Recombinant coagulation factor VIII ( Sino Cell Technologies)

摘要：使用腺相关病毒（AAV）载体的基因转移在过去十年中取得了巨大进展，并成功治愈了血友病A和B等严重疾病。然而，对AAV衣壳抗原或转基因产物的免疫反应仍在阻碍这一进展。旨在减弱T细胞反应的免疫抑制在一些患者中显示出成功，但在其他人中失败，特别是在接受了非常高AAV载体剂量的患者中。尽管最初认为AAV载体只引起低于系统性症状阈值的边缘先天反应，但最近的试验表明，补体激活可能导致严重的不良事件。背根神经节毒性也被发现是高载体剂量的并发症，同样严重的肝毒性也是如此。大多数严重并发症发生在接受非常高载体剂量的患者中，这表明应该探索使用更高效的AAV载体以允许剂量减少或反复给予较小剂量，后者结合抗体或B细胞耗竭措施。 1.  引言 基于腺相关病毒（AAV）载体的基因转移技术在减轻症状甚至治愈由单基因缺陷引起的疾病方面取得了进展，例如Leber先天性黑蒙症，这是一种先天性失明，或由于凝血因子9基因功能丧失突变引起的血友病B。尽管AAV载体的免疫原性较差，并且在小鼠、狗和非人灵长类动物中能持续多年，但接受大剂量注射的人类会针对AAV衣壳或甚至转基因产物产生T细胞和B细胞反应。T细胞可能导致转导细胞的排斥，而B细胞如果产生AAV中和抗体，则会阻止载体的再次成功应用。更糟糕的是，如果抗体中和了可溶性转基因产物，它们可能会干扰传统的蛋白质疗法。通过在基因转移期间或之后给予的免疫抑制剂，部分可以预防针对AAV载体转导细胞的免疫介导排斥。免疫抑制药物改善了AAV介导的基因转移的疗效，但有些患者没有反应，仍然排斥AAV转导的细胞，而其他人不需要药物，但仍然接受治疗，因为目前还无法预测哪些患者会产生破坏性的免疫反应。尽管在过去二十年中，我们对AAV自然感染或不同血清型AAV载体介导的基因转移在不同剂量下应用于不同器官时的先天和适应性免疫反应有了更好的理解，但一些基本问题仍然没有答案。本文综述了AAV引起的不同类型的免疫反应，以及它们如何转化为缺乏疗效甚至更糟的毒性（图1）。 图1：AAV载体的免疫反应和毒性。图表显示了注射AAV载体时引发的不同类型的免疫反应。毒性在下方被下划线标出，并列在可能促成不良事件的免疫反应成分旁边。图表中使用了以下缩写：CpG，未甲基化的CpG基序；C1和C3，补体因子1或3；DCs，树突状细胞；DRG，背根神经节，dsRNA，双链RNA；MAC，膜攻击复合物；MHC，主要组织相容性复合体；NK细胞，自然杀伤细胞，TMA，血栓性微血管病，？- 仍有待更详细的测试。 2.  AAV和AAV载体的基本生物学 AAV是依赖病毒，自然感染灵长类和其他物种，在辅助病毒如腺病毒的帮助下可以复制。作为一个属，它们对静止和分裂的宿主细胞具有广泛的范围，尽管不同血清型的AAV或AAV载体具有更有限的嗜性；例如，在人类中，AAV1载体对肌肉有很高的嗜性，而AAV2载体容易感染肺和脑细胞。嗜性可能因物种而异：AAV8载体比人类更有效地感染小鼠肝细胞。AAV感染无症状，病毒在个体一生中持续存在。然而，AAV具有免疫原性，因为它们刺激可检测的B细胞和T细胞反应。由于长期适应性免疫的诱导依赖于需要通过炎症信号驱动的先前成熟来呈现抗原的细胞，AAV感染必须能够触发先天免疫反应，在自然感染中，这些反应可能部分由辅助病毒驱动。AAV携带一个单链DNA基因组，有两个开放阅读框架（ORF），编码调节蛋白以及衣壳抗原。基因组两侧有反转末端重复（ITR）序列。在AAV载体中，两个ORF被删除，并替换为治疗蛋白或RNA的表达载体；在病毒生产过程中，删除的序列以及来自辅助病毒的必要序列以转录方式提供。注射后，AAV载体的衣壳抗原存在于接种物中，但与转基因产物不同，它们不是由转导细胞积极产生的。这反过来限制了衣壳抗原向免疫系统呈现的持续时间，直到蛋白质被降解，根据临床试验结果，这可能需要几个月。 3.  免疫学101：与AAV及其载体相关的知识 3.1.  先天反应 病毒或病毒载体在其抗原或基因组中携带病原体相关分子模式（PAMP），这些在哺乳动物中不存在，因此被所谓的病原体识别受体（PRR）识别为威胁，PRR位于细胞表面、内体内部或细胞质中。某些类型的PRR表达，如Toll样受体（TLR），通常具有细胞类型特异性；例如，巨噬细胞表达TLR2但不表达树突状细胞，而TLR3的表达模式正好相反。PAMP与PRR结合启动一个信号级联反应，最终激活转录因子，如核因子κB（NF-kB）、激活蛋白1（AP-1）、干扰素调节因子（IRF）-3和-7。这启动了炎症介质的产生，如细胞因子和趋化因子，树突状细胞成熟为专业的抗原呈递细胞，激活其他先天免疫系统的细胞，如自然杀伤细胞、巨噬细胞和中性粒细胞。病毒也可以通过启动通常由内质网（ER）应激触发的未折叠蛋白反应来引发炎症反应。例如，表达凝血因子VIII的AAV载体由于该蛋白的过度表达而触发ER应激反应；ER应激又可能促进针对AAV或FVIII特异性免疫反应的激活。在大多数情况下，先天免疫反应是非抗原特异性的，它们的激活是短暂的，它们缺乏“记忆”，因此第二次暴露于同一病原体会引发非常相似的反应。 补体系统是先天免疫系统的一部分，但在某些方面依赖于适应性免疫系统的效应分子，它为抵抗病毒提供了关键的防御机制。它可以直接杀死或中和病毒，它可以聚集病毒，促进白细胞的吞噬作用，并且与病毒特异性抗体协同杀死感染细胞，从而阻止新病毒后代的产生。有三条途径可以通过几个步骤激活补体形成所谓的膜攻击复合物（MAC）。在经典途径中，抗原-抗体复合物激活C1复合物，然后分别将C2和C4分裂成a和b。C4b和C2b形成一个名为C3转化酶的复合物，它将C3分裂成a和b；后者与C4bC2b复合物一起消化C5成a和b。C5b与C6、C7、C8和C9结合形成MAC。在凝集素途径中，病毒碳水化合物与甘露糖结合凝集素（MBL）/纤维胶凝集素-甘露糖相关丝氨酸蛋白酶1（MASP）复合物结合，激活C1复合物。一些病毒激活替代补体途径。这条途径在低水平持续转化C3为C3a和C3b。通常，补体抑制因子H和I使C3b失活，防止途径完全激活。一些病毒与C3b结合导致补体因子B分裂成a和b。Bb与C3结合形成替代C3转化酶，可以裂解C3成a和b，从而实现补体的完全激活。激活的补体引发炎症反应，作为中性粒细胞的强大吸引剂，触发凝血途径，损伤内皮细胞并激活血小板，这可能导致微血管损伤和血栓形成。AAV载体与补体因子C3结合，但正如AAV8载体所示，也提高了补体抑制因子H和I；因此，人们认为AAV载体不会直接激活替代补体途径。 3.2.  适应性免疫反应 抗原特异性适应性免疫反应比先天反应出现得更慢，根据抗原负荷、抗原暴露部位和炎症反应的强度，可能需要一到几周的时间才能在血液中检测到。