Arginine Hydrochloride

摘要：重组蛋白技术的创新为其纯化带来了众多的挑战。本文深入探讨了为人工设计的治疗性蛋白开发纯化流程的复杂情况。主要障碍包括控制蛋白质还原、蛋白质捕获、确保稳定性、消除聚集体、去除宿主细胞蛋白和优化蛋白质回收。在这篇综述中，我们概述了可以获得高纯度产品的纯化策略，并强调了应对重组治疗性蛋白所呈现的独特挑战相应的解决方案，并通过实际案例研来举例。最后，我们提供了对未来纯化流程开发的展望。1.引言治疗性蛋白质在过去几十年中在对抗众多疾病中发挥了关键作用。随后，重组产品的格局呈指数级扩大，包括了多样的生物制品，如血液制品、激素、细胞因子和单克隆抗体（mAbs）。随着基因工程技术的进步，蛋白质药物研究取得了重大突破。融合蛋白、肽段和工程化抗体等技术的应用，使蛋白质药物的构建多样化，允许根据疾病特征和患者需求进行定制。蛋白质表达系统的进步使得几乎任何所需的蛋白质或肽段的合成成为可能。值得注意的是，这一技术进步促进了前所未有的分子的创造，这些分子与天然蛋白质不同，例如融合蛋白和双特异性抗体。这些治疗性蛋白质的新类别展示了独特的功能，对提高药物功效具有巨大潜力。在蛋白质细胞培养中，存在可能触发不良反应或过敏反应的杂质。对这些杂质的免疫反应可能导致对它们内源性对应物的耐受性丧失，导致严重的不良事件。ICH Q6B指南提出了制定产品质量规格（外观、身份、纯度和杂质、效力和数量）时应考虑的原则。与此同时，在应对市场价格法规和竞争的同时，制药公司必须解决成本效益生产和实现高产品回收率的重要挑战，以确保可持续的盈利能力。从复杂混合物中提取高纯度目标产品是一项极具挑战性的任务。蛋白质结构的多样性导致产品和流程相关杂质的复杂性增加。例如，双特异性抗体（BsAbs）是一种新兴的生物治疗类别，具有设计多样性，每个抗体都有独特的抗原结合域组合，可结合两种不同的抗原表位。多目标设计允许同时引入BsAb特有的副产品，如错配产品、不需要的片段和更高水平的聚集体。这些杂质的存在与目标抗体非常相似，使得分离变得困难，因此通常需要开发额外的纯化策略以获得高纯度产品。抗体融合蛋白结合了抗体靶向和长半衰期的优势。然而，它们受到链不匹配、产品裂解和聚集体的困扰。酸性不稳定性可在亲和洗脱期间导致蛋白质断裂或聚集，从而损害蛋白质质量。酸性蛋白质的等电点与宿主细胞蛋白（HCPs）相似，使得HCPs的分离变得困难。没有标签的重组蛋白质设计缺乏特定的亲和域，因此在去除HCPs和捕获目标产品方面存在重大障碍。面对这些挑战，优化各个单元操作和整个纯化过程变得特别重要。这篇综述概述了在纯化复杂治疗性蛋白质时遇到的现有挑战，包括多特异性抗体、融合蛋白和重组蛋白。蛋白质纯化过程中的主要挑战包括蛋白质还原、蛋白质捕获、维持蛋白质稳定性、去除聚集体和HCPs以及实现高回收率。本文提出了解决这些独特挑战所提出的相应解决方案。这些方法有潜力加速在研究和开发新产品中的进展，缩短商业化所需的时间，并显著降低生产成本。2.解决蛋白质纯化中的挑战蛋白质纯化是一个包含多个步骤和不同原理的复杂过程。第一个单元操作是从培养液中去除细胞和细胞碎片。这个重要步骤被称为“澄清”，可以通过物理方法如过滤来实现。纯化过程通常包括三个主要步骤：捕获（分离、浓缩、体积减少）、中间纯化（去除大量杂质或主要蛋白质污染物）和抛光（去除微量杂质、密切相关的污染物和蛋白质聚集体）。这些纯化阶段通常利用各种色谱技术，因为它们具备出色的分辨率。最后，通过缓冲液交换获得药品并添加添加剂以增强蛋白质产品的稳定性和保质期。2.1蛋白质还原蛋白质包含多个二硫键，正确的二硫键配对对蛋白质结构和活性至关重要。理想情况下，二硫键在蛋白质分泌到细胞外环境之前就已正确配对，但在细胞培养的复杂氧化还原环境中，二硫键断裂很容易发生。