛生物分布。他提醒我们，我们应该担心在自身免疫疾病患者中出现针对自身mRNA抗体的出现。 监管机构的作用是确保药品的安全性和有效性。COVID-19大流行紧急情况加速了COVID-19疫苗的生产和临床使用的时间表；因此，某些安全方面可能没有得到完全解决。因此，重要的是在未来考虑到这些方面，以免破坏公众对疫苗的普遍信心。 WHO在2023年5月初宣布结束COVID-19大流行紧急阶段，但将继续授权使用紧急使用清单（EUL）程序。疫苗的紧急授权应通过顺利过渡转变为预认证。然而，应该就这种过渡到mRNA疫苗的常规使用开展广泛的公共讨论，而不是使它们受到GTPs所需的控制。 在EMA旨在规范从2023年起新疫苗临床评估的文件中，没有提到mRNA疫苗，仍然指定疫苗含有抗原；因此，该文件将不适用于不含抗原的mRNA疫苗。再次指出，当使用新的给药系统或疫苗含有新型佐剂或辅料时，非临床药代动力学研究可能适用。为mRNA疫苗特别明确这些点是很遗憾的。2021年初的一篇文章强调了需要进一步研究以确保mRNA疫苗的质量、有效性和安全性；这些产品上市之前就已撰写。在临床前试验的详细结果和上市后阶段发布的安全数据的基础上，澄清应要求哪些额外的控制似乎很重要。 将来，应该讨论所有基于mRNA的产品是否应受到相同的法规和控制，无论它们是否被视为疫苗。当治疗性mRNA旨在用于代表人类一小部分的病人时，对其进行严格控制，而将针对健康人群大多数的mRNA疫苗排除在这些控制之外，这是没有道理的。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 名称：2024第三届新型疫苗研发峰会 时间：2024年8月16-17日（周五-周六） 地点：苏州（酒店定向通知） 主办单位：四叶草会展、生物制品圈 媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈 会议费用：点击二维码即可查询。 报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，免交报名费，承担一定工作任务）！ 转发分享福利：疫苗研发企业、科研院校和监管机构人员，前30位报名人员转发分享会议信息可免费参会（不含餐饮）报名后，扫描下方二维码加工作人员微信后，发送截图即可。 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 大会日程 已经确定的报告人 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：当前的疫苗在预防感染和疾病的效力以及效力的持久性方面存在很大差异。一些疫苗只需单剂量就能提供几乎终身的保护，而其他疫苗即使在年度加强剂后也只能提供有限的保护。是什么变量使疫苗诱导的免疫反应持续存在？在这些因素和技术方面的突破能否帮助我们生产出具有更好保护和更少剂量的疫苗？疫苗诱导保护的持久性现在是疫苗学研究的热门领域，特别是在COVID-19疫苗失去光彩之后。它激发了关于现有疫苗对社会的最终效用以及加强反疫苗阵营的讨论。为了维持公众对疫苗的信任，必须开发持久的疫苗。 涵盖领域：本综述总结了许可疫苗的保护情况。它分析了决定抗体寿命的免疫学原理以及疫苗和接种者参数。综述最后讨论了挑战以及如何提高疫苗持久性的前进方向。 专家意见：尽管取得了巨大的进步，我们仍然缺乏基本的标记和持久保护的可靠相关性。大多数研究集中在体液免疫反应上，但我们还必须关注先天的、粘膜的和细胞的反应——它们的评估、相关性、决定因素和新型佐剂。必须找到适合持久免疫的疫苗设计和平台。 1.引言  “免疫力下降”一词不仅在学术界和工业界，而且在普通大众中都成为了热门话题，因为很明显，COVID-19疫苗提供的保护并不像麻疹等其他疫苗那样持久。对COVID-19疫苗的快速发展和迅速部署的兴奋逐渐消退，很快，围绕免疫保护持久性的辩论就开始了。因此，疫苗诱导保护的持久性是当今研究的热门领域。是什么因素决定了疫苗诱导的免疫保护的持久性？病原体的性质（快速变异病毒与“稳定”病毒）、疫苗的生物学特性（活减毒疫苗与灭活病毒疫苗、佐剂的添加和类型）、还是接种时间表（剂量、剂量数量和剂量间隔）是否对疫苗衍生免疫的长期持久性有任何影响？众所周知，大多数人类冠状病毒引起的自然感染，包括严重急性呼吸综合征冠状病毒-2（SARS-CoV-2）和流感，不像麻疹、风疹、水痘和腮腺炎等其他呼吸道病原体那样提供持久的保护。针对所有这些病原体的当前一代疫苗也遵循了类似的模式。 本综述提供了目前使用的许可疫苗提供的保护持久性的概述。它总结了当前知识、最新进展、知识空白、挑战和瓶颈，以及如何克服这些长期由疫苗诱导的保护。 2.关键许可疫苗提供的保护持久性概述  为了分析当前许可疫苗提供的免疫保护的持久性，我们将其大致分为三类（表1）：(1) 提供长期保护（>20年）的疫苗。(2) 提供中等期限保护（5-20年）的疫苗。(3) 提供短期保护（<5年）的疫苗。 2.1 提供长期保护的疫苗（>20年）  2.1.1 麻疹疫苗  几乎所有接种者的单剂量疫苗提供终身保护。初次免疫反应在接触野生病毒或重新接种后得到加强。一旦血清转化，可以检测到保护性抗麻疹抗体≥120 mIU/mL，可能终身，抗体滴度没有显著下降。建模研究估计抗麻疹抗体的半衰期超过3000年。 2.1.2 风疹疫苗  风疹疫苗也诱导强烈的免疫反应，预计是终身的。风疹病毒特异性体液免疫反应在接种后随时间减弱，但幅度适中。尽管尚未建立绝对的免疫保护相关性，但抗风疹IgG抗体的截止水平≥10 IU/mL通常对风疹病具有保护作用。一项纵向研究估计，风疹特异性免疫得到维持，估计半衰期为114年，没有显著的滴度下降率。 2.1.3 黄热病疫苗  活减毒黄热病疫苗具有出色的长期有效性。中和抗体的滴度是保护的相关性。