更新于：2024-06-20
CV-9202
更新于：2024-06-20
概要
基本信息
药物类型 治疗性疫苗、mRNA疫苗 |
别名 BI 13618409、BI 1361849、BI-1361849 + [1] |
作用机制 5T4抑制剂(5T4滋养层糖蛋白抑制剂)、MAGEC1拮抗剂(MAGE family member C1 antagonists)、MAGEC2拮抗剂(MAGE family member C2 antagonists) |
在研适应症 |
非在研适应症- |
最高研发阶段临床2期 |
首次获批日期- |
最高研发阶段(中国)- |
特殊审评- |
序列信息
Sequence Code 1038074778
Sequence Code 1038074779
靶点: *****
Sequence Code 1038074780
Sequence Code 1038074781
靶点: *****
Sequence Code 1038074782
靶点: *****
Sequence Code 1038074783
靶点: *****
关联
4
项与 CV-9202 相关的临床试验A Phase 1/2 Study of Combination Immunotherapy and mRNA Vaccine in Subjects With Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC)
This is an open-label, multicenter, 2-arm study to evaluate the safety and preliminary efficacy of the addition of a vaccine therapy to 1 or 2 checkpoint inhibitors for NSCLC.
Arm A: messenger ribonucleic acid (mRNA) Vaccine [BI 1361849 (formerly CV9202)] + anti-programmed death ligand 1 (PD-L1) antibody [durvalumab]
Arm B: messenger ribonucleic acid (mRNA) Vaccine [BI 1361849] + anti-programmed death ligand 1 (PD-L1) [durvalumab] + anti-cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4) antibody [tremelimumab]
The run-in evaluation phase is followed by an expansion phase in which the cohort is expanded to 20 subjects (inclusive of subjects from the run-in).
Arm A: messenger ribonucleic acid (mRNA) Vaccine [BI 1361849 (formerly CV9202)] + anti-programmed death ligand 1 (PD-L1) antibody [durvalumab]
Arm B: messenger ribonucleic acid (mRNA) Vaccine [BI 1361849] + anti-programmed death ligand 1 (PD-L1) [durvalumab] + anti-cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4) antibody [tremelimumab]
The run-in evaluation phase is followed by an expansion phase in which the cohort is expanded to 20 subjects (inclusive of subjects from the run-in).
开始日期2017-12-20 |
申办/合作机构 |
A randomised, double blind phase I/II trial to investigate efficacy, immunogenicity and safety of intradermally administered BI 1361849 (CV9202) plus afatinib versus placebo plus afatinib as first-line treatment for patients with stage IV adenocarcinoma of the lung harbouring common EGFR mutations. - A study of BI 1361849 (CV9202) plus afatinib in 1st line NSCLC pts harbouring common EGFR mutations
开始日期2016-01-07 |
申办/合作机构- |
A randomised, double-blind phase II trial to determine efficacy, safety and immunogenicity of BI 1361849 (CV9202) maintenance vaccination therapy versus placebo given intradermally in patients with inoperable locally advanced NSCLC after definitive concurrent chemoradiation (CRT) therapy - Phase II study of BI 1361849 (CV9202) vs. placebo after definitive CRT
开始日期2015-11-20 |
100 项与 CV-9202 相关的临床结果
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100 项与 CV-9202 相关的转化医学
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100 项与 CV-9202 相关的专利（医药）
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2
项与 CV-9202 相关的文献（医药）2019-12-01·Journal for immunotherapy of cancer2区 · 医学
Phase Ib evaluation of a self-adjuvanted protamine formulated mRNA-based active cancer immunotherapy, BI1361849 (CV9202), combined with local radiation treatment in patients with stage IV non-small cell lung cancer
2区 · 医学
ArticleOA
作者: Bischoff, Helge ; Griesinger, Frank ; Pall, Georg ; Sebastian, Martin ; Pless, Miklos ; Hilbe, Wolfgang ; Hipp, Madeleine M ; Hong, Henoch S ; Alt, Jürgen ; Geißler, Michael ; Gnad-Vogt, Ulrike ; Seibel, Tobias ; Doener, Fatma ; Fotin-Mleczek, Mariola ; Koch, Sven D ; Weiss, Christian ; Schröder, Andreas ; Stosnach, Claudia ; Scheel, Birgit ; Zippelius, Alfred ; Cathomas, Richard ; Klinkhardt, Ute ; Wehler, Thomas ; Papachristofilou, Alexandros ; Muth, Anke ; Früh, Martin ; Kallen, Karl-Josef
BACKGROUND:
Preclinical studies demonstrate synergism between cancer immunotherapy and local radiation, enhancing anti-tumor effects and promoting immune responses. BI1361849 (CV9202) is an active cancer immunotherapeutic comprising protamine-formulated, sequence-optimized mRNA encoding six non-small cell lung cancer (NSCLC)-associated antigens (NY-ESO-1, MAGE-C1, MAGE-C2, survivin, 5T4, and MUC-1), intended to induce targeted immune responses.
METHODS:
We describe a phase Ib clinical trial evaluating treatment with BI1361849 combined with local radiation in 26 stage IV NSCLC patients with partial response (PR)/stable disease (SD) after standard first-line therapy. Patients were stratified into three strata (1: non-squamous NSCLC, no epidermal growth factor receptor (EGFR) mutation, PR/SD after ≥4 cycles of platinum- and pemetrexed-based treatment [n = 16]; 2: squamous NSCLC, PR/SD after ≥4 cycles of platinum-based and non-platinum compound treatment [n = 8]; 3: non-squamous NSCLC, EGFR mutation, PR/SD after ≥3 and ≤ 6 months EGFR-tyrosine kinase inhibitor (TKI) treatment [n = 2]). Patients received intradermal BI1361849, local radiation (4 × 5 Gy), then BI1361849 until disease progression. Strata 1 and 3 also had maintenance pemetrexed or continued EGFR-TKI therapy, respectively. The primary endpoint was evaluation of safety; secondary objectives included assessment of clinical efficacy (every 6 weeks during treatment) and of immune response (on Days 1 [baseline], 19 and 61).
RESULTS:
Study treatment was well tolerated; injection site reactions and flu-like symptoms were the most common BI1361849-related adverse events. Three patients had grade 3 BI1361849-related adverse events (fatigue, pyrexia); there was one grade 3 radiation-related event (dysphagia). In comparison to baseline, immunomonitoring revealed increased BI1361849 antigen-specific immune responses in the majority of patients (84%), whereby antigen-specific antibody levels were increased in 80% and functional T cells in 40% of patients, and involvement of multiple antigen specificities was evident in 52% of patients. One patient had a partial response in combination with pemetrexed maintenance, and 46.2% achieved stable disease as best overall response. Best overall response was SD in 57.7% for target lesions.
CONCLUSION:
The results support further investigation of mRNA-based immunotherapy in NSCLC including combinations with immune checkpoint inhibitors.
TRIAL REGISTRATION:
ClinicalTrials.gov identifier: NCT01915524 .
2014-12-01·BMC cancer2区 · 医学
Phase Ib study evaluating a self-adjuvanted mRNA cancer vaccine (RNActive®) combined with local radiation as consolidation and maintenance treatment for patients with stage IV non-small cell lung cancer
2区 · 医学
ArticleOA
作者: Richard Cathomas ; Sven D Koch ; Wolfgang Hilbe ; Alfred Zippelius ; Birgit Scheel ; Gerd Rippin ; Christian Weiss ; Mariola Fotin-Mleczek ; Martin Früh ; Regina Heidenreich ; Karl-Josef Kallen ; Ulrike Gnad-Vogt ; Martin Sebastian ; Alexandros Papachristofilou ; Thomas Wehler
BACKGROUND:
Advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) represents a significant unmet medical need. Despite advances with targeted therapies in a small subset of patients, fewer than 20% of patients survive for more than two years after diagnosis. Cancer vaccines are a promising therapeutic approach that offers the potential for durable responses through the engagement of the patient's own immune system. CV9202 is a self-adjuvanting mRNA vaccine that targets six antigens commonly expressed in NSCLC (NY-ESO-1, MAGEC1, MAGEC2, 5 T4, survivin, and MUC1).
METHODS/DESIGN:
The trial will assess the safety and tolerability of CV9202 vaccination combined with local radiation designed to enhance immune responses and will include patients with stage IV NSCLC and a response or stable disease after first-line chemotherapy or therapy with an EGFR tyrosine kinase inhibitor. Three histological and molecular subtypes of NSCLC will be investigated (squamous and non-squamous cell with/without EGFR mutations). All patients will receive two initial vaccinations with CV9202 prior to local radiotherapy (5 GY per day for four successive days) followed by further vaccinations until disease progression. The primary endpoint of the study is the number of patients experiencing Grade >3 treatment-related adverse events. Pharmacodynamic analyses include the assessment of immune responses to the antigens encoded by CV9202 and others not included in the panel (antigen spreading) and standard efficacy assessments.
DISCUSSION:
RNActive self-adjuvanted mRNA vaccines offer the potential for simultaneously inducing immune responses to a wide panel of antigens commonly expressed in tumors. This trial will assess the feasibility of this approach in combination with local radiotherapy in NSCLC patients.
TRIAL REGISTRATION:
Clinicaltrials.gov: NCT01915524/EudraCT No.: 2012-004230-41.
8
项与 CV-9202 相关的新闻（医药）2023-11-11