抑制还原酶的活性是解决抗体还原问题的有效的途径。本研究展示了针对蛋白质还原的不同解决策略（图1）。图1(A)展示了一个严重还原问题的单克隆抗体分子。在澄清阶段，观察到抗体在低温下储存长达24小时后，分子片段显著减少，导致目标分子的CE-SDSNR纯度从97.2%下降到57.7%。通过向收获的样品中添加0.5 mM CuSO4，有效地抑制了抗体的还原。铜离子可以直接抑制Trx的活性，从而抑制酶介导的分子还原。另一个双特异性抗体分子展示了相同的还原问题，随着孵化时间的增加问题变得更加严重（图1B）。在室温下孵化7小时后，目标抗体的CE-SDS-NR纯度从最初的85.4%下降到56.7%。采用了不同的策略来抑制还原反应，结果表明，持续通气、添加硫酸铜和半胱胺有效地抑制了分子断裂。空气曝气是首选方法，因为它在操作上方便，且无需添加剂。持续的空气曝气可以增加液体中的溶解氧，减少NADPH的产生，并保持硫氧还蛋白的电子源处于缺乏状态，从而抑制抗体的氧化还原反应。此外，通过调节pH和温度以降低硫氧还蛋白催化反应性，以及实施快速纯化以减少催化反应时间，也可以抑制或减缓抗体还原。基于该系统的原理，表1总结了解决下游纯化中抗体还原问题的常见策略。2.2 蛋白质捕获蛋白质捕获是一个反复出现的话题，研究人员已经设计了不同的蛋白质标签以实现有效的分离。虽然单克隆抗体的捕获方法已经建立，但复杂融合蛋白、无标签重组蛋白和疫苗的捕获方法可能会有显著差异，这取决于每种蛋白的独特属性。2.2.1 抗体融合蛋白 亲和色谱法（AC）广泛用于单克隆抗体的捕获，这依赖于目标抗体与AC树脂之间的特异性结合。随着分子设计的复杂性增加，已经开发了各种基于抗体片段的融合蛋白，如Fc融合蛋白、ScFv融合蛋白和VHH融合蛋白。如图2所示，抗体由不同的结构域组成，不同的域可以被设计并作为具有治疗活性的重组融合蛋白生产。在抗体过程开发中，已经开发了Protein A、Protein G和Protein L AC用于在不同位点捕获抗体。Fc融合蛋白是最常见的设计结构，通常可以使用Protein A和Protein G色谱法捕获。Protein G以类似于Protein A的方式识别抗体的Fab和Fc区域，但具有不同的结合特异性。基于ScFv设计的蛋白质是另一种组合形式，这些形式是通过不同的链和连接体组合实现的。Protein L和Protein A可以特异性识别ScFv的VL和VH区域以实现选择性捕获。选择最佳的亲和树脂是蛋白质捕获的主要任务。理论上，Protein A、Protein G和Protein L都可以用于捕获Fab片段，它们在应用中显示出截然不同的结合能力。不同的配体结构、配体密度和树脂基质导致相同配体类型的蛋白质捕获能力有显著差异。虽然原理可以为过程开发中捕获树脂的选择提供指导，但重要的是要注意，不同的树脂可能对不同的分子表现出不同的特异性。研究表明，Protein L树脂对Fab片段展示了优越的捕获能力，并且来自不同来源的Protein L树脂显示出不同的捕获能力。除了选择树脂外，缓冲系统的选择对于蛋白质捕获也至关重要，特别是对于不稳定的融合蛋白。AC通常采用酸性洗脱将目标蛋白从树脂上分离，在这种条件下，蛋白质可能会变得不稳定。此外，对于酸性融合蛋白，pH值在其等电点（pI）周围的调整可能导致蛋白质沉淀或聚集。因此，对于对酸性条件敏感的融合蛋白，建议选择亲和力较低的树脂，并减少洗脱缓冲液的缓冲能力，以提高洗脱pH值。该研究展示了亲和树脂、洗脱缓冲液浓度和pH对酸性融合蛋白（图3）的捕获效果。这种蛋白质在暴露于酸性条件时会发生沉淀。亲和树脂#2专门设计用于在高pH值下实现蛋白质洗脱，避免在酸性条件下的蛋白质沉淀。此外，亲和树脂#2对蛋白质的亲和力较低，允许在高pH洗脱期间实现高回收率。