B细胞识别可溶性或表面结合抗原上的线性或构象表位。初始B细胞首先分化成短暂存活的浆细胞，主要产生未经过亲和力成熟的IgM抗体。在滤泡T辅助细胞的帮助下，抗原暴露的B细胞然后形成生发中心，在那里它们经历类别转换和亲和力成熟，随后分化为长期存活的浆细胞和记忆B细胞。长期存活的浆细胞归巢到淋巴组织和骨髓，后者为它们提供了一个可以存活数十年的生态位。记忆B细胞主要留在淋巴结或脾脏。在再次遇到它们的抗原时，它们要么增殖并经历额外的亲和力成熟，要么承担效应功能并开始分泌抗体。记忆抗体反应通常比初次反应更快出现，峰值反应更高更持久，抗体对它们的认知抗原的亲和力也增加了。它们对T细胞帮助的依赖性也较小，T细胞帮助基本上是用来诱导初次成熟的抗体反应。 T细胞通过细胞内降解病毒蛋白产生的小肽激活。肽与MHC分子结合，然后被运输到细胞表面，与MHC类I分子结合的肽被CD8+ T细胞识别，而与MHC类II分子结合的肽触发CD4+ T细胞反应。MHC类I分子存在于大多数细胞上，而MHC类II分子仅由免疫系统的细胞如巨噬细胞、树突状细胞和B细胞表达。激活后的CD4+ T细胞根据炎症反应的类型和T细胞受体（TcR）信号的强度分化为不同的亚群，即Th1细胞，它们促进CD8+ T细胞反应，Th2细胞，它们推动B细胞激活，Th17细胞，它们诱导强烈的炎症反应并激活中性粒细胞，Th22细胞，在保护皮肤免受感染方面发挥作用，以及调节性T细胞（Tregs），它们抑制效应T细胞反应，对维持对自身抗原的耐受至关重要。 原始CD8+ T细胞的激活通常需要来自CD4+ T细胞和成熟的树突状细胞的帮助，这些细胞呈现MHC类I肽复合物以及如CD80或CD86等共刺激因子，这些因子与T细胞上的CD28结合。原始CD8+ T细胞可以通过直接感染的树突状细胞激活，或者对于那些无法感染这些关键抗原呈递细胞的病毒，通过一种称为交叉呈递的过程来激活。CD8+ T细胞对抗原极其敏感，仅有2-4个MHC类I肽复合物就可以触发反应。激活后，CD8+ T细胞将其代谢转向糖酵解能量产生。这种转变对于产生完全功能的效应T细胞至关重要，因为它支持T细胞的快速增殖，并为分裂的细胞和效应分子提供构建块。激活后，CD8+ T细胞迁移到感染组织，在那里它们释放抗病毒细胞因子，如干扰素（IFN）-γ，或通过释放穿孔素和颗粒酶B裂解表达抗原的细胞。一旦表达抗原的细胞被清除，大多数激活的CD8+ T细胞就会经历凋亡，剩余的细胞分化为不同亚群的记忆细胞：效应记忆细胞循环，它们仍然部分激活，并且可以立即开始效应功能而无需进一步增殖；中央记忆细胞归巢到淋巴结，它们是“休息的细胞”，在遇到它们的抗原后增殖，然后成为效应细胞。组织驻留记忆细胞可以在几乎所有组织中找到；它们通过在遇到它们的认知抗原时立即承担效应功能，提供快速的局部保护。在病毒载量保持高水平的慢性感染期间，会导致所谓的T细胞耗竭：T细胞上调其表面的共抑制分子，改变其代谢从糖酵解能量产生转向脂肪酸氧化，经历不可逆的表观遗传变化，失去功能，并最终死亡。病毒持续感染，要么进入潜伏期，要么仅以非常低的水平存在，不会导致T细胞耗竭，但可能导致免疫系统过度反应。记忆CD8+ T细胞的召回比初次反应的激活要求不那么严格。记忆CD8+ T细胞可以在没有共刺激因子的情况下由抗原呈递激活，不再需要T细胞帮助。然而，记忆CD8+ T细胞激活的抗原阈值略高于原始T细胞。 4.  AAV载体的免疫反应和毒性 免疫反应和相关的不良事件与AAV载体剂量直接相关，并部分与应用方式有关。低至中等剂量，如用于眼部疾病矫正或使用优化的转基因产物治疗血友病B的注射剂量，通常未能诱导可检测的T细胞反应，尽管它们可能刺激AAV衣壳特异性抗体反应。给予免疫特惠部位如大脑或免疫抑制微环境如肝脏的AAV载体不太可能引发强烈反应，而系统性给予或给予肌肉的载体则相反。尚未证明但有可能的是，年龄也可能起作用，因为老年人的先天和适应性免疫系统功能下降。先天反应如补体激活在AAV基因转移后可能导致显著毒性，但大多数不良事件与适应性反应有关。针对转基因产物的T细胞和B细胞反应已有报道，但适应性免疫系统更常见的是对AAV衣壳的抗原反应。尽管大多数人类，除了非常年幼的儿童外，可能对AAV衣壳抗原具有免疫记忆，但目前尚不清楚这些细胞的召回是否是AAV基因转移时遇到问题的根本原因，或者高载体剂量的初次反应是否应受责备。需要获得这些知识，因为它影响哪种免疫抑制方案可以减弱AAV特异性免疫反应并允许持续的转基因产物表达。正在探索的许多药物，如雷帕霉素，一种mTOR抑制剂，将阻断适应性免疫系统原始细胞的刺激，而不影响召回反应。同样，通过修改AAV载体的PAMPs减少炎症信号可能会减少初次反应，但对记忆细胞的重新激活影响有限。 4.1.  先天反应 与其他病毒相比，AAV或基于AAV的载体只引起适度的炎症反应，这可以通过TLR9与载体基因组中未甲基化的CpG序列结合触发，通过衣壳蛋白中的PAMP与TLR2结合，以及可能通过双链RNA，这可能与黑素瘤分化相关蛋白5（MDA5）相互作用，MDA5是RIG-I样受体家族的一个螺旋酶，作为细胞质PRR。TLR2和TLR9由单核细胞和巨噬细胞表达。骨髓树突状细胞对TLR2呈阳性，而浆细胞样树突状细胞，是I型IFN的丰富来源，对TLR9呈阳性。MDA5广泛表达。通过AAV的PAMPs阻断先天PRR激活减弱了初次而不是二次免疫反应。最常用的方法是从AAV载体的基因组中去除富含CpG的序列。动物研究表明，减少载体的CpG基序减弱了CD8+ T细胞反应，而没有改变B细胞反应。ITRs非常富含CpG序列，不能修改，以至于完全耗尽AAV载体基因组的CpG可能不可行。由AAV载体触发的适度先天免疫反应可能足以推动适应性免疫反应，但到目前为止，它们并没有与其他病毒载体（如腺病毒载体）在临床试验中直接和早期引起的毒性联系起来。这样的载体，即使是作为疫苗以适度剂量使用，也会在8-24小时内在许多患者中引起1-3级系统反应，而用于基因治疗的高剂量已导致由于先天免疫系统的超激活而导致死亡。然而，随着越来越高剂量的AAV载体进入临床试验，先天免疫反应可能会加入到可以引起基因转移受者严重不良事件的免疫反应列表中。 4.2.  补体反应 在一些年轻患者中，高剂量的AAV（等于或高于5 x 10^13 vg/kg）已导致血栓性微血管病（TMA），伴有溶血性贫血、血小板计数低和溶血性尿毒症综合征（HUS），导致肾脏损伤，即使在给予类固醇的情况下也是如此。用于脊髓性肌肉萎缩症（SMA）的AAV载体在超过1400名个体中进行了矫正，导致4个月至4岁女孩中出现9例TMA病例。在杜氏肌营养不良症（DMD）治疗试验中，注射表达小型肌营养不良蛋白的AAV9载体在15名7-12岁男性接受者中有4例出现TMA。