摘要在过去的十年中，用于预防和治疗应用的信使RNA（mRNA）疫苗的开发已经迅速发展。mRNA疫苗在各种应用中已证明具有治疗功效，包括传染病、免疫疗法、遗传性疾病、再生医学和癌症。许多mRNA疫苗已进入临床试验，少数几种已获得FDA上市批准。与传统方法相比，这种新兴的治疗方法在以下几个方面具有优势：安全性，有效性，适应性，批量生产以及成本效益。然而，值得一提的是，向目标部位的递送和体内降解以及热稳定性是能够改变其疗效和结果的限制因素。在本文中，我们介绍了不同类型的mRNA疫苗，其作用方式以及优化其开发和克服其限制的过程。我们还重点探讨了各种纳米颗粒介导的mRNA疫苗的递送系统。一般来说，递送系统在提高mRNA疫苗稳定性，生物相容性和对目标细胞和组织的靶向能力方面起着至关重要的作用。除了作为运载工具的功能外，它们还能保护mRNA分子免受可能改变其效率的物理、化学和生物活性的伤害。最后，我们重点讨论了关于未来应聚焦更安全和更有效的mRNA应用，并强调了当前mRNA疫苗的优点和缺点。1.背景疫苗接种在抗击传染病方面发挥了关键作用，并在全球公共卫生方面做出了重大贡献。传统的疫苗平台在疾病预防中发挥了重要作用，主要使用灭活或减毒病原体、蛋白质亚基或病毒载体。然而，这些传统的疫苗平台通常需要复杂的制造过程，并且在可扩展性、开发速度和适应新出现病原体方面可能存在限制。近年来，mRNA（即信使RNA）疫苗已成为一种突破性的技术，为针对包括病毒爆发和新兴病原体在内的传染病进行快速和有针对性的疫苗开发提供了一个多功能平台。mRNA疫苗是新一代的疫苗，利用体内细胞生产特定的抗原，进而引发针对产生的抗原的免疫反应。这种创新方法比传统疫苗平台具有许多优势。它已经引起了人们的极大关注，特别是在最近针对SARS-CoV-2病毒的mRNA疫苗成功开发和使用情况下。mRNA疫苗的一个主要优势是它们的快速开发和生产能力。与传统疫苗需要耗时且昂贵的制造过程不同，mRNA疫苗可以在几周内设计和合成，为应对新兴传染病或不断变化的病原体提供前所未有的灵活性和速度。此外，mRNA疫苗的遗传信息模板特性使得通过简单地改变编码所需抗原的mRNA序列来轻松适应不同的病原体。然而，有效地将mRNA分子传递到目标细胞是一个重大的挑战，因为它们容易受到降解、稳定性有限并且难以到达所需的作用部位。纳米颗粒已成为有潜力的工具，为mRNA疫苗递送提供了许多优点，克服了裸露的mRNA分子的固有局限性。这些纳米级载体提供保护和输送能力，促进有效的细胞摄取、保护免受酶降解以及mRNA有效载荷的控释。此外，纳米颗粒可以经过改造来提高稳定性、延长循环时间，并促进其靶向递送到免疫细胞或特定组织，最终增强了mRNA疫苗的免疫原性和疗效。脂质纳米颗粒（LNPs）已成为目前mRNA疫苗传递的主要纳米颗粒。LNP可以在其疏水核心中封装和保护mRNA，从而实现高效的细胞摄取和胞内释放。这种方法已成功应用于开发针对各种传染病（包括COVID-19）的mRNA疫苗。LNP表现出优秀的安全性、高转染效率和诱导强大免疫反应的能力，使其成为有效疫苗接种策略的潜力工具。除了LNP之外，还探索了其他类型的纳米颗粒，如聚合物纳米颗粒、肽和基于鱼精蛋白的递送系统，用于mRNA疫苗的递送。每种纳米颗粒类别都有着不同的优势，例如可调的尺寸、表面修饰和靶向传递能力。包括合成聚合物和天然聚合物在内的聚合物纳米粒子在设计上具有多样性，可以保护裸露的mRNA免受降解。与此同时，自组装肽和鱼精蛋白纳米复合物在细胞穿透方面具有独特的性质。纳米颗粒mRNA疫苗的重要性和相关性超越了它们在预防传染病方面的应用。mRNA技术在解决其他疾病治疗方面也具有潜力，包括癌症免疫治疗、个性化医疗和遗传疾病的干预治疗。使用纳米颗粒快速设计和生产mRNA疫苗的能力证明了它具有应对新发传染病的灵活性，在疫情应对中是一笔宝贵的财富。本综述我们将全面概述纳米颗粒作为mRNA疫苗递送载体的功能。我们将介绍mRNA疫苗的定义、作用机制、传递系统、生产工艺和临床应用。通过阐明纳米颗粒mRNA疫苗的重要性和相关性，本综述还将致力于揭示疫苗开发的进步以及mRNA疫苗在传染病预防和其他治疗干预中的潜力。2.mRNA疫苗的发展这一部分将讨论不同类型的mRNA疫苗，阐述其作用机制以及提高mRNA疫苗安全性和有效性的不同方法。2.1.mRNA疫苗的分类基因疫苗的接种后免疫效果优于传统疫苗，例如重组蛋白和活病毒或灭活病毒疫苗。例如，DNA疫苗可以刺激体液免疫和细胞免疫。此外，与传统的疫苗相比，基因疫苗更容易实现大规模生产。mRNA疫苗有三种类型：传统mRNA疫苗、自扩增mRNA疫苗和跨扩增mRNA疫苗。传统mRNA含有非翻译区（5UTR、3UTR）和免疫抗原的编码区；因此，它被称为非扩增或非复制型mRNA。免疫反应与转录的mRNA数量成正比，由于其未扩增的行为可能导致需要反复施用mRNA，因此可能需要高剂量的mRNA。自我扩增mRNA疫苗是通过添加来自我复制RNA病毒的复制子而进行基因修饰的mRNA。自我扩增mRNA和跨扩增mRNA都具有5’端和3’端保守序列元件（CSE）。据推测，CSE除了能与病毒或细胞蛋白结合外，还可以调节病毒RNA合成。自我扩增mRNA和跨扩增mRNA之间的主要区别在于自我扩增mRNA具有非结构蛋白1-4（nsP 1-4）序列，而跨扩增mRNA需要同时递送两个RNA基因，即没有nsP 1-4编码序列的mRNA和有nsP1-4编码序列的mRNA。2.2.mRNA疫苗的作用机制的确，细胞中的mRNA是从细胞核中的基因组DNA转录而来，并且可以在细胞质中的核糖体上进行翻译以形成所需的蛋白质。最初，mRNA在RNA聚合酶的帮助下从基因组DNA转录为初级mRNA。初级mRNA包含外显子和内含子。此后，初级mRNA经过进一步的修饰转化为成熟mRNA，这些修饰包括剪接初级mRNA以去除非编码内含子、封闭5'UTR，并在3'端添加聚腺苷酸序列。在mRNA疫苗技术中，mRNA在体外合成，并经过注射和穿过细胞膜以在细胞质中进行翻译。在mRNA从细胞核（天然合成的mRNA）或从细胞膜（mRNA疫苗）转移到细胞质后，mRNA通过核糖体翻译成所需的蛋白质。在翻译过程中，poly-A尾与poly-A结合蛋白（PABP）结合，真核起始因子eIFs与5'UTR帽结合以启动翻译。核糖体然后翻译mRNA中翻译区（由三个核苷酸组成）的每个密码子，将其转化为氨基酸。从mRNA翻译的作用机制中可以知道，合成的mRNA疫苗中的5'帽、5'UTR、翻译区、3'UTR和poly-A尾等成分需要被核糖体识别，才能成功地将mRNA翻译成所需的抗原。与质粒DNA（pDNA）疫苗相比，使用mRNA疫苗的主要优势在于不需要像pDNA在翻译成所需蛋白质之前进入细胞核内并成功转录为所需的mRNA。体外合成RNA的递送存在几个生理障碍。阻碍RNA传递的主要障碍之一是穿越细胞膜并从内体中逃逸。因此，mRNA需要一种递送载体，这将在下一节（第3节）中详细解释。在传统mRNA中，开放读框（ORFs）编码抗原，可以翻译成感兴趣的抗原，例如病毒表位，从而诱发免疫反应，引起接种者被感染时对病原体的识别。图1说明了mRNA给药后免疫系统激活的机制。图1 mRNA脂质纳米颗粒疫苗的免疫激活机制。自扩增mRNA包含能在蛋白翻译之前RNA扩增所需的病毒复制序列如CSE和nsP 1-4，nsP1负责5’端帽状结构化病毒RNA，nsP2除了具有解旋酶和蛋白酶活性之外，还可以在复制过程中解开RNA双链。此外，nsP2可以裂解nsP 1-4多肽蛋白为其亚基（nsP1、nsP2、nsP3和nsP4） 。nsP3促进病毒和宿主蛋白之间的相互作用，而nsP4是一种RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp），催化RNA复制。自我复制后，自我扩增mRNA可以产生数个拷贝，这些拷贝将翻译成抗原，因而比传统mRNA引起的免疫反应更强。2.3.mRNA疫苗优化能够增强mRNA疫苗的稳定性、安全性和有效性的方法各有不同。修饰mRNA的非翻译区(UTR)对于增加其稳定性及其有效性起着至关重要的作用。尽管5'和3'UTR在mRNA翻译过程中没有翻译序列，但它们在改善mRNA的稳定性和从mRNA中表达蛋白质方面起着至关重要的作用。mRNA的5'帽和3'UTR中的poly(A)尾可以调节mRNA的翻译效率。例如，据报道，在5'UTR中修饰反义帽类似物可以增强mRNA翻译。这种翻译增强可能是由于修饰帽与核糖体中的真核翻译起始因子(eIFs)的结合力增加。此外，当在未成熟树突状细胞中转染时，将mRNA的帽转换为磷酸硫代酯基团可能改善mRNA疫苗的稳定性和表达。向mRNA中添加核苷酸可以改变疫苗的稳定性和翻译能力。据报道，在哺乳动物细胞中向mRNA中插入假尿苷与未修饰的mRNA相比，增加了翻译蛋白的产量，并减少了不希望的免疫原性反应。因此可以通过减少免疫原性反应和增加蛋白质表达来分别增强安全性和有效性。此外，将修饰的核苷酸整合到mRNA序列中可以减少或消除Toll样受体(TLRs)的激活，最终增强mRNA疫苗的安全性。3.mRNA疫苗递送系统本部分将介绍四种不同类型的材料，即聚合物、肽、鱼精蛋白和脂质，以及它们为了提高给药后的mRNA疫苗稳定性、有效性和安全性，作为裸mRNA的载体所各自拥有的递送系统。3.1.聚合物纳米颗粒聚合物通常起初是与聚乙烯亚胺（PEI）聚合物一起用于核酸的递送。然而，由于PEI存在高表面电荷密度和毒性，其应用受到了限制。因此，研究人员一直在探索替代递送方法，例如将低分子量PEI与聚乙烯基乙二醇（PEG）结合并把它与环糊精结合，这是一种有效且更安全的途径，并且可以通过不同的途径给药导致产生不同的抗体。新型的可生物降解的聚合物如聚(氨基酯)，有希望未来用于肺部mRNA递送。科学家已经开发出用于结构-功能研究的聚(氨基酯)库，这些库可以通过Michael反应制备。这些可生物降解聚合物可以容易地修饰主链和外围基团，而具有高胺密度的超支化树枝状球形树状大分子可以有效地形成mRNA复合物。然而，这些复合物存在电荷密度过大可能会伤害细胞并引起血清聚集的问题，但通过向其核心添加PEG或二硫键可以解决这些问题。使用pH响应性聚合物是另一种mRNA递送方法。这些聚合物能够在到达细胞质时由于细胞质内的pH不同而发生自我降解，进而释放出mRNA进入细胞。含有阳离子或两亲性胺基团的亲水性聚合物也可以通过静电结合mRNA，形成纳米复合物，将mRNA携带进入细胞。通常，像壳聚糖和PEI这样的高分子量聚合物需要经过修饰以改善其转染有效性和持久性。同时，mRNA的亲和力受到聚合物长度、电荷密度和混合物浓度的影响。3.2.肽纳米颗粒和蛋白纳米颗粒由于基于肽/蛋白质的生物纳米材料具有良好的生物相容性和相对易获得性，因此已被广泛应用于药物递送、疾病诊断和疫苗开发等领域。这种纳米材料一般具有20-200纳米的尺寸，是进行有效淋巴结定位的理想选择。在疫苗递送系统中使用自组装蛋白质载体是一种可靠且安全的方法，例如Wang等人报道称，通过将Pre-S1 HBV表面抗原与自组装的铁蛋白纳米粒子（NP-PreS1）结合，实现了具有治疗和预防双重属性的HBV疫苗接种。由于阳离子或两亲性胺基团（如精氨酸）的存在，两亲性肽可以与mRNA静电结合形成纳米复合物，进而帮助将mRNA递送到细胞中。内体的pH值可以改变具有重复精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸（RALA）基序的细胞穿透肽（CPP）的结构，从而促进膜和内体之间形成孔道，使mRNA进入细胞。此外，RALA可以激活T细胞介导的免疫应答并将mRNA转运到树突状细胞。最近一项关于两亲性CPP/mRNA复合物的研究表明，这些直径小于200纳米的复合物在小鼠结肠癌细胞中显示出显着的细胞摄取和蛋白表达。3.3.鱼精蛋白纳米颗粒鱼精蛋白是一种主要由带正电的氨基酸组成的阳离子蛋白。这种正电荷使其能够与核酸如RNA，形成复合物，从而保护生物系统免受核酸酶的降解，并增强其向目标组织的递送。由于鱼精蛋白复合物具有多种特性和临床安全性，因此在生物医学研究中作为药物递送纳米载体具有多种应用。鱼精蛋白递送系统的最重要特性是阳离子性质，这是由于精氨酸富含序列的存在增强了鱼精蛋白与任何负电荷分子（如mRNA）的复合物，因此，鱼精蛋白递送系统可以用于基于mRNA疫苗的设计。将利用半乳糖苷酶的鱼精蛋白-mRNA复合物注射到胶质母细胞瘤组织中，以评估mRNA 鱼精蛋白复合物的可行性。研究表明，鱼精蛋白保护的mRNA会导致肿瘤生长显着减少并最终消失，并且在肿瘤内注射稳定mRNA后产生记忆抗肿瘤免疫应答。此外，鱼精蛋白与CureVac的自我佐剂RNActive®递送技术结合使用，以形成mRNA复合物，从而开发出狂犬病和流感A疫苗。应当注意的是，与其他常用的转染试剂（例如聚乙烯亚胺（PEI）聚合物）相比，鱼精蛋白一直被用于改善复合核酸的转染效率，并且未检测到浓度高达10mM时的细胞毒性，而其他转染试剂在剂量超过5mM时会引发体内毒性作用。最近，为了制备稳定良好的疫苗，鱼精蛋白在mRNA递送方面的应用已经增加并且预计将开展更多的研究。3.4.脂质纳米颗粒(LNPs）LNPs是一种智能的、纳米级的脂质载体，用于将mRNA转运到细胞质中。这些颗粒纳米载体可以通过与早期内体脂质双层融合有效地将mRNA递送到细胞内，并保护mRNA在系统循环中免于被RNA酶降解。LNPs已被用于开发已获得临床批准的SARS-CoV-2 mRNA疫苗。对于mRNA给药，LNPs提供了许多优势，如配方简单、可定制、具有生物相容性以及高mRNA负载能力。LNPs通常由三种主要成分组成：可电离的脂质（40-50%）、胆固醇（38-45%）和辅助磷脂（10-12%）。在某些情况下，会添加第四种成分，例如聚乙二醇化脂质即PEG脂质（1-2%），如图2所示。这些成分共同作用，包装和保护裸露的mRNA。第一批携带RNA的脂质是阳离子DOTMA [1,2-二油基-3-三甲基氨基丙烷]及其合成等效物DOTAP [1,2-二油酰-3-三甲基氨基丙烷]，这两者在1989年被发现。从那时起，许多其他的阳离子脂质，如被广泛使用的Lipofectamine，也被用于RNA递送。图2 核酸递送系统LNPs的主要成分。阳离子脂质两亲物已被创造并评估为核酸的载体。阳离子脂质与天然脂质具有相似的分子结构，只是包含阳离子头部基团而不是天然脂质的两性离子或阴离子头部基团，阳离子头部基团由一个连接基团将极性基团和疏水基团相连而形成，并且带正电荷。相比之下，疏水基团包含两个烷烃链或胆固醇基团。由于阳离子脂质具有正电荷表面，可以与负电荷细胞表面结合，促进LNPs渗透进入细胞，因此更适合用于药物递送应用。LNPs被用于递送针对COVID-19、流感和结核病的mRNA疫苗和药物。当可离子化的脂质在生理pH水平下引入血流时，它们呈中性电荷，这提高了它们的安全性，并且与其他脂质相比延长了血液循环时间。这些可离子化的脂质在酸性溶液中与mRNA结合，形成纳米颗粒，其中带正电的脂质吸引RNA。此外，由于内体的酸性环境，它们容易与内体膜融合，将mRNA释放到细胞质中。第一批用于RNA运输的可电离脂质是DODAP（1,2-二油基-3-二甲基氨基丙烷）和DODMA（1,2-二油氧基-3-二甲基氨基丙烷）。用于mRNA递送的另一种可电离脂质是DLin-MC3-DMA，用于包封siRNA时具有高效性和安全性。由于微流体学这项革命性技术的出现，mRNA递送科学可能会发生转变。微流体设备预计将用于制造用于药物和疫苗的LNPs，使用频率随着技术的进步增加。通过微流体学实现mRNA装载到LNPs中，这包括精确控制mRNA和LNP成分的混合，并使mRNA很好包封在LNP内。此外，微流体学能够制造具有均匀粒径分布的LNPs，这对于有效地将mRNA递送到细胞中至关重要。制备装载mRNA的LNPs的典型程序包括将mRNA溶解在低pH水性缓冲液（pH~4.0）中，并通过微流体学将它们与疏水性脂质的乙醇溶液混合形成稳定的LNPs，具有低的多分散指数。这些LNPs最初含有25-50%乙醇和低pH；因此，它们需要进一步通过膜过滤进行透析和缓冲液交换以获得最终的大批量产品。该产品可以通过0.2um无菌级过滤器过滤灭菌，然后填充到无菌容器中。成品药物产品可以是冻干或直接填充的形式。4.mRNA疫苗应用针对包括传染病和个体差异性癌症疫苗的不同疾病，mRNA疫苗已被广泛研究和开发。随着mRNA修饰和递送技术的不断发展，mRNA疫苗的潜在应用预计将进一步增加。4.1.针对传染病的mRNA疫苗mRNA疫苗的开发工作原本长期以来一直处于初级阶段，但COVID-19大流行已经加速了研究工作，促使人们对预防传染病mRNA疫苗的可能性产生了重大兴趣。最突出、最广泛使用的例子是辉瑞-生物技术公司(Pfizer-BioNTech)和莫德纳(Moderna)公司的COVID-19疫苗，它们编码SARS-CoV-2的刺突蛋白来刺激机体针对病毒的免疫反应。mRNA疫苗编码刺突蛋白的抗原或其受体结合域，从而保护感染者免受这种危及生命的感染。2020年末，美国食品和药物管理局(FDA)批准了第一批针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗，即辉瑞-BioNTech疫苗(BNT162b2)和Moderna疫苗(mRNA-1273)。这两种疫苗都是使用含有可电离脂质的LNPs包封mRNA而成。两剂量的BNT162b2证明在预防住院方面的有效性为87%，预防有症状COVID-19的有效性为94%，总体上预防COVID-19的有效性为95%。研究表明BNT162b2和mRNA-1273的一次和加强免疫对SARS-CoV-2止的有效性为90%。需要注意的是，Moderna疫苗在4-8℃下储存一个月后仍显示出良好的安全性和有效性，而辉瑞-BioNTech疫苗需要-60℃的储存条件。目前正在开发几种针对传染病（如流感、寨卡病毒、巨细胞病毒和狂犬病）的mRNA疫苗。最近的一项研究开发了一种基于LNP的疫苗，由编码流感A和B病毒血凝素抗原的20个谱系组成，以保护机体免受同源和异源易变异病毒感染。4.2.针对癌症的mRNA疫苗mRNA癌症疫苗的作用靶点取决于肿瘤抗原，以刺激细胞免疫。肿瘤抗原分为肿瘤特异性抗原（TSA）和肿瘤相关抗原（TAA），其中TSA仅表达于肿瘤细胞，而TAA则可在正常或肿瘤细胞都表达。BioNTech正在开发的mRNA癌症疫苗FixVac BNT111是针对四种黑色素瘤TAA的典型代表，4种TAA包括酪氨酸酶、黑色素瘤抗原家族A3（MAGE A3）、纽约食管鳞状细胞癌1（NY-ESO-1）和跨膜磷酸酶与张力同源物（TPTE）。根据一项临床前研究，BNT111在I / II期临床试验中显示出对肿瘤的有效免疫反应，其中75％的患者在接受八次注射后至少对一种TAA产生免疫反应，且CD8+ T细胞在T细胞免疫反应中起关键作用。针对个体患者肿瘤特异性突变的BNT112和BNT113（即个体化疫苗）是mRNA疫苗另一类代表，它们靶向五种前列腺癌特异性抗原（PAP、PSA和三种未公开的抗原）和HPV16衍生的肿瘤抗原（HPV16 E6和E7癌蛋白）。此外，BNT122是一种组合疫苗，旨在编码个体肿瘤突变和一组个性化的预制造非突变共享肿瘤相关抗原（BNT114），目前正在进行临床试验评估其在治疗各种类型癌症中的安全性、耐受性和疗效。不同的疫苗候选者被用于治疗多种类型的癌症，如黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌等。5.mRNA疫苗临床试验mRNA疫苗可以用于控制多种危及生命的疾病传播，例如预防传染病和治疗癌症，这种类型的疫苗也可应用于免疫疗法。然而，目前预防传染病是mRNA疫苗主要布局领域，在所有正在进行的mRNA疫苗试验中占比约为70%。在COVID-19大流行和mRNA疫苗的成功推出之后，近年来基于mRNA的疫苗的临床试验数量显著增加。FDA最近批准了两种针对COVID-19的快速反应mRNA疫苗，这一项卓越的成就促进更多基于mRNA的疫苗进入临床试验，用于不同的医学应用。针对传染病的mRNA疫苗通常以一次性注射的方式给药，被免疫和非免疫细胞摄取后翻译成抗原。许多针对传染病和癌症的mRNA候选疫苗已经进入临床试验阶段，其中最常见的例子如表1所示。2015年的寨卡病毒感染是全球健康危机出现的传染病之一。这种感染导致轻度至重度症状，如发烧和疲劳，可能在怀孕期间发展为胎儿死亡。已经证明，针对任何寨卡病毒株的抗原（即prM-e蛋白）的免疫可以预防寨卡病毒引起的所有感染，因为该疾病是由单一血清型引起的。将编码寨卡病毒结构基因的优化mRNA封装到基于脂质纳米颗粒载体中是生产mRNA寨卡疫苗的多功能平台。使用编码寨卡病毒-E基因的优化mRNA疫苗的初次-加强疫苗免疫后，会产生病毒样颗粒，进而导致寨卡病毒中和抗体（nAbs）水平升高，从而保护免疫功能低下和免疫功能低下的小鼠。因此， mRNA寨卡疫苗接种诱导了针对寨卡病毒的保护性抗体反应。据报道，由携带prM-E mRNA的LNP组成的30μg或50μg mRNA疫苗产生的中和抗体是传统灭活病毒疫苗诱导的中和抗体的50-100倍。利用mRNA平台作为寨卡病毒候选疫苗显示出对寨卡病毒的强大中和抗体反应，为快速预防寨卡病毒感染提供了概念验证。尽管这种疫苗有效，但它的设计很差，会通过产生交叉反应抗体来激活登革热病毒感染反应。在一项临床试验中，新的寨卡病毒疫苗是由莫德纳公司通过将E蛋白中的突变融合环表位插入优化prM-E mRNA（mRNA-1893）中开发的。使用这种基于mRNA的疫苗的小鼠免疫结果显示出对寨卡病毒的保护作用，而没有产生登革热增强抗体。mRNA疫苗的关键优势之一是成功地同时靶向由不同蛋白质诱导的病毒感染。例如，Moderna设计的巨细胞病毒（CMV）疫苗（mRNA-1647）包含六种不同mRNA序列的混合物，一种编码CMV糖蛋白B（gB），另外五种编码五种不同蛋白质，形成五聚体蛋白质。莫德纳公司已经对一种编码灌注F蛋白的新候选疫苗（mRNA-1345）用于接种儿童预防呼吸道合胞病毒（RSV）进行了评估。该产品已配制成脂质纳米颗粒LNP，目前正处于临床试验2期和3期之间的阶段。一段编码全长刺突蛋白的未修饰的mRNA序列包封在脂质LNPs后形成了针对COVID-19的CureVac疫苗候选物(CVnCoV)。该疫苗候选物冰箱中放置三个月过程中显示出了良好的稳定性。两剂量的CVnCoV显示出与从COVID-19恢复者相似的中和抗体水平。尽管该疫苗候选物具有良好的性质，但临床试验结果表明CVnCoV针对COVID-19的有效性仅为约47%。Arcturus Therapeutics 公司生产了一种装载到LNP中的自我扩增mRNA疫苗候选物(ARCT-021)，该疫苗候选物编码完整长度的刺突蛋白。接种一剂ARCT-021疫苗就能通过提高体内IgG滴度和激发强烈的T细胞反应，有效保护接种小鼠免受SARS-CoV-2的感染，实现了单次接种后的完全免疫。除了传染病之外，癌症也是基于mRNA的制剂可以靶向和控制的主要疾病之一。开发了几种候选疫苗来治疗多种癌症类型，如黑色素瘤和癌症。BNT122是BioNTech公司和Genentech公司合作开发的产品之一，具有良好的安全性。它含有约20种特定患者的新表位，用于静脉注射（I.V.）治疗皮肤癌症（即黑色素瘤）。另一种基于mRNA的癌症个性化疫苗是mRNA-4157，其在单个mRNA链中编码多达34种新抗原。mRNA-4157疫苗是由莫德纳公司和默克公司合作开发的，采用肌肉注射（I.M.）给药，由脂质递送载体包封mRNA形成。与单独使用pembrolizumab作为高危黑色素瘤切除患者的辅助治疗相比，个性化的基于mRNA的癌症疫苗（mRNA-4157）与单克隆抗体化疗pembrolizhumab（Keytruda）联合使用提高了患者的无复发生存率（RFS）。如前一节所述，BNT111是一种癌症候选疫苗，靶向通常在肿瘤细胞表面表达的肿瘤相关抗原TAA。这种mRNA疫苗可以表达出四种不同的黑色素瘤相关抗原，以此提高靶向效率。BNT111通常单独通过静脉注射给药，或与赛尼哌联合给药以提高治疗黑色素瘤的疗效，赛尼哌是由再生元和赛诺菲共同开发的一种抗PD-1单克隆抗体。临床2期试验评估了BNT111与西米普利单抗联合使用，作为单药治疗抗PD1难治性/复发性不可切除的III期或IV期黑色素瘤患者的疗效。根据风险因素，在难治性或复发的情况下，存活期可能短至六个月。