在大多数临床试验中，使用1/10的滴度的空斑减少中和试验（PRNT50）用于相关保护。 根据Poland等人的研究，第二次世界大战士兵中有80.6%的中和抗体持续了三十多年。在流行和非流行国家的几项额外研究中也显示出中和抗体的长期持久性。由于没有记录到有文件证明的血清转化个体中的黄热病感染，人们认为疫苗提供终身保护的假设是正确的。 2.1.4 乙肝疫苗  乙肝疫苗是一种T细胞依赖的亚单位疫苗，乙肝病毒感染有很长的潜伏期，允许在接触病毒时有足够的时间发生记忆反应。因此，一旦发生血清转化，即使抗体滴度下降到保护水平10mIU/mL以下，疫苗也可以提供长期保护。 2.1.5 甲肝灭活疫苗  许多建模和抗HAV动力学研究已证实，通过单剂量或双剂量疫苗接种计划，至少可以维持30年的高水平血清保护。此外，在记忆B和T细胞存在的情况下，即使没有可检测的抗体，对临床疾病的保护也可能持续。 2.2.提供中等期限保护的疫苗（5-20年）  2.2.1 口服脊髓灰质炎疫苗（OPV）  在血清转化后，OPV几乎提供了终身的抗麻痹脊髓灰质炎保护，即使在以后的生活中抗体滴度降至可检测水平以下。然而，血清转化和效力在不同的地理环境中有所不同：在工业化国家的温带气候中高于热带条件下的发展中国家。根据一项意大利研究，对麻痹疾病的免疫保护在最后一次OPV剂量后持续了18年，即使在最后一次OPV剂量后30年，超过95%的受试者检测到针对脊髓灰质炎病毒1型和2型的保护性抗体。 2.2.2 灭活脊髓灰质炎疫苗（IPV）  来自工业化国家的研究指出，IPV诱导的抗体可以保护免受麻痹性脊髓灰质炎的侵害，可能持续数十年，甚至终身。根据一项来自意大利的回顾性队列研究，在最后一次疫苗剂量后18年，超过90%的研究参与者中存在针对三种脊髓灰质炎类型的中和抗体。在这项研究中，IPV比OPV诱导了更高滴度的中和抗体。 2.2.3 甲型肝炎活减毒疫苗  像灭活疫苗一样，活减毒甲型肝炎疫苗也提供了长期保护。在流行区，基于H2菌株的活减毒疫苗单剂量接种后，至少已经证明了15-17年的保护以及免疫记忆的持久性。 2.2.4 人乳头瘤病毒（HPV）疫苗  这些疫苗的独特之处在于，即使单剂量，它们也提供了针对HPV相关疾病的持久保护，并且它们提供的保护实际上是无菌的，这意味着它们预防感染而不仅仅是疾病。尽管它们是非活减毒疫苗。二价、四价和九价疫苗已显示出最长的预防效果：哥斯达黎加试验11年，FUTURE II试验14年，长期随访（LTFU）扩展研究和斯堪的纳维亚研究8年。澳大利亚的一项真实世界有效性研究对疫苗效力的观察时间最长，为四价疫苗的12年。 2.2.5 卡介苗（BCG）疫苗  即使BCG疫苗的效力因临床实体和人口统计学而有很大差异，它提供了相当长的保护期 - 甚至长达50年。一项彻底的分析发现，在某些群体中，婴儿BCG疫苗后的保护可以持续长达15年；然而，保护效力最终会减弱。 2.2.6. 白喉 接种疫苗后，白喉抗体的保护水平（0.1IU/mL）可以持续数十年，尽管在接种后的十年内，部分接种者中的抗体会减少。白喉特异性抗体的半衰期估计约为19年。考虑到白喉感染的潜伏期较短，以及在高疫苗覆盖率下自然增强也有限，建议每十年进行一次加强剂注射，特别是在工业化国家，以维持保护水平。然而，最近的研究表明，在大多数人中保护滴度持续时间更长，而且较少的加强剂就足够了。 2.2.7. 破伤风 破伤风疫苗提供的保护期限也与白喉抗原相似。在接种3剂初次接种计划后，抗破伤风抗体的保护水平0.1 IU/ml可以持续3-5年。然后，在生命中的第二年和第五年以及一些人在青少年时期的加强剂后，它可能会持续终身。破伤风特异性抗体的半衰期估计约为11年。然而，在大多数人中，最后一剂后的十年内，抗体水平接近最低保护水平。因此，建议每十年进行一次加强剂注射以维持保护水平。最近的研究表明，较少的加强剂可能就足够了。 2.2.8. 水痘疫苗 美国和日本的许多研究表明，在接种一剂水痘疫苗后，抗水痘抗体的长期持续存在。然而，有人担心这些研究是在社区内有大量病毒传播时进行的，现在由于缺乏广泛传播，可能会有所下降。后续研究表明，接种OKA株水痘疫苗后，免疫会下降。尽管抗水痘抗体的半衰期估计为50年，但滴度经常波动。 2.2.9. 腮腺炎疫苗 尽管野生腮腺炎病毒感染提供了终身免疫，但报告了腮腺炎疾病的复发[38]。在活减毒疫苗中至少使用了13种不同的腮腺炎病毒株。它们在效力上有一定的差异，但总体上，它们保护了80%的接种者。一些研究报告了单剂的效力为60-90%。根据对64项MMR疫苗研究的Cochrane综述，单剂的效力为69-81%。另一项研究发现，接种疫苗后腮腺炎特异性抗体滴度至少持续32个月，然后缓慢下降。据估计，在接种两剂疫苗后的6-7年内有85%的保护，在没有自然增强的情况下到12年降至接种前水平。自然增强时抗体滴度持续时间更长：例如，芬兰的一项研究报告，在接种MMR疫苗20年后，有74%的血清阳性。一项纵向研究估计，抗腮腺炎抗体的半衰期超过500年（95%CI：90至无穷大），并显示滴度随时间没有显著下降。 2.2.10. 肺炎球菌结合疫苗（PCVs） 尽管确切的保护期限尚未确定，但PCVs在初级婴儿接种计划后提供了相当好的保护。很少有纵向研究测量针对肺炎球菌疾病的持久免疫。不同的专家观察到不同血清型的保护率有显著差异。一项关于PCV7的鼻咽携带研究发现，持续保护了五年。在南非，一种实验性PCV，PCV9，在接种后6.3年内显示出对侵袭性肺炎球菌病（IPD）的一致保护。 2.2.11. 狂犬病疫苗 接种狂犬病疫苗后诱导的中和抗体（VNA）被认为是对抗狂犬病的有价值的保护相关因素，滴度≥0.5 IU被视为截止点。Briggs等人发现，在接种后九年，80%的接种对象仍有可检测的VNA滴度。值得注意的是，他们没有发现VNA滴度与作为PrEP或PEP一部分接受的疫苗剂量数量或自疫苗系列最后一剂以来经过的时间之间的相关性。