减少洗脱缓冲液的缓冲能力可以进一步提高蛋白质洗脱液的pH值。优化后，蛋白质洗脱液的pH值在整个捕获过程中保持在其pI值以上，从而避免洗脱后pH调整和通过聚集造成的产品损失。2.2.2 无标签重组蛋白由于缺乏亲和域，无标签重组蛋白只能依赖于基于蛋白质的物理化学属性（如电荷、疏水性和分子量）的非特异性捕获。图4展示了无标签融合蛋白的纯化策略。离子交换色谱（IEX）通常在温和条件下具有高分辨率和高结合能力，因此推荐用于捕获重组蛋白。阴离子交换色谱（AEX）树脂上色素的过度吸附会导致产品纯度下降，并使树脂再生变得困难，从而降低其操作寿命。因此，阳离子交换色谱（CEX）被用作首选的离子交换捕获方法。此外，样品pH应与目标分子的等电点相差至少0.5个单位，以确保产品稳定性。需要微调pH和电导率，以最大化结合能力和分离。疏水作用色谱（HIC）树脂已在蛋白质纯化步骤中使用，并具有高吸附能力、高选择性、温和的洗脱条件和低成本等主要优势。通过选择合适的疏水强度树脂和优化高盐装载条件，可以实现更好的分离效果。此外，HIC在低盐条件下进行洗脱，使其对后续过程相对友好。该研究展示了pI值为5.9的酸性重组蛋白的捕获策略（图5）。蛋白质的溶解度受pH和电导率的影响，低pH和低电导率下会发生沉淀。另一方面，为了通过CEX实现捕获，pH应保持在蛋白质的pI值以下，电导率应保持较低，以保持足够的静电相互作用。因此，需要仔细调整装载条件，以实现蛋白质捕获，同时保持蛋白质稳定性。从图5(B)可以看出，在测试范围内，pH对回收率的影响大于电导率。基于这些结果，装载条件设置为pH 5.5和电导率11 mS/cm，以实现最佳捕获能力。2.3 不稳定蛋白确保整个过程中蛋白质的稳定性是蛋白质纯化的首要考虑因素，因为大多数蛋白质容易受到温度、pH或盐浓度变化的影响。由于人工设计的非天然蛋白质的复杂性，它们在传统的纯化过程中容易出现沉淀和质量下降的问题。以下总结了在蛋白质纯化过程中导致蛋白质不稳定的因素和解决这一问题的策略。2.3.1 缓冲体系和条件不适当的pH条件是导致蛋白质不稳定的最常见因素，这导致蛋白质迅速聚集和断裂。AC的洗脱缓冲液通常呈酸性，长时间暴露于这种条件会导致蛋白质活性持续下降。因此，在洗脱后，应尽快将pH调回中性，以防止长期活性降低。此外，缓冲体系和蛋白质浓度对稳定性也至关重要。对于结构松散的蛋白质，不适当的溶液条件可以导致疏水区域的部分暴露，从而加速聚集体的形成。2.3.2 稳定剂在病毒灭活过程中，采用有机溶剂作为解决方案来解决由低pH值引起的不稳定性问题。然而，添加不适当的有机试剂可能会引起更高程度的通过非共价结合形成的聚集体。单独添加PS80配合适当的浓度和处理时间，就可以实现所需的病毒灭活。表面活性剂不仅能灭活病毒，还有助于维持蛋白质的稳定性。在工艺开发过程中，对于具有强疏水性的蛋白质，在亲和步骤中发生了显著的沉淀。考虑到分子结构相对扩展，并且分子中存在暴露的疏水区域，因此在工艺缓冲液中引入了表面活性剂来稳定蛋白质结构，并显著提高产品回收率。2.3.3 其他因素热量和剪切力可能导致不可逆的蛋白质聚集，而冷冻和脱水可能导致某些复杂蛋白质结构的构象变化，影响它们的活性。尽管通常在冻融过程中向药物物质（DS）中添加辅料以稳定其稳定性，但在纯化过程中不希望在过程中间添加额外的辅料。因此，缩短纯化过程的持续时间并最小化样品的冻融是最有效和方便的方法。表2总结了在纯化过程中导致蛋白质结构变化的因素及其相应的解决策略。2.4 蛋白质聚集体去除蛋白质聚集是蛋白质纯化中最具有挑战性的方面之一。部分聚集体源自细胞培养过程中由于共价或非共价相互作用形成的蛋白质。后期聚集在很大程度上取决于缓冲液条件，包括pH值、离子强度、缓冲体系和添加剂。