高达50%的患者在接受检查点抑制剂治疗后病情进一步发展。重复剂量的BNT111疫苗接种通过增加患者血浆中IFN-y、IFN-α、IL-6、TNF-α和其他细胞因子的分泌，诱导了对抗原的免疫反应。此外，CV9202是CureVac公司开发的靶向非小细胞肺癌的候选疫苗，由六种编码不同抗原的mRNA组成。mRNA也可以用作免疫疗药物，主要用于抗癌。在临床试验中研究了几个基于mRNA的候选药物，表明在免疫疗法中使用这种先进技术的巨大潜力。在表1中，对四种产品（BNT141、BNT311/GEN1046、BNT312/GEN1042和BNT211）进行了癌症有效免疫治疗的研究。BioNTech开发的BNT141产品通过靶向表达CLDN18.2的细胞，对不同类型的癌症都有效，如非小细胞肺癌癌症、胃食管交界腺癌、转移性癌症、癌症、癌症胆囊、癌症胰腺癌、胆道癌症、结直肠癌癌症和黏液性卵巢癌。BNT311/GEN1046和BNT312/GEN1042是mRNA免疫治疗药物，含有分别靶向PD-L1×4-1BB和CD40×4-1BB的双特性抗体。据报道，BNT311/GEN1046和BNT312/GEN1042可以刺激T细胞的增殖、细胞因子的分泌和抗肿瘤活性。这两种免疫治疗候选药物在给药后在外周血中表现出药效学免疫效应，表明其可用于治疗晚期难治性实体瘤患者。BNT211是BioNTech生产的另一种免疫治疗候选药物，可以通过靶向肿瘤特异性抗原Claudin-6（CLDN6）发挥作用。该疫苗的治疗表现出高达86%的疾病控制率和43%的总反应率。与mRNA疫苗给药相关的其中一个主要关注点是免疫接种后可能引发的严重不良事件（例如，过敏性反应）。据报道，辉瑞-BioNTech和Moderna的抗COVID-19 mRNA疫苗引起的过敏性反应是传统疫苗的2-4倍。抗体可能针对mRNA纳米递送载体或mRNA分子本身产生，从而促进严重的免疫反应，因此优化纳米载体的成分并对mRNA进行分子修饰是避免或减少不良反应的关键步骤。美国疾病控制和预防中心（CDC）建议，对辉瑞-BioNTech或莫德纳疫苗有过敏反应史的人应避免接种其他基于mRNA的疫苗。在低收入国家，保护免受传染病侵害是这些国家面临的最重大挑战。疫苗行业以及mRNA疫苗制造行业中需要解决的一个主要问题是提供某些储存条件，如-20℃。因此，需要开发一种可以在室温下稳定保存的耐热疫苗，以增强全球对mRNA疫苗的接种。最后需要注意的是，疫苗的出现使过去几十年间世界上几种致命的传染病得到根除，然而一些反疫苗运动也在传播不正确的信息，这些疾病又卷土重来。表1：进入临床试验的mRNA疫苗（截至2023年6月1日）6.mRNA疫苗的未来应用新冠肺炎mRNA疫苗的成功研发促进mRNA未来开发的创新，这些创新不仅可以产生具有更强表达和出色稳定性的下一代mRNA，还能提高临床前研究中mRNA递送的效率，从而加速其临床转化。6.1.mRNA疫苗开发中的未来考虑6.1.1.mRNA疫苗应用的多种形式自我扩增mRNA包括α病毒来源的复制子，其可以扩增编码表达蛋白的序列，因此需要的剂量比大多数传统非复制mRNA低得多。由于整合了额外的复制子基因，并且核苷酸修饰在复制过程中不适用，因此自我扩增mRNA比传统mRNA更具有重要意义。目前正在对几种候选者进行临床试验评估。基于自我扩增mRNA的SARS-CoV-2疫苗已经在动物中显示出诱导高水平的中和抗体。这些疫苗可以以较小的剂量（从1到10克）接种，低于已有SARS-CoV-2疫苗的非复制mRNA剂量（从30到100克）。环状信使RNA（circ.mRNAs）是结构为环状的单链RNA，通过后拼接过程产生。最近的研究表明，某些circ.mRNAs的蛋白质编码功能在蛋白质翻译中应用前景非常广阔，由于缺乏核酸外切酶降解过程所需的末端基序，circ.mRNAs比线性mRNAs具有更出色的稳定性。与未修饰的线性mRNA相比，环状RNA引起的免疫反应更少。与线性mRNA疫苗相比，circ.mRNA疫苗引起更多显著的中和抗体。公司正在研究circ.mRNAs的其他变体，包括优化的内部核糖体进入位点（IRES）。6.1.2.mRNA的理想递送系统LNP被认为是最常见的mRNA递送系统之一。非LNP系统，如类似逆转录病毒的蛋白PEG10，由于免疫刺激和毒性最小，具有mRNA递送潜力。EntosPharma公司创建了一个应用低毒性相关小跨膜（FAST）蛋白和中性脂质融合的蛋白脂质载体（proteo-lipid）平台，以将mRNA直接递送到细胞质中。来自相分离肽的还原响应凝聚体和pH值实现了mRNA在细胞质中对细胞的直接递送和还原响应的mRNA释放。为了提高LNP的效力，人们继续进行着各种目的的LNP创新研发。杂环类脂、不饱和脂质和炔脂可以改善LNP的效果。同时，其通过巯基或双磷酸基团进行结构修饰可以靶向地将mRNA作用于粘液或骨骼。具有两亲性的单组分可离子化树突状分子Janus可以有效地将mRNA递送到各种组织中，这表明现有的四组分LNP系统可能会简化。生物相容性载体由生物膜制成，可创建新的mRNA递送平台。不同的生物膜载体系统，包括细胞膜的囊泡、细菌外膜的囊泡和细胞外囊泡（如外泌体），已被用于在体内和体外环境中递送治疗性mRNA。例如，治疗实体瘤的Codiak BioSciences公司已经开始利用工程化外泌体的现有疗法进行人体试验。外泌体mRNA疫苗在小鼠体内比LNP载体刺激了更多的IgG和分泌型IgA。与现有平台相比，外泌体因其较低的免疫原性和毒性而被认为是一种有前景的mRNA递送平台。因此，它们是临床试验中多种mRNA给药的理想选择。为了扩大mRNA疗法在各领域的应用，已经实现了器官或细胞特异性mRNA的递送。为了将mRNA递送到小鼠的肺、脾或肝，已经开发了器官选择性靶向纳米粒子（OSTN）平台。通过新版OSTN平台含可电离磷脂膜的特性，mRNA递送的效率明显提高。另外的给药方法包括将mRNA纳米颗粒靶向递送至膀胱，口服靶向至消化道的机器人药丸，或经吸入靶向至肺。通过研发优化的LNP或聚合物纳米粒子药物，旨在实现mRNA向特定细胞类型的靶向递送和利用细胞特异性配体。随着研究的深入，这些靶向器官或细胞的mRNA递送系统将扩大mRNA疗法所能治疗的疾病范围。6.1.3.mRNA的给药途径与储存注意事项寻找mRNA的不同给药途径可以为其开辟更多新应用。已有研究表明使用超支化的聚β-氨基酸酯（hPBAEs）纳米制剂可通过吸入给药将mRNA递送到肺部，导致小鼠肺部荧光素酶蛋白的高表达。鼻内接种方式可以触发针对呼吸道感染的黏膜免疫反应，使其成为COVID-19疫苗给药的有前景的方法。由于其非侵入性、患者自理特征以及快速实施潜力，口服给药已成为疫苗给药的极佳替代途径。BioNTech公司与Matinas BioPharma公司合作，近期开发了一种潜在的新型口服脂质纳米晶体mRNA疫苗，该疫苗利用钙离子与阴离子磷脂相互作用形成脂质纳米晶体，从而将mRNA活性药物分子装载到纳米晶体层中。mRNA的热稳定性在开发mRNA新应用中发挥关键作用。CureVac开发的候选疫苗CVnCoV疫苗在5℃下可以保存至少3个月；室温条件下用于接种时，有效期为24h。但不幸的是，在临床2b/3期试验中，CVnCoV对COVID-19的疗效仅为47%。最近，CureVac针对第二代候选疫苗CV2CoV进行了优化，与CVnCoV相比，CV2CoV的蛋白翻译和免疫原性均有所提高。体内研究表明，CV2CoV表达的蛋白比CVnCoV更多，并诱导大鼠产生高水平的针对SARS-CoV-2变异株（B.1.1.7、B.1.1.298和B.1.351）的交叉中和抗体。6.2.mRNA疫苗的未来新颖和多功能疗法6.2.1.用于预防传染病的mRNA疫苗mRNA疫苗已在传染病、癌症、遗传病和再生医学等多个领域得到应用。mRNA疫苗已在COVID-19病毒感染预防中表现出显著的有效性和安全性，目前正在针对包括流感、寨卡病毒、狂犬病、HIV和结核病在内其他病原体进行开发。mRNA疫苗通过将编码特定抗原的mRNA递送到接种者细胞中，利用细胞表达抗原并将其呈递给免疫系统，mRNA疫苗可以诱导保护性免疫。此外，mRNA疫苗可以设计为靶向多种抗原或病原体株，以提高其有效性和对变异株及合并感染的抵抗力。6.2.2.用于癌症治疗的mRNA疫苗mRNA疗法可将肿瘤相关抗原、免疫调节因子或基因编辑组件递送到肿瘤患者体内，以刺激抗肿瘤免疫反应或纠正遗传缺陷。肿瘤相关抗原是肿瘤细胞而非正常细胞表达的蛋白质，免疫系统可识别其为外来抗原。免疫调节剂如细胞因子、检查点抑制剂和共刺激分子可刺激或抑制免疫反应。基因编辑组件包括Cas9（CRISPR）、转录激活剂样核酸酶（ETALN）和锌指核酸酶（ZF）等效应物。mRNA疗法可诱导肿瘤细胞死亡、激活免疫细胞、或通过将编码这些分子的mRNA递送到肿瘤细胞或免疫细胞中来调控肿瘤抑制基因或癌基因表达。6.2.3.用于遗传性疾病治疗的mRNA疫苗mRNA疗法可以取代或补充遗传性疾病中缺失或功能异常的蛋白质或基因，例如血友病、囊性纤维化和肌肉萎缩症。血友病是一种由凝血因子编码基因突变引起的出血性疾病。囊性纤维化跨膜调节因子（CFTR）编码基因中的任意突变会导致肺病，即囊性纤维化。肌肉萎缩症是由编码肌营养不良蛋白的基因突变引起的肌肉疾病。通过将编码这些蛋白质或基因的mRNA递送到病变细胞或组织中，mRNA疗法可以恢复其正常功能并缓解疾病症状。6.2.4.mRNA疫苗在再生医学中的应用在再生医学中，mRNA疗法可以诱导细胞的多能性、分化或重编程，以进行组织修复或器官移植。多能性是指细胞分化成机体所有类型细胞的能力。细胞针对特定功能进行特化称为分化。重编程是指将细胞从一种类型转化为另一种类型。mRNA疗法可通过递送可影响多能性、分化或重编程过程的转录因子、生长因子或信号分子等编码因子的mRNA，从体细胞（如成纤维细胞或血细胞）生成多功能性干细胞（PSCs）、分化细胞（心肌细胞或神经元）或重编程细胞（诱导多功能性干细胞或诱导神经元）。6.3.mRNA疫苗的优点和验收标准与依赖于弱化或灭活的病毒或其成分来诱导免疫的传统疫苗相比，mRNA疫苗在以下几个方面具有优势：6.3.1.生产速度一旦目标抗原的基因序列被确定，mRNA疫苗就可以被迅速设计和合成。这使得针对新出现的传染病（例如COVID-19）能够做出更快的反应；6.3.2.规模化生产mRNA疫苗可以使用经济高效的标准化技术（例如无细胞转录和纯化）大规模生产；6.3.3.安全性mRNA疫苗不包含传染性病原体或其成分，因此它们不会导致原本要预防的疾病。此外，它们不会干扰细胞功能或整合到宿主基因组中；6.3.4.多样性mRNA疫苗可以经过修饰以表达不同的抗原或抗原组合，从而能够开发针对多种病原体多价或通用疫苗。此外，mRNA疫苗也可以进行修饰以改善其稳定性、递送效率、免疫原性和特异性；6.3.5.有效性在临床试验中，mRNA疫苗已显示出对COVID-19的高度保护作用，有效性从94%到95%不等。此外，它们同时诱导体液免疫和细胞免疫反应，这对于长期免疫和防止变异株出现至关重要。6.4.mRNA疫苗的缺点和挑战对mRNA疫苗局限性的更深入理解，将无疑有助于未来设计更安全、更有效的mRNA疫苗。这些局限性包括以下几点：6.4.1.mRNA的稳定性酶和温度波动可以降解mRNA分子，从而限制其保质期和储存条件。mRNA疫苗需要超低温储存和专门的运输设备，这带来了物流方面的挑战并增加了成本。提高mRNA分子的热稳定性以及开发能够耐受更高温度的制剂对未来的mRNA应用至关重要。6.4.2.mRNA的递送在递送过程中，mRNA分子应受到保护以避免被酶降解并高效转运至目标细胞。将它们包裹在保护性载体中如脂质纳米颗粒LNPs、聚合物纳米颗粒或脂质-聚合物混合纳米颗粒，可以保护mRNA免于降解，增强其被细胞摄取和释放，以及调节其免疫原性。然而，LNPs也能导致不良反应，如炎症、过敏反应和免疫反应。6.4.3.可及性和接受程度mRNA疫苗生产过程的可及性和接受程度也是需要着重考虑的因素。mRNA疫苗制造需要标准化和高品质的原材料，如核苷酸、酶和脂质，以及用于合成、纯化和制剂的专门设备和设施。这些要求给mRNA药物的批量生产和分发带来了技术和物流方面的障碍。一些人群可能会由于误解、不信任和伦理方面的担忧而拒绝接种mRNA疫苗。6.4.4.变异mRNA疫苗被设计用于靶向一种特定抗原，例如SARS-CoV-2的刺突蛋白。然而，由于RNA病毒通常具有较高的突变率，它们会随着时间的推移而发生演变。这种突变可能会影响病毒的特性，例如其传播能力和病情严重程度。此外，变异株可能含有会改变与关键宿主成分的相互作用的突变。值得注意的是，选择压力能造成突变，使变异株能够逃避适应性免疫反应。6.4.5.免疫原性新的研究数据表明体液免疫和细胞免疫在保护人体免受病毒感染方面的重要性。mRNA疫苗可以诱导固有免疫系统调节抗原特异性免疫反应。然而，有关疫苗实测方法以及mRNA疫苗提供的保护持续时间描述的信息仍然不足。其他人类冠状病毒的经验表明，如果免疫反应减弱，再感染是可能的。目前仍然缺乏能够准确模拟人类免疫反应的动物模型。研究人员必须继续在人体试验中证明mRNA疫苗的临床疗效。6.4.6.群体间的差异免疫系统与固有免疫和适应性免疫相关联，监测接种人群的保护性免疫是确定疫苗效果的关键因素。身体状况、性别、年龄和遗传变异也可能影响疫苗的有效性。许多国家测试技术资源有限，难以量化个人感染的真实风险。世界卫生组织（WHO）的最新数据发现，SARS-CoV-2病毒主要在年轻人之间传播，40岁以下的人更容易感染。基于mRNA的抗病毒疫苗与传统疫苗相比具有显著优势，但对于不同人群接种效果方面仍存在争议。必须开展更多研究以了解多个个体的接种状况。了解造成mRNA疫苗效果个体差异的机制将有助于推动mRNA疫苗的发展。6.4.7.不良反应对于任何疫苗而言，接种后都有可能出现轻度到中度的副作用。有些严重的副作用也有可能发生，引起了人们的恐惧和焦虑。理论上，mRNA疫苗比其他类型的疫苗更安全，因为其生产过程中不涉及传染性病毒，且降低了毒力回复和插入突变的危险性。但由于受试者数量较少，临床试验可能本质上无法评估疫苗的安全性，因此需要全面和长期的疫苗安全监测。通过分析数据发现，并不是所有接种后的直接反应都是由mRNA本身引起，疫苗成分如赋形剂、非活性成分和脂质体传送载体都与过敏反应有关。研究表明不良反应的发生与剂量有关，但剂量是否影响不良反应的发生仍有待研究。此外，个体间固有免疫系统的差异也不容忽视。目前，mRNA疫苗安全性的评估受到接种个体样本量、比较组、随访时间、年龄、性别和种族/民族背景的限制。进一步研究接种疫苗与相关不良事件之间的关联实现了对mRNA候选疫苗的安全性进行更全面的评估。最后，继续开展公众教育和沟通对于提高对mRNA疫苗安全性和有效性的认识和信心至关重要，这有助于改善全球健康状况并挽救数百万人的生命。7.结论本综述文章强调了mRNA疫苗在彻底改变传染病预防和治疗干预措施中的重要作用。传统疫苗平台在可扩展性、开发速度和适应新病原体的能力方面存在局限性，而mRNA疫苗提供了一个有针对性地进行疫苗开发的通用且快速的平台。mRNA疫苗的模块化性质使其容易适应于不同的病原体，而其快速生产能力为应对任何可能出现的传染病提供了灵活性。然而，mRNA分子的有效递送构成了一个挑战，通过使用纳米颗粒作为输送系统解决了递送问题。脂质纳米颗粒LNPs已成为mRNA疫苗输送的主要纳米颗粒类别，可提供mRNA保护、有效的细胞摄取以及mRNA有效载荷的受控释放。本综述讨论的关键点包括不同类型mRNA疫苗的介绍、作用机制以及在开发过程中所需优化的环节。mRNA疫苗的临床试验特别是在COVID-19背景下进行的试验，均显示出良好的安全性和有效性。从这些试验中吸取的经验教训将为未来的研究和发展努力提供指引。mRNA疫苗的未来应用不仅限于传染病预防，还可能在癌症免疫疗法和解决遗传性疾病等医疗领域发挥潜力。本文还概述了针对不同疾病的mRNA疫苗的优势和局限性，以及需要克服的挑战。简而言之，mRNA疫苗为未来传染病和癌症防治提供了令人兴奋的可能性。mRNA疫苗具有的灵活性、适应性和快速生产能力使它们成为疾病预防和治疗干预的有价值工具。仍需要进一步研究探索其充分潜力、解决挑战并针对不同疾病情况优化使用。未来建议重点研究改善疫苗设计、输送系统和生产工艺。了解mRNA疫苗产生的免疫反应的长期安全性和持久性至关重要。此外，探索将mRNA疫苗与其他免疫治疗策略结合可以进一步提高其有效性。继续在mRNA疫苗领域进行研究与合作，将为创新性的疾病预防和治疗解决方案铺平道路。参考资料：Al Fayez N, Nassar MS, Alshehri AA, Alnefaie MK, Almughem FA, Alshehri BY, Alawad AO, Tawfik EA. Recent Advancement in mRNA Vaccine Development and Applications. Pharmaceutics. 2023 Jul 18;15(7):1972. doi: 10.3390/pharmaceutics15071972. PMID: 37514158; PMCID: PMC10384963.
信使RNA疫苗免疫疗法
2023-08-29
摘要患者对信使核糖核酸(mRNA)疫苗表现出良好的耐受性，编码分子的选择是灵活多样的。这些疫苗可以被设计成表达包含多个表位的全长抗原，而不受主要组织相容性复合体(MHC)的限制，相对容易控制，并且可以快速批量生产。美国食品药品监督管理局(FDA)于2021年批准了辉瑞和BioNTech生产的首个基于mRNA的新型冠状病毒病(COVID-19)疫苗，引发了mRNA疫苗研发热潮。基于上述特点和mRNA疫苗的发展，尤其是近五年来，mRNA肿瘤疫苗已成为研究热点，发展迅速。本文从抗原/靶点的选择和表达、载体和佐剂的应用、不同给药途径和临床前评价等方面对mRNA肿瘤疫苗的研究进展进行了分析，以反映mRNA肿瘤疫苗的发展趋势和面临的挑战。关键词：mRNA，癌症疫苗，肿瘤相关抗原，新抗原，mRNA递送载体，佐剂，给药途径。1.mRNA疫苗和mRNA癌症疫苗1961年，Brenner等人首次发现mRNA，它是基因作为蛋白质表达所必需的关键中间分子，含有与氨基酸(蛋白质的基本单位)相对应的密码子信息。1990年，Wolff等人首次证明，通过肌肉注射编码相应蛋白的纯RNA，可以在小鼠体内有效表达特定蛋白[如氯霉素乙酰转移酶和荧光素酶(Luc)]；具体来说，βgLucβgAn RNA的蛋白表达以剂量依赖性和时间依赖性的方式发生；这项工作还提出了mRNA疫苗的概念。2020年，美国食品和药物管理局(FDA)紧急批准了Pfizer--BioNTech/BNT162b2和Moderna/mRNA-1273生产的两种基于mRNA的疫苗，用于预防2019年冠状病毒病(COVID - 19)。2021年，美国食品药品监督管理局(FDA)批准了Pfizer-BioNTech(上市名称为Comirnaty)生产的首个COVID-19疫苗，激发了mRNA疫苗的研发热情，并对mRNA癌症疫苗的突破产生了期待。迄今为止，研究人员已将mRNA用作疫苗平台[例如流感病毒、人类免疫缺陷病毒、冠状病毒、病毒抗原(狂犬病病毒糖蛋白、寨卡病毒和委内瑞拉马脑炎病毒的蛋白质)，细菌病原体(结核分枝杆菌)和癌症]和蛋白质替代平台(例如factor IX、卵泡抑素、鸟氨酸经甲氨基甲酰基酶和促红细胞生成素)，用于疾病的预防和治疗。mRNA疫苗具有许多共同特征。与质粒脱氧核糖核酸(DNA)和病毒载体存在因基因插入和/或感染而导致突变的风险不同，mRNA进入细胞质后可直接翻译成蛋白质；因此，mRNA疫苗是非整合的、非传染性的、耐受性良好的。mRNA也在细胞中短暂表达，允许重复接种。mRNA转录物中编码单位的选择是灵活多样的，允许编码抗原和免疫调节分子来诱导和调节适应性和先天免疫应答，并且含有多个表位的编码全长抗原可以由MHC Ⅰ类(MHC-Ⅰ)和Ⅱ类(MHC-Ⅱ)分子呈现，而不受MHC限制。体外转录(IVT) mRNA的生产不需要细胞，防止了蛋白质或病毒的污染，并允许快速、经济和容易的大规模生产。mRNA癌症疫苗利用编码肿瘤抗原或免疫调节分子的mRNA递送相应的蛋白，结合相关的递送载体和佐剂，诱导抗肿瘤应答。图1显示了mRNA癌症疫苗的发展时间表。抗肿瘤T细胞是介导这些疫苗治疗效果的主要预期效应细胞，图2总结了抗肿瘤T细胞产生和作用的机制。RNA在疫苗位点被DCs摄取，翻译并加工成抗原MHC Ⅰ/Ⅱ复合物并呈递到细胞表面。活化的DCs到达引流淋巴结，呈递的抗原MHC Ⅰ/Ⅱ复合物与淋巴结内分化簇8 (CD8)+/CD4+ T细胞(第一信号)表面的T细胞受体(TCR)结合，导致T细胞活化和增殖，共刺激信号分子[如CD80/CD86, OX40配体(OX40L)]与受体(如CD28, OX40)在T细胞(第二信号)和细胞因子[如干扰素(IFN) I，白细胞介素12 (IL-12)， IL-1]与T细胞上的细胞因子受体结合(第三信号)。此外，CD4+ T细胞分泌的IL-2可促进CD8+ T细胞扩增。活化的T细胞在趋化因子[如CC -趋化因子受体7，CC -趋化因子配体(CCL) 5，CXC -趋化因子配体9/10]的作用下向肿瘤组织迁移并浸润，最大限度地发挥其分泌的效应器[如IFN-γ、肿瘤坏死因子(TNF)、穿孔素、颗粒酶]的抗肿瘤作用。内源性抗原主要通过MHC-Ⅰ分子呈递激活细胞毒性CD8+ T细胞，外源性抗原主要通过MHC-Ⅱ分子呈递激活辅助CD4+ T细胞。细胞毒CD8+ T细胞通常对靶细胞具有很强的直接杀伤作用，这些细胞是癌症疫苗预期诱导的主要效应细胞。2.mRNA癌症疫苗在临床前和临床研究中的进展疫苗的核心作用是提供能被人体免疫细胞识别的抗原，从而引发免疫反应。抗原/靶点的选择和表达、载体和佐剂的应用以及给药途径是疫苗设计中需要考虑的关键因素。表1总结了这些因素的进展在临床前和临床设置。表2总结了2016年至2021年期间使用基于mRNA的癌症疫苗的临床试验。2.1.选定抗原或靶标2.1.1.肿瘤相关抗原研制肿瘤疫苗的第一步是抗原的选择，抗原应具有较高的肿瘤特异性，并能诱导强而可控的抗肿瘤T细胞反应。肿瘤抗原根据其组织分布、表达水平和中枢耐受状态可分为TAAs和TSAs。TAAs在肿瘤中普遍过表达，在正常组织中也有表达，肿瘤特异性弱，中枢耐受性强，免疫原性弱，主要包括组织分化抗原和癌胚抗原。