在所有病例中，症状在基因转移后6-12天开始。大多数患者通过血浆置换、类固醇、血液透析、血小板输血和eculizumab（一种补体抑制剂）成功治疗。尽管如此，SMA和DMD治疗组各有一名患者因TMA并发症死亡。原发性TMA是由影响补体调节的遗传性或获得性缺陷引起的。继发性TMA是由其他病理条件如恶性肿瘤、药物、感染、自身免疫等引起的补体激活引起的。可以诱导继发性TMA的感染包括流感病毒、SARS-CoV-2或B19病毒，后者是一种与AAV有关的细小病毒。 AAV基因转移后的TMA与补体的病理激活有关。一些病毒如SARS-CoV-2携带可以激活补体凝集素途径的基序。这条途径不太可能涉及AAV基因转移后的TMA。补体激活的经典途径需要AAV载体与抗体结合。在AAV基因转移后，不仅可以通过传统的未切换的B细胞，还可以通过B1和边缘区（MZ）B细胞非常快速地在3到4天内诱导IgM反应，由于IgM是补体的有效激活剂，这些早期抗体可以结合AAV并启动TMA。这将要求在抗体产生时AAV颗粒仍然可以在血液或间质液中被获取。使用生物发光AAV颗粒的动物研究表明，AAV被细胞非常迅速地吸收，一旦病毒穿透细胞膜，它就免于抗体的屏蔽，这使得补体激活途径在TMA患者中的可行性受到质疑。或者，补体激活的经典途径可能被预先存在的AAV结合抗体触发；尽管大多数AAV基因转移试验只招募没有可检测到的AAV中和抗体的接受者，但这并不一定排除低水平的结合抗体或甚至自然发生的IgM的存在，这些抗体可以与AAV载体低亲和力结合。应该重新考虑替代补体途径的激活。如上所述，已知AAV与C3结合，同时上调补体抑制因子I和H可能不足以阻止高载体剂量激活途径。然而，TMA的发病时间学，最早在基因转移后第6天被检测到，反驳了AAV载体通过替代补体途径激活的说法。 4.3.  B细胞反应 AAV特异性B细胞反应可以由自然感染引起，或者可以被AAV基因转移刺激或召回。但是，考虑到AAV诱导的抗体对补体激活和TMA的潜在贡献，这种免疫反应不会伤害患者，但通过中和载体，阻止它们传递有效载荷，从而排除了成功的AAV介导的基因转移。已经尝试过改变载体衣壳以避免其中和，尽管成功有限，因为许多抗体结合的领域对转导至关重要。空的AAV颗粒被用作抗体诱饵，但这种方法可能会增加T细胞反应的诱导。血浆置换，包括选择性去除AAV特异性抗体的方法，已在具有预先存在的中和抗体的动物中允许成功的AAV转导。通过使用Imlifidase（IdeS），一种链球菌半胱氨酸蛋白酶，能够将IgG裂解成F(ab’)2片段和Fc，获得了类似的结果。 对分泌型转基因产物的中和抗体的诱导可能非常有害，因为这些抗体可能使传统的蛋白质治疗复杂化。这种反应的刺激似乎取决于载体应用的途径。肝转移AAV载体表达因子VIII或IX，这是用于矫正血友病的途径，到目前为止还没有导致转基因产品中和抗体的形成，这可能部分反映了Tregs的抑制作用，长期存在的蛋白质治疗随着时间的推移导致耐受性，以及仔细选择患者排除那些有抑制物形成史的人。相比之下，至少在动物中，肌肉注射表达F.IX的AAV载体导致抑制物的形成。 动物研究表明，通过例如雷帕霉素和依布替尼的免疫抑制治疗，可以阻断或至少减弱对转基因产物的初次抗体反应。然而，免疫抑制将需要长时间的，甚至是基因转移接受者的寿命，考虑到药物对感染敏感性的影响，可能不是一个可行的选择。 4.4.  T细胞反应 在用于矫正血友病B的早期基因治疗试验中，AAV载体接受者最初产生的F.IX水平足以减轻他们的症状，但大约4周后发展为亚临床性转氨酶升高，伴随着循环中的AAV特异性T细胞增加和转基因产物表达丧失。T细胞进一步被鉴定为属于CD8+ T细胞亚群，人们认为它们反映了先前自然感染引起的T细胞的记忆反应。随后的试验在基因转移后仔细监测患者的病情，并用类固醇治疗肝酶的增加，这消除了T细胞反应并允许持续的F.IX表达。在需要通过静脉注射大量AAV载体的神经肌肉疾病的试验中，一些患者的肝毒性更为严重。大约三分之一的Onasemnogene abeparvovec接受者，这是一种FDA批准的用于SMA治疗的AAV9载体疗法，表现出与主要由CD8+ T细胞组成的炎症反应相关的肝损伤。到目前为止，所有患者在类固醇治疗后都已康复。 尽管CD8+ T细胞是系统性AAV基因转移引起肝损伤最可能的原因，但效应细胞来自记忆细胞库的假设应该重新审视。在大多数血友病患者中，反应出现得非常慢，这更符合初次而非二次T细胞反应的特征。此外，在大多数AAV患者中，T细胞的激活可以通过在基因转移时或转氨酶升高时给予的泼尼松阻止。对其他抗原的研究表明，类固醇通过影响T细胞转换为糖酵解能量产生的作用；这阻止了原始CD8+ T细胞和具有低亲和力而非高亲和力受体的记忆CD8+ T细胞的激活。考虑到AAV基因转移接受者中的CD8+ T细胞反应是由来自输入病毒颗粒的衣壳蛋白的有限量的抗原驱动的，这些病毒颗粒在几周至几个月内缓慢降解，很难想象肝脏毒性是由针对仅与MHC类I分子低亲和力结合的表位的T细胞引起的。 4.5.  免疫反应在AAV基因转移引起的其他不良事件中的潜在作用 4.5.1.  致命性肝毒性 在一项针对X连锁肌管肌病的治疗试验中，四名患有预先存在的肝病的患者在接受AAV基因转移几周后死亡。患者对免疫抑制药物没有反应，他们的肝脏没有细胞浸润的证据，这导致结论是直接的载体或转基因产物毒性而不是T细胞引起了致命性肝损伤。我想指出，即使是在肝脏的门脉和周围门脉区域的微小T细胞反应，也可能损害肝脏循环，这在预先存在肝病的患者中可能变得致命。任何需要非常高剂量载体的AAV基因转移试验都应该仔细监测血液中的AAV衣壳特异性T细胞，以帮助分析潜在的严重不良事件，而这样的数据在XLMTM试验中并不可用。 4.5.2.  背根神经节（DGR）毒性 在非人灵长类动物中的研究表明，通过鞘内、脑室内、小脑延髓池内以及在较小程度上通过静脉转移大量AAV载体可能会引起DGR毒性，而免疫抑制并不能减轻这种毒性。大多数动物保持无症状，但在安乐死时显示出中枢和周围神经系统的组织学病变，伴有轴突退行性变、神经元细胞损伤以及B细胞和T细胞浸润。随后的研究表明，通过转移micro (mi)RNA138可以阻断非人灵长类动物的DGR毒性，这减少了神经元中的转基因表达，表明是转基因产物的直接毒性而不是免疫机制介导了这一不良事件。 在临床试验中也观察到DRG毒性。在一个试验中，两名家族性肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者和突变在编码超氧化物歧化酶1（SOD1）的基因中，通过单次鞘内注射编码针对SOD1的microRNA的AAV载体进行治疗。