然而，肌肉内（IM）计划比皮内计划诱导的中和抗体持续时间更长。德国一项关于接种诱导的狂犬病VNA持久性的研究，在Pr-EP和PEP计划最后一剂后14年的18名受试者中发现了可检测的抗体。此外，狂犬病疫苗诱导了强大的免疫记忆，即使在初次接种计划多年后也提供了出色的“免疫回忆”。 2.2.12.带状疱疹重组疫苗 这种新的带状疱疹疫苗基于水痘-带状疱疹病毒（VZV）的糖蛋白E，并具有AS01B佐剂系统。接种两剂疫苗后，体液免疫反应[抗糖蛋白E（gE）抗体]和细胞免疫反应（gE特异性CD4+ T细胞）的持久性已持续六年。Boutry等人对之前临床试验的长期随访研究中注册的7413名参与者进行了随访，以研究疫苗效力的持久性。他们发现在第二剂后的八年有84.1%的效力。 2.2.13.全细胞百日咳（wP） 各种研究估计了全细胞百日咳（wP）疫苗提供的保护期限，范围从4到12年。长期研究表明，在这段时间内，wP疫苗和自然感染的保护明显下降。英国Campbell等人的一项研究引用了在三个主要剂量后，10-16岁儿童中有83.7%的效力，尽管在第三剂后的1-2年内注意到疫苗效力下降。根据系统综述，wP疫苗效力的年损失范围从2-13%。 2.2.14.肺炎球菌多糖疫苗（PPSV） 肺炎球菌多糖疫苗建议在老年人和具有特定风险因素的儿童中使用。接种疫苗后，抗体水平在最初上升后随时间下降，并在接种后4-7年内几乎达到基线水平。在老年人中进行的大量研究表明，疫苗效力随时间下降，五年后可能没有效力。然而，一项主要针对65岁以上成年人的大型队列研究表明，即使在接种后九年，也显示出对严重肺炎球菌感染的良好保护。 2.2.15.b型流感嗜血杆菌（hib）结合疫苗 b型流感嗜血杆菌（Hib）结合疫苗具有高度免疫原性，估计在初次接种系列后的效力为95-100%。大多数专家认为，Hib结合疫苗提供了持久的免疫力，尽管滴度下降。然而，确切的保护性免疫持续时间尚不清楚，初次接种计划后是否需要加强剂仍然不确定。人们普遍认为，Hib结合疫苗在完成初次接种系列后至少保护五年。许多国家已经通过三剂初次接种计划成功控制了Hib疾病，但一些国家在几年后不得不引入加强剂。根据一些研究，婴儿期三剂提供的保护仅持续到生命的第二年，并且很快下降。加强剂的免疫回忆反应是极好的。 2.3 提供短期保护的疫苗（<5年） 2.3.1.脑膜炎球菌疫苗 脑膜炎球菌多糖疫苗作为T细胞非依赖疫苗，不提供持久的保护/记忆细胞反应。在2-4岁的年幼儿童中，保护仅持续几个月，而在年龄较大的儿童中，持续2-3年。重新接种再次提供类似的持续保护。脑膜炎球菌结合疫苗提供比多糖疫苗更好的保护，但即使这些疫苗，效力也会随着年份而下降。保护的血清学相关因素是使用婴儿兔补体的血清杀菌滴度≥1:8（rSBA）。在7-9岁儿童中进行的免疫原性研究表明，在接种疫苗两年后，血清群A的血清阳性率从97.3%下降到63.6%，其他血清群（C、W和Y135）为87.9%，六年后下降到仅有20%。Cohn等人表明，单剂疫苗的效力从接种后<1年的79%（49%至91%）下降到接种后3至<8年的61%（25%至79%）。脑膜炎球菌结合疫苗后的保护性抗体滴度下降也随儿童年龄而异，五岁以下儿童的下降速度比五岁以上儿童快。 2.3.2.无细胞百日咳（aP）疫苗  与全细胞百日咳（wP）疫苗相比，无细胞百日咳（aP）疫苗的效力下降速度更快。Schwartz等人观察到，尽管早期效果很高，但接种aP疫苗后四年内保护效力迅速下降。aP疫苗最后一剂后的效力从第一年的约90%下降到6至8年后的30-40%。TdaP疫苗的保护效力下降速度甚至更快：一些研究表明保护效力迅速下降，四年后效力降至低至8.9%。 2.3.3.登革热疫苗 目前，有两种减毒活登革热疫苗——CYD-TDV（赛诺菲的Dengvaxia™）和TAK-003（武田的Qdenga™）在一些国家的不同人群中获得许可和批准使用。根据三项效力试验的数据，CYD-TDV为血清阳性个体提供长达五年的针对严重登革热的保护。另一种活登革热疫苗TAK-003已评估54个月。公布的数据显示，对病毒学确诊的登革热（VCD）的效力为62.0%，对住院VCD的效力为83.6%。根据未公布的后续数据，疫苗在血清阳性个体中对VCD的效力为64.2%，在血清阴性个体中为53.5%。在54个月的跟踪后，对住院登革热的疫苗效力超过80%。 2.3.4.霍乱疫苗 全球有两种霍乱疫苗：单价和双价-灭活全细胞口服霍乱疫苗。前者的原型是WC-rBS（霍乱毒素的重组B亚单位——Dukoral®），全球有三种不同的双价疫苗产品，包含O1和O139菌株（不含B亚单位），并作为Shanchol™、Euvichol™和mORCVAX™销售。除了主要在越南使用的mORCVAX™外，它们都是WHO预认证的。这些霍乱疫苗的估计保护期限从6个月到5年不等。对于单价Dukoral™疫苗，儿童的保护只持续六个月，成人持续两年。对于双价全细胞疫苗，Shanchol™，在接种后的保护可长达5年。在加尔各答进行的一项大型随机对照试验中，不同年龄组的效力不同——在较大的儿童和成人中最高，在幼儿中最低。五年后的联合VE估计为65%。 2.3.5.日本脑炎疫苗  日本脑炎活疫苗（SA-14-14-2）：来自尼泊尔的研究表明，这种基于SA-14-14-2菌株的减毒活JE疫苗在单剂量后提供长达五年的合理良好保护。尼泊尔儿童的一项病例对照研究发现，单剂量后五年的有效性为96.2%。另一项针对成人的病例对照研究发现，在印度阿萨姆邦的两个地区，单剂量接种七年后的有效性为77.0%（95%CI：67.0-83.0）。然而，印度戈拉克普尔地区最近的一项横断面研究发现，在第二次疫苗接种后两年，97.74%的样本对特定IgG抗体呈阴性。 灭活Vero细胞源疫苗（IXIARO®/JESPECT®（奥地利Valneva）&JEEV®（印度BE）：来自流行区的长期保护临床疾病的数据有限。