应根据不同的物理和化学属性变化，利用不同的色谱模式去除聚集体。2.4.1 基于亲和性的纯化亲和树脂可以捕获单体和聚集体。亲和力的差异可以在聚集体上产生不同的分离效果，因为Protein A可以同时结合抗体的Fc和Fab区域，而结合亲和力取决于树脂和抗体的设计。如图6所示，Protein A与抗体之间的亲和力取决于两者的结构。天然Protein A与Fab区域的相互作用较弱，而与Fc区域的结合很强。相比之下，重组Protein A缺乏与Fab的相互作用。研究发现，每个单体只能结合一个Protein A配体，而每个二聚体可以结合两个配体。因此，与mAb单体相比，一个mAb的聚集体更容易被保留。另一方面，在聚集体形成过程中，Fc区域可能被埋在内部或部分丢失。对于这种类型的聚集体，与重组Protein A的相互作用比mAb单体与Protein A之间的相互作用要弱。通常，在洗脱前加入适当的洗涤步骤可以有效地在早期阶段消除这些聚集体。添加剂通常用于分离聚集体和目标蛋白。向洗涤和洗脱缓冲液中添加氯化钙/聚乙二醇（PEG）或氯化钠/PEG组合可以有效地增强聚集体和目标抗体的分离。Hofmeister盐系列可以通过调整抗体种类与Protein A配体之间的疏水相互作用来提高树脂的选择性。使用氯化镁和氯化钙作为洗脱添加剂已实现双特异性产品与Fc-Fc同源二聚体之间的出色分离。2.4.2 基于电荷的纯化聚集导致蛋白质表面覆盖，与单体相比，表面电荷存在差异。尽管聚集体通常比单体蛋白更紧密地结合到阳离子交换树脂上，但两者之间的分离通常很困难，特别是当聚集体是二聚体时。除了筛选不同类型的阳离子树脂外，通过向流动相中添加辅料可以改善单体和聚集体的分离。使用pH-电导率混合梯度洗脱方法已证明其在从样品中去除聚集体方面的有效性。基于疏水性的纯化。疏水作用色谱法（HIC）在聚集体去除方面具有显著优势，因为与单体相比，聚集体表现出增加的表面疏水性。通过HIC的分离效率可能受到蛋白质疏水性、盐的类型和浓度以及树脂的疏水性的影响。通过降低盐浓度或使用具有更强疏水性的树脂，目标蛋白质可以流过，而聚集体和其他杂质则被保留，从而避免了由高导电率引起的蛋白质不稳定。具有不同极性的添加剂可以改变蛋白质、杂质和树脂之间的疏水相互作用，从而提高分辨率并实现更好的分离。2.4.3 基于多模式的纯化一些蛋白质和聚集体不能通过使用单一机制的色谱法有效分离。多模式色谱法允许在单一步骤中基于电荷、疏水性、氢键和其他因素进行分离，因此提供了更好的选择性。陶瓷羟基磷灰石（CHT™）是一种具有双重交换机制的多模式树脂，基于磷酸根的阳离子交换和钙离子金属螯合。实验结果已证明CHT™树脂在去除聚集体、DNA、内毒素和其他杂质方面具有极佳的效果。因此，在双特异性抗体（BsAbs）、融合蛋白和重组蛋白质的开发中，可以考虑使用CHT™树脂来去除具有挑战性的杂质。聚集体的形成机制复杂，导致异质的结构特征。因此，去除聚集体需要彻底的优化努力。表3总结了在纯化过程中去除蛋白质聚集体的方法和优化策略。2.5 HCP去除HCP（宿主细胞蛋白）是活细胞分泌的蛋白质和细胞死亡及裂解时释放的细胞内蛋白质的异质混合物，大多数HCP杂质是酸性蛋白。通过蛋白质组学和其他方法，已经鉴定出来自CHO细胞的超过6000种HCP。在下游过程中，蛋白质纯化通常涉及使用正交色谱分离方法来实现HCP去除。然而，在细胞培养期间实现这些蛋白质的高滴度证明是困难的，这随后导致无标签重组蛋白（> 10,000 ppm）和双特异性抗体或融合蛋白（几千ppm）与典型的单克隆抗体（<2000 ppm）相比，捕获后的HCP含量更高。2.5.1 深度过滤法（DF）深度过滤（DF）用于固液分离，也可以用于通过电荷结合和蛋白质之间的静电相互作用来去除HCP。