TAAs的中枢免疫耐受是利用这些抗原开发癌症疫苗的主要挑战。使用多个(如2-6个)共享TAAs的组合已成为临床开发靶向mRNA癌症疫苗的趋势。所选择的TAAs通常在相关肿瘤中广泛表达，当与不同的载体或佐剂结合时，可以诱导抗肿瘤免疫反应。2009年，Weide等人对鱼精蛋白(RNActive®)保护mRNA癌症疫苗进行了1/2期临床研究，采用GM-CSF作为佐剂，编码6种TAAs (Melan-A、酪氨酸酶、gp100、MAGE-A1、MAGE-A3和生存素)。这种疫苗是皮内注射。该疫苗显著降低了免疫抑制细胞(如外周血中的Foxp3+/CD4+调节性T细胞(Tregs)和骨髓抑制细胞)，并增加了一部分患者的特异性T细胞。1例接受治疗的患者完全缓解，未发生大于Ⅱ级的不良反应(NCTO0204607)。2011年，Fotin-Mleczek等人对编码卵白蛋白(OVA)/PSMA/STEAP和PSMA的蛋白蛋白复合物mRNA癌症疫苗进行了临床前研究。结果表明，双组分mRNA肿瘤疫苗可通过TLR7诱导自佐剂作用，平衡适应性免疫反应，并具有持续的抗肿瘤作用(NCT00831467,NCT00923312)。2014年，Fotin-Mleczek 等人研究表明，蛋白复合OVA -编码mRNA的癌症疫苗与临床前放疗联合使用具有较强的协同抗肿瘤作用。编码4-5种前列腺特异性抗原[如CV9103 (NCT00831467)和CV9104 (NCT01817738)]或5-6种黑色素瘤和非小细胞肺癌TAAs[如CV9201 (NCT00923312)和CV9202 (NCT03164772)]的蛋白复合物肿瘤疫苗正在临床试验中。BN111是一种mRNA癌症候选疫苗，编码4种TAAs (NY-ESO-1、MAGE-A3、酪氨酸酶和TPTE)的固定组合，这些TAAs在黑色素瘤中普遍存在，并作为RNA -脂质复合物制剂(Lipo - MERIT)递送。BNT111单独或联合免疫检查点PD-1抑制剂可诱导不可切除黑色素瘤患者持续和强抗原特异性CD4+ / CD8+ T细胞反应和客观反应。超过5%的患者发生了相关不良事件，大多数不良反应为1-2级(NCT02410733)。基于这些结果，BNT111已获得FDA快速通道指定用于临床转化治疗晚期黑色素瘤(NCT04526899)。Lipo-MERIT mRNA癌症疫苗编码3个针对OC的TAAs (NCT04163094)， 5个针对PC的TAAs[如BNT112 (NCT04382898)]，或针对HNSCC和HNC的共享癌症抗原的固定组合[BNT113 (NCT04534205)]，目前正在临床试验中。AML和骨髓瘤mRNA肿瘤疫苗的临床翻译也呈现出从单一TAA的应用[如WT1 (NCTO0834002、NCT00965224、NCTO1291420)]到多个TAA的联合应用[如WT1、PRAME、CMV pp65、癌睾丸抗原7、MAGE-A3 (NCTO1734304、NCT02405338、NCT01995708)]的趋势。研究发现，在43%的化疗后缓解的AML患者中，经WT1 mRNA电穿孔的DCs可预防或延迟复发(NCT00965224)，改善的总生存率(OS)率或临床反应与诱导WT1特异性CD8+ T细胞反应(NCTO0965224, NCTO1291420)相关。TLR7 /8成熟DCs转染编码WT1、PRAME和CMV pp65的RNA可防止在完全缓解的AML患者亚群中复发(NCTO1734304)。mRNA肿瘤疫苗也在朝着个体化和精确化方向发展，初步趋势是从应用自体肿瘤[如AML (NCT00514189-已终止)、前列腺癌(NCT01197625)、NCT01278940、NCT008464562、NCT00961844-已终止]或肿瘤干细胞[如OC (NCT01334047-已终止)]衍生mRNA向采用个体化TAA 面板 (NCT01334047、NCT02709616、NCT02808364、NCT02808416)发展。负载完整肿瘤mRNA的DCs可以诱导针对肿瘤内广泛抗原的T细胞反应，甚至是患者独有的抗原(NCT01278940)。研究发现，用癌症干细胞衍生mRNA转染的树突状细胞可诱导患者产生免疫应答，并显示出有希望的初步安全性结果(NCT00846456)。含有3-13种不同TAA mRNA的个性化TAA面板脉冲DCs与良好的OS相关，并且治疗的患者没有出现Ⅲ/Ⅳ级不良事件(NCT02709616, NCT02808364, NCT02808416)。来源于自体肿瘤细胞或肿瘤干细胞的mRNA包含肿瘤细胞中的所有蛋白。这个策略简单可行，但其靶向性和有效性有待提高，同时也要考虑安全性。图1 mRNA癌症疫苗发展的时间轴。缩写：CART，电荷改变可释放转运体；CLAN，阳离子脂质辅助纳米颗粒；DCs,树突状细胞；DOTAP/DP7-C，1,2-二醇-3-三甲基丙烷氯/胆固醇改性阳离子肽DP7；LCP NPs，脂质/钙/磷酸（LCP）纳米颗粒；LPC，阳离子脂质体/鱼精蛋白复合物；LNPs，脂质纳米颗粒；Mann,甘露聚糖；PGCP NPs，聚（乳酸共乙醇酸）（PLGA）/G0-C14/神经酰胺聚（乙二醇）（PEG）(PGCP) NPs；PSA，前列腺特异性抗原；ssPAlmE-PALA，脂质纳米颗粒和a-螺旋阳离子肽“KALA”；triMN-LPR，阳离子脂质体(L)-一种阳离子聚合物(P)-mRNA (R)，称为脂多聚体（LPR），通过A-D-甘露聚糖苷（triMN）的三天线功能化。2.1.2.肿瘤特异性抗原TSAs通常是由肿瘤细胞基因组中的非同义突变形成的肿瘤新抗原；这些抗原在正常细胞中不表达，具有很强的肿瘤特异性和免疫原性，中枢耐受性较弱。TSAs与抗肿瘤免疫反应之间的相关性已在多项研究中得到证实。对来自癌症基因组图谱的18个实体肿瘤数据中的数千个RNA序列的分析显示，每个肿瘤中新抗原的数量与T细胞细胞毒性活性相关基因的表达呈正相关。对来自癌症基因组图谱的515例患者的6个位点的RNA-seq数据分析表明，高水平的免疫原性突变表位与患者生存率的提高有关。具有高水平免疫原性突变的肿瘤具有更高水平的CD8A、PD-1和CTLA4。对619例结-直肠癌样本的全外显子序列分析表明，肿瘤中高水平的新抗原与肿瘤浸润淋巴细胞的增加和生存率的提高相关。在子宫内膜癌中也证实了新抗原水平与肿瘤浸润淋巴细胞数量之间的关系。此外，发现具有高水平新抗原的肿瘤比具有低水平新抗原的肿瘤具有明显的同质性。突变负荷大于每百万碱基10个体细胞突变的肿瘤(相当于表达基因中150个非同义突变)更容易形成免疫原性新抗原，而突变负荷小于每百万碱基1个体细胞突变的肿瘤不太可能形成免疫原性新抗原。大多数肿瘤的突变负荷为每百万碱基1-10个体细胞突变，通常可以形成T细胞识别的新抗原。Rajasagi等人利用全外显子测序和HLA -肽预测结合算法(即NetMHCpan)分析了13种不同肿瘤(2488个样本)的预测突变HLA-结合肽，结果表明每个肿瘤都可以产生数万到数千个新抗原，这表明新抗原在大多数肿瘤中是常见的。图2 mRNA癌症疫苗的作用机制图mRNA癌症疫苗的流行趋势是向个体化和精密度发展，旨在开发使用多种(20种)新抗原的mRNA癌症疫苗[如，IVAC MUTANOME (NCTO2035956)、IVAC_W_brel_uID和IVAC_W_brel_uID/IVAC_M_uID (NCT02316457)、RO7198457(NCT03289962、NCT04161755、NCT03815058、NCT04486378)、mRNA-4157 (NCT03313778、NCT03897881)、NCI4650/mRNA4650 (NCT03480152)、NCT03468244、NCT03908671]。2015年，Kreiter等人通过外显子组测序和MHC-Ⅱ表位预测结合算法分析了小鼠肿瘤细胞(如黑色素瘤细胞系B16F10、结肠癌细胞系CT26和乳腺癌细胞系4T1)中的突变肽，并制备了编码这些突变肽的RNA疫苗，在临床前评估它们的抗肿瘤作用。多新表位RNA在体内有效诱导T细胞应答，抑制小鼠肿瘤的生长和转移，大部分免疫原性突变体被CD4+ T细胞识别；即使RNA只编码一个新表位(如B16-M30)，也能诱导更强的T细胞反应，并控制小鼠B16F10黑色素瘤的生长。Zhang等人对DOTAP/DP7-C脂质体进行了临床前研究，DOTAP/DP7-C脂质体作为载体和佐剂，装载了编码小鼠LLC细胞系LL2 (DOTAP/DP7-C/LL2)五种肿瘤新抗原的mRNA。DOTAP/DP7-C/LL2显著抑制原位和皮下LL2肿瘤的生长，刺激抗原特异性淋巴细胞反应。2017年，Sahin 等人发现基于RNA的多重新表位疫苗可诱导黑色素瘤患者的抗原特异性多克隆T细胞免疫反应；选择的新表位中有60%具有免疫原性，这些新表位诱导的主要T细胞反应是CD4+ T细胞反应，肿瘤转移明显减少，约75%的患者无进展生存期为27个月(NCT02035956)。2020年，Cafri等人发现编码20种新抗原的NCI4650/mRNA-4650可在胃肠道肿瘤患者中诱导新抗原特异性T细胞反应；选择的新抗原中有21%是免疫原性的，来自患者的新抗原特异性T细胞中有59%是CD4+ T细胞(NCT03480152)。虽然mRNA的制备是快速和经济的(良好生产规范级RNA可在3周内制备)，但肿瘤新抗原的筛选和鉴定可能需要很长时间和昂贵，并且在疫苗制备过程中患者的病情可能发生变化，导致研究人员错过了患者的最佳治疗机会。基于高通量和生物信息学技术对基因深度测序和大数据集蛋白质组学分析的参数，治疗性肿瘤新抗原肽疫苗、RNA疫苗和融合DC -肿瘤细胞疫苗的制备时间分别约为160天、114天、103(89-160)天和10天。新抗原的筛选和鉴定速度直接影响mRNA新抗原疫苗的临床疗效，是mRNA新抗原疫苗面临的一大挑战。同时，肿瘤新抗原预测的准确性有待提高。表1 mRNA癌症疫苗在临床前和临床设置的概述2.1.3.免疫调节分子与肿瘤抑制基因编码CD70、CD40配体和组成活性TLR4的mRNA(命名为TriMix, NCT03788083)；编码人OX40L、IL-23和IL-36γ的mRNA(命名为mRNA-2752, NCT02872025，NCTO3739931)；和编码IL-12、IL-15、GM-CSF和IFN-α的mRNA(命名为SAR441000/BNT131、NCT03871348)是编码免疫调节分子的三种具有代表性的mRNA癌症疫苗，这类疫苗还包括编码TLR7/8激动剂和RIG-1激动剂的mRNA疫苗(CV8102/ RNA佐剂®、NCT03291002、NCT03203005)；mRNA编码OX40L [mRNA-2416 (NCT03323398)]；mRNA编码IL-12[MEDI1191 (NCT03946800)， BNT151 (NCT04455620)]；mRNA编码IL-12和IL-7 (BNT152, BNT153，NCT04710043)；和编码BisCCL2/5i的mRNA。一些研究表明，编码免疫调节分子(如TriMix，mRNA-2752，BNT131和mRNA编码BisCCL2/5i)和肿瘤抑制基因(如PTEN或p53编码mRNA)的mRNA癌症疫苗作为单一疗法也具有抗肿瘤作用，通常与多种肿瘤抗原(如MAGE-A3、MAGE-C2、酪氨酸酶、gp100、生存素、hTERT和新抗原)和免疫检查点抑制剂(如抗PD-1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合用作辅助治疗。2012年，Van Lint等人发现，结节内注射TriMix和TAA(如TRP2/WT1/P1A) mRNA可诱导DCs成熟并原位启动抗原特异性T细胞。与不加佐剂的荧光素酶(FLuc) mRNA脉冲DCs相比，TriMix显著降低了DCs中FLuc的表达，且LPS、单磷酰脂质A、聚(I:C)诱导的降低作用更强；而TriMix可以产生免疫刺激环境来改善T细胞反应，优于LPS。2016年Bialkowski等人发现HPV16-E7-TriMix mRNA可诱导CD8+ T淋巴细胞向肿瘤粘膜迁移，控制肿瘤生长。当与顺铂联合使用时，HPV16-E7-TriMix mRNA通过下调髓源性抑制细胞(MDSCs)和Tregs的数量来抵抗免疫抑制微环境，导致生殖道肿瘤完全消退。在多种小鼠肿瘤模型中，瘤内注射TriMix已被肿瘤浸润的树突状细胞吸收，然后呈交给肿瘤引流淋巴结的T细胞，诱导抗肿瘤T细胞反应和抗肿瘤作用。2013年和2016年，Wilgenhof等人发现，与TriMix共电孔的DCs和编码四种与HLA Ⅱ靶向信号(DCLAMP)(命名为TriMixDC-MEL)相关的黑色素瘤相关抗原(MAGE-A3、MAGE-C2、酪氨酸酶或gp100)之一的mRNA，在预处理的晚期黑色素瘤患者中具有良好的耐受性，并在两名患者(NCT01066390)中引起完全缓解和部分缓解。TriMixDC-MEL联合免疫检查点抑制剂(ipilimumab)在预先治疗的晚期黑色素瘤患者(NCTO1302496)中耐受并诱导高度持久的肿瘤反应。2020年，De Keersmaecker等人研究表明，在相当一部分晚期黑色素瘤患者中，TriMixDC-MEL和ipilimumab联合使用可诱导有效的CD8+ T细胞反应，并与患者的临床反应相关(NCTO1302496)。2019年Hewitt发现，在瘤内注射包裹在LNPs中的编码IL- 23、IL-36γ和OX40L的三联体mRNA，可以激活并招募多种免疫细胞(例如DCs和T细胞)进入肿瘤，从而诱导依赖于Batf3的交叉呈递DCs和细胞毒性CD8+ T细胞的持久抗肿瘤免疫。该疫苗与免疫检查点抑制剂(如抗PD -1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合使用，在体内抗免疫检查点抑制剂模型中具有强大的抗肿瘤作用。2021年，Hotz等人发现BNT131联合抗PD -1抗体可显著提高荷瘤小鼠(如B16和MC38荷瘤小鼠)的生存率。2021年，Wang等人发现编码BisCCL2/5i LNPs的mRNA与编码PD-1配体抑制剂LNPs的mRNA联合可显著延长荷瘤(如原发性肝癌、结直肠癌和胰腺癌的肝转移)小鼠的生存期，且BisCCL2/5i可促进这些肿瘤对PD-1配体抑制剂的敏感性。表2 2016-2021年期间关于mRNA癌症疫苗的临床试验一些临床前研究表明，使用编码肿瘤抑制基因(如PTEN和p53)的mRNA治疗肿瘤是可行的。2018年，Islam等人研究发现，负载抑癌基因PTEN编码mRNA的聚脂包被多聚脂杂交NPs(如mRNA- pgcp NPs)可在体外和体内有效转染PTEN基因缺失的前列腺癌细胞，并通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶Akt通路促进癌细胞凋亡，显著抑制肿瘤生长。2021年，Lin等人发现肿瘤抑制基因PTEN编码mRNA NPs可诱导PTEN突变的黑色素瘤细胞和PTEN缺失的前列腺癌细胞自噬和死亡。PTEN-mRNA NPs上调免疫抑制TME中的CD8+ T细胞和促炎细胞因子(如IL-12、TNF-α和IFN-γ)，下调Tregs和MDSCs，并与抗PD -1抗体联合对这些肿瘤产生有效的抗肿瘤作用。2019年，Kong 等人研究发现肿瘤抑制基因p53-编码mRNA NPs可促进p53缺失型肝细胞和NSCLC细胞对哺乳动物雷帕霉素抑制剂靶点(依维莫司)的敏感性，且p53-mRNA NPs与依维莫司联用在体外和体内肝癌和NSCLC模型中具有显著的协同抗肿瘤作用。编码p53和肿瘤抗原(如生存素、hTERT、新抗原)的mRNA癌症疫苗目前正处于临床试验阶段(NCTO0978913、NCT02316457)。2.1.4. mRNA癌症疫苗与免疫检查点抑制剂的联合研究肿瘤发展过程中对TAAs的中枢免疫耐受和外周免疫耐受(如免疫检查点通路，TME)是癌症疫苗面临的两大挑战。两者都会影响癌症疫苗的效力和持续时间。为了靶向中枢免疫耐受，多个TAAs或多个TSAs的组合是mRNA癌症疫苗发展的主要趋势。为了靶向外周免疫耐受，将mRNA癌症疫苗与免疫检查点抑制剂(如抗PD -1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合使用是mRNA癌症疫苗应用的另一个主要趋势。2018年，Liu等人对负载MUCI mRNA的LCP NPs联合抗-CTLA-4抗体治疗TNBC进行了临床前评估，结果表明LCP-mRNA NPs作为单一疗法或联合治疗的一部分(LCP-mRNA NPs + 抗-CTLA-4)可显著抑制肿瘤生长，且联合治疗的抑制效果明显强于LCP-mRNA NP单疗法。Wang等人研究表明，同时装载编码黑色素瘤相关抗原TRP2的mRNA和靶向PD-L1的小干扰RNA的LCP NPs可以在体外和体内有效地将mRNA传递到DCs中，并促进DCs的成熟。靶向PD-L1的小干扰RNA下调DCs中PD-L1的表达，增强抗肿瘤免疫和抗肿瘤作用，疫苗有效抑制肿瘤生长。2019年，Verbeke等人研究表明，单独使用Galsomes mRNA的体内抗肿瘤作用不明显，这种治疗可以增加免疫微环境中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、不变性NKT (iNKT)、NK和M1肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的数量；这些作者还发现，治疗对PD-1/PD-L1通路的负调控可能会限制其抗肿瘤作用。与单独接种疫苗相比，结合OVA mRNA Galsomes和抗PD-L1抗体显著增加脾脏iNKT细胞数量，降低脾脏DC细胞上PD-L1水平和脾脏增生iNKT细胞上PD-1水平，显著提高抗肿瘤效果。此外，Oberli等人表明，含有编码单一肿瘤抗原(例如gp100或TRP2)的mRNA的lnp和使用这两种抗原的序贯治疗在体内均具有显著的抗肿瘤作用；但两种方法的抗肿瘤作用无显著性差异。2.2.抗原或目标的表达2.2.1. mRNA分子的药效学用于制备疫苗的mRNA主要包括常规的非复制mRNA和病毒衍生的自扩增mRNA。mRNA的IVT是制备分子的主要技术，利用噬菌体RNA聚合酶(如T3、T7或SP6 RNA聚合酶)和含有目标抗原序列的线性化DNA模板。非复制性IVT mRNA的基本结构包括一个编码目标蛋白的开放阅读框(ORF)、一个位于5'和3'非翻译区(UTRs)两侧的7-methylgaunosine 5'帽和一个3' poly(A) 尾。5'帽和3'poly(A)可以在IVT过程中添加，也可以在初始IVT后酶促添加。自我扩增的mRNA包含两个ORFs，一个编码目标抗原序列，另一个编码病毒复制机制，从而实现持久的细胞内RNA扩增。一种由编码CEA的甲病毒复制子组成的mRNA疫苗(称为AVX701)正在临床试验中(NCTO0529984, NCTO1890213)。与蛋白质或肽疫苗不同，mRNA癌症疫苗产生效果的第一步是编码蛋白的序列信息可以翻译成功能蛋白。影响翻译过程的因素包括正调节因素、负调节因素和双向调节因素。正调控因子总结如下:①5′帽及其修饰物[如抗反向帽类似物CleanCap]可招募真核翻译起始因子4E，促进核糖体识别和翻译起始，消除mRNA序列中的游离磷酸基团，显著增强mRNA的稳定性。②poly(A)序列及其修饰(如长度’)可以减缓RNA外切酶的降解过程，从而增加稳定性，延长体内半衰期，提高mRNA的翻译效率。③UTR优化[例如，由a-珠蛋白和β-珠蛋白衍生的3' UTR序列，AU和GU-富集序列；3' UTR中的稳定元素；5' UTR中的GCC-(A/G)- CCAUGG，短而松散的5' UTR135]和ORF的密码子优化(如尿苷的缺失，G:C含量的富集，同义频繁密码子，具有较高转移RNA丰度的密码子)可以提高mRNA的稳定性和蛋白质翻译。表达载体中的表位通过不同的序列和信号肽(例如，内核/溶酶体信号分选片段和跨膜-细胞质结构域)连接，以增加IVT，提高抗原在细胞内加工和呈递的靶向性。④核苷修饰[如假尿嘧啶(Ψ)、1-甲基假尿嘧啶、5-甲基胞苷(5meC)和n -乙酰胞苷修饰转录后RNA]和纯化IVT-mRNA(如Mg2+31、温度、高压液相色谱和快速蛋白液相色谱)以减少双链RNA的污染，可以降低分子的先天免疫激活，增加蛋白质翻译。与未修饰的mRNA相比，核苷修饰的mRNA (5meC, Ψ)可显著促进小鼠FLuc的表达。LCP(修饰mRNA)的体内抗肿瘤作用明显强于LCP(未修饰mRNA)。负调控因素包括:①细胞外RNases酶能快速降解裸mRNA。②IVT产生的双链RNA杂质可以结合细胞质中的模式识别受体(PRRs)[如RIG - Ⅰ，黑色素瘤分化相关蛋白5 (一种RIG -Ⅰ受体)，蛋白激酶RNA激活(也称为真核翻译起始因子2 alpha激酶2)，2'-5'-寡腺苷酸合成酶]和内体(如TLR3)来激活特定途径[如RIG -Ⅰ /MAD5→线粒体抗病毒信号蛋白→IFN Ⅰ，(IFN Ⅰ→)蛋白激酶RNA激活→真核翻译起始因子2alpha， (IFN Ⅰ→)2′5′-寡聚腺苷酸合成酶→核糖核酸酶L, TLR3→含有Toll/IL-1受体结构域的适配器诱导IFN-β→IFN Ⅰ]，可抑制mRNA翻译，促进mRNA酶解。双向调节因子包括未修饰的单链RNA作为病原体相关分子模式(PAMP)，它可以结合内体中的PRRs[如TLR7, TLR8]来激活特定途径(TLR8→髓样分化因子88→促炎细胞因子；TLR7→骨髓分化因子88→干扰素调节因子7→IFN Ⅰ)。一方面，mRNA可以激活先天免疫反应(DC成熟和激活)，进而激活适应性免疫反应(T和B细胞免疫反应);另一方面，过早和过度激活IFN Ⅰ可抑制mRNA翻译，促进mRNA酶解，促进DC和T细胞凋亡。过度强烈的炎症反应也会引起毒副作用。在T细胞中，Ⅰ型IFN受体信号的激活先于TCR信号的激活，可作为促进免疫应答的真正第三信号。Udhayakumar等人表明，与含有未修饰mRNA的RALA mRNA纳米复合物相比，含有Ψ-和 5meC-修饰mRNA的mRNA纳米复合物诱导了有效的抗原特异性细胞毒性T细胞反应，并且具有优越的疗效，修饰的(5meC，Ψ) mRNA纳米复合物通过抑制IFN-β活化显著降低了Ⅰ型IFNs对CTLs的抑制作用，并有效诱导了CTLs。