Arginine Hydrochloride

DOI:  10.1002/anie.202422372 靶向共价抑制剂（TCIs）与非共价小分子抑制剂相比，在许多情况下都表现出更高的效力和选择性，并且可以在机体内停留更长的时间，延长药效；在一些情况下，TCIs可以帮助缓解与癌症相关的获得性耐药性问题。 当前，绝大多数TCIs，包括所有的FDA批准的针对蛋白激酶的共价药物，都是基于与暴露的非催化性Cys残基反应而设计的；然而，大多数药物靶蛋白并不存在非催化性Cys，例如500多种蛋白激酶中，超过一半的蛋白激酶没有非催化性Cys残基。因此，拓展TCIs靶向非Cys类的、丰富存在的、不易突变的亲核性氨基酸非常关键。 近日（Jan. 08），新加坡国立大学、中山大学、暨南大学等合作，在Angew. Chem. Int. Ed.上刊载了一篇以乙二醛作为共价弹头，具有细胞活性的、不可逆共价靶向精氨酸残基的研究。这种策略同时适用于激酶类、和非激酶类靶标，具有普遍的适用性。 01 精氨酸靶向共价抑制剂 1.1、精氨酸靶向共价抑制剂开发的潜力 精氨酸（R）类似于赖氨酸（K)，是蛋白质中最丰富的一类氨基酸，其出现频率为5.4%，在蛋白质折叠、活性、蛋白质-蛋白质以及蛋白质-核酸相互作用中发挥重要作用。 精氨酸经常作为抑制剂与靶蛋白的识别位点，通过与带有负电荷的羧酸盐或磷酸盐基序发生静电相互作用或形成氢键；其也是蛋白质相互作用（PPI）“热点”中第二丰富的氨基酸。 药物靶标的溶剂前沿点经常发生突变，转变为精氨酸，包括一些激酶，如TrkA G595R、ALK G1202R等，导致获得性耐药性。解决这种耐药性问题的可行性方案之一既是靶向共价抑制剂。 精氨酸具有作为共价靶向潜力。 除了它比Cys更广泛存在以外还有它自身特性以及有可用“弹头”方面的原因。首先，就精氨酸而言，具有很强的碱性残基。其胍基残基在生理条件下pKa~12，总是完全质子化的，因此具有弱亲核性；再者，多种反应性亲电基团已被用于选择性修饰精氨酸残基蛋白，如各种邻二羰基基团，包括苯乙二醛、甲基乙二醛、1,2-环己二酮、α,β-二酮酰胺等。 1.2、基于α,β-二酮酰胺的精氨酸TCIs 最近也已经有精氨酸TCIs的报道，如下图，2022年，J Am Chem Soc上报道的首个利用α,β-二酮酰胺靶向KRASG12R，设计了不可逆共价抑制剂。 如上图，这个报道首先给优化的亲和元件上安装了α,β-二酮弹头，并将其氧化为α-二羟基的不稳定结构，这种不稳定结构易于与精氨酸胍基团自发性反应成环。然而，比较遗憾的是该化合物不具有细胞活性。 此外，需要在抑制剂（亲和元件）和引入的弹头（α,β-二酮酰胺）之间连接N原子，这可能进一步限制了该“弹头”在其它药物靶点上的应用。 1.3、精氨酸与乙二醛 精氨酸与乙二醛的Maillard反应中的糖基化位点，也经常被用于精氨酸选择性蛋白修饰、和DNA/RNA的共价修饰，如下图A、B。 在亲核性更强的赖氨酸、半胱氨酸都存在的情况下，“携带”有乙二醛“亲电弹头”的共价抑制剂为什么可以化学选择性地靶向亲核性更弱的精氨酸残基呢？ 如上图C，可以合理地解释这种现象发生的原因：这主要是由“热力学因素”致使的，乙二醛与精氨酸首先发生可逆性缩合，进而脱水打破可逆性平衡，产生了高度稳定的五元环加和产物。这一过程比由Lys、Cys残基获得的可逆、或不稳定的加合物更加有利。 因此，带有乙二醛共价弹头的TCIs更容易化学选择性靶向精氨酸。 本文正是利用乙二醛弹头开发靶向精氨酸的TCIs。 02 基于乙二醛弹头的TCIs设计 2.1、基于乙二醛弹头的设计思路 首先，如下图，乙二醛弹头可以从羧基结构（COOH）通过三步适度的变化，经由α-羰基偕二醇转化获得。鉴于偕二醇与乙二醛之间的不平衡转化，可以对于通过偕二醋酸酯进行保护和脱保护。 再者，羧基（COOH，来自药物）和精氨酸（来自蛋白质靶标）之间可以形成一种分子间的氢键、或盐桥作用。据2018年报道的一项基于DrugBank中的统计，~16%药物中包含有羧基基序。 这些包含羧基基序（COOH）已知可逆抑制剂，将是天赐的精氨酸靶向共价抑制剂设计的亲和元件；在通过适度的转化，在羧基原位安装上乙二醛类二羰基共价弹头，进而设计为精氨酸靶向共价抑制剂。 因此，本文的设计思路则是通过转化存在于许多非共价抑制剂的羧基基序为乙二醛弹头，快速便捷地产生具有精氨酸靶向的TCIs，如下图。 因此，上述提到的乙二醛/精氨酸之间的“热力学因素”致使的缩合，将最初设计不当的选择性非共价抑制剂/靶标相互作用，改善为选择性、不可逆共价靶向抑制剂。 