因此，采用两种分离策略：首先，控制条件以促进HCP沉淀；其次，通过与深度过滤器材料的静电相互作用去除可溶性HCP。大多数来自CHO细胞的HCP的等电点（pI）落在4.5–7.5的pH范围内，在中和过程中变得不溶，导致聚集和沉淀。在单克隆抗体开发中，控制低pH灭活后的pH值允许HCP从溶液中沉淀，可以在中间深度过滤期间去除它们[36]。可以设计一个最佳的过程，通过pH调整实现HCP的选择性沉淀，同时最小化产品损失。2.5.2 亲和色谱法（AC）亲和色谱法（AC）是蛋白质捕获的理想工具，因为目标蛋白可以以特定方式强烈结合到树脂上。然而，由于与Protein A树脂的非特异性相互作用或与目标蛋白的非特异性结合，一些HCP会与产品共同洗脱。一种常见的方法是在洗脱前使用高盐浓度或低pH（5–5.5）的洗涤缓冲液来去除部分HCP，但这些条件通常不能完全破坏HCP与目标蛋白之间的结合。最近的研究已经发现，使用高pH和高导电性的洗涤缓冲液溶液可以更有效地去除HCP，因为在碱性条件下（pH > 8），mAb与大多数HCP之间的静电相互作用是相互排斥的。由于HCP可以通过静电相互作用、疏水相互作用和氢键等各种机制与蛋白质结合，因此可以使用破坏这些相互作用的试剂来有效去除HCP。迄今为止，已经测试了含有不同添加剂的洗涤缓冲液溶液用于HCP去除。组氨酸盐酸盐显示出良好的HCP去除效果，因为它可以与蛋白质形成氢键，破坏疏水和静电相互作用。2.5.3 离子交换色谱法离子交换色谱法。HCP的分离归因于电荷-电荷相互作用。大多数HCP属于酸性蛋白，因此在基本目标蛋白的情况下，AEX的流穿模式对HCP去除有效。在流穿模式中，提出了使用相对较高的pH值来增强HCP去除的弱分配色谱法（WPC），用于单克隆抗体的纯化。对于结合和洗脱模式，可以利用HCP和目标蛋白之间的pI差异，在蛋白质洗脱之前去除部分HCP，从而最小化HCP与目标蛋白的共同洗脱。此外，在单克隆抗体纯化过程中，已经使用氨基酸在各种色谱分离中增强了HCP的清除。研究表明，使用CEX结合额外的洗涤步骤和洗脱缓冲液中的氨基酸添加剂，可以有效地去除pI为5.9的重组蛋白中的HCP（图7）。增加洗涤缓冲液的强度会诱导目标蛋白的部分损失，但证明在去除弱结合的HCP方面是有效的。在洗脱缓冲液中添加精氨酸进一步降低了HCP含量。精氨酸的存在稳定了蛋白质洗脱后的pH值，防止了更强结合的HCP的洗脱。因此，通过增加洗涤步骤和优化洗脱缓冲液，可以显著增强HCP的去除能力。2.5.4 疏水作用色谱法氨基酸作为蛋白质的基本组成部分，在电荷和极性上有所不同，导致目标蛋白和HCP之间的疏水性变化。HIC在结合和洗脱模式以及低盐流穿模式中都展示了出色的HCP去除能力。可以通过控制HIC过程中使用的盐的类型和浓度、温度、pH值和配体来提高选择性。2.5.5 多模式色谱法多模式树脂具有离子交换和疏水性的双重特性，多种相互作用的组合可能提供更好的选择性。Capto™ Adhere树脂，结合了阴离子交换和疏水作用功能，能够实现高达2-3 LRV的清除能力，将HCP水平降低至低于10 ppm。Capto™ MMC树脂，具有阳离子交换和疏水性质，通常在结合和洗脱模式下使用，在最佳过程条件下展示了良好的HCP和杂质去除能力。CHT™树脂，在流穿模式下运行，也表现出了在HCP去除方面的卓越能力。然而，通过多模式色谱法实现增强分离需要全面的设计实验研究，以探索不同因素的潜在相互作用。在所有与过程相关的杂质中，HCP通常特别令人关注，因为它们可能影响产品的安全性、有效性和稳定性。最近，高密度和灌注细胞培养的发展引入了在纯化增加水平的HCP和其他杂质方面的更多挑战。图8推荐了在下游处理的不同阶段进行HCP去除的有效策略。纯化应该针对最大化整个过程的去除能力进行优化。