在菲律宾对300名儿童进行的IXIARO®研究发现，在初次接种两剂疫苗后三年，90%的未增强受试者具有保护性抗JE抗体。在奥地利对IXIARO疫苗的两剂接受者进行的5年跟踪研究发现，81%的受试者保持了保护性抗体滴度。另一项来自非流行区的研究证明了在两剂IXIARO初次接种后六年和15个月后增强剂的血清保护持续存在。 2.3.6.伤寒疫苗 Vi-多糖疫苗：作为一种T细胞非依赖性抗原，它不诱导记忆细胞和免疫球蛋白类别转换。因此，它不提供长期保护，需要每三年重新接种以继续保护。即使在三年内，疫苗效力从21个月后的64%下降到第三年的约55%。 伤寒结合疫苗：作为T细胞依赖性疫苗，结合疫苗诱导强大的免疫反应，产生记忆细胞，从而提供长期保护。在越南两至五岁儿童中进行的一项研究中，使用与Pseudomonas aeruginosa（Vi-rEPA结合疫苗）抗原相同的无毒重组蛋白开发的疫苗，在主动监测27周后，被动监测19周，有效性为89%。使用破伤风毒素作为载体蛋白的另一种结合疫苗Vi-TT（Typbar-TCV™）的研究显示，单剂量保护可能持续长达五年。纵向研究发现，在加强和未加强队列中，儿童初次接种后的抗Vi-IgG抗体持续存在高达7年。然而，在五年后，滴度显著下降，制造商推荐在初次剂量后五年加强。 2.3.7.带状疱疹活减毒疫苗 这种活减毒疫苗的保护时间比重组灭活疫苗短。对带状疱疹和带状疱疹后神经痛住院的效力更高且更好维持。一项真实世界有效性研究表明，带状疱疹疫苗效率从第一年的67%（95%CI：65%至69%）下降到十年后的15%（5%至24%）。对带状疱疹后神经痛的效力在同一时期从83%（78%至87%）下降到41%（17%至59%）。疫苗对带状疱疹眼病的效力从71%（63%至76%）下降到29%（18%至39%），而对带状疱疹住院的效力从90%（67%至97%）下降到五至八年内的53%（25%至70%）。 2.3.8.轮状病毒疫苗 减毒活轮状病毒疫苗的有效性在高负担-高死亡率地区比在低负担-低发病率的工业化国家更快下降。根据一项元回归研究，活口服轮状病毒疫苗的效力在高死亡率环境中更快下降，12个月后的汇总效力仅为44%。相比之下，在低和中等死亡率环境中，相应的数字为77%至94%。一些来自低负担-低死亡率国家的效力研究甚至在初次接种后三年也证明了对严重轮状病毒病的持续保护。 2.3.9.流感疫苗 流感疫苗不产生长期保护。接种后，已免疫个体的抗HA抗体在接种后2至4周达到峰值，而在未免疫个体和老年人中，它们在接种后至少4周达到峰值。六个月后，滴度下降超过50%，下降量与达到的最高滴度成正比。然后滴度在接下来的两到三年内保持恒定。根据临床试验数据，针对疫苗中相同抗原株的免疫大约持续6至8个月。 不同流感亚型的疫苗效力（VE）变化显著。AH3病毒的VE下降比AH1病毒更为明显。此外，VE受自免疫以来的时间间隔影响。根据一项全面审查和元分析，接种疫苗后3至6个月的流感病毒亚型A/H3和B型的VE比0至3个月显著降低。另一项研究发现，流感A(H3N2)、流感B和流感A(H1N1) pdm09病毒导致VE每月下降7%（绝对值）。在上一季节接受过流感疫苗接种的患者，VE下降更为明显。澳大利亚的一项研究发现了流感疫苗效力的季内下降。研究发现，实验室验证的最佳抗流感防御是在症状出现后两个月内进行免疫。根据2018年对疫苗持久性11项最新研究的分析，疫苗效力可能在接种后90天内消失。 2.3.10.SARS-CoV-2疫苗 目前尚无已知的SARS-CoV-2疫苗针对COVID-19疾病的保护期限的广泛估计，这不仅因疾病状态和类型而异，还因流行变体而异。此外，尽管在过去三年中广泛使用了不同的疫苗并进行了数百项研究，但迄今为止尚未确定针对该疾病的可靠免疫保护相关因素。总体而言，感染和疫苗均不提供持久保护。这些疫苗的有效性在初次和加强接种后的时间内迅速下降。大多数研究，包括系统综述，发现在疫苗剂量后的3至6个月内保护显著下降，特别是针对Omicron变体。 一项广泛的审查评估了78项关于Omicron变体出现之前四种COVID-19疫苗特定疫苗效力/有效性的研究，得出结论认为，针对有症状疾病的VE在初次系列六个月后下降了20-30%。然而，VE仍然很高，针对严重疾病的VE在初次系列后六个月保持在70%左右，并且在六个月后仅下降了10%。 另一项基于40项同行评审研究的审查发现，针对Omicron变体的VE在初次系列六个月后仅为20%，在加强剂量九个月后为30%——与Delta变体相比，VE对Omicron的下降更快。 另一项基于41项研究的灭活COVID-19疫苗性能的综述发现，初次疫苗效力（VE）在六个月后显著下降。该研究指出，针对Delta变体的VE为52.8%，而对Omicron变体则急剧下降至16.4%。然而，与mRNA疫苗一样，即使在初次接种系列六个月后，针对严重疾病的VE仍然很好，并且在加强剂量后有所提高。 3.疫苗提供的长期保护的免疫学基础  疫苗诱导的免疫反应非常复杂，涉及先天和适应性免疫系统中广泛免疫细胞的协调作用（图1）。最终，大多数当前疫苗提供的保护是通过针对病原体或其有毒成分的特定表位的病原体特异性抗体来实现的。抗体完全由一类称为浆细胞的B淋巴细胞（B细胞）产生。抗体产生的过程始于疫苗抗原从注射部位到达引流淋巴结，在那里它们被亚帽状区域的专业巨噬细胞捕获，然后运输到B细胞区域（滤泡）（图1中的步骤‘a’）。在这里，B细胞被激活，激活的B细胞迁移到B细胞滤泡和T细胞区域（称为边缘区）之间的边界区域。 图1. 疫苗诱导的免疫反应在引流淋巴结中的示意图。（改编自：Chen Z, Gao X, Yu D. 疫苗保护的持久性：免疫机制、评估方法和改进策略。View, 2022; 3, 20200103）。 