相比之下，Oberli等人表明，未修饰mRNA LNP疫苗在外周血中诱导的CD8 T细胞应答(7.8%)比核苷修饰mRNA (5meC，Ψ) LNP疫苗(1.0%)强得多，并表明Ⅰ型干扰素是保护性CD8 T细胞应答所必需的。这些相互矛盾的结果可能与双向调节因素有关。2.2.2.疫苗抗原表达方法根据抗原的表达，疫苗可分为多肽或蛋白质疫苗、细胞疫苗(如肿瘤细胞疫苗、DC疫苗和工程细胞疫苗)、核酸疫苗(如DNA和RNA疫苗)和病毒载体疫苗。肽或蛋白疫苗是广泛使用的疫苗类型。抗原肽的序列定义明确，易于控制。肽疫苗包括短肽疫苗和长肽疫苗。短肽疫苗有一些缺点，包括蛋白质水解导致抗原降解和免疫反应持续时间较短，短肽可以结合许多核细胞表面的MHC Ⅰ分子，这些核细胞作为非专业抗原呈递细胞APCs)，通常不含共刺激信号，导致抗原耐受和T细胞功能障碍。长肽疫苗通常含有20-30个氨基酸，可激活CD4+和CD8+ T细胞。蛋白质疫苗也能诱导T细胞反应；然而，长肽通常比蛋白质更有效地被APCs内化和加工。长肽疫苗的缺点包括对酶降解的敏感性、快速清除和注射部位吸收不足。细胞疫苗主要包括癌细胞疫苗和DC疫苗。癌细胞疫苗是用自体或异体灭活的全细胞及其衍生物(如细胞裂解物、DC融合衍生物、表达TSAs或免疫增强因子的修饰全细胞和肿瘤衍生mRNAs)，它们通常包含细胞的所有抗原，在疫苗设计和生产之前不需要费力地鉴定，从而导致相对快速的制备和某些个性化特征。然而，使用癌细胞的方法不能准确地测定和控制相应的肿瘤抗原，质量控制困难，而且癌细胞往往含有较少的特异性抗原，导致免疫原性较弱和潜在的致癌性。DCs是最有效的APCs，在连接先天和适应性免疫反应中起着核心作用。DC疫苗一般使用自体DC作为载体来表达和呈递抗原。1996年，Boczkowski等人证明了使用肿瘤来源的mRNA癌细胞脉冲DCs的可行性。2017年之前，在大约24项临床试验中，mRNA癌症疫苗使用DCs作为载体。然而，DC疫苗的制备工艺复杂，生产昂贵，质量控制困难。此外，患者必须具有相对正常的免疫功能，没有化疗或其他治疗引起的骨髓抑制，并提供大量功能性DCs，导致可用疫苗数量有限。核酸疫苗是用编码抗原的核酸(如DNA、RNA)制备的。mRNA疫苗的特点已在本文第1部分进行了描述。与mRNA相比，DNA必须进入细胞核才能翻译成相应的抗原，这有插入突变引起的潜在风险，可能比mRNA更不安全。总的来说，核酸对降解敏感，不稳定，半衰期短，导致裸核酸被APCs吸收的效率较低。新的载体和给药途径。用于提高核酸的吸收和呈递效率(下文讨论)。有限的研究表明mRNA癌症疫苗与肽或蛋白癌症疫苗相比具有抗肿瘤优势。用体外合成的鸡OVA RNA脉冲的DCs比用OVA肽脉冲的DCs在体外刺激OVA特异性的初级CTL反应更有效。在原位治疗性肿瘤模型中，DOTAP/DP-C/mRNA编码5种新抗原在诱导脾脏产生活化T细胞(CD3+ CD8+ IFN-γ+)方面明显强于DOTAP/DP-C/突变肽。LCP(修饰mRNA)的体内抗肿瘤作用显著强于LCP (TRP2肽/CpG)。编码IL-23、IL-36和OX40L的三联体mRNAs提高MC38-S荷瘤小鼠存活率的能力明显强于相应的蛋白处理。肽抗原通常只含有一个表位，而mRNAs编码的全长抗原含有多个表位，可以诱导T细胞靶向这些表位，产生更强的抗肿瘤作用。病毒载体疫苗是利用病毒作为表达或呈递抗原的载体制备的。目前，被广泛研究的病毒载体包括痘病毒、腺病毒和疱疹病毒。出于安全考虑，采用复制缺陷病毒或减毒病毒。痘病毒可包含多个基因，复制和转录仅限于细胞质，插入突变的风险较低，表达产物可呈现MHC Ⅰ和Ⅱ。非禽类痘病毒可以诱导宿主产生免疫反应，从而使其只能使用一种或最多两种疫苗。重组鸟痘病毒可以多次接种，其病毒外壳蛋白不能在哺乳动物细胞中产生，并且病毒不能诱导宿主产生免疫反应来中和病毒。重组腺病毒载体易于设计，作为疫苗和基因治疗药物的载体已显示出实用性；然而，它们的免疫原性会影响疫苗的效果。疱疹病毒有广泛的宿主范围；可感染神经细胞、外周血单核细胞和DCs；并且具有复制周期短、容量大、安全性相对较好的特点。此外，其他载体，如细菌和酵母，在临床前研究中显示出作为疫苗载体的潜力。总的来说，免疫原性、致癌性、传染性、包装能力有限和病毒载体生产困难是广泛应用的挑战。2.3.mRNA癌症疫苗的载体开发具有良好的安全性、靶向性、稳定性、自佐剂效应、负载能力和通用性的mRNA递送载体，能够高效、持续地递送和呈递抗原，激活APCs，是mRNA肿瘤疫苗领域的一个基本方向。mRNA肿瘤疫苗在临床前采用的载体如表3所示。mRNA癌症疫苗中使用的主要载体之一是脂质体及其衍生物。1995年，Conry等人显示了编码人CEA复合物的脂质体mRNA的体液免疫原性，首次在临床前研究中证实了mRNA癌症疫苗的概念验证。甘露糖可以与DCs表面表达的甘露糖受体结合，利用靶向DCs的载体促进mRNA的高效传递和转染。2011年，Perche等人研究表明，携带mRNA的Man11-LPR100转染DCs的效率是无糖LPR100的4倍，并且在体内具有更好的抗肿瘤作用。由于甘露糖与其受体之间的结合力较弱，增加载体表面甘露糖的密度可能是提高甘露糖修饰LPR递送效率的有效途径。2018年，Le Moignic 等人研究表明，与单甘油三酯- LPR相比，三甘油三酯- LPR可以更有效地诱导抗原转染，通过在注射部位诱导局部炎症反应，将更多的DCs招募到引流淋巴结，并更有效地诱导抗原特异性免疫反应。2018年，Wang 等人利用甘糖醇偶联物(MPn-CHs)制备了DCs靶向脂质体(MPn-LPs)作为mRNA载体，结果表明MP1000-LPs负载mRNA (MP1000-LPX)具有良好的转染效率，MP1000-LPX主要通过增强DCs上甘糖受体(如CD206)的表达来增强mRNA的表达。2020年，Son等人研究表明，采用多糖包被二氧化硅纳米颗粒制备的Mann -capsules可以通过Dectin-2或TLR-4激活骨髓源性树突状细胞(BMDC)，且Mann -capsules促进BMDC分化和成熟的能力明显强于PEI或脂质体；此外，PEI和脂质体具有高毒性。LNPs似乎是一种很有前途的mRNA癌症疫苗载体。LNPs的成分主要包括可电离脂质，促进mRNA的自组装和内体释放；磷脂，支持脂质双层结构；胆固醇，一种稳定剂；脂质锚定聚乙二醇，延长配方的半衰期。还考虑了筛选和鉴定这些媒介的高通量技术。2017年，Oberli 等人构建并优化了LNP库，发现含有编码肿瘤抗原的mRNAs(如gp100和TRP2)与LNPs作为佐剂结合，可有效诱导抗原特异性CD8+ T细胞，抑制肿瘤生长，延长小鼠OS。2018年，McKinlay等人对基于两亲性CARTs的mRNA载体库进行了高通量筛选研究，结果表明，与单一CART或脂质体 2000相比，双CART可将体外淋巴细胞mRNA转染效率提高9倍；体外mRNA转染效率为80%，小鼠淋巴细胞mRNA转染效率为1.5%。2019年，Miao等人建立了一种高通量的可电离类脂质构建技术，可在一天内合成数千种脂质制剂，并使用DCs(如HeLa细胞、BMDCs或骨髓源性巨噬细胞)高通量评估LNPs的转染效率。结果表明，mRNA LNPs通过干扰素基因通路的胞内刺激物诱导APC成熟，增强抗肿瘤作用。2021年，Meng等人发现含有CpG核心的VLVPs可以促进DC成熟和抗原呈递、抗原特异性CD8+ T细胞在淋巴器官中的增殖和肿瘤中的T细胞浸润，并减少免疫抑制细胞(如肿瘤相关骨髓源性抑制细胞和表达精氨酸酶1的抑制性DCs)。以LNPs为载体的mRNA癌症疫苗[如编码新抗原的mRNA-4157 (NCTO3313778、NCTO3897881)和编码突变蛋白的V941 (NCT03948763)]目前正处于临床试验阶段。多阳离子肽鱼精蛋白和DCs是mRNA癌症疫苗中采用的另外两种主要载体。鱼精蛋白和DCs的特点及其作为mRNA癌症疫苗载体的研究进展分别见第2.1.1节和2.2.2节。鱼精蛋白可以保护mRNA不被血清RNA酶降解，促进mRNA的传递。此外，鱼精蛋白可与脂质体联合使用(例如，阳离子脂质体-鱼精蛋白，LPC和VLVP)。2000年，Hoerr等人发现脂质体包裹的浓缩RNA-肽复合物可诱导抗原特异性细胞免疫反应和体液免疫反应，裸RNA和蛋白蛋白保护的RNA在体内均可诱导特异性免疫反应，而受保护的RNA在体外稳定时间较长。Mai等人的研究表明，携带细胞角蛋白19编码mRNA的LPC经鼻递送可诱导小鼠APC成熟和强烈的细胞免疫反应，并降低肿瘤的生长。载体对疫苗的效力有关键影响。Phua等人表明，在没有NP载体的情况下，鼻内接种裸mRNA不能诱导抗肿瘤免疫反应。然而，临床前和临床研究都在综合考虑所选靶点、佐剂和递送方法的基础上证明了裸mRNA的可行性和有效性。发现FLT3可增强结内裸RNA的抗肿瘤作用。结内HPV16-E7-TriMix裸mRNA和瘤内TriMix裸mRNA均可诱导有效的抗肿瘤T细胞反应。结节内裸mRNA多重新表位疫苗诱导有效的抗原特异性T细胞免疫应答(NCT02035956)。2.4.佐剂在mRNA癌症疫苗的临床前研究中开发的一类主要佐剂[如LPS73, poly(I:C), Td, CpG]是PAMPs，它通过PAMP-PRR途径激活DCs，然后调节先天和适应性免疫反应。作为一种强效的回忆抗原，Td可通过CCL3106促进DC迁移，提高抗肿瘤作用。LPS辅助处理进一步提高了CD8+ T细胞水平和LNP mRNA诱导细胞的抗肿瘤活性。mRNA- CART联合CpG的体内抗肿瘤作用明显强于mRNA-CART和裸mRNA与CpG的联合，也强于mRNA-CART与TLR7配体或CD80 /86 mRNA的联合。大多数新型载体(如脂质样材料C1、DOTAP/ DP7-C、Mann-capsule、LNPs)兼具载体和佐剂的特性，其中一些载体具有佐剂的功能，类似于PAMPs。Mann -capsule通过Dectin-2或TLR-4激活BMDCs，葡聚糖-capsule通过CD206、CD209或巨噬细胞诱导的C型凝集素激活BMDCs。DP7-C、DOTAP和mRNA分别通过TLR2、TLR4和TLR7激活DCs。DOTAP/DP7C诱导DC成熟和抗原呈递的能力明显强于DOTAP、poly(I:C)和CpG。Cl或C1 mRNA可通过TLR4依赖的核因子κB信号通路促进BMDC活化，C1- OVA mRNA的体内抗肿瘤作用是TLR4依赖的CpG，因为VLVP中含有的佐剂，可以提高疫苗的效果，阻止PD-1在T细胞中的表达。然而，这些类PAMP佐剂可能影响mRNAs的翻译效率和降解，并具有潜在的毒性，如2.2.1节所述。开发既不影响mRNA翻译效率，又能积极调节多种先天和适应性免疫反应，促炎作用相对温和，毒性较低的新型佐剂已成为重要方向。TAA mRNA的免疫原性可以通过GM-CSF mRNA的共递送而增强。FLT3配体可促进浆细胞样DCs、经典DCs和NK细胞的扩增；诱导T辅助1型微环境；增强肿瘤内T细胞浸润及裸RNA的抗肿瘤作用。mRNA LNPs可通过刺激干扰素基因依赖性激活Ⅰ型IFN，诱导APC成熟，限制全身细胞因子表达，增强抗肿瘤作用。用于mRNA Galsomes的佐剂α-GC可通过DCs呈递激活iNKT细胞。活化的iNKT细胞可与DCs发生双向正调节作用，可正向调节NK细胞和免疫抑制细胞(如MDSCs和M1 TAMs)，不影响mRNA翻译效率，促进直接和间接的抗肿瘤作用。编码免疫共刺激分子的mRNA可用作佐剂(见2.1.3节)。TriMix (NCT01066390, NCTO1302496)；mRNA-2752 (NCT02872025)；mRNA编码人OX40L (mRNA-2416, NCT03323398)；编码IL-12、IL-15、GM-CSF和IFN-α的mRNA (BNT131，NCTO3871348)；编码IL-12的mRNA (MEDI1191，NCT03946800)；和mRNA编码的TLR7 /8激动剂和RIG-1-兴奋剂(RNA佐剂®)，NCT03291002，NCT03203005]正在临床试验中作为辅助治疗与免疫检查点抑制剂联合使用。表3 在临床前环境中用于mRNA癌症疫苗的递送系统概述2.5.给药途径给药途径直接影响疫苗的效力，mRNA癌症疫苗通常采用的给药途径包括静脉注射、皮内、皮下、肌肉注射、结内和肿瘤内给药。静脉注射允许更大的疫苗量和直接将疫苗输送到淋巴器官，但也有更大的系统性毒性风险。皮下注射疫苗的真皮含有APCs(如，DCs和巨噬细胞)以及血管和淋巴血管，但主要由致密结缔组织组成，导致通过皮内途径给药时疫苗量很小。皮内给药也可导致注射部位的不良反应(例如，肿胀、疼痛、红斑和瘙痒)。皮下注射疫苗的皮下区域含有比真皮更少的APCs；然而，它主要由脂肪组织的松散网络组成，允许通过皮下途径注射更大的注射量，从而引起更少的局部副作用(如疼痛)。肌肉注射疫苗的肌肉含有致密的血液网络，可以帮助招募和再循环不同类型的免疫细胞(如，浸润性APCs)到注射部位。肌内给药比皮内给药的注射量大，局部副作用也比皮内和皮下给药轻。结内注射疫苗的淋巴结含有多个APCs，结内给药具有较高的递送效率，允许小剂量的疫苗，但涉及复杂的程瘤内给药主要用于编码免疫共刺激分子的mRNA疫苗(例如TriMix, CV8102, mRNA-2752, mRNA-2416, BNT131和MEDI1191)作为免疫辅助治疗，也允许小剂量的疫苗，涉及复杂的程序。准确预测特定疫苗的最佳给药途径是困难的，建议通过直接比较研究来选择疫苗的最佳给药途径。结内注射的Luc-RNA在体内的转染效率优于皮内或皮下注射。经静脉注射OVA RNA复合DOTAP-DOPE诱导的CTLs杀伤作用优于皮内或皮下注射(静脉注射＞皮内注射＞皮下注射)。结内递送OVA mRNA联合TriMix诱导的抗原特异性T细胞的体内细胞毒性明显强于皮内递送疫苗。皮内接种E7 mRNA单糖化-LPR诱导的抗原特异性T细胞应答明显强于皮下接种。通过CART有效地将mRNA传递到APCs中(次要淋巴细胞APCs优先通过静脉注射靶向，而局部APCs通过皮下注射靶向)。肿瘤内三次给药的编码IL-23、IL-36和OX40L的三联体mRNAs的抗肿瘤作用显著优于同种药物的皮内或皮下给药；然而，在同一剂量下，通过这些途径的抗肿瘤效果没有显著差异，这表明对肿瘤疫苗的给药效果也与给药频率有关。鼻黏膜富含APCs和免疫细胞，临床前研究表明经鼻内注射的mRNA癌疫苗初步有效。鼻内接种mRNA纳米颗粒和鼻内递送LPC mRNA均可诱导抗肿瘤免疫应答。3.mRNA癌症疫苗的挑战和趋势迄今为止，已有数百种癌症疫苗进行了临床评估，美国食品和药物管理局(FDA)批准了三种治疗性癌症疫苗[卡介苗 (TheraCys®)，一种牛分支杆菌减毒活株，用于治疗非肌肉浸润性膀胱癌；Sipuleucel-T (Provenge®)，一种用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌的DC疫苗；以及用于治疗晚期黑色素瘤的溶瘤性疱疹病毒疫苗(talimogene laherparepvec, T-VEC) (Imlygic®)和两种预防性癌症疫苗(HPV疫苗和乙型肝炎病毒疫苗)。影响mRNA肿瘤疫苗研制的因素主要包括分子本身的内在因素和外部因素[如对肿瘤抗原的中枢耐受性(见第2.1.1节)、肿瘤和HLA的异质性以及肿瘤免疫微环境]。这些因素深刻地影响了mRNA癌症疫苗的发展。从内在因素来看，研究人员通过改进mRNA的结构和序列，改进mRNA的制备和纯化技术(见第2.2.1节)，开发新的传递载体(见第2.3节)，在一定程度上提高了mRNA癌症疫苗的有效性。肿瘤异质性的本质是肿瘤细胞的基因组异质性，导致抗原异质性，这是影响抗肿瘤T细胞反应产生的关键因素，也是开发个性化癌症疫苗的主要原因。HLA异质性主要是指个体间HLA分子类型的不同，导致个体间这些分子对肿瘤抗原的结合区域或结合亲和力存在差异，从而影响抗肿瘤T细胞反应的产生和强度。HLA异质性是由HLA等位基因在不同民族和地区人群中的多态性引起的。HLA Ⅰ等位基因包括9-11个常见超型，其覆盖率为90%。HLA-A loci (HLA-A等位基因：A*0101、A*0201、A*0301、A*1101和A*2402)占HLA-Ⅰ等位基因的60%，HLA-B loci (HLA-B等位基因：B*0702、B*0801、B*2705、B*3501和B*5701)占这些等位基因的35%以上。TME由免疫细胞、间充质细胞以及多种细胞因子和组织因子组成，在肿瘤发生和免疫逃逸中起重要作用。大质量内的间质压力可减少大分子(如抗体)和效应细胞(如T细胞)的扩散。大多数实体瘤也缺乏T细胞共刺激分子。TME通常含有免疫抑制细胞，包括CD4+Tregs, MDSCs，抑制性CD8+T细胞，M2 TAMs和调节性NK/NKT细胞。这些免疫抑制细胞和TME中的肿瘤细胞可以释放大量可溶性的免疫抑制因子，包括转化生长因子β、IL-10、PD-L1、吲哚胺2,3-双加氧酶和血管内皮生长因子等，进入微环境。考虑到肿瘤和HLA的异质性，肿瘤新抗原疫苗的开发在理论上比TAA定向疫苗具有更强的特异性抗肿瘤作用和更弱的毒副作用，一直是癌症疫苗研究的主要热点(见2.1.2节)。鉴于肿瘤免疫微环境，开发基于免疫的联合疗法(例如，与佐剂或免疫检查点抑制剂联合)已成为癌症疫苗应用的一个关键趋势(见第2.1.4和2.4节)。4.讨论产品的临床前评价是进入临床转化的前提，合理的评价可以提高预测临床结果的可靠性。临床前评价所采用的参数、技术和方法是疫苗质量标准的重要组成部分。疫苗的临床前评价应充分阐明疫苗的作用和机制，而mRNA肿瘤疫苗临床前评价的重点是确定抗原特异性T细胞反应的产生(如T细胞的数量和活化)和效果(如T细胞的杀伤作用和抗原亲和力)。一般来说，在临床前评估中，定量的体外和体内试验用于评估mRNA癌症疫苗的效果和机制。根据目前对抗原特异性T细胞免疫应答的认识，评价参数主要包括①鉴定疫苗的理化特性；②mRNA转染APC的效率(如结合与摄取、内化与转运、表达与分布)；③APCs的分化、成熟和抗原提呈；④疫苗免疫刺激；⑤细胞免疫原性(如CTL的产生、增殖和靶细胞杀伤)；⑥体液免疫原性；⑦抗肿瘤作用及相关机制；⑧初步毒性（如细胞毒性、内脏毒性和溶血）。诸如颗粒大小、电荷、对mRNA的结合能力和负载率、稳定性(如时间、温度和血清稳定性)、聚乙二醇化和硬度等因素可影响抗原递送(如淋巴引流)。Son等人研究表明，尺寸为~220 nm的Mann-capsules具有良好的变形能力，通过50 nm孔膜后的回复率约为30%。与基于蛋白质或肽的疫苗不同，mRNA疫苗开发的第一步是确保mRNA序列中编码的信息能够有效地翻译成相应的蛋白质或肽。mRNA的体外和体内转染效率是mRNA疫苗临床前评价的重要参数，提高mRNA的转染效率是提高mRNA疫苗药效学的关键途径。然而，APCs的体外转染效率可能存在差异，DOTAP/ DP7 - 增加了绿色荧光蛋白mRNA在APCs(包括293T、JAWSII、DC2.4和BMDCs)中的体外转染效率分别为84.87±3.21%、12.23±1.35%、28.49±2.46%和14.51±2.35%。为了验证mRNA在体外和体内的转染效率，我们以多种APCs作为体外转染模型，在体内检测不同器官的多种APCs的mRNA转染效率。增强绿色荧光蛋白(FLuc)是实验中常用的转染蛋白。染料标记的mRNA或疫苗载体已广泛用于转染研究。共聚焦显微镜和流式细胞术常用于评估细胞内微转染(如递送、摄取和翻译)，共聚焦显微镜可更直观、准确地评估mRNA的翻译效率，交互式视频信息系统可用于评估全身或局部大转染(如分布、淋巴引流)。用于体内抗肿瘤活性评价的肿瘤模型主要包括治疗性或预防性皮下、原位和肺转移肿瘤模型，所建立的体内肿瘤模型应准确模拟人体病理。Bialkowski等人的研究表明TC-1肿瘤的TME可因肿瘤接种部位(即皮下、肺部和生殖道)的不同而有显著差异，这直接影响了E7-TriMix mRNA疫苗的抗肿瘤效果。在选择用于临床前评估的细胞或动物模型时，物种特异性是需要考虑的重要因素。为了获得更准确的评价信息，可以建立人源化动物模型。通过静脉注射人外周血单个核细胞(HLA-A2型)的CD34+造血干细胞建立的人源化小鼠，进入免疫缺陷NOD/ shi-scid IL-2Rγnull小鼠或C57BL/6小鼠，建立体内肿瘤模型(如结果表明，转染修饰的人CD133 mRNA的DCs处理人源化小鼠模型的中位生存期大于60天，转染修饰的小鼠CD133 mRNA的DCs处理同源小鼠肿瘤模型的中位生存期为38天。肿瘤疫苗理论上具有抗肿瘤复发和转移的作用，可以建立多种体内肿瘤模型进行评价，阐明这些疫苗在预防或治疗肿瘤转移或复发方面的优势。有效的抗肿瘤反应需要多个免疫细胞的协同作用，而不是单个细胞的作用。目前，大多数肿瘤疫苗的重点是诱导CD8+T细胞，但CD4+T细胞等免疫细胞在诱导和维持免疫记忆、增强CTLs的肿瘤杀伤作用中也发挥着重要作用。采用NKT配体(如α-GC)作为佐剂的mRNA Galsomes通过iNKT细胞诱导抗肿瘤作用。在含有CD4+和CD8+T细胞的培养系统中转染CD133 mRNA的DCs比仅含有CD4+或CD8+T细胞的培养系统中的DCs更有效地激活T细胞并杀死肿瘤靶细胞。也有人担心mRNA癌症疫苗的安全性和副作用。修饰后的mRNA可与血清蛋白结合形成血管闭塞，具有潜在的毒性。DOTAP/DP7-C mRNA具有良好的血清稳定性和较低的细胞毒性；然而，Lipo2000和PEI25K具有很强的细胞毒性。最后，我们期待mRNA癌症疫苗的成功临床转化。参考资料：He Q, Gao H, Tan D, Zhang H, Wang JZ. mRNA cancer vaccines: Advances, trends and challenges. Acta Pharm Sin B. 2022 Jul;12(7):2969-2989. doi: 10.1016/j.apsb.2022.03.011. Epub 2022 Mar 23. PMID: 35345451; PMCID: PMC8942458.