一名患者在接受基因转移当天用泼尼松治疗，治疗后约4周显示出循环中的AAV衣壳特异性T细胞增加，并同时发展出神经症状，根据MRI扫描与DRG毒性一致。第二名患者接受了更积极的免疫抑制方案；他的T细胞反应较低，出现较晚，没有发展出神经症状，他的MRI没有异常。 在另一个试验中，两名接受免疫抑制的患者接受了通过静脉注射表达生存运动神经元1的rhAAV10载体治疗SMA 2型，再次一名患者发展为DRG毒性。目前尚不清楚，在人类中适应性免疫反应，如AAV特异性CD8+ T细胞，是否促成了DRG。 4.6.  心肌炎在DMD患者中 如上所述，炎症环境对于触发适应性免疫反应至关重要，而在AAV基因转移中，这是由AAV载体中或上的PAMPs触发的。一些疾病，如DMD，其特征是肌肉浸润的白细胞对肌肉纤维退化反应，增加了促炎细胞因子的分泌，这可能加剧免疫介导的不良事件。如果加剧的炎症影响心肌，这是特别令人担忧的。事实上，在辉瑞的一个Ib期试验中，2名DMD患者在接受了表达小型肌营养不良蛋白的AAV9载体后观察到心肌炎；其中一名患者死亡（https://pharmaphorum.com/news/myocarditis-case-mars-sareptadmd-gene-therapy-readout/）。在Sarepta Therapeutics使用AAVrh74载体进行的第二个小型肌营养不良蛋白1试验中，20名患者中有1名也发展为心肌炎（https://investorrelations.sarepta.com/news-releases/news-releasedetails/sarepta-therapeutics-investigational-gene-therapy-srp-9001），通过类固醇治疗得到解决。尽管AAV载体诱导的心肌炎的病因尚未完全理解，但似乎DMD患者受损肌肉组织中的炎症环境有利于诱导对AAV载体转基因产物的免疫反应，或者AAV载体诱导的额外炎症反应促进了对肌肉细胞的自身反应性T细胞反应。 5.  结论 免疫系统介导的毒性继续挑战AAV载体成功基因转移，特别是当需要高剂量来纠正目标遗传疾病时。免疫抑制，可以进一步优化，已成功用于减弱一些AAV载体诱导的免疫反应，但在其他情况下失败了。更令人担忧的是，最近描述的一些严重甚至致命的不良事件，如TMA、暴发性肝毒性或心肌炎。TMA是由过度的补体激活引起的，但目前尚不清楚这一途径在AAV基因转移中是如何激活的，以及影响补体系统的遗传变异是否起作用。在系统转移非常高剂量的AAV载体时，T细胞介导的严重肝毒性是可以预期的，观察到预先存在肝病的患者死亡可能有不同的病因，仍有待更详细地调查。 避免对非常高剂量的AAV载体转移的免疫介导毒性没有简单的途径；我们的免疫系统经过漫长的进化，将病毒视为威胁，并相应地通过清除它们及其感染的细胞来做出反应。每场战争都会造成附带损害，免疫系统对病毒或AAV载体进行的战斗也不例外。在这个阶段，我们的重点可能必须从使用过高剂量的AAV载体转移。我们的努力应该集中在开发能够更有效地转导细胞、实现更高转基因产物表达或提供更高活性转基因的载体上；这两种方法都可以实现剂量节约。同时，该领域应该探索选择性阻断B细胞对AAV基因转移反应的免疫抑制方案。通过抑制B细胞激活或从循环中去除这类抗体来预防基因转移后AAV中和抗体的诱导，将允许重复使用较低剂量的AAV载体，以替代目前使用的冲击疗法。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:体内基因疗法正迅速成为单基因遗传病治疗的新范式。近三十年来，血友病A（HA）和血友病B（HB）一直是基因疗法发展中的模型疾病。这一努力即将结出硕果，已完成的关键腺相关病毒（AAV）载体基因增加试验报告了令人鼓舞的结果，并且预计在不久的将来，当前一代的HA和HB AAV载体将获得监管批准。在这里，我们回顾了AAV基因疗法在HA和HB中的临床发展，并审视了最近从血友病和其他单基因疾病的AAV临床试验中浮现出来的突出问题。 1.引言 先天性血友病A（HA）和血友病B（HB）是由于凝血因子VIII（FVIII）或因子IX（FIX）的缺乏而引起的X连锁出血性疾病。血友病的出血特点主要是关节和肌肉出血，尽管出血到封闭空间可能是致命的。出血表型的严重程度由因子活性预测。严重疾病的患者因子活性低于正常值的1%，并且经常自发出血，而中度疾病的患者因子活性为正常值的1-5%，在轻微创伤后出血，有时也会自发出血，轻度疾病的患者因子活性为正常值的5-40%，通常只在受伤时出血。在现代血液银行出现之前，血友病是一种致命的儿科疾病；然而，血友病护理的持续进步显著改善了结果，以至于现在预计在资源丰富的国家血友病患者的预期寿命是正常的。重要的是，目前血友病治疗的成本使得世界上80%的血友病患者无法常规获得护理。目前的护理标准是反复输注FVIII或FIX浓缩物以改善止血，这是对出血的响应或预防出血的预防性措施。最近，一种模拟FVIII功能的双特异性抗体emicizumab已获准用于HA，其他针对HA和HB的新方法也处于不同的临床开发阶段。Emicizumab通过皮下注射给药，现在在美国用于大多数有无FVIII同种抗体的HA患者的预防。大多数在1980年代之前出生的血友病患者因污染的血浆衍生因子浓缩物而获得医源性HIV、HBV和/或HCV感染，这一风险目前已通过使用高效的病毒灭活程序和重组蛋白消除。血友病的预防性治疗基于因子水平和出血表型之间的关联，目标是将严重表型（<1%正常）转换为中度或轻度范围。实际上，这需要每周多次静脉输注FVIII或FIX浓缩物以维持因子活性谷值>正常值的1%，尽管随着延长半衰期因子的出现，这种频率已经降低。最近，一种模拟FVIII功能的双特异性抗体emicizumab已获准用于HA患者，其他针对HA和HB的新方法也处于不同的临床开发阶段。Emicizumab通过皮下注射给药，现在在HA中广泛使用。 2.当前临床开发中的血友病基因治疗策略 对于严重的血友病A（HA）和血友病B（HB），基因治疗提供了一种理想化的预防方案，即单次给予基因传递产品就能提供长期持续的因子水平，足以减轻出血。尽管在过去三十年中研究了多种血友病基因治疗策略，但最先进的方法是使用以肝脏特异性启动子控制的、包含密码子优化的F8或F9变体转基因的系统性给予的重组腺相关病毒（AAV）载体（表1）。HA和HB AAV载体在临床开发中的区别在于结果，包括转基因衍生因子活性水平、表达的持久性、受体间的异质性以及年化出血率（ABR）。迄今为止，只有内源性因子水平≤2%且无晚期肝病的成年男性接受了基因治疗。尽管在HA和HB基因治疗中反复证明了概念验证的成功，但尚未实现所有患者稳定因子表达足以消除或几乎消除出血的目标。 