之后，有两种途径：一是激活的B细胞可以诱导额外的滤泡外反应（无需T细胞帮助），导致产生短暂存活的浆细胞（图1中的步骤‘b’）。细菌抗原如脂多糖诱导这种类型的反应。顾名思义，这些短暂存活的浆细胞分泌抗体的时间很短；因此，疫苗诱导的保护只持续很短的时间。没有T细胞帮助，产生的抗体亲和力低至适中，主要是IgM型，没有同种型转换。值得注意的是，这种反应相对迅速，导致接种疫苗后几天内IgM抗体出现。Vi多糖伤寒疫苗是这方面的经典例子。 第二条途径是诱导生发中心（GC）反应。这条途径涉及不同淋巴结区域的复杂协调活动，相对较慢：生发中心的发展大约需要两周时间。在T细胞区域，抗原通过抗原呈递细胞（APC）如树突状细胞（DC）的主要组织相容性复合体（MHC）II类分子呈递给naïve CD4+ T细胞，导致它们功能分化为辅助T细胞（Th细胞）（图1中的步骤‘c’）。这些Th细胞提供辅助信号，激活边缘区的B细胞，导致额外的滤泡外反应，产生短暂存活的浆细胞（图1中的步骤‘d’）。这些短暂存在的浆细胞在一段时间后开始死亡，导致接种疫苗后4-8周记录的抗体滴度降低。然而，由于T细胞以第1型细胞因子干扰素-γ（IFN-γ）（由滤泡辅助T细胞（TFH细胞）和Th1细胞产生）或第2型细胞因子白介素-4（IL-4）[由TFH和Th2细胞产生]的形式提供帮助，存在同种型转换为IgG1/IgG3或IgG1和IgE。一些初次激活的CD4+T细胞致力于分化为TFH细胞（图1中的步骤‘e’），它们支持生发中心反应的启动和维持。 生发中心反应是由一些激活的B细胞在接收到初次激活的T细胞和滤泡树突状细胞（FDCs）的信号后向生发中心迁移而启动的（图1中的步骤‘f’）。FDCs在这里至关重要：它们吸引抗原特异性B和TFH细胞，并长期捕获/保留抗原。被携带抗原的FDCs吸引的B细胞成为生发中心反应的创始人。每个生发中心只包含单一抗原的B细胞。这些B细胞经历大规模克隆性增殖、体细胞超突变和亲和力成熟[在几轮选择后选择最适合的B细胞（具有最高亲和力）]。 此外，它们分化为长期存活的浆细胞（图1中的步骤‘g’），这些浆细胞在长期（初级免疫反应）分泌大量高亲和力抗体。一些生发中心B细胞分化为记忆B细胞（图1中的步骤‘h’）。记忆细胞作为休息细胞持续存在，直到再次暴露于相同抗原时，它们重新增殖并分化为浆细胞，分泌大量高亲和力抗体（次级免疫反应）。这次次级免疫反应后抗体滴度的下降比初次免疫反应慢得多。因此，当同一病原体感染或疫苗加强剂量后，几天内可以注意到抗体滴度的快速增加。在生发中心反应期间，一部分浆细胞可以迁移到主要位于骨髓内长期存活的生态位，在那里它们的存活和抗体生产可能持续多年。通过测量疫苗接种后6-12个月的抗体滴度，可以预测抗体的长期持久性，因为到这个时候，所有短期浆细胞都已消失，在没有重复接种的情况下，血清中的抗体仅由长期存活的浆细胞分泌。 除了这种抗体介导的免疫反应（体液免疫反应），CD8+ T细胞介导的细胞溶解是针对细胞内感染的细胞免疫的关键机制。它在T细胞区域诱导，其中naïve CD8+ T细胞通过树突状细胞上的MHC I类分子交叉呈递抗原，驱动它们分化为短暂存活的效应CD8+ T细胞（图1中的步骤‘i’）或驻留记忆CD8+ T细胞（图1中的步骤‘j’）。与体液免疫反应一样，大多数短暂存活的细胞毒性效应细胞在初次免疫反应结束时进入程序性细胞死亡。相比之下，记忆CD8+ T细胞持续时间更长，它们可以在再次暴露于同一病原体时迅速增殖成大量效应细胞。除了保护细胞内抗原外，记忆CD8+ T细胞的保护功能还被认为是老年人在抗体反应不足时的重要保护机制。此外，最近发现了一种新的CD8+ T细胞亚群，它们在非淋巴组织中长期存在并可以控制再感染。被称为组织驻留记忆T细胞（TRM），它们对于开发针对通过呼吸道和消化道进入的感染的疫苗具有极大兴趣，因为传统的基于抗体的疫苗在初次感染期间不能诱导足够的能力来中和病原体。体液免疫持久性的关键决定因素是两种广泛的免疫机制——记忆B细胞依赖性和记忆B细胞独立性。后者的免疫是通过位于骨髓生态位中的长期存活浆细胞产生的抗体提供的。记忆B细胞本身不提供保护，但在抗原暴露后它们会分裂并分化为浆细胞，以分泌大量抗原特异性抗体。因此，为了评估免疫原诱导的免疫持久性，测量记忆B细胞计数应该提供免疫持久性的估计。然而，研究表明这种相关性在现实生活中并非所有疫苗都存在。虽然在麻疹和风疹等特定抗原的情况下，记忆B细胞群体保持稳定，并与数十年后的抗体水平很好地相关，而在水痘-带状疱疹病毒、Epstein-Bar病毒、破伤风或白喉等其他一些抗原的情况下，则不存在这种相关性。还注意到，对于需要多次或重复剂量的疫苗，这种关联也不存在。这一观察结果反映了记忆B细胞的单纯持久性可能不能保证抗体的持久性，可能涉及其他机制来维持长期抗体水平。其中一种机制可能是“印迹寿命”现象，其中B细胞信号在诱导抗原特异性免疫反应期间决定了浆细胞的寿命。大多数抗原诱导记忆B细胞形成，但抗体产生的持续时间并不相同。这一假设可能解释了为什么某些抗原提供长期免疫，而其他抗原只提供短期保护。 在这一过程中，负责将免疫细胞分化为不同亚群和途径的确切机制至今仍然不甚了解。然而，诱导良好的生发中心反应、许多长期存活的浆细胞以及记忆B细胞和T细胞的形成对于持久、长期的疫苗诱导保护至关重要（图2）。 图2. 持久疫苗诱导免疫反应的关键免疫学决定因素。B细胞和T细胞反应有助于提供疫苗诱导免疫反应的持久性。A. 淋巴结中的生发中心（圈出）是B细胞产生和成熟的地方。B. 脾脏等淋巴组织中的记忆B细胞。C. 长寿命浆细胞移至骨髓生态位并在那里生存，提供持久的免疫力。D. 肠道固有层和肠道上皮中的记忆T细胞。E. 组织驻留记忆T细胞（TRM）在鼻腔和肺部。这些细胞位于非淋巴组织，如皮肤、肠道和肺气道，不通过血液循环。大多数T细胞在成熟前在胸腺发育，然后被输送到外围。 4.