信使RNA疫苗上市批准紧急使用授权加速审批
2023-08-29
摘要患者对信使核糖核酸(mRNA)疫苗表现出良好的耐受性，编码分子的选择是灵活多样的。这些疫苗可以被设计成表达包含多个表位的全长抗原，而不受主要组织相容性复合体(MHC)的限制，相对容易控制，并且可以快速批量生产。美国食品药品监督管理局(FDA)于2021年批准了辉瑞和BioNTech生产的首个基于mRNA的新型冠状病毒病(COVID-19)疫苗，引发了mRNA疫苗研发热潮。基于上述特点和mRNA疫苗的发展，尤其是近五年来，mRNA肿瘤疫苗已成为研究热点，发展迅速。本文从抗原/靶点的选择和表达、载体和佐剂的应用、不同给药途径和临床前评价等方面对mRNA肿瘤疫苗的研究进展进行了分析，以反映mRNA肿瘤疫苗的发展趋势和面临的挑战。关键词：mRNA，癌症疫苗，肿瘤相关抗原，新抗原，mRNA递送载体，佐剂，给药途径。1.mRNA疫苗和mRNA癌症疫苗1961年，Brenner等人首次发现mRNA，它是基因作为蛋白质表达所必需的关键中间分子，含有与氨基酸(蛋白质的基本单位)相对应的密码子信息。1990年，Wolff等人首次证明，通过肌肉注射编码相应蛋白的纯RNA，可以在小鼠体内有效表达特定蛋白[如氯霉素乙酰转移酶和荧光素酶(Luc)]；具体来说，βgLucβgAn RNA的蛋白表达以剂量依赖性和时间依赖性的方式发生；这项工作还提出了mRNA疫苗的概念。2020年，美国食品和药物管理局(FDA)紧急批准了Pfizer--BioNTech/BNT162b2和Moderna/mRNA-1273生产的两种基于mRNA的疫苗，用于预防2019年冠状病毒病(COVID - 19)。2021年，美国食品药品监督管理局(FDA)批准了Pfizer-BioNTech(上市名称为Comirnaty)生产的首个COVID-19疫苗，激发了mRNA疫苗的研发热情，并对mRNA癌症疫苗的突破产生了期待。迄今为止，研究人员已将mRNA用作疫苗平台[例如流感病毒、人类免疫缺陷病毒、冠状病毒、病毒抗原(狂犬病病毒糖蛋白、寨卡病毒和委内瑞拉马脑炎病毒的蛋白质)，细菌病原体(结核分枝杆菌)和癌症]和蛋白质替代平台(例如factor IX、卵泡抑素、鸟氨酸经甲氨基甲酰基酶和促红细胞生成素)，用于疾病的预防和治疗。mRNA疫苗具有许多共同特征。与质粒脱氧核糖核酸(DNA)和病毒载体存在因基因插入和/或感染而导致突变的风险不同，mRNA进入细胞质后可直接翻译成蛋白质；因此，mRNA疫苗是非整合的、非传染性的、耐受性良好的。mRNA也在细胞中短暂表达，允许重复接种。mRNA转录物中编码单位的选择是灵活多样的，允许编码抗原和免疫调节分子来诱导和调节适应性和先天免疫应答，并且含有多个表位的编码全长抗原可以由MHC Ⅰ类(MHC-Ⅰ)和Ⅱ类(MHC-Ⅱ)分子呈现，而不受MHC限制。体外转录(IVT) mRNA的生产不需要细胞，防止了蛋白质或病毒的污染，并允许快速、经济和容易的大规模生产。mRNA癌症疫苗利用编码肿瘤抗原或免疫调节分子的mRNA递送相应的蛋白，结合相关的递送载体和佐剂，诱导抗肿瘤应答。图1显示了mRNA癌症疫苗的发展时间表。抗肿瘤T细胞是介导这些疫苗治疗效果的主要预期效应细胞，图2总结了抗肿瘤T细胞产生和作用的机制。RNA在疫苗位点被DCs摄取，翻译并加工成抗原MHC Ⅰ/Ⅱ复合物并呈递到细胞表面。活化的DCs到达引流淋巴结，呈递的抗原MHC Ⅰ/Ⅱ复合物与淋巴结内分化簇8 (CD8)+/CD4+ T细胞(第一信号)表面的T细胞受体(TCR)结合，导致T细胞活化和增殖，共刺激信号分子[如CD80/CD86, OX40配体(OX40L)]与受体(如CD28, OX40)在T细胞(第二信号)和细胞因子[如干扰素(IFN) I，白细胞介素12 (IL-12)， IL-1]与T细胞上的细胞因子受体结合(第三信号)。此外，CD4+ T细胞分泌的IL-2可促进CD8+ T细胞扩增。活化的T细胞在趋化因子[如CC -趋化因子受体7，CC -趋化因子配体(CCL) 5，CXC -趋化因子配体9/10]的作用下向肿瘤组织迁移并浸润，最大限度地发挥其分泌的效应器[如IFN-γ、肿瘤坏死因子(TNF)、穿孔素、颗粒酶]的抗肿瘤作用。内源性抗原主要通过MHC-Ⅰ分子呈递激活细胞毒性CD8+ T细胞，外源性抗原主要通过MHC-Ⅱ分子呈递激活辅助CD4+ T细胞。细胞毒CD8+ T细胞通常对靶细胞具有很强的直接杀伤作用，这些细胞是癌症疫苗预期诱导的主要效应细胞。2.mRNA癌症疫苗在临床前和临床研究中的进展疫苗的核心作用是提供能被人体免疫细胞识别的抗原，从而引发免疫反应。抗原/靶点的选择和表达、载体和佐剂的应用以及给药途径是疫苗设计中需要考虑的关键因素。表1总结了这些因素的进展在临床前和临床设置。表2总结了2016年至2021年期间使用基于mRNA的癌症疫苗的临床试验。2.1.选定抗原或靶标2.1.1.肿瘤相关抗原研制肿瘤疫苗的第一步是抗原的选择，抗原应具有较高的肿瘤特异性，并能诱导强而可控的抗肿瘤T细胞反应。肿瘤抗原根据其组织分布、表达水平和中枢耐受状态可分为TAAs和TSAs。TAAs在肿瘤中普遍过表达，在正常组织中也有表达，肿瘤特异性弱，中枢耐受性强，免疫原性弱，主要包括组织分化抗原和癌胚抗原。TAAs的中枢免疫耐受是利用这些抗原开发癌症疫苗的主要挑战。使用多个(如2-6个)共享TAAs的组合已成为临床开发靶向mRNA癌症疫苗的趋势。所选择的TAAs通常在相关肿瘤中广泛表达，当与不同的载体或佐剂结合时，可以诱导抗肿瘤免疫反应。2009年，Weide等人对鱼精蛋白(RNActive®)保护mRNA癌症疫苗进行了1/2期临床研究，采用GM-CSF作为佐剂，编码6种TAAs (Melan-A、酪氨酸酶、gp100、MAGE-A1、MAGE-A3和生存素)。这种疫苗是皮内注射。该疫苗显著降低了免疫抑制细胞(如外周血中的Foxp3+/CD4+调节性T细胞(Tregs)和骨髓抑制细胞)，并增加了一部分患者的特异性T细胞。1例接受治疗的患者完全缓解，未发生大于Ⅱ级的不良反应(NCTO0204607)。2011年，Fotin-Mleczek等人对编码卵白蛋白(OVA)/PSMA/STEAP和PSMA的蛋白蛋白复合物mRNA癌症疫苗进行了临床前研究。结果表明，双组分mRNA肿瘤疫苗可通过TLR7诱导自佐剂作用，平衡适应性免疫反应，并具有持续的抗肿瘤作用(NCT00831467,NCT00923312)。2014年，Fotin-Mleczek 等人研究表明，蛋白复合OVA -编码mRNA的癌症疫苗与临床前放疗联合使用具有较强的协同抗肿瘤作用。编码4-5种前列腺特异性抗原[如CV9103 (NCT00831467)和CV9104 (NCT01817738)]或5-6种黑色素瘤和非小细胞肺癌TAAs[如CV9201 (NCT00923312)和CV9202 (NCT03164772)]的蛋白复合物肿瘤疫苗正在临床试验中。BN111是一种mRNA癌症候选疫苗，编码4种TAAs (NY-ESO-1、MAGE-A3、酪氨酸酶和TPTE)的固定组合，这些TAAs在黑色素瘤中普遍存在，并作为RNA -脂质复合物制剂(Lipo - MERIT)递送。BNT111单独或联合免疫检查点PD-1抑制剂可诱导不可切除黑色素瘤患者持续和强抗原特异性CD4+ / CD8+ T细胞反应和客观反应。超过5%的患者发生了相关不良事件，大多数不良反应为1-2级(NCT02410733)。基于这些结果，BNT111已获得FDA快速通道指定用于临床转化治疗晚期黑色素瘤(NCT04526899)。Lipo-MERIT mRNA癌症疫苗编码3个针对OC的TAAs (NCT04163094)， 5个针对PC的TAAs[如BNT112 (NCT04382898)]，或针对HNSCC和HNC的共享癌症抗原的固定组合[BNT113 (NCT04534205)]，目前正在临床试验中。AML和骨髓瘤mRNA肿瘤疫苗的临床翻译也呈现出从单一TAA的应用[如WT1 (NCTO0834002、NCT00965224、NCTO1291420)]到多个TAA的联合应用[如WT1、PRAME、CMV pp65、癌睾丸抗原7、MAGE-A3 (NCTO1734304、NCT02405338、NCT01995708)]的趋势。研究发现，在43%的化疗后缓解的AML患者中，经WT1 mRNA电穿孔的DCs可预防或延迟复发(NCT00965224)，改善的总生存率(OS)率或临床反应与诱导WT1特异性CD8+ T细胞反应(NCTO0965224, NCTO1291420)相关。TLR7 /8成熟DCs转染编码WT1、PRAME和CMV pp65的RNA可防止在完全缓解的AML患者亚群中复发(NCTO1734304)。mRNA肿瘤疫苗也在朝着个体化和精确化方向发展，初步趋势是从应用自体肿瘤[如AML (NCT00514189-已终止)、前列腺癌(NCT01197625)、NCT01278940、NCT008464562、NCT00961844-已终止]或肿瘤干细胞[如OC (NCT01334047-已终止)]衍生mRNA向采用个体化TAA 面板 (NCT01334047、NCT02709616、NCT02808364、NCT02808416)发展。负载完整肿瘤mRNA的DCs可以诱导针对肿瘤内广泛抗原的T细胞反应，甚至是患者独有的抗原(NCT01278940)。研究发现，用癌症干细胞衍生mRNA转染的树突状细胞可诱导患者产生免疫应答，并显示出有希望的初步安全性结果(NCT00846456)。含有3-13种不同TAA mRNA的个性化TAA面板脉冲DCs与良好的OS相关，并且治疗的患者没有出现Ⅲ/Ⅳ级不良事件(NCT02709616, NCT02808364, NCT02808416)。来源于自体肿瘤细胞或肿瘤干细胞的mRNA包含肿瘤细胞中的所有蛋白。这个策略简单可行，但其靶向性和有效性有待提高，同时也要考虑安全性。图1 mRNA癌症疫苗发展的时间轴。缩写：CART，电荷改变可释放转运体；CLAN，阳离子脂质辅助纳米颗粒；DCs,树突状细胞；DOTAP/DP7-C，1,2-二醇-3-三甲基丙烷氯/胆固醇改性阳离子肽DP7；LCP NPs，脂质/钙/磷酸（LCP）纳米颗粒；LPC，阳离子脂质体/鱼精蛋白复合物；LNPs，脂质纳米颗粒；Mann,甘露聚糖；PGCP NPs，聚（乳酸共乙醇酸）（PLGA）/G0-C14/神经酰胺聚（乙二醇）（PEG）(PGCP) NPs；PSA，前列腺特异性抗原；ssPAlmE-PALA，脂质纳米颗粒和a-螺旋阳离子肽“KALA”；triMN-LPR，阳离子脂质体(L)-一种阳离子聚合物(P)-mRNA (R)，称为脂多聚体（LPR），通过A-D-甘露聚糖苷（triMN）的三天线功能化。2.1.2.肿瘤特异性抗原TSAs通常是由肿瘤细胞基因组中的非同义突变形成的肿瘤新抗原；这些抗原在正常细胞中不表达，具有很强的肿瘤特异性和免疫原性，中枢耐受性较弱。TSAs与抗肿瘤免疫反应之间的相关性已在多项研究中得到证实。对来自癌症基因组图谱的18个实体肿瘤数据中的数千个RNA序列的分析显示，每个肿瘤中新抗原的数量与T细胞细胞毒性活性相关基因的表达呈正相关。对来自癌症基因组图谱的515例患者的6个位点的RNA-seq数据分析表明，高水平的免疫原性突变表位与患者生存率的提高有关。具有高水平免疫原性突变的肿瘤具有更高水平的CD8A、PD-1和CTLA4。对619例结-直肠癌样本的全外显子序列分析表明，肿瘤中高水平的新抗原与肿瘤浸润淋巴细胞的增加和生存率的提高相关。在子宫内膜癌中也证实了新抗原水平与肿瘤浸润淋巴细胞数量之间的关系。此外，发现具有高水平新抗原的肿瘤比具有低水平新抗原的肿瘤具有明显的同质性。突变负荷大于每百万碱基10个体细胞突变的肿瘤(相当于表达基因中150个非同义突变)更容易形成免疫原性新抗原，而突变负荷小于每百万碱基1个体细胞突变的肿瘤不太可能形成免疫原性新抗原。大多数肿瘤的突变负荷为每百万碱基1-10个体细胞突变，通常可以形成T细胞识别的新抗原。Rajasagi等人利用全外显子测序和HLA -肽预测结合算法(即NetMHCpan)分析了13种不同肿瘤(2488个样本)的预测突变HLA-结合肽，结果表明每个肿瘤都可以产生数万到数千个新抗原，这表明新抗原在大多数肿瘤中是常见的。图2 mRNA癌症疫苗的作用机制图mRNA癌症疫苗的流行趋势是向个体化和精密度发展，旨在开发使用多种(20种)新抗原的mRNA癌症疫苗[如，IVAC MUTANOME (NCTO2035956)、IVAC_W_brel_uID和IVAC_W_brel_uID/IVAC_M_uID (NCT02316457)、RO7198457(NCT03289962、NCT04161755、NCT03815058、NCT04486378)、mRNA-4157 (NCT03313778、NCT03897881)、NCI4650/mRNA4650 (NCT03480152)、NCT03468244、NCT03908671]。2015年，Kreiter等人通过外显子组测序和MHC-Ⅱ表位预测结合算法分析了小鼠肿瘤细胞(如黑色素瘤细胞系B16F10、结肠癌细胞系CT26和乳腺癌细胞系4T1)中的突变肽，并制备了编码这些突变肽的RNA疫苗，在临床前评估它们的抗肿瘤作用。多新表位RNA在体内有效诱导T细胞应答，抑制小鼠肿瘤的生长和转移，大部分免疫原性突变体被CD4+ T细胞识别；即使RNA只编码一个新表位(如B16-M30)，也能诱导更强的T细胞反应，并控制小鼠B16F10黑色素瘤的生长。Zhang等人对DOTAP/DP7-C脂质体进行了临床前研究，DOTAP/DP7-C脂质体作为载体和佐剂，装载了编码小鼠LLC细胞系LL2 (DOTAP/DP7-C/LL2)五种肿瘤新抗原的mRNA。DOTAP/DP7-C/LL2显著抑制原位和皮下LL2肿瘤的生长，刺激抗原特异性淋巴细胞反应。2017年，Sahin 等人发现基于RNA的多重新表位疫苗可诱导黑色素瘤患者的抗原特异性多克隆T细胞免疫反应；选择的新表位中有60%具有免疫原性，这些新表位诱导的主要T细胞反应是CD4+ T细胞反应，肿瘤转移明显减少，约75%的患者无进展生存期为27个月(NCT02035956)。2020年，Cafri等人发现编码20种新抗原的NCI4650/mRNA-4650可在胃肠道肿瘤患者中诱导新抗原特异性T细胞反应；选择的新抗原中有21%是免疫原性的，来自患者的新抗原特异性T细胞中有59%是CD4+ T细胞(NCT03480152)。虽然mRNA的制备是快速和经济的(良好生产规范级RNA可在3周内制备)，但肿瘤新抗原的筛选和鉴定可能需要很长时间和昂贵，并且在疫苗制备过程中患者的病情可能发生变化，导致研究人员错过了患者的最佳治疗机会。基于高通量和生物信息学技术对基因深度测序和大数据集蛋白质组学分析的参数，治疗性肿瘤新抗原肽疫苗、RNA疫苗和融合DC -肿瘤细胞疫苗的制备时间分别约为160天、114天、103(89-160)天和10天。新抗原的筛选和鉴定速度直接影响mRNA新抗原疫苗的临床疗效，是mRNA新抗原疫苗面临的一大挑战。同时，肿瘤新抗原预测的准确性有待提高。表1 mRNA癌症疫苗在临床前和临床设置的概述2.1.3.免疫调节分子与肿瘤抑制基因编码CD70、CD40配体和组成活性TLR4的mRNA(命名为TriMix, NCT03788083)；编码人OX40L、IL-23和IL-36γ的mRNA(命名为mRNA-2752, NCT02872025，NCTO3739931)；和编码IL-12、IL-15、GM-CSF和IFN-α的mRNA(命名为SAR441000/BNT131、NCT03871348)是编码免疫调节分子的三种具有代表性的mRNA癌症疫苗，这类疫苗还包括编码TLR7/8激动剂和RIG-1激动剂的mRNA疫苗(CV8102/ RNA佐剂®、NCT03291002、NCT03203005)；mRNA编码OX40L [mRNA-2416 (NCT03323398)]；mRNA编码IL-12[MEDI1191 (NCT03946800)， BNT151 (NCT04455620)]；mRNA编码IL-12和IL-7 (BNT152, BNT153，NCT04710043)；和编码BisCCL2/5i的mRNA。一些研究表明，编码免疫调节分子(如TriMix，mRNA-2752，BNT131和mRNA编码BisCCL2/5i)和肿瘤抑制基因(如PTEN或p53编码mRNA)的mRNA癌症疫苗作为单一疗法也具有抗肿瘤作用，通常与多种肿瘤抗原(如MAGE-A3、MAGE-C2、酪氨酸酶、gp100、生存素、hTERT和新抗原)和免疫检查点抑制剂(如抗PD-1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合用作辅助治疗。2012年，Van Lint等人发现，结节内注射TriMix和TAA(如TRP2/WT1/P1A) mRNA可诱导DCs成熟并原位启动抗原特异性T细胞。与不加佐剂的荧光素酶(FLuc) mRNA脉冲DCs相比，TriMix显著降低了DCs中FLuc的表达，且LPS、单磷酰脂质A、聚(I:C)诱导的降低作用更强；而TriMix可以产生免疫刺激环境来改善T细胞反应，优于LPS。2016年Bialkowski等人发现HPV16-E7-TriMix mRNA可诱导CD8+ T淋巴细胞向肿瘤粘膜迁移，控制肿瘤生长。