野生型AAV是一种非致病性、复制缺陷的DNA细小病毒。AAV载体由一个二十面体蛋白衣壳组成，包围着基因有效载荷，并在每端由一个倒置末端重复序列所衬托。倒置末端重复序列是表达载体中唯一的病毒来源成分，对于将载体基因组包装到衣壳中以及转导后的环状表观DNA形成至关重要。重组AAV载体是通过使用人类HEK293细胞的瞬时转染或Sf9昆虫细胞的杆状病毒感染的方法制造的。成功的靶组织转导遵循一个不完全理解的多步骤途径，从衣壳被细胞表面受体识别到核中形成环状表观载体基因组。尽管AAV载体基因组主要是非整合性的，但严格的检查显示罕见的整合事件。 载体血清型由组成衣壳的蛋白定义，这影响载体的组织趋向性、宿主对载体的免疫反应以及制造考虑。正在评估自然发生的AAV血清型和生物工程化的衣壳用于血友病基因治疗（表1）。当前基因治疗产品使用的肝脏特异性启动子是人类α1-抗胰蛋白酶（hAAT）启动子的迭代，具有来自ApoE或修改的转甲状腺素启动子的增强元件。 表 1:正在进行的血友病A和血友病B AAV基因治疗试验 缩写：AAV，腺相关病毒；UCL，伦敦大学学院；sc，自互补；ss，单链；vg，载体基因组。 由于全长F8 cDNA（7 kb）超出了AAV载体的包装能力（约4.7 kb），因此基于AAV的HA基因治疗方法使用B域缺失的FVIII变体。虽然B域占F8 cDNA的40%，但它对凝血活性并非必需。大多数研究使用FVIII-SQ变体，这也用于商业重组FVIII产品。一项试验正在评估一种新型B域缺失FVIII变体（FVIII-V3），它在残留B域替代连接链上增加了额外的糖基化位点以改善蛋白质分泌。 F9 cDNA（1.6 kb）很容易包装在AAV载体内。早期基于AAV的HB基因治疗研究使用了野生型FIX。然而，当前AAV方法用于HB使用的是FIX-R338L（FIX-Padua）变体，这是一种自然发生的错义突变，其活性大约是野生型FIX的八倍。R338L替换导致活化的FIX-R338L与活化的FVIII之间的相互作用增强，但它不会改变与野生型FIX相比的FIX-R338L活化或失活。 3.抗AAV抗体的作用 预先存在的AAV中和抗体可能限制目标组织的转导，因此限制治疗效果，尽管预先存在的体液AAV免疫的临床意义尚未完全理解。AAV抗体被量化为总AAV结合抗体或特定的AAV中和抗体（NAbs），一些研究报告了高度的一致性。然而，NAb检测方法并不标准化，根据方法的不同，结果呈现异质性，这使得个别研究观察的普遍性变得复杂。报告的NAb滴度是限制载体转导50%所需的血清稀释度。 抗AAV NAbs在自然感染野生型AAV或系统性重组AAV载体给药后发展；然而，载体给药后发展出的AAV NAb滴度通常至少比环境暴露后发展出的滴度高一个数量级。环境暴露导致大约30%的NAb血清流行率，尽管这在地理、使用的检测方法和血清型方面差异很大。由于AAV血清型2（AAV2）是地方性的，人类通常对AAV2有最高的NAb血清流行率，这些通常在儿童时期发展。对接受系统性AAV载体的第一批受试者的小组分析显示，多达15年后仍持续存在多血清型交叉反应的AAV NAbs；这些结果与人类自然感染后NAb的持续性以及临床前动物模型中系统性AAV载体给药后的NAb持续性一致。重要的是，没有临床数据支持有效策略来克服系统性AAV载体给药后发展出的NAb滴度（即，>1:1,000）。因此，当前数据表明，重复给药AAV载体（相同或替代血清型）将无效。 预先存在的NAbs所施加的效力限制在系统性给药AAV载体的首次人体研究中被识别，该研究在HB男性中进行。在这里，与NAb滴度为1:17的受试者相比，NAb滴度<1:5的受试者观察到更高的FIX转基因水平。基于这些有限的数据，随后的血友病基因治疗大多排除了NAb滴度>1:5的患者（表1）。然而，即使是低滴度NAbs也可能影响效力。我们在评估FIX-R338L用于HB的首次成功试验中观察到，唯一一个有可测量NAb滴度（1:1）的接受者比其他七个完全维持转基因表达的接受者有更低的FIX活性水平，他们的滴度为阴性（<1:1）。 最近，NAbs在限制效力方面的作用受到了对HB的系统性AAV5载体（AMT-061，现在为etranocogene dezaparvovec）的临床开发的质疑。在最初的I/IIa期研究中，排除了AAV5 NAbs阳性的参与者。然而，使用更敏感的基于荧光素酶的NAb检测的回顾性分析显示，在接受载体给药前，10名接受者中有3人有可检测的AAV5 NAbs（范围1:21–1:340），没有明显的转基因表达差异。在非人类灵长类动物的临床前研究中，高达1:1,000的NAb滴度同样没有显示出降低转基因表达。因此，在随后的IIb期和III期研究中，NAb滴度不是排除标准。发表的IIb期数据显示，在3名基于荧光素酶的NAb滴度在1:20到1:50之间的接受者中，FIX活性水平为30-60%。在III期研究的54名受试者中报告了类似的FIX活性水平；然而，具有最高NAb滴度（>1:3,000）的受试者没有反应。这些结果并不是证明预先存在的NAbs对系统性AAV效力无关紧要，而是表明区分可治疗和难治性NAb滴度的阈值取决于NAb检测的特性、给药的载体以及载体剂量。实际上，AMT-061的给药剂量是以前以NAb滴度>1:5作为排除标准的AAV载体研究的四十倍[每公斤2 × 10^13个载体基因组（vg/kg）]（例如，5 × 10^11 vg/kg）；这与动物研究一致，后者证明了载体剂量与排除转基因表达所需的阈值NAb滴度之间的非线性关系。AAV载体对血友病的监管批准可能包括基于相关关键研究的纳入标准。 由于预先存在的抗AAV抗体目前极有可能阻止载体再给药并限制有资格接受AAV基因治疗的患者数量，因此正在进行的工作是开发方法来根除或避免预先存在的抗体以及预防载体给药后的产生。到目前为止，没有动物数据证明能够克服系统性AAV载体后观察到的NAb滴度的量级（即，>1:1,000）。此外，到目前为止，还没有成功的人类系统性AAV再给药。鉴于AAV对血友病的当前临床开发状态和短期内潜在的显著活性改进，当前缺乏证明的载体再给药策略是临床医生和血友病患者在决定基因治疗产品时最重要的考虑因素之一。应向患者提供咨询，使他们充分意识到当前的临床开发状态可能只允许一次终身系统性AAV载体给药；这很重要，以防止如果一种载体最终不如另一种载体，患者会有“买方的遗憾”，并强调在给药前全面了解每种载体的所有可用信息的重要性，以确保做出明智的决定。 4.AAV治疗的短期安全性考虑 迄今为止，在血友病患者中评估的系统性AAV载体剂量（2 × 10^11 至 6 × 10^13 vg/kg）范围内，尚未出现重大安全问题，尽管已有描述的无症状肝毒性和免疫反应。