决定抗体反应持久性的因素  某些已知因素决定了疫苗诱导的抗体反应可能持续的时间（表2）： 4.1.与疫苗和接种相关因素 4.1.1.疫苗平台 疫苗平台对决定持久性至关重要。在所有疫苗平台中，只有减毒活疫苗和病毒样颗粒（VLP）基疫苗能够引发持久的抗体反应，这些反应可以持续数十年，甚至一生，无需进一步暴露于抗原或重新激活免疫记忆。Amanna等人对45名个体进行了长达26年的长期研究，研究了针对病毒抗原（天花、麻疹、腮腺炎、风疹、水痘-带状疱疹病毒和Epstein-Barr病毒）和非复制抗原（破伤风和白喉）的特异性抗体水平。他们发现，针对病毒的抗体反应保持了显著的稳定性，估计半衰期从水痘-带状疱疹病毒的50年到麻疹和腮腺炎等其他病毒的200多年不等。针对非复制抗原（破伤风和白喉）的抗体反应下降更快，估计半衰期分别为11年和19年。与非活抗原相比，活疫苗由于微生物的繁殖和传播，导致多个淋巴结激活。微生物复制过程导致抗原不断产生，这反过来有助于强烈且持久的免疫反应。VLP基疫苗，如人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗，由具有在其表面展示高度重复抗原序列的超分子纳米颗粒组成。VLPs的高抗原价，即疫苗抗原向免疫系统呈现的密集程度，可以显著增强早期B细胞激活和生发中心反应的持久性。这反过来导致增加的、持久的浆细胞分化，从而产生持久且长期的免疫反应。COVID-19疫苗具有吸引力，因为已开发出多种疫苗，主要基于其刺突抗原，但采用不同平台。例如，Moderna的mRNA疫苗诱导高滴度的疫苗诱导的结合和中和抗体以及CD4和CD8细胞。然而，这些在六个月后下降，而Janssen的疫苗，是一种基于病毒载体（Adenovirus-26）的疫苗，诱导的抗体滴度、CD4和CD8细胞的峰值低于mRNA疫苗，但持续时间更长（长达8个月）。此外，研究表明，使用不同平台的疫苗进行增强（异源增强）比同源计划诱导更好的免疫反应。 4.1.2.抗原形式 抗原的形式影响免疫反应。颗粒状抗原，如病毒颗粒或聚集蛋白，通过树突状细胞更有效的抗原摄取和迁移。它们比抗原为单体或可溶性时，从CD4+和CD8+ T细胞中引发更强的反应。因此，颗粒状抗原和热或化学诱导的聚集抗原比可溶性、单体抗原引发更强大和持久的免疫反应。尽管如此，有几个实际案例偏离了这一原则。例如，最近批准的RTS, S疟疾疫苗由重复的颗粒状抗原与强效佐剂结合而成。尽管如此，这种疫苗在接种时仅在约36%的个体中诱导保护性免疫反应，且保护水平在三年内降至0%。 疫苗学中的另一个最新发展是“基于结构”的蛋白质抗原设计（现在称为“设计抗原”），它描绘了“融合前”和“融合后”形式的抗原结构。新的成像技术如X射线晶体学和冷冻电子显微镜（Cryo-EM）的出现使得研究这些形式成为可能。针对“融合后”（抗原与宿主细胞融合后）形态的抗体并不能充分中和病毒在结合细胞前循环形式，即“融合前”形态。针对仅在融合前形态期间暴露的表位的抗体在中和病毒方面非常有效。这一概念的知识导致了呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗的成功开发，并已应用于设计一些基于mRNA和蛋白质的COVID-19疫苗。 (1) 抗原类型是决定疫苗诱导的免疫反应持久性的关键因素。多糖抗原是“T细胞非依赖性”的，在没有T细胞帮助的情况下不诱导TFH细胞和生发中心反应（见上文）。因此，这些抗原的抗体反应主要是IgM型，低滴度的低亲和力IgG，且仅持续短时间。因此，抗体反应的持久性和“质量”是次优的。将多糖抗原与“载体”蛋白结合可以诱导TFH细胞、生发中心反应，从而产生具有同种型转换和免疫记忆的高亲和力抗体反应，从而实现长期保护，如肺炎球菌结合疫苗和伤寒结合疫苗所见。 (2) 佐剂。佐剂以多种方式改善对灭活疫苗的免疫反应，如修改抗原的传递方式、延长其持续时间（使用储存或缓慢释放的配方）以及增强Th反应（免疫调节）。佐剂可以通过增强免疫反应的质量和强度来增强疫苗诱导的免疫的持久性。 (3) 抗原剂量也是一个因素，就疫苗诱导的免疫的持久性而言。一般来说，增加抗原剂量可以通过增加B/T细胞结合的抗原可用性来增强免疫反应。然而，也存在一些复杂性，因为抗原剂量也显示除了影响Th1/Th2偏向和招募Th17和TFH细胞外，还影响调节性T细胞（Tregs）的诱导。 (4) 接种时间表也调节抗体反应的幅度和持续时间。当初次剂量在不到一个月的间隔内给予时，产生的免疫反应比在更长的间隔（1-2个月）给予相同数量的疫苗剂量时的免疫反应持续时间更短。这是因为产生较少的生发中心后B细胞，它们能够长期存活。主要反应波之间的时间间隔较短增加了竞争，对持久性产生负面影响。为了获得最佳的记忆检索和增强的免疫反应，有必要有至少3到4个月的较长间隔。非活T细胞依赖性免疫的最佳时间是至少在最后一剂初次剂量后4-6个月，允许生发中心的B细胞进行必要的亲和力成熟并创造记忆细胞。“过早”给予增强剂量会导致在增强时抗体升高，形成抗原-抗体复合物，减少了可用于B细胞初次接触的抗原。此外，抗体介导的反馈机制可能直接对B细胞产生负面影响。 (5) 给药途径。疫苗的免疫反应可以根据给药途径而不同。例如，Styles等人在他们的动物研究中表明，皮内接种比肌肉注射更能在淋巴结中保留抗原，这导致更强烈和持久的抗原特异性生发中心T和B细胞的激活。Jegaskanda等人表明，鼻内活减毒流感疫苗，随后肌肉注射亚单位疫苗增强，导致强烈的免疫反应。同样，肌肉注射mRNA-脂质纳米颗粒作为初始剂量，随后鼻内蛋白疫苗作为增强剂，导致对SARS-CoV2的强大而有效的免疫反应。因此，各种平台和给药方法的组合可以增强保护的持久性。 4.2.与接种者相关的因素 接种时的年龄：接种者在接种时的年龄也会影响疫苗抗体的持久性，因为在年龄的两个极端，由于免疫系统的不成熟和衰老，抗体反应时间较短。