2.6 蛋白质回收对于复杂蛋白，聚集体和HCP等杂质的存在导致产量降低。因此，在保持产品质量的同时最大化回收率，成为蛋白质纯化过程开发的一个关键挑战。深度过滤（DF）用于细胞培养液的初始澄清，以保护色谱柱。选择合适的DF过滤器是减少由于吸附导致的蛋白质损失的关键。蛋白质表面的不均匀电荷导致与带电膜发生静电相互作用，引起蛋白质吸附。因此，研究不同材料的DF膜可以提高蛋白质回收率并减少由于蛋白质吸附造成的损失。此外，通过增加洗涤缓冲液的电导率可以减轻部分吸附。然而，应对洗涤缓冲液盐浓度的调整特别关注，因为过高的电导率可能不适用于后续的分离阶段。在亲和色谱法（AC）中，蛋白质与树脂的强结合可能使蛋白质的洗脱变得困难，导致蛋白质回收率低。以前的研究表明，高离子强度的存在可能促进蛋白质与Protein A之间的疏水相互作用，因此需要较低的pH值进行洗脱。此外，与单克隆抗体相比，融合蛋白通常在低pH条件下表现出较弱的稳定性，这对于在较低pH下进行洗脱提出了挑战。通过使用精氨酸缓冲液或其他添加剂，可以在高pH下实现洗脱，同时确保高回收率。疏水作用色谱法（HIC）通常与低产量相关，这是由于不利的溶剂条件，或目标蛋白质在疏水表面上的变性。已经探索了各种方法来提高HIC的回收率。在HIC中，结合和洗脱模式经常导致蛋白质与树脂基质之间的过强结合，给蛋白质洗脱带来挑战。精氨酸和己二醇可以减弱蛋白质与树脂基质之间的相互作用，从而提高各种蛋白质的回收率和纯度。在努力通过解决如聚集体和HCP去除等问题来实现高纯度的同时，部分蛋白质产品不可避免地会损失。根据我们平台的数据，蛋白质损失主要发生在深度过滤和各种色谱步骤中。对于深度过滤，选择合适的膜和优化洗涤缓冲液是解决蛋白质损失的主要措施。对于色谱法，通过在产品中间体和过程缓冲液中添加辅料是提高回收率的有效策略，这通过调节蛋白质与树脂之间的结合亲和力来实现。3.未来展望与结论治疗性蛋白质药物的开发是一项多方面的系统工程努力，涉及多种学科。正如我们在这篇综述中讨论的，双特异性抗体、融合蛋白和重组蛋白质的多样性在开发有效和经济的纯化工艺方面存在重大挑战。色谱技术在蛋白质纯化中起着关键作用；然而，树脂的开发落后于由抗体技术进步引起的需求。亲和树脂和多模式树脂代表着解决蛋白质纯化挑战中最有希望的色谱介质。这两种类型的树脂对杂质表现出更强的选择性，能够更好地区分不同的蛋白质和与流程相关的杂质。相比之下，在过滤步骤的开发进展缓慢，使得基于过滤过程的理想杂质去除难以实现。尽管如此，树脂与过滤过程在产品设计中的结合可能为耗材的突破提供了一个有希望的方向。这类产品将结合过滤过程的效率与色谱过程的选择性，可能显著提高纯化的效率和经济性。高效的实验设计也是纯化工艺开发中的另一个追求。合理的实验设计是减少实验数量的基础，需要充分理解目标蛋白。计算生物学是利用计算机模型和机器学习算法预测目标蛋白属性、识别相关性并优化纯化工艺条件的未来趋势，从而减少试错实验。这有可能从根本上提高纯化工艺开发的准确性和效率。另一方面，高通量筛选技术的引入极大地提高了蛋白质纯化的效率。高通量筛选通过并行处理大量样品，加速了纯化工艺的评估、优化和选择。总之，随着技术的不断进步，探索更有效、准确和环保的蛋白质纯化方法将继续推动该领域的发展。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