然而，研究血友病中使用的载体剂量更高的AAV基因治疗试验最近揭示了在使用>1 × 10^14 vg/kg载体剂量时观察到的重大安全问题，并表明系统性AAV载体给药的剂量限制毒性（47-50）（补充表1中综述）。虽然剂量限制毒性在药物开发中并不是一个新概念，但现在有证据表明这一普遍概念适用于系统性AAV载体。 4.1AAV短期毒性的出现 在其他疾病队列中观察到的AAV毒性与血友病基因治疗的直接相关性尚未定义。至少，这些新出现的观察结果为使用最低治疗载体剂量提供了理由，并支持治疗医生将AAV作为治疗类别的理解（补充表1）。例如，在评估系统性AAV载体剂量>1.1 × 10^14 vg/kg的一些神经肌肉试验中，观察到在载体后2周内出现的血栓性微血管病（TMA），并有补体激活的证据，符合非典型溶血性尿毒症综合征。虽然发表的文章很少，但报告的数据概述了TMA的终末器官毒性，包括恶性高血压、需要血液透析的肾衰竭，以及对eculizumab的反应性。然而，这种管理并不是普遍有效的，至少有一例患者因TMA并发症死亡。 除了TMA，AAV载体后短期和长期背根神经节（DRG）毒性的可能性最近在一项对256只非人类灵长类动物的荟萃分析中被识别，这些动物接受了33种不同载体，具有可变的血清型、表达盒和给药途径（脊髓内、脑脊液内和系统性）。一些动物显示出轻微的DRG毒性的组织学证据，而临床症状和严重的组织学发现只在两个动物中发现。这种主要是组织学发现的病因尚不清楚，但被假设与转导的DRG细胞中的未折叠蛋白反应有关。迄今为止，这种毒性的临床确认仅限于一名接受了脊髓内给药AAV载体治疗肌萎缩侧索硬化症的试验参与者；症状在使用糖皮质激素后有所减少，但在发表时并未改善。目前尚不清楚DRG毒性是否取决于AAV衣壳、剂量、盒式磁带或给药途径，还是可能的AAV载体平台毒性。 4.2 AAV的肝毒性和免疫反应 所有AAV血清型都能有效转运至肝脏，无论目标细胞是什么。因此，系统性AAV传递的主要安全考虑是肝毒性。所有针对血友病的AAV基因治疗试验都显示出无症状的肝细胞毒性，尽管发生的频率和过程因使用的载体和剂量而异。这种肝细胞损伤模式以转氨酶升高为特征，其中丙氨酸氨基转移酶的升高超过天门冬氨酸氨基转移酶的增加，而胆红素或γ-谷氨酰转移酶没有相应增加。在大多数但并非所有情况下，这伴随着因子活性的下降，这种下降可能或可能不会对免疫调节有反应。在给药后，目前正在进行血友病A关键试验的单一AAV载体导致多月转氨酶升高，其病因不明，与因子活性下降或对免疫调节的反应无关。大多数参与者因转氨酶升高接受了免疫调节，但没有证据表明其有效性或确定治疗病理。 然而，在血友病试验中观察到的大多数转氨酶升高发生在针对AAV衣壳的细胞毒性免疫反应的情况下。这种AAV“衣壳免疫反应”被假设是由衣壳特异性细胞毒性CD8+ T细胞识别主要组织相容性复合体I分子上的AAV衣壳肽段并清除所致；如果足够多的转导肝细胞被靶向，这理论上构成了一个安全问题。然而，到目前为止，AAV衣壳细胞免疫反应在很大程度上一直是血友病基因治疗的效力考虑因素，导致多次试验中部分或全部转基因表达的丧失。衣壳免疫反应的特征是转氨酶升高、因子活性下降，通常但并非总是外周血液中的单核细胞对AAV衣壳肽段在干扰素-γ抗衣壳酶联免疫吸附点（ELISpot）检测中有反应。值得注意的是，ELISpot检测在临床试验中的预测价值变化很大，并且由于技术上的复杂性，不太可能在许可后转化。尽管如此，即使是轻微的转氨酶升高和因子水平下降也已被证明对支持衣壳免疫反应相当敏感。衣壳免疫反应通常在载体给药后12周内首次观察到。 一旦有衣壳免疫反应的证据，就需要用免疫调节来维持转基因表达。已经尝试了各种策略，以糖皮质激素为主。重要的是，免疫调节并不总是成功的，可能受到载体相关和接受者相关元素的影响。迄今为止，合理设计的免疫调节方案尚未出现。最后，免疫调节的持续时间非常多变，从几周到超过1年不等，随之而来的安全问题。为了最好地评估免疫抑制的风险/效益概况，了解正在治疗的是什么以及确认干预措施既必要又有效至关重要。 虽然在血友病的AAV基因治疗后没有观察到肝衰竭，但在针对两种其他遗传病的AAV载体中已经观察到。具体来说，用于脊髓性肌肉萎缩症（SMA）的onasemnogene abeparvovec（Zolgensma®），剂量为1.1 × 10^14 vg/kg，带有肝毒性的警告标签。许可后，两名儿童在输注后6-8周出现急性肝衰竭，对糖皮质激素干预有反应。虽然确切的病因尚不清楚，但AAV衣壳细胞免疫反应在时间上呈现载体后、肝活检标本中有CD8+ T细胞浸润，以及类固醇反应性方面得到了强烈支持。最后，与在血友病试验中观察到的肝细胞毒性以及Zolgensma不同，在使用迄今为止人类AAV介导基因转移中使用的最高铁剂量的X连锁肌管性肌病（XLMTM）研究中，观察到肝胆汁毒性，导致四名试验参与者（3.5 × 10^14 vg/kg队列中的17人中有3人；1.1 × 10^14 vg/kg队列中的7人中有1人）肝衰竭和死亡。XLMTM的肝胆汁损伤模式和不明确的自然病史，可能包括潜在的肝病，与衣壳免疫反应不一致。这些严重肝毒性与血友病基因治疗的相关性尚不清楚，但其发生仍然支持使用尽可能低的AAV载体剂量，并在开处AAV基因治疗之前了解所有潜在的AAV毒性。 5.AAV治疗的长期安全性考虑 系统性AAV载体给药的主要假设长期安全问题仍然是肝脏和目标器官毒性以及遗传毒性的风险。虽然AAV主要是非整合性的，但在动物和人类在环境AAV暴露或载体给药后的测序数据显示，低频AAV整合事件倾向于活跃转录位点。给新生小鼠系统性给予AAV载体表明，在没有直接人类同源物的Rian位点的AAV整合导致了克隆性并几乎完全穿透肝细胞癌（HCC）。随后的研究表明，HCC风险与载体剂量和细胞分裂程度相关，并且通过使用肝细胞特异性启动子而被消除，但被非肝细胞特异性启动子增强。在大型动物血友病模型中，最近也证明了系统性AAV载体后的AAV整合和克隆性。然而，同样重要的是，这些动物被跟踪了10年，没有肿瘤发生的证据；尽管如此，这项研究提供了第一个大型动物数据，突显了AAV介导整合的风险。理解血友病患者接受AAV后的肝细胞癌理论风险因几乎所有严重的血友病患者>45岁因医疗原因获得了HBV和/或HCV，导致与普通人群相比HCC发病率增加而变得复杂。血友病和其他疾病队列中的AAV临床试验数据令人放心，尽管队列规模和纵向随访有限。在血友病基因治疗接受者人群中，一名有长期HCV感染史的单一参与者在载体后1年发展为HCC。最近对肿瘤组织的测序分析发现了预期的低频随机AAV整合，没有克隆性，并且存在与HCV相关HCC中发现的突变，表明AAV载体输注没有促进患者的HCC。