在婴儿期，通过胎盘传递的先天抗体也会对减毒活疫苗的免疫反应产生不利影响。即使是对非活疫苗的免疫反应也会受到这些母体来源的抗体的影响，但影响较小。性别：尽管这方面的研究尚不充分，但一些迹象表明免疫反应也可能因性别而异。研究表明，女性对感染的免疫反应比男性更为活跃。  遗传因素：与许多MHC分子相关的抗原表位更有可能诱发反应。关键分子的基因多态性，这些分子对于B细胞和T细胞的激活/分化分子影响抗体反应的质量。MHC分子的个体和群体变异[人类白细胞抗原A2（HLA A2）]显著影响T细胞反应。疾病状况：某些疾病状况也会影响疫苗抗体的持久性。增加的代谢（如HIV）或通过尿液或消化道的抗体丢失会降低疫苗抗体的持久性。免疫抑制药物和状况影响疫苗诱导的保护的持久性。最近的研究表明，肥胖可能会加速COVID-19和流感疫苗效力的下降。  肠道微生物群：最近的研究揭示了肠道微生物群对免疫系统的发展和对疫苗的免疫反应的影响。肠道微生物群在出生时/出生后建立对儿童疫苗反应的影响尚不清楚。 4.3.目标病原体相关因素 目标病原体及其致病性显著影响免疫反应和持久性。例如，潜伏期和感染力（疾病在社区中获得的速度）影响疫苗的有效性。较长的潜伏期允许更有效的记忆反应和对有症状疾病的长期保护。这一现象在SARS-CoV-2大流行期间得到了广泛记录，其中对感染的保护水平随着SARS-CoV-2新毒株的潜伏期缩短而下降。此外，研究发现疫苗的有效性通常在病毒传播或感染力较低的地区更大。这种情况在五价轮状病毒疫苗的案例中得到了证明，其现实世界效率从45%到90%不等。口服脊髓灰质炎疫苗（OPV）也显示出显著的有效性变化。 针对在粘膜表面复制而不引起系统性感染/显著病毒血症的病毒的许可和实验性疫苗也未能诱导持久的保护。这些病毒的自然感染[如流感、副流感、RSV、SARS-CoV2和其他“人类普通感冒病毒”]也不会提供长期保护。可能的因素包括：（a）它们不像麻疹、腮腺炎、风疹、天花等其他病毒那样与多个免疫区室和免疫活性细胞接触，（b）它们有较短的潜伏期，因为它们在粘膜复制后立即引起疾病（系统传播所需的时间在粘膜复制后被切断），（c）鼻分泌物IgA的半衰期远短于血清IgG。因此，主要诱导粘膜免疫反应的病毒不会导致对这些病毒的持久保护。从进化的角度来看，粘膜表面定期接触更多的抗原。因此，它们已经进化为“容忍”较少危险的抗原，并下调对它们的免疫反应以最小化旁观者组织损伤，专注于更危险的抗原以进行强大的免疫反应。这种免疫“决策”的机制尚未完全理解。病毒遗传变异（正在传播的病毒株/变体的数量和种类）也对疫苗效力产生不利影响，这一点在流感和SARS-CoV2病毒中很容易观察到。 4.4.其他因素 一些其他“环境因素”，大部分尚不清楚，也可能影响疫苗诱导的免疫反应。例如，热带和温带国家对口服脊髓灰质炎疫苗（OPV）的免疫反应存在巨大差异。解释这种效应的一个假设是，在热带国家，多种肠道病原体在循环中，这影响了免疫系统对疫苗的“吸收”。即使是疫苗接种的时间也已被证明会影响免疫反应的强度。昼夜节律钟对关键免疫细胞功能的影响，包括细胞因子产生、细胞迁移、树突状细胞活性以及T细胞和B细胞活性，已被证明；然而，其对细胞或分子水平上免疫反应的确切机制仍然不清楚。 5.如何提高疫苗诱导的保护的持久性？  5.1.挑战与未来方向  尽管疫苗在控制传染病、提高生活质量、延长预期寿命以及创造巨大的经济效益方面取得了225年的成功，但讽刺的是，我们仍在学习最好的疫苗是如何工作的，以及如何改进疫苗设计以提高保护效果。大多数现有疫苗是经验性开发的。由于对免疫记忆机制的无知以及测量诱导长期免疫保护的细胞成分的挑战，疫苗持久性评估也是一种“观望”方法。最近的进展开始减少我们在疫苗介导保护和长期免疫的潜在机制方面的知识差距。我们可能可以通过利用这些细微差别和优化免疫反应联系，以更少的剂量诱导更有效和持久的免疫。 自然感染诱导的免疫通常比疫苗诱导的保护更持久。探索这种差距是开发更持久保护疫苗的一种方法。Beukema等人延长了抗原递送，以复制自然感染抗原动态，以提高小鼠流感疫苗的持久性。他们将标准的主要增强免疫反应与28天间隔的免疫反应与连续14、21或28天每天剂量的全灭活流感病毒疫苗的免疫反应进行了比较。28天的延长抗原管理达到了最高的细胞和体液免疫反应水平，其次是21天和14天的递送以及主要增强免疫。延长疫苗递送还提高了抗体反应的质量，显著高水平的高亲和力、平衡的IgG亚类和交叉反应性抗体。Lee等人发现，在恒河猴中，对HIV包膜蛋白免疫原的长期主要、慢速递送（12天）导致了更多的记忆B细胞、更高的抗体体细胞突变，以及对非免疫优势表位更强大的免疫反应。需要进一步研究以确定最佳的抗原递送方法和配方，这些方法和配方延长了抗原的可用性，诱导了对流感和其他病毒的长期和保护性免疫，以及提供更少剂量的长期保护的疫苗。关于这一概念的HIV疫苗临床试验的第一阶段正在进行中（NCT05471076）。 与无佐剂平台或具有单一佐剂的平台不同，复制病毒载体模仿自然感染并激活多个受体和炎症途径以维持免疫反应。因此，早期先天信号因病原体或平台而异，可能是加速疫苗开发和实现更持久保护的替代终点。大多数现代疫苗的保护相关因素是针对病原体抗原的抗体。由于细胞反应难以测量，我们主要关注体液抗原反应。然而，在过去的2-3十年中，CD4+和CD8+ T细胞记忆的定量分析和功能特征已经取得了进展。多种方法，如MHC I类四聚体、肽诱导的细胞内细胞因子标记和IFNγ ELISPOT，可以评估抗原特异性T细胞反应的频率。借助先进的流式细胞仪设备和试剂，可以同时评估许多T细胞功能和表型标记。这些研究和T细胞基因表达谱的先进微阵列分析提供了有关记忆T细胞反应的信息。例如，抗病毒T细胞记忆在天花免疫和SARS-CoV-1感染后持续数十年。 