引言铁死亡是一种由致死性脂质过氧化物过量触发的铁依赖形式的调性细胞死亡，由于对肿瘤的代谢特征和铁死亡易感性的交集了解有限，因此阻碍了在癌症治疗中靶向铁死亡。2024年3月19日，复旦大学詹成及德克萨斯大学MD安德森癌症中心甘波谊共同通讯在Nature Communications 发表题为“Polyamine-mediated ferroptosis amplification acts as a targetable vulnerability in cancer”的研究论文，该研究中，利用代谢物库，精氨酸被鉴定为铁死亡促进剂。这一作用主要是通过精氨酸转化为多胺来实现的，而多胺以H2O2依赖的方式发挥其有效的铁死亡促进特性。值得注意的是，铁死亡信号——铁超载——通过WNT/MYC信号通路显著激活鸟氨酸脱羧酶1 (ODC1)的表达，以及随后增加的多胺合成，从而形成一个放大铁死亡的铁超载-WNT/MYC-ODC1-多胺-H2O2正反馈回路。该研究注意到铁死亡细胞释放出增强的含有多胺的细胞外囊泡到微环境中，从而进一步使邻近细胞对铁死亡敏感，并加速铁死亡在肿瘤区域的“扩散”。此外，补充多胺还通过诱导铁死亡使癌细胞或异种移植瘤对放疗或化疗增敏。总之，通过鉴定精氨酸作为铁死亡介质，本研究阐明了多胺的强促铁化特性及其机制，以及铁过载-WNT/MYC/ODC1-多胺-H2O2放大铁死亡的正反馈轴。该研究结果还提出了以前未被重视的多胺超载肿瘤的代谢易感性，这可能为铁死亡相关癌症治疗提供潜在的靶点和策略。铁死亡是指由质膜或膜细胞器中不受限制的脂质过氧化引发的一种铁依赖性细胞死亡形式，由于其独特的机制和形态特征，它不同于细胞凋亡等其他形式的调节性细胞死亡。简而言之，在富含铁的微环境中，过量的H2O2与铁发生Fenton反应，产生高反应性的羟基自由基，攻击并过氧化位于细胞膜上的含有多不饱和脂肪酸(PUFA)的磷脂的双烯丙基部分，从而导致膜破裂和铁死亡。同时，细胞进化出多种铁死亡防御机制，主要由SLC7A11/GPX4依赖性谷胱甘肽（GSH）系统、FSP1-、DHODH或GPD2依赖性泛醇系统和GCH1依赖性四氢生物蝶呤（BH4）系统。这两个过程之间的不平衡，例如铁死亡诱导剂（FIN 对防御途径的失活，将导致脂质过氧化物的快速积累并引发有效的铁沉降细胞死亡。越来越多的证据表明，铁死亡在肿瘤生物学和癌症治疗中起着关键作用。一方面，多种经典的癌症治疗策略可触发铁死亡。另一方面，铁死亡参与一组与癌症相关的信号通路。因此，这些研究将铁死亡确定为癌症发展的天然屏障，并表明改变肿瘤细胞对铁死亡的反应可能为治疗传统疗法难治的癌症提供新的途径。重要的是，癌细胞获得代谢适应，支持其增强的生长和增殖速度。然而，这些特征，如ROS的高负荷和增强的PUFA合成，使一些癌细胞本质上易受铁死亡的影响。因此，更好地了解肿瘤代谢特征与铁死亡调节之间的相互作用，并确定临床实践的潜在治疗靶点是有意义的。尽管越来越多的研究表明，一些酶及其代谢产物/代谢物和相应的酶参与铁死亡调节，但仍缺乏对内源性代谢物的促铁或抗铁死亡特性的系统分析。模式图（Credit: Nature Communications）该研究使用代谢物化合物库，发现精氨酸及其下游代谢产物多胺以h2o2依赖的方式显著增强癌细胞对铁死亡的敏感性。铁死亡的重要信号——铁过载通过WNT/MYC信号诱导多胺合成，从而形成放大铁死亡的正反馈轴。同样，多胺也通过诱导铁死亡使癌细胞对放疗或化疗增敏。鉴于癌细胞通常具有较高的细胞内多胺丰度，研究结果表明，在癌症治疗中，多胺代谢是铁死亡的一个可靶向易感因素。原文链接https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41467-024-46776-w责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Nature | 破除传统：为何我们需要重新思考肿瘤的命名方式热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述