除此之外，在数百名血友病基因治疗试验参与者中没有HCC的报告，即使是在接受系统性AAV载体的第一批参与者（HB患者）的15年随访数据中也是如此。总之，到目前为止，没有临床证据直接支持AAV载体输注作为HCC发展的危险因素。然而，这种理论风险只有在载体给药后几十年才会预期发展。鉴于AAV载体给药后肿瘤发生的长期风险存在多个未知因素以及血友病人群中HCC风险增加，作者的观点是，接受AAV基因治疗的血友病患者应该在载体后数十年内通过血清甲胎蛋白水平、肝功能研究和肝脏超声监测，以监测HCC和长期肝毒性。最终，成人血友病人群之外的队列更接近于小鼠在AAV给药后HCC发展的风险因素。具体来说，婴儿由于肝脏快速生长和由此产生的高细胞分裂率，接受具有普遍启动子的高系统性AAV载体剂量（例如给患有SMA的婴儿的Zolgensma）更密切地模仿了小鼠模型中确定的遗传毒性风险因素；因此，这些婴儿是一个重要的队列，需要仔细跟踪，以回答关于人类AAV遗传毒性和系统性AAV载体给药后HCC风险的问题。 6.转基因蛋白的短期和长期安全性考虑 转基因蛋白的主要安全性考虑包括：(a) 免疫反应，无论是否对自身抗原有交叉反应；(b) 促血栓形成的风险。在考虑迄今为止在血友病A（HA）和血友病B（HB）基因治疗试验中观察到的FVIII和FIX的异质性表达时，促血栓形成的风险尤为重要。超生理水平的FVIII和FIX活性是静脉血栓形成的独立危险因素。流行病学数据显示，超生理水平FVIII活性[优势比（OR）8.8–21.3]的静脉血栓形成风险高于FIX（静脉血栓形成OR 1.8–4.0），尽管在任何情况下都不受欢迎。事实上，一名表达超生理水平FIX活性（200–520%）的HB研究对象在他的动静脉瘘中发展出血栓，并接受了抗凝治疗。类似地，由于一名受试者超生理FVIII表达和静脉血栓形成，辉瑞公司赞助的III期AAV基因治疗试验最近暂停。基于这些原因，HA或HB基因治疗的治疗窗口可能在正常因子水平的上限结束。 除了超生理表达外，理论上促血栓形成的风险可能由增强止血功能的变异蛋白赋予，例如FIX-R338L，它在所有目前正在进行的HB基因治疗工作中使用。重要的是，FIX-R338L的调节方式与野生型FIX相同，这与临床前数据一致，后者证明血栓形成风险与FIX活性相关，与野生型与FIX-R338L表达无关；综合这些结果支持FIX-R338L本身不是促血栓形成的结论。 此外，虽然可能对表达的转基因产生多种免疫反应，但到目前为止，没有试验参与者对转基因蛋白发展出NAbs；值得注意的是，当前血友病基因治疗试验的入选标准严格排除最有可能发展出抑制物的患者（例如，当前或过去有抑制物病史或有<50–150因子暴露的患者）。然而，小型和大型动物数据表明，肝细胞表达转基因会诱导转基因耐受；这已经为多种蛋白证明，包括FVIII、FIX和FIX-R338L。此外，现有的临床前数据表明，肝脏导向的基因转移可能诱导转基因产物免疫耐受。因此，在肝脏导向的基因治疗后对转基因蛋白持续的免疫反应是不太可能的。事实上，基因治疗的未来扩展适应症可能包括在预先存在FVIII抑制物的HA患者中诱导耐受。国家心肺血液研究所赞助的“FVIII抑制物科学现状”研讨会的共识建议明确支持追求基因治疗用于HA的FVIII耐受诱导。然而，最近在接受AAV肌肉导向基因治疗的杜氏肌营养不良症患者中观察到针对转基因蛋白的抗体；这些抗体被假设与自身抗原交叉反应，突显了AAV基因治疗在单基因疾病中的一些持续未知因素。 7.血友病基因治疗的有效性数据 在具有持续转基因表达的临床试验中，大多数具有持续转基因表达的试验参与者已经显示出表型改善（图1）；基因治疗相对于当前血友病护理的潜在优越疗效是没有争议的。此外，尽管因子表达水平存在异质性，但短期内年化出血率（ABR）的降低相对均匀。然而，个别载体，特别是血友病A载体，可能会基于表达的持久性和长期疗效来区分自己。 图 1. (a) 血友病A和(b) 血友病B AAV基因治疗临床试验参与者在AAV载体注射前后的年化出血率（ABR）。数据提取方式如下：BMN270（valoctocogene roxaparvovec）代表平均ABR（n = 134名参与者）；SPK-8011代表在AAV衣壳免疫反应外维持表达并被跟踪超过1年的参与者的平均ABR（n = 15）；SB-525（giroctocogene fitelparvovec）代表仅在载体注射后的参与者的平均ABR（n = 4）；AAV-wt-FIX（scAAV2/8-LP1-hFIXco）代表报道的中位数ABR（n = 10名参与者）；AMT-060代表平均ABR（n = 10名参与者）；AMT-061（etranacogene dezaparvovec）代表所有出血事件的平均ABR（n = 54名参与者）；SPK-9001（fidanacogene elaparvovec）代表平均ABR（n = 10名参与者）。 虽然流行病学研究为避免超治疗表达及随之而来的安全问题提供了强有力的理由，但确切的最低期望因子活性仍然不清楚，可能因患者的活动水平和关节健康等特征而异。可以从现有的血友病A自然史数据中模拟目标最低期望因子活性，这些数据显示一阶段FVIII活性≥12%可赋予ABR<1。此外，emicizumab预防治疗在>50%的试验参与者中赋予ABR<1，并估计具有10-30%的体内FVIII止血等效性；这些发现和血友病自然史数据普遍支持类似的目标最低表达。实际上，这些近似值到目前为止得到了对累积可用基因治疗数据的分析支持，在其中持续的FVIII活性>10-20%的一阶段测定在大多数接受者中可靠地允许ABR<1（图2）。 图 2. 年化出血率（ABR）与因子VIII（FVIII）活性之间的关系。(a) 所有基因治疗接受者接受0.5–2 × 10^12个基因组/kg的SPK-8011（黑色方块）、4–6 × 10^13个基因组/kg AAV5-FVIII I/II期（红色圆圈）和6 × 10^13个基因组/kg AAV5-FVIII III期（蓝色三角形）的ABR和FVIII活性。绘制的FVIII活性水平是通过单阶段测定或使用1.6的校正因子从色原测定结果转换而来。黑色垂直线代表正常FVIII水平的10%。蓝色阴影框表示ABR ≤1的接受者。(b) 基因治疗接受者中ABR ≤1的百分比，其FVIII活性由单阶段测定确定。来自基因治疗接受者的ABR数据被分组为每组10个，然后作为分组组中最大FVIII水平的函数进行绘制。 然而，根据AAV载体的不同，观察到的转基因表达变化10-100倍。因此，不可能针对个体患者的因子阈值需求。此外，在具有人类肝细胞嵌合的小鼠克隆群体的研究表明，仅转导效率就有高达七倍的变异。