当与顺铂联合使用时，HPV16-E7-TriMix mRNA通过下调髓源性抑制细胞(MDSCs)和Tregs的数量来抵抗免疫抑制微环境，导致生殖道肿瘤完全消退。在多种小鼠肿瘤模型中，瘤内注射TriMix已被肿瘤浸润的树突状细胞吸收，然后呈交给肿瘤引流淋巴结的T细胞，诱导抗肿瘤T细胞反应和抗肿瘤作用。2013年和2016年，Wilgenhof等人发现，与TriMix共电孔的DCs和编码四种与HLA Ⅱ靶向信号(DCLAMP)(命名为TriMixDC-MEL)相关的黑色素瘤相关抗原(MAGE-A3、MAGE-C2、酪氨酸酶或gp100)之一的mRNA，在预处理的晚期黑色素瘤患者中具有良好的耐受性，并在两名患者(NCT01066390)中引起完全缓解和部分缓解。TriMixDC-MEL联合免疫检查点抑制剂(ipilimumab)在预先治疗的晚期黑色素瘤患者(NCTO1302496)中耐受并诱导高度持久的肿瘤反应。2020年，De Keersmaecker等人研究表明，在相当一部分晚期黑色素瘤患者中，TriMixDC-MEL和ipilimumab联合使用可诱导有效的CD8+ T细胞反应，并与患者的临床反应相关(NCTO1302496)。2019年Hewitt发现，在瘤内注射包裹在LNPs中的编码IL- 23、IL-36γ和OX40L的三联体mRNA，可以激活并招募多种免疫细胞(例如DCs和T细胞)进入肿瘤，从而诱导依赖于Batf3的交叉呈递DCs和细胞毒性CD8+ T细胞的持久抗肿瘤免疫。该疫苗与免疫检查点抑制剂(如抗PD -1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合使用，在体内抗免疫检查点抑制剂模型中具有强大的抗肿瘤作用。2021年，Hotz等人发现BNT131联合抗PD -1抗体可显著提高荷瘤小鼠(如B16和MC38荷瘤小鼠)的生存率。2021年，Wang等人发现编码BisCCL2/5i LNPs的mRNA与编码PD-1配体抑制剂LNPs的mRNA联合可显著延长荷瘤(如原发性肝癌、结直肠癌和胰腺癌的肝转移)小鼠的生存期，且BisCCL2/5i可促进这些肿瘤对PD-1配体抑制剂的敏感性。表2 2016-2021年期间关于mRNA癌症疫苗的临床试验一些临床前研究表明，使用编码肿瘤抑制基因(如PTEN和p53)的mRNA治疗肿瘤是可行的。2018年，Islam等人研究发现，负载抑癌基因PTEN编码mRNA的聚脂包被多聚脂杂交NPs(如mRNA- pgcp NPs)可在体外和体内有效转染PTEN基因缺失的前列腺癌细胞，并通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶Akt通路促进癌细胞凋亡，显著抑制肿瘤生长。2021年，Lin等人发现肿瘤抑制基因PTEN编码mRNA NPs可诱导PTEN突变的黑色素瘤细胞和PTEN缺失的前列腺癌细胞自噬和死亡。PTEN-mRNA NPs上调免疫抑制TME中的CD8+ T细胞和促炎细胞因子(如IL-12、TNF-α和IFN-γ)，下调Tregs和MDSCs，并与抗PD -1抗体联合对这些肿瘤产生有效的抗肿瘤作用。2019年，Kong 等人研究发现肿瘤抑制基因p53-编码mRNA NPs可促进p53缺失型肝细胞和NSCLC细胞对哺乳动物雷帕霉素抑制剂靶点(依维莫司)的敏感性，且p53-mRNA NPs与依维莫司联用在体外和体内肝癌和NSCLC模型中具有显著的协同抗肿瘤作用。编码p53和肿瘤抗原(如生存素、hTERT、新抗原)的mRNA癌症疫苗目前正处于临床试验阶段(NCTO0978913、NCT02316457)。2.1.4. mRNA癌症疫苗与免疫检查点抑制剂的联合研究肿瘤发展过程中对TAAs的中枢免疫耐受和外周免疫耐受(如免疫检查点通路，TME)是癌症疫苗面临的两大挑战。两者都会影响癌症疫苗的效力和持续时间。为了靶向中枢免疫耐受，多个TAAs或多个TSAs的组合是mRNA癌症疫苗发展的主要趋势。为了靶向外周免疫耐受，将mRNA癌症疫苗与免疫检查点抑制剂(如抗PD -1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合使用是mRNA癌症疫苗应用的另一个主要趋势。2018年，Liu等人对负载MUCI mRNA的LCP NPs联合抗-CTLA-4抗体治疗TNBC进行了临床前评估，结果表明LCP-mRNA NPs作为单一疗法或联合治疗的一部分(LCP-mRNA NPs + 抗-CTLA-4)可显著抑制肿瘤生长，且联合治疗的抑制效果明显强于LCP-mRNA NP单疗法。Wang等人研究表明，同时装载编码黑色素瘤相关抗原TRP2的mRNA和靶向PD-L1的小干扰RNA的LCP NPs可以在体外和体内有效地将mRNA传递到DCs中，并促进DCs的成熟。靶向PD-L1的小干扰RNA下调DCs中PD-L1的表达，增强抗肿瘤免疫和抗肿瘤作用，疫苗有效抑制肿瘤生长。2019年，Verbeke等人研究表明，单独使用Galsomes mRNA的体内抗肿瘤作用不明显，这种治疗可以增加免疫微环境中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、不变性NKT (iNKT)、NK和M1肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的数量；这些作者还发现，治疗对PD-1/PD-L1通路的负调控可能会限制其抗肿瘤作用。与单独接种疫苗相比，结合OVA mRNA Galsomes和抗PD-L1抗体显著增加脾脏iNKT细胞数量，降低脾脏DC细胞上PD-L1水平和脾脏增生iNKT细胞上PD-1水平，显著提高抗肿瘤效果。此外，Oberli等人表明，含有编码单一肿瘤抗原(例如gp100或TRP2)的mRNA的lnp和使用这两种抗原的序贯治疗在体内均具有显著的抗肿瘤作用；但两种方法的抗肿瘤作用无显著性差异。2.2.抗原或目标的表达2.2.1. mRNA分子的药效学用于制备疫苗的mRNA主要包括常规的非复制mRNA和病毒衍生的自扩增mRNA。mRNA的IVT是制备分子的主要技术，利用噬菌体RNA聚合酶(如T3、T7或SP6 RNA聚合酶)和含有目标抗原序列的线性化DNA模板。非复制性IVT mRNA的基本结构包括一个编码目标蛋白的开放阅读框(ORF)、一个位于5'和3'非翻译区(UTRs)两侧的7-methylgaunosine 5'帽和一个3' poly(A) 尾。5'帽和3'poly(A)可以在IVT过程中添加，也可以在初始IVT后酶促添加。自我扩增的mRNA包含两个ORFs，一个编码目标抗原序列，另一个编码病毒复制机制，从而实现持久的细胞内RNA扩增。一种由编码CEA的甲病毒复制子组成的mRNA疫苗(称为AVX701)正在临床试验中(NCTO0529984, NCTO1890213)。与蛋白质或肽疫苗不同，mRNA癌症疫苗产生效果的第一步是编码蛋白的序列信息可以翻译成功能蛋白。影响翻译过程的因素包括正调节因素、负调节因素和双向调节因素。正调控因子总结如下:①5′帽及其修饰物[如抗反向帽类似物CleanCap]可招募真核翻译起始因子4E，促进核糖体识别和翻译起始，消除mRNA序列中的游离磷酸基团，显著增强mRNA的稳定性。②poly(A)序列及其修饰(如长度’)可以减缓RNA外切酶的降解过程，从而增加稳定性，延长体内半衰期，提高mRNA的翻译效率。③UTR优化[例如，由a-珠蛋白和β-珠蛋白衍生的3' UTR序列，AU和GU-富集序列；3' UTR中的稳定元素；5' UTR中的GCC-(A/G)- CCAUGG，短而松散的5' UTR135]和ORF的密码子优化(如尿苷的缺失，G:C含量的富集，同义频繁密码子，具有较高转移RNA丰度的密码子)可以提高mRNA的稳定性和蛋白质翻译。表达载体中的表位通过不同的序列和信号肽(例如，内核/溶酶体信号分选片段和跨膜-细胞质结构域)连接，以增加IVT，提高抗原在细胞内加工和呈递的靶向性。④核苷修饰[如假尿嘧啶(Ψ)、1-甲基假尿嘧啶、5-甲基胞苷(5meC)和n -乙酰胞苷修饰转录后RNA]和纯化IVT-mRNA(如Mg2+31、温度、高压液相色谱和快速蛋白液相色谱)以减少双链RNA的污染，可以降低分子的先天免疫激活，增加蛋白质翻译。与未修饰的mRNA相比，核苷修饰的mRNA (5meC, Ψ)可显著促进小鼠FLuc的表达。LCP(修饰mRNA)的体内抗肿瘤作用明显强于LCP(未修饰mRNA)。负调控因素包括:①细胞外RNases酶能快速降解裸mRNA。②IVT产生的双链RNA杂质可以结合细胞质中的模式识别受体(PRRs)[如RIG - Ⅰ，黑色素瘤分化相关蛋白5 (一种RIG -Ⅰ受体)，蛋白激酶RNA激活(也称为真核翻译起始因子2 alpha激酶2)，2'-5'-寡腺苷酸合成酶]和内体(如TLR3)来激活特定途径[如RIG -Ⅰ /MAD5→线粒体抗病毒信号蛋白→IFN Ⅰ，(IFN Ⅰ→)蛋白激酶RNA激活→真核翻译起始因子2alpha， (IFN Ⅰ→)2′5′-寡聚腺苷酸合成酶→核糖核酸酶L, TLR3→含有Toll/IL-1受体结构域的适配器诱导IFN-β→IFN Ⅰ]，可抑制mRNA翻译，促进mRNA酶解。双向调节因子包括未修饰的单链RNA作为病原体相关分子模式(PAMP)，它可以结合内体中的PRRs[如TLR7, TLR8]来激活特定途径(TLR8→髓样分化因子88→促炎细胞因子；TLR7→骨髓分化因子88→干扰素调节因子7→IFN Ⅰ)。一方面，mRNA可以激活先天免疫反应(DC成熟和激活)，进而激活适应性免疫反应(T和B细胞免疫反应);另一方面，过早和过度激活IFN Ⅰ可抑制mRNA翻译，促进mRNA酶解，促进DC和T细胞凋亡。过度强烈的炎症反应也会引起毒副作用。在T细胞中，Ⅰ型IFN受体信号的激活先于TCR信号的激活，可作为促进免疫应答的真正第三信号。Udhayakumar等人表明，与含有未修饰mRNA的RALA mRNA纳米复合物相比，含有Ψ-和 5meC-修饰mRNA的mRNA纳米复合物诱导了有效的抗原特异性细胞毒性T细胞反应，并且具有优越的疗效，修饰的(5meC，Ψ) mRNA纳米复合物通过抑制IFN-β活化显著降低了Ⅰ型IFNs对CTLs的抑制作用，并有效诱导了CTLs。相比之下，Oberli等人表明，未修饰mRNA LNP疫苗在外周血中诱导的CD8 T细胞应答(7.8%)比核苷修饰mRNA (5meC，Ψ) LNP疫苗(1.0%)强得多，并表明Ⅰ型干扰素是保护性CD8 T细胞应答所必需的。这些相互矛盾的结果可能与双向调节因素有关。2.2.2.疫苗抗原表达方法根据抗原的表达，疫苗可分为多肽或蛋白质疫苗、细胞疫苗(如肿瘤细胞疫苗、DC疫苗和工程细胞疫苗)、核酸疫苗(如DNA和RNA疫苗)和病毒载体疫苗。肽或蛋白疫苗是广泛使用的疫苗类型。抗原肽的序列定义明确，易于控制。肽疫苗包括短肽疫苗和长肽疫苗。短肽疫苗有一些缺点，包括蛋白质水解导致抗原降解和免疫反应持续时间较短，短肽可以结合许多核细胞表面的MHC Ⅰ分子，这些核细胞作为非专业抗原呈递细胞APCs)，通常不含共刺激信号，导致抗原耐受和T细胞功能障碍。长肽疫苗通常含有20-30个氨基酸，可激活CD4+和CD8+ T细胞。蛋白质疫苗也能诱导T细胞反应；然而，长肽通常比蛋白质更有效地被APCs内化和加工。长肽疫苗的缺点包括对酶降解的敏感性、快速清除和注射部位吸收不足。细胞疫苗主要包括癌细胞疫苗和DC疫苗。癌细胞疫苗是用自体或异体灭活的全细胞及其衍生物(如细胞裂解物、DC融合衍生物、表达TSAs或免疫增强因子的修饰全细胞和肿瘤衍生mRNAs)，它们通常包含细胞的所有抗原，在疫苗设计和生产之前不需要费力地鉴定，从而导致相对快速的制备和某些个性化特征。然而，使用癌细胞的方法不能准确地测定和控制相应的肿瘤抗原，质量控制困难，而且癌细胞往往含有较少的特异性抗原，导致免疫原性较弱和潜在的致癌性。DCs是最有效的APCs，在连接先天和适应性免疫反应中起着核心作用。DC疫苗一般使用自体DC作为载体来表达和呈递抗原。1996年，Boczkowski等人证明了使用肿瘤来源的mRNA癌细胞脉冲DCs的可行性。2017年之前，在大约24项临床试验中，mRNA癌症疫苗使用DCs作为载体。然而，DC疫苗的制备工艺复杂，生产昂贵，质量控制困难。此外，患者必须具有相对正常的免疫功能，没有化疗或其他治疗引起的骨髓抑制，并提供大量功能性DCs，导致可用疫苗数量有限。核酸疫苗是用编码抗原的核酸(如DNA、RNA)制备的。mRNA疫苗的特点已在本文第1部分进行了描述。与mRNA相比，DNA必须进入细胞核才能翻译成相应的抗原，这有插入突变引起的潜在风险，可能比mRNA更不安全。总的来说，核酸对降解敏感，不稳定，半衰期短，导致裸核酸被APCs吸收的效率较低。新的载体和给药途径。用于提高核酸的吸收和呈递效率(下文讨论)。有限的研究表明mRNA癌症疫苗与肽或蛋白癌症疫苗相比具有抗肿瘤优势。用体外合成的鸡OVA RNA脉冲的DCs比用OVA肽脉冲的DCs在体外刺激OVA特异性的初级CTL反应更有效。在原位治疗性肿瘤模型中，DOTAP/DP-C/mRNA编码5种新抗原在诱导脾脏产生活化T细胞(CD3+ CD8+ IFN-γ+)方面明显强于DOTAP/DP-C/突变肽。LCP(修饰mRNA)的体内抗肿瘤作用显著强于LCP (TRP2肽/CpG)。编码IL-23、IL-36和OX40L的三联体mRNAs提高MC38-S荷瘤小鼠存活率的能力明显强于相应的蛋白处理。肽抗原通常只含有一个表位，而mRNAs编码的全长抗原含有多个表位，可以诱导T细胞靶向这些表位，产生更强的抗肿瘤作用。病毒载体疫苗是利用病毒作为表达或呈递抗原的载体制备的。目前，被广泛研究的病毒载体包括痘病毒、腺病毒和疱疹病毒。出于安全考虑，采用复制缺陷病毒或减毒病毒。痘病毒可包含多个基因，复制和转录仅限于细胞质，插入突变的风险较低，表达产物可呈现MHC Ⅰ和Ⅱ。非禽类痘病毒可以诱导宿主产生免疫反应，从而使其只能使用一种或最多两种疫苗。重组鸟痘病毒可以多次接种，其病毒外壳蛋白不能在哺乳动物细胞中产生，并且病毒不能诱导宿主产生免疫反应来中和病毒。重组腺病毒载体易于设计，作为疫苗和基因治疗药物的载体已显示出实用性；然而，它们的免疫原性会影响疫苗的效果。疱疹病毒有广泛的宿主范围；可感染神经细胞、外周血单核细胞和DCs；并且具有复制周期短、容量大、安全性相对较好的特点。此外，其他载体，如细菌和酵母，在临床前研究中显示出作为疫苗载体的潜力。总的来说，免疫原性、致癌性、传染性、包装能力有限和病毒载体生产困难是广泛应用的挑战。2.3.mRNA癌症疫苗的载体开发具有良好的安全性、靶向性、稳定性、自佐剂效应、负载能力和通用性的mRNA递送载体，能够高效、持续地递送和呈递抗原，激活APCs，是mRNA肿瘤疫苗领域的一个基本方向。mRNA肿瘤疫苗在临床前采用的载体如表3所示。mRNA癌症疫苗中使用的主要载体之一是脂质体及其衍生物。1995年，Conry等人显示了编码人CEA复合物的脂质体mRNA的体液免疫原性，首次在临床前研究中证实了mRNA癌症疫苗的概念验证。甘露糖可以与DCs表面表达的甘露糖受体结合，利用靶向DCs的载体促进mRNA的高效传递和转染。2011年，Perche等人研究表明，携带mRNA的Man11-LPR100转染DCs的效率是无糖LPR100的4倍，并且在体内具有更好的抗肿瘤作用。由于甘露糖与其受体之间的结合力较弱，增加载体表面甘露糖的密度可能是提高甘露糖修饰LPR递送效率的有效途径。2018年，Le Moignic 等人研究表明，与单甘油三酯- LPR相比，三甘油三酯- LPR可以更有效地诱导抗原转染，通过在注射部位诱导局部炎症反应，将更多的DCs招募到引流淋巴结，并更有效地诱导抗原特异性免疫反应。2018年，Wang 等人利用甘糖醇偶联物(MPn-CHs)制备了DCs靶向脂质体(MPn-LPs)作为mRNA载体，结果表明MP1000-LPs负载mRNA (MP1000-LPX)具有良好的转染效率，MP1000-LPX主要通过增强DCs上甘糖受体(如CD206)的表达来增强mRNA的表达。2020年，Son等人研究表明，采用多糖包被二氧化硅纳米颗粒制备的Mann -capsules可以通过Dectin-2或TLR-4激活骨髓源性树突状细胞(BMDC)，且Mann -capsules促进BMDC分化和成熟的能力明显强于PEI或脂质体；此外，PEI和脂质体具有高毒性。LNPs似乎是一种很有前途的mRNA癌症疫苗载体。LNPs的成分主要包括可电离脂质，促进mRNA的自组装和内体释放；磷脂，支持脂质双层结构；胆固醇，一种稳定剂；脂质锚定聚乙二醇，延长配方的半衰期。还考虑了筛选和鉴定这些媒介的高通量技术。2017年，Oberli 等人构建并优化了LNP库，发现含有编码肿瘤抗原的mRNAs(如gp100和TRP2)与LNPs作为佐剂结合，可有效诱导抗原特异性CD8+ T细胞，抑制肿瘤生长，延长小鼠OS。2018年，McKinlay等人对基于两亲性CARTs的mRNA载体库进行了高通量筛选研究，结果表明，与单一CART或脂质体 2000相比，双CART可将体外淋巴细胞mRNA转染效率提高9倍；体外mRNA转染效率为80%，小鼠淋巴细胞mRNA转染效率为1.5%。2019年，Miao等人建立了一种高通量的可电离类脂质构建技术，可在一天内合成数千种脂质制剂，并使用DCs(如HeLa细胞、BMDCs或骨髓源性巨噬细胞)高通量评估LNPs的转染效率。