尽管所有信息和日益增长的共识表明，对于最具挑战性的传染病（例如艾滋病、疟疾和结核病），可能需要有效的病原体特异性体液和细胞介导的免疫的结合才能创造有效的疫苗，但我们仍然远未利用细胞免疫。识别和验证T细胞特异性免疫相关因素（或T细胞和抗体所需的共同免疫相关因素以实现疫苗介导的保护）将在这一领域取得巨大成功。 还应该探索新的佐剂以延长疫苗诱导的保护。灭活和重组疫苗使用佐剂来增强疫苗介导的免疫反应，增加血清转化率，减少抗原剂量，以及为类似的保护减少剂量。铝盐，最受欢迎的佐剂，面临与疫苗相同的问题：它们的作用机制仍在讨论中。较新的佐剂系统可能针对先天免疫系统信号通路，如Toll样受体（TLR），以指导疫苗诱导的免疫，并更好地匹配病原体特异性免疫需求（例如细胞与体液免疫的倾斜），从而产生更持久的免疫反应。例如，AS04是MPL（单磷酸脂A）（一种TLR-4激动剂）和氢氧化铝的组合，用于HPV疫苗，TCV™。这种HPV疫苗Cervarix®，与同一疫苗平台（病毒样颗粒，VLP）但只有铝盐（硫酸铝氢氧化物）作为佐剂的Cervarix®相比，诱导了2到9倍更强的抗体反应，但血清抗体衰减相似，表明ASO4并没有显著改变体液免疫反应动力学。因此，更好的佐剂系统可以帮助我们实现“量身定制”的免疫反应。鉴于存在这种佐剂诱导免疫介导疾病的可能性，追求这种方法时需要谨慎考虑安全性。 6.结论  在过去两个世纪中，疫苗研究和开发取得了巨大进步，但大多数疫苗都是经验性开发的。我们仍需理解它们的机制，特别是先天、体液和细胞成分及其亚成分之间复杂的相互作用。这一领域的发现开始减少我们的知识差距。同样，生物工程技术也在迅速发展。通过纳米颗粒和病毒样颗粒疫苗，可以精细调节抗原价数和密度。抗原递送可以通过更新的生物材料进行控制和持续。新的佐剂，特别是粘膜佐剂，可以激活特定的先天免疫途径。随着免疫反应持久性的机制变得更加清晰，我们可以有策略地构建疫苗，以更少的剂量提供持久的疫苗诱导保护。 7.专家意见  疫苗在减少与传染病相关的发病率和死亡率方面做出了巨大贡献，最终降低了婴幼儿/五岁以下儿童死亡率、残疾生活年（DALY）、学校和工作缺勤率，从而提高了生产力、生活水平和预期寿命。尽管我们只有少数几种疫苗能提供长期（>20年/终身）保护，只需一剂或两剂；绝大多数疫苗提供7-10年的保护，通常需要多剂。相当多的疫苗只提供短期保护（<5年）。无疑，延长疫苗诱导保护的寿命将作为实现上述所有好处的“倍增器”。此外，通过大幅降低免疫计划的成本，它对国家具有巨大的直接和间接经济效益，增加了疫苗特别是医学科学的声誉。 在过去几年中，疫苗开发取得了一些快速进展。开发新疫苗的孕育期已大大缩短——从概念批准到产品许可。这主要归功于新疫苗平台的出现，如基于核酸的mRNA和DNA疫苗，以及对抗原的生物学活性形式及其与宿主细胞相互作用的深入了解，帮助专家设计了更有效和有效的配方，如RSV疫苗的成功开发所示。在确保疫苗诱导免疫的持久性方面也取得了一些进展，但速度要慢得多。正如我们的综述所讨论的，HPV疫苗在这方面脱颖而出。基于VLP疫苗平台，它们具有高度重复的抗原序列的超分子纳米颗粒，这显著促进了早期B细胞激活和GC反应的持久性，导致增强的长期浆细胞分化和持久的免疫反应。因此，尽管是灭活疫苗，它们提供长期保护，类似于减毒活疫苗，无需加强剂。许多其他策略目前正在积极研究中，以提高疫苗保护的持久性。调整传统免疫技术，如长期主要、慢速递送（12天）免疫方法，是这一方向上的一种策略，如在一些动物研究中用实验性HIV疫苗和流感疫苗开发所示。 大多数目前许可的疫苗都是通过“开发然后看/评估”的方法经验性开发的。现在的需要是有策略地开发疫苗。毫无疑问，我们对免疫学的理解以及长期保护的确切相关因素存在挑战。因此，需要确定不同疫苗配方和保护性免疫的“保护阈值”，以便将最低抗体水平维持在阈值以上，以避免突破性感染。 正如综述中所详述的，增强免疫反应持久性的两个关键免疫机制是生发中心的记忆B细胞生成和长寿命浆细胞在骨髓生态位中的生存。需要识别导致生发中心的起源和持久性的因素，除了它们的递送性质和动力学。同样，识别因代理和疫苗平台而异的早期先天信号可能有助于发展和确保长寿命浆细胞在骨髓中的生存，提供持久的免疫反应。在非人类灵长类动物上使用佐剂SARS-CoV-2疫苗的工作中，Prabakaran等人展示了一种识别和分离抗原特异性长寿命浆细胞（LLPCs）的敏感方法。他们发表的工作表明，刺突蛋白疫苗可以诱导和维持LLPCs。 针对不同变体中保守的抗原位点或基因的特定表位也可以确保保护的持久性。此外，需要超越抗体产生的测量，针对关键粘膜部位，以证明不同粘膜组织中组织产生的记忆细胞，这可能有助于防止突破性感染并确保持久性。 解决我们理解中的这些差距的方案应该成为疫苗学领域未来研究议程的一部分。我们有信心，我们正从经验性疫苗开发的时代缓慢但肯定地过渡到“设计疫苗”的时代，特别强调保护的持久性。在未来几年中，疫苗行业将能够借助生物材料和疫苗开发生物工程的进步，解决当前的不足。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 名称：2024第三届新型疫苗研发峰会 时间：2024年8月16-17日（周五-周六） 地点：苏州（酒店定向通知） 主办单位：四叶草会展、生物制品圈 媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈 会议费用：点击二维码即可查询。 报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，免交报名费，承担一定工作任务）！ 转发分享福利：疫苗研发企业、科研院校和监管机构人员，前30位报名人员转发分享会议信息可免费参会（不含餐饮）报名后，扫描下方二维码加工作人员微信后，发送截图即可。 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