这些数据与影响从载体输注到稳态转基因表达的每个步骤的多个生物变量一致，并强调了该领域可能不得不在不久的将来容忍患者间转基因表达的变异。 使我们能够清楚定义目标和可接受转基因表达的治疗范围变得复杂的是，对测量的转基因FIX或FVIII活性与体内止血功能的关联程度的信心。具体来说，通过一阶段（OSA）或色谱法（CSA）测定转基因衍生的FVIII-SQ和FIX-R338L会有所不同。在人类和小鼠中，FVIII:C通过OSA测量比CSA高出大约1.6倍，这是二十年重组FVIII-SQ蛋白临床使用中未见到的观察结果。类似地，通过OSA测定的FIX-R338L活性高于通过CSA测定的FIX活性。然而，与转基因衍生的FVIII-SQ不同，与重组FIX-R388L的相对检测差异得以维持，并且总体上与我们对FIX-R338L酶功能的了解一致。 8.转基因表达的持久性 尽管在成功但变量的因子表达情况下，短期内的临床效益相对均匀且出色，但不同载体在长期稳定表达方面存在异质性（图3）。大型动物数据显示，无论是FIX还是FVIII表达，在载体输注后长达8年的时间里都稳定或没有减少。迄今为止，可用的HB临床试验数据模仿了大型动物数据的观察结果；发表的数据长达3年，摘要数据长达8年，证明了FIX表达的持久性和稳定性。关于HA表达持久性的数据存在冲突。 具体来说，在目前进行HA III期试验的载体中，两者从第1年到第2年都几乎失去了一半的FVIII水平。在这些载体中，valoctocogene roxaparvovec（AAV5-FVIII或BMN-270）已经在I/II期试验参与者中连续减少了6年的FVIII水平。在更大的III期试验参与者队列中观察到了类似的结果（n = 17），从第1年到第2年失去了40%的表达，并在目前可用的3年随访数据中继续减少FVIII活性（图3）。有趣的是，与valoctocogene roxaparvovec观察到的FVIII水平下降非常相似的是，接受SB-525（现在为giroctocogene fitelparvovec）并在2年后接受随访的I/II期数据的参与者（n = 4）（图3）；这个载体处于暂停的关键试验中。与valoctocogene roxaparvovec和giroctocogene fitelparvovec的观察结果不同，接受SPK-8011并在没有衣壳免疫反应的情况下维持FVIII表达的参与者（n = 5）在载体输注后长达3年内显示出明显的稳定FVIII水平（图3）。虽然giroctocogene fitelparvovec（SB-525）和valoctocogene roxaparvovec（BMN27）的长期FVIII药代动力学看起来相似，但它们与SPK-8011的观察结果明显不同，这为当前HA AAV介导的基因添加策略中大约稳定的多年FVIII表达是可能的提供了原理证明。 图 3. AAV基因治疗后多年因子VIII (FVIII)活性。数据提取自公开发表的出版物或摘要。点代表中位数FVIII水平（SB-525除外，只有平均值可用），误差条是四分位间距。数据来自接受3 × 10^13、6 × 10^13和0.5–2 × 10^12 vg/kg剂量的SB-525、AAV5-FVIII和SPK-8011的AAV载体的队列。接受SPK-8011治疗的两名参与者由于载体注射后3个月内的衣壳细胞免疫反应而失去了所有FVIII表达，不包括在内。绘制的SPK-8011参与者数据分别代表第1年的n = 15，第2年的n = 11，以及第3年的n = 5，反映了可用随访数据的持续时间。FVIII活性通过单阶段测定或使用1.6的校正因子从色原测定结果转换得出，用于AAV5-FVIII结果。 在HA临床试验中观察到的表达持久性差异的原因是什么尚不清楚。鉴于当前策略旨在维持染色体外转基因的稳定，由于细胞分裂和损失，预期会出现一定程度的表达下降，尽管是逐渐的，正如目前的HB工作所证明的那样。图3中呈现的综合数据可能表明高水平的转基因FVIII是不可持续的；然而，仔细审查valoctocogene roxaparvovec后个体接受者的FVIII水平并不表明FVIII水平和FVIII下降之间有明确的关系。这需要进一步研究。目前对两个正在进行III期试验的HA载体观察到的FVIII表达下降的假设机制包括（a）由于载体或FVIII毒性导致的转导细胞丢失，（b）基因沉默，（c）未检测到的对AAV衣壳或表达转基因的免疫反应，或（d）个别载体的特性阻碍了稳定的串联染色体外载体表达盒DNA的形成。由于FVIII未折叠蛋白反应导致转导肝细胞丢失的假设得到了在重组FVIII哺乳动物表达系统中观察到这一现象以及在小鼠模型中通过肝脏导向AAV介导的基因转移后的超治疗表达FVIII的先前观察结果的支持。然而，尽管采样和/或时机考虑限制了解释，但在HA受试者的肝活检中没有未折叠蛋白反应的证据。不同AAV产品用于制造平台如何导致转基因FVIII水平下降也未知。鉴于我们对AAV载体输注后发展持久、高滴度、多血清型、交叉反应AAV NAbs的了解，以及我们目前无法克服高滴度AAV NAbs，FVIII水平的稳定性是关于临床试验注册或许可AAV产品选择决策的关键考虑因素。潜在的接受者需要完全理解他们只能接受一次AAV基因治疗，并且在他们的利弊计算中必须考虑转基因FVIII表达的丧失。 9.未来方向 全面考虑下一代血友病A（HA）和血友病B（HB）的基因治疗方法超出了这篇综述的范围。许多新方法正准备在当前进展的基础上进行。这些包括使用FVIII变体的下一代AAV载体以改善分泌或止血功能，以及用于基因编辑的AAV载体和脂质纳米颗粒。尽管仍处于临床前开发阶段，但预计这些方法中的一些将很快进入临床。此外，系统性递送以靶向肝脏以及使用慢病毒载体进行体外造血干细胞转导正在临床前或首次人体临床试验中进行。 目前的努力排除了整个儿科人群，以及缺乏常规治疗途径的患者（世界上大部分血友病人群）。这些人群可能是基因治疗可能产生最大影响的人群。 10.结论 在基于AAV的血友病和其他单基因遗传病的基因添加方面取得的进展建立了一种新的治疗范式。了解AAV平台以及对单个载体迄今为止可用信息的全面了解是必要的，以便能够真正知情同意使用研究性或许可载体的治疗。血友病社区热切期待当前一代许可的AAV载体用于HA和HB，预计将很快进入临床。重要的是，尽管当前血友病基因治疗在概念验证方面取得了反复的成功，但能够稳定、持久地表达FVIII或FIX以改善所有患者的出血仍然是一个未实现的希望。这定义了下一代基于基因的血友病治疗的发展目标。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。