结果表明，mRNA LNPs通过干扰素基因通路的胞内刺激物诱导APC成熟，增强抗肿瘤作用。2021年，Meng等人发现含有CpG核心的VLVPs可以促进DC成熟和抗原呈递、抗原特异性CD8+ T细胞在淋巴器官中的增殖和肿瘤中的T细胞浸润，并减少免疫抑制细胞(如肿瘤相关骨髓源性抑制细胞和表达精氨酸酶1的抑制性DCs)。以LNPs为载体的mRNA癌症疫苗[如编码新抗原的mRNA-4157 (NCTO3313778、NCTO3897881)和编码突变蛋白的V941 (NCT03948763)]目前正处于临床试验阶段。多阳离子肽鱼精蛋白和DCs是mRNA癌症疫苗中采用的另外两种主要载体。鱼精蛋白和DCs的特点及其作为mRNA癌症疫苗载体的研究进展分别见第2.1.1节和2.2.2节。鱼精蛋白可以保护mRNA不被血清RNA酶降解，促进mRNA的传递。此外，鱼精蛋白可与脂质体联合使用(例如，阳离子脂质体-鱼精蛋白，LPC和VLVP)。2000年，Hoerr等人发现脂质体包裹的浓缩RNA-肽复合物可诱导抗原特异性细胞免疫反应和体液免疫反应，裸RNA和蛋白蛋白保护的RNA在体内均可诱导特异性免疫反应，而受保护的RNA在体外稳定时间较长。Mai等人的研究表明，携带细胞角蛋白19编码mRNA的LPC经鼻递送可诱导小鼠APC成熟和强烈的细胞免疫反应，并降低肿瘤的生长。载体对疫苗的效力有关键影响。Phua等人表明，在没有NP载体的情况下，鼻内接种裸mRNA不能诱导抗肿瘤免疫反应。然而，临床前和临床研究都在综合考虑所选靶点、佐剂和递送方法的基础上证明了裸mRNA的可行性和有效性。发现FLT3可增强结内裸RNA的抗肿瘤作用。结内HPV16-E7-TriMix裸mRNA和瘤内TriMix裸mRNA均可诱导有效的抗肿瘤T细胞反应。结节内裸mRNA多重新表位疫苗诱导有效的抗原特异性T细胞免疫应答(NCT02035956)。2.4.佐剂在mRNA癌症疫苗的临床前研究中开发的一类主要佐剂[如LPS73, poly(I:C), Td, CpG]是PAMPs，它通过PAMP-PRR途径激活DCs，然后调节先天和适应性免疫反应。作为一种强效的回忆抗原，Td可通过CCL3106促进DC迁移，提高抗肿瘤作用。LPS辅助处理进一步提高了CD8+ T细胞水平和LNP mRNA诱导细胞的抗肿瘤活性。mRNA- CART联合CpG的体内抗肿瘤作用明显强于mRNA-CART和裸mRNA与CpG的联合，也强于mRNA-CART与TLR7配体或CD80 /86 mRNA的联合。大多数新型载体(如脂质样材料C1、DOTAP/ DP7-C、Mann-capsule、LNPs)兼具载体和佐剂的特性，其中一些载体具有佐剂的功能，类似于PAMPs。Mann -capsule通过Dectin-2或TLR-4激活BMDCs，葡聚糖-capsule通过CD206、CD209或巨噬细胞诱导的C型凝集素激活BMDCs。DP7-C、DOTAP和mRNA分别通过TLR2、TLR4和TLR7激活DCs。DOTAP/DP7C诱导DC成熟和抗原呈递的能力明显强于DOTAP、poly(I:C)和CpG。Cl或C1 mRNA可通过TLR4依赖的核因子κB信号通路促进BMDC活化，C1- OVA mRNA的体内抗肿瘤作用是TLR4依赖的CpG，因为VLVP中含有的佐剂，可以提高疫苗的效果，阻止PD-1在T细胞中的表达。然而，这些类PAMP佐剂可能影响mRNAs的翻译效率和降解，并具有潜在的毒性，如2.2.1节所述。开发既不影响mRNA翻译效率，又能积极调节多种先天和适应性免疫反应，促炎作用相对温和，毒性较低的新型佐剂已成为重要方向。TAA mRNA的免疫原性可以通过GM-CSF mRNA的共递送而增强。FLT3配体可促进浆细胞样DCs、经典DCs和NK细胞的扩增；诱导T辅助1型微环境；增强肿瘤内T细胞浸润及裸RNA的抗肿瘤作用。mRNA LNPs可通过刺激干扰素基因依赖性激活Ⅰ型IFN，诱导APC成熟，限制全身细胞因子表达，增强抗肿瘤作用。用于mRNA Galsomes的佐剂α-GC可通过DCs呈递激活iNKT细胞。活化的iNKT细胞可与DCs发生双向正调节作用，可正向调节NK细胞和免疫抑制细胞(如MDSCs和M1 TAMs)，不影响mRNA翻译效率，促进直接和间接的抗肿瘤作用。编码免疫共刺激分子的mRNA可用作佐剂(见2.1.3节)。TriMix (NCT01066390, NCTO1302496)；mRNA-2752 (NCT02872025)；mRNA编码人OX40L (mRNA-2416, NCT03323398)；编码IL-12、IL-15、GM-CSF和IFN-α的mRNA (BNT131，NCTO3871348)；编码IL-12的mRNA (MEDI1191，NCT03946800)；和mRNA编码的TLR7 /8激动剂和RIG-1-兴奋剂(RNA佐剂®)，NCT03291002，NCT03203005]正在临床试验中作为辅助治疗与免疫检查点抑制剂联合使用。表3 在临床前环境中用于mRNA癌症疫苗的递送系统概述2.5.给药途径给药途径直接影响疫苗的效力，mRNA癌症疫苗通常采用的给药途径包括静脉注射、皮内、皮下、肌肉注射、结内和肿瘤内给药。静脉注射允许更大的疫苗量和直接将疫苗输送到淋巴器官，但也有更大的系统性毒性风险。皮下注射疫苗的真皮含有APCs(如，DCs和巨噬细胞)以及血管和淋巴血管，但主要由致密结缔组织组成，导致通过皮内途径给药时疫苗量很小。皮内给药也可导致注射部位的不良反应(例如，肿胀、疼痛、红斑和瘙痒)。皮下注射疫苗的皮下区域含有比真皮更少的APCs；然而，它主要由脂肪组织的松散网络组成，允许通过皮下途径注射更大的注射量，从而引起更少的局部副作用(如疼痛)。肌肉注射疫苗的肌肉含有致密的血液网络，可以帮助招募和再循环不同类型的免疫细胞(如，浸润性APCs)到注射部位。肌内给药比皮内给药的注射量大，局部副作用也比皮内和皮下给药轻。结内注射疫苗的淋巴结含有多个APCs，结内给药具有较高的递送效率，允许小剂量的疫苗，但涉及复杂的程瘤内给药主要用于编码免疫共刺激分子的mRNA疫苗(例如TriMix, CV8102, mRNA-2752, mRNA-2416, BNT131和MEDI1191)作为免疫辅助治疗，也允许小剂量的疫苗，涉及复杂的程序。准确预测特定疫苗的最佳给药途径是困难的，建议通过直接比较研究来选择疫苗的最佳给药途径。结内注射的Luc-RNA在体内的转染效率优于皮内或皮下注射。经静脉注射OVA RNA复合DOTAP-DOPE诱导的CTLs杀伤作用优于皮内或皮下注射(静脉注射＞皮内注射＞皮下注射)。结内递送OVA mRNA联合TriMix诱导的抗原特异性T细胞的体内细胞毒性明显强于皮内递送疫苗。皮内接种E7 mRNA单糖化-LPR诱导的抗原特异性T细胞应答明显强于皮下接种。通过CART有效地将mRNA传递到APCs中(次要淋巴细胞APCs优先通过静脉注射靶向，而局部APCs通过皮下注射靶向)。肿瘤内三次给药的编码IL-23、IL-36和OX40L的三联体mRNAs的抗肿瘤作用显著优于同种药物的皮内或皮下给药；然而，在同一剂量下，通过这些途径的抗肿瘤效果没有显著差异，这表明对肿瘤疫苗的给药效果也与给药频率有关。鼻黏膜富含APCs和免疫细胞，临床前研究表明经鼻内注射的mRNA癌疫苗初步有效。鼻内接种mRNA纳米颗粒和鼻内递送LPC mRNA均可诱导抗肿瘤免疫应答。3.mRNA癌症疫苗的挑战和趋势迄今为止，已有数百种癌症疫苗进行了临床评估，美国食品和药物管理局(FDA)批准了三种治疗性癌症疫苗[卡介苗 (TheraCys®)，一种牛分支杆菌减毒活株，用于治疗非肌肉浸润性膀胱癌；Sipuleucel-T (Provenge®)，一种用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌的DC疫苗；以及用于治疗晚期黑色素瘤的溶瘤性疱疹病毒疫苗(talimogene laherparepvec, T-VEC) (Imlygic®)和两种预防性癌症疫苗(HPV疫苗和乙型肝炎病毒疫苗)。影响mRNA肿瘤疫苗研制的因素主要包括分子本身的内在因素和外部因素[如对肿瘤抗原的中枢耐受性(见第2.1.1节)、肿瘤和HLA的异质性以及肿瘤免疫微环境]。这些因素深刻地影响了mRNA癌症疫苗的发展。从内在因素来看，研究人员通过改进mRNA的结构和序列，改进mRNA的制备和纯化技术(见第2.2.1节)，开发新的传递载体(见第2.3节)，在一定程度上提高了mRNA癌症疫苗的有效性。肿瘤异质性的本质是肿瘤细胞的基因组异质性，导致抗原异质性，这是影响抗肿瘤T细胞反应产生的关键因素，也是开发个性化癌症疫苗的主要原因。HLA异质性主要是指个体间HLA分子类型的不同，导致个体间这些分子对肿瘤抗原的结合区域或结合亲和力存在差异，从而影响抗肿瘤T细胞反应的产生和强度。HLA异质性是由HLA等位基因在不同民族和地区人群中的多态性引起的。HLA Ⅰ等位基因包括9-11个常见超型，其覆盖率为90%。HLA-A loci (HLA-A等位基因：A*0101、A*0201、A*0301、A*1101和A*2402)占HLA-Ⅰ等位基因的60%，HLA-B loci (HLA-B等位基因：B*0702、B*0801、B*2705、B*3501和B*5701)占这些等位基因的35%以上。TME由免疫细胞、间充质细胞以及多种细胞因子和组织因子组成，在肿瘤发生和免疫逃逸中起重要作用。大质量内的间质压力可减少大分子(如抗体)和效应细胞(如T细胞)的扩散。大多数实体瘤也缺乏T细胞共刺激分子。TME通常含有免疫抑制细胞，包括CD4+Tregs, MDSCs，抑制性CD8+T细胞，M2 TAMs和调节性NK/NKT细胞。这些免疫抑制细胞和TME中的肿瘤细胞可以释放大量可溶性的免疫抑制因子，包括转化生长因子β、IL-10、PD-L1、吲哚胺2,3-双加氧酶和血管内皮生长因子等，进入微环境。考虑到肿瘤和HLA的异质性，肿瘤新抗原疫苗的开发在理论上比TAA定向疫苗具有更强的特异性抗肿瘤作用和更弱的毒副作用，一直是癌症疫苗研究的主要热点(见2.1.2节)。鉴于肿瘤免疫微环境，开发基于免疫的联合疗法(例如，与佐剂或免疫检查点抑制剂联合)已成为癌症疫苗应用的一个关键趋势(见第2.1.4和2.4节)。4.讨论产品的临床前评价是进入临床转化的前提，合理的评价可以提高预测临床结果的可靠性。临床前评价所采用的参数、技术和方法是疫苗质量标准的重要组成部分。疫苗的临床前评价应充分阐明疫苗的作用和机制，而mRNA肿瘤疫苗临床前评价的重点是确定抗原特异性T细胞反应的产生(如T细胞的数量和活化)和效果(如T细胞的杀伤作用和抗原亲和力)。一般来说，在临床前评估中，定量的体外和体内试验用于评估mRNA癌症疫苗的效果和机制。根据目前对抗原特异性T细胞免疫应答的认识，评价参数主要包括①鉴定疫苗的理化特性；②mRNA转染APC的效率(如结合与摄取、内化与转运、表达与分布)；③APCs的分化、成熟和抗原提呈；④疫苗免疫刺激；⑤细胞免疫原性(如CTL的产生、增殖和靶细胞杀伤)；⑥体液免疫原性；⑦抗肿瘤作用及相关机制；⑧初步毒性（如细胞毒性、内脏毒性和溶血）。诸如颗粒大小、电荷、对mRNA的结合能力和负载率、稳定性(如时间、温度和血清稳定性)、聚乙二醇化和硬度等因素可影响抗原递送(如淋巴引流)。Son等人研究表明，尺寸为~220 nm的Mann-capsules具有良好的变形能力，通过50 nm孔膜后的回复率约为30%。与基于蛋白质或肽的疫苗不同，mRNA疫苗开发的第一步是确保mRNA序列中编码的信息能够有效地翻译成相应的蛋白质或肽。mRNA的体外和体内转染效率是mRNA疫苗临床前评价的重要参数，提高mRNA的转染效率是提高mRNA疫苗药效学的关键途径。然而，APCs的体外转染效率可能存在差异，DOTAP/ DP7 - 增加了绿色荧光蛋白mRNA在APCs(包括293T、JAWSII、DC2.4和BMDCs)中的体外转染效率分别为84.87±3.21%、12.23±1.35%、28.49±2.46%和14.51±2.35%。为了验证mRNA在体外和体内的转染效率，我们以多种APCs作为体外转染模型，在体内检测不同器官的多种APCs的mRNA转染效率。增强绿色荧光蛋白(FLuc)是实验中常用的转染蛋白。染料标记的mRNA或疫苗载体已广泛用于转染研究。共聚焦显微镜和流式细胞术常用于评估细胞内微转染(如递送、摄取和翻译)，共聚焦显微镜可更直观、准确地评估mRNA的翻译效率，交互式视频信息系统可用于评估全身或局部大转染(如分布、淋巴引流)。用于体内抗肿瘤活性评价的肿瘤模型主要包括治疗性或预防性皮下、原位和肺转移肿瘤模型，所建立的体内肿瘤模型应准确模拟人体病理。Bialkowski等人的研究表明TC-1肿瘤的TME可因肿瘤接种部位(即皮下、肺部和生殖道)的不同而有显著差异，这直接影响了E7-TriMix mRNA疫苗的抗肿瘤效果。在选择用于临床前评估的细胞或动物模型时，物种特异性是需要考虑的重要因素。为了获得更准确的评价信息，可以建立人源化动物模型。通过静脉注射人外周血单个核细胞(HLA-A2型)的CD34+造血干细胞建立的人源化小鼠，进入免疫缺陷NOD/ shi-scid IL-2Rγnull小鼠或C57BL/6小鼠，建立体内肿瘤模型(如结果表明，转染修饰的人CD133 mRNA的DCs处理人源化小鼠模型的中位生存期大于60天，转染修饰的小鼠CD133 mRNA的DCs处理同源小鼠肿瘤模型的中位生存期为38天。肿瘤疫苗理论上具有抗肿瘤复发和转移的作用，可以建立多种体内肿瘤模型进行评价，阐明这些疫苗在预防或治疗肿瘤转移或复发方面的优势。有效的抗肿瘤反应需要多个免疫细胞的协同作用，而不是单个细胞的作用。目前，大多数肿瘤疫苗的重点是诱导CD8+T细胞，但CD4+T细胞等免疫细胞在诱导和维持免疫记忆、增强CTLs的肿瘤杀伤作用中也发挥着重要作用。采用NKT配体(如α-GC)作为佐剂的mRNA Galsomes通过iNKT细胞诱导抗肿瘤作用。在含有CD4+和CD8+T细胞的培养系统中转染CD133 mRNA的DCs比仅含有CD4+或CD8+T细胞的培养系统中的DCs更有效地激活T细胞并杀死肿瘤靶细胞。也有人担心mRNA癌症疫苗的安全性和副作用。修饰后的mRNA可与血清蛋白结合形成血管闭塞，具有潜在的毒性。DOTAP/DP7-C mRNA具有良好的血清稳定性和较低的细胞毒性；然而，Lipo2000和PEI25K具有很强的细胞毒性。最后，我们期待mRNA癌症疫苗的成功临床转化。参考资料：He Q, Gao H, Tan D, Zhang H, Wang JZ. mRNA cancer vaccines: Advances, trends and challenges. Acta Pharm Sin B. 2022 Jul;12(7):2969-2989. doi: 10.1016/j.apsb.2022.03.011. Epub 2022 Mar 23. PMID: 35345451; PMCID: PMC8942458.
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|---|---|---|---|---|
| 非小细胞肺癌 | 临床2期 | 比利时 | 2015-11-07 |
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| 研究 | 分期 | 人群特征 | 评价人数 | 分组 | 结果 | 评价 | 发布日期 |
|---|
AACR2024 人工标引  | 临床1期 | 57 | 淵鬱網窪餘繭廠願網齋(艱觸艱鹹積積鑰鹹蓋鏇) = 鹽壓淵襯鑰構窪餘鑰構 廠顧構鹹鬱襯醖醖廠簾 (積糧壓糧醖膚鑰構壓鏇 ) 更多 | 积极 | 2024-04-05 | ||
淵鬱網窪餘繭廠願網齋(艱觸艱鹹積積鑰鹹蓋鏇) = 鹽繭網憲蓋膚壓網憲鏇 廠顧構鹹鬱襯醖醖廠簾 (積糧壓糧醖膚鑰構壓鏇 ) 更多 | |||||||
临床1/2期 | 61 | (Arm A: BI 1361849 mRNA Vaccine + Durvalumab) | 範簾製積網壓選夢網構(衊簾鑰淵膚鏇網願顧齋) = 夢窪簾衊憲衊顧鑰積淵 鑰憲糧選窪鹽壓衊鏇夢 (醖廠範壓製網鹽膚願齋, 糧壓夢淵繭壓繭構構構 ~ 鏇願憲衊蓋醖醖夢繭餘) 更多 | - | 2022-09-27 | ||
(Arm B: BI 1361849 mRNA Vaccine + Durvalumab + Tremelimumab) | 範簾製積網壓選夢網構(衊簾鑰淵膚鏇網願顧齋) = 窪醖繭簾齋積繭夢遞製 鑰憲糧選窪鹽壓衊鏇夢 (醖廠範壓製網鹽膚願齋, 範艱艱艱鹽衊壓鬱願鬱 ~ 鏇餘選齋顧簾築築簾窪) 更多 | ||||||
临床1期 | 26 | 範遞繭衊糧夢艱簾膚淵(遞夢窪夢壓衊鹽鬱壓齋) = Three patients had grade 3 BI1361849-related adverse events (fatigue, pyrexia); there was one grade 3 radiation-related event (dysphagia) 製顧窪夢觸鏇窪艱網鏇 (觸齋築積鑰築範繭繭鏇 ) 更多 | 积极 | 2019-02-08 |
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