2.2、可用结构搜索 研究人员针对已发表的X-射线蛋白/配体复合物的生物信息研究进行统计，如下图，旨在20万多个可用的结构中，有1000多个具有C-COOH基序，其中包含39个FDA批准药物。 在这些候选物中，246个含有靠近靶蛋白的COOH（＜5Å）。进一步靶标结构分析表明，这些“可靶向精氨酸”既存在于激酶中，也包含在非激酶中，既存在于靶标蛋白质内部，也有暴露于溶剂区表面。 其中，228个属于非激酶类，18个属于激酶类；非激酶类中，103个靶标精氨酸位于溶剂暴露区，125种位于靶标内部；18种激酶中，11种精氨酸位于溶剂暴露区，7种位于靶标内部。 这表明本文中基于乙二醛的TCI设计策略居伊欧潜在的普遍适用性。 如下图，是所有满足本文研究的靶标及其配体。结合可用数据，作者选择性其中的Mcl-1（髓系细胞白血病-1，非激酶类，癌症中的关键生成因子）、AURKA（一种在细胞周期进程中有重要作用的有丝分裂激酶）及其已知配体分子作为研究对象。 上下滚动查看更多 2.3、靶向Mcl-1精氨酸的TCIs Mcl-1是典型的基于PPI的治疗靶点，具有Bcl-2家族蛋白中高度保守的“hotspot”精氨酸残基R263，如下图。 几乎所有报道的Mcl-1抑制剂都含有与R263形成关键有利相互作用的羧基基序。如上图中，Mcl-1非共价抑制剂RM0（R1=COOH）。本文中，根据作者的设计策略，合成了相应的乙二醛基TCI，RM1。 与GSH共孵育12小时，RM1依然能够保持稳定，其对GSH活性几乎可以忽略不记；但RM1却可以与N-Fmoc精氨酸甲酯在不同的缓冲液中反应，如下图。 如下图A，体外IC50检测表明，与非共价的RM0 （IC50 = 2021nM, T = 0h）相比，RM1的效力（IC50 = 5675nM, T = 0h）略有下降。然而，随着孵育时间延长，观察到RM1时间依赖性显著，（IC50=480nM，T=5h），表明其为共价抑制剂。相比之下，RM0没有明显的时间依赖性变化。图B中的蛋白质谱明确证实了RM1与Mcl-1发生共价反应，形成了单修饰内蛋白。 同时发现，使用大量的RM1（RM1:精氨酸Mcl-1=10:1），也没有观察到其它共价加成物形成。与其它Bcl-2家族蛋白相比，这种针对Mcl-1 R263的活性和选择性是独一无二的，所有这些Bcl-2家族蛋白都具有相同的保守精氨酸，图下图C，也包括R263突变的Mcl-1，如下图B底部。 这表明，RM1在生理条件下对Mcl-1结合口袋具有高度选择性共价结合。如下图D，是RM1/Mcl-1的不可逆反应动力学。 通过晶体结构（下图E）可以看出，RM1结合BH3结构域，具有明确的电子密度，从RM1延伸到R263的侧链，并且在R263和RM1之间形成了咪唑酮结构。这种加合物咪唑酮结构与完整蛋白质谱显示的水分子丢失的结果一致。这些结果表明，RM1确实是精氨酸反应性的，以乙二醛为基础的Mcl-1靶向共价抑制剂，并且可以通过选择抑制剂支架和共价化学反应来实现对靶向精氨酸残基Mcl-1的选择性。 如下图F，与R263不同，R233也是独特的，暴露于溶剂区，与RM1的R2部分的的苯环靠近。因此，作者在该苯环上设计了RM2（基于乙二醛）、RM3（基于α,β-二酮酰胺）、和RM4（基于羧基，非共价对照物）。预计RM2、RM3可能共价结合R233；同时，这两种化合物也可用于比较乙二醛和α,β-二酮酰胺的化学反应性。 如上图G，RM2、3显示出相似的增加的抑制活性，在图H蛋白质谱中也观察到了配体与靶标的加合物产物。上图I中，RM1、RM2显示出比R3、R4提高的细胞活性。通过蛋白印迹分析（图J、K），RM0-4都适度抑制内源性Mcl-1介导的MV-4-11细胞线粒体依赖性凋亡通路的激活。 综合考虑，乙二醛可能在开发精氨酸反应性TCIs方面具有潜在的前景。 2.4、靶向AURKA精氨酸的TCIs AURKA（Aurora A）是一种有丝分裂激酶，在细胞周期进程中至关重要，是众所周知的晚期癌症靶点。共价激酶抑制剂（CKIs）是癌症治疗中的重要药物，FDA获批的9种药物中CKIs中，都是靶向激酶ATP活性位点附近的非催化性Cys位点。然而，此前还没有以精氨酸为目标的CKI报道。 如下图，RA0是强效、选择性、可口服生物利用的Aurka抑制剂，在酶促检测中对一个包含295个激酶的激酶组表现出良好的选择性。RA0的COOH基序（R1）与靶标的Arg220靠近，形成氢键，是本文中安装乙二醛的良好位点。 因此，基于同样的设计策略，本文中合成了精氨酸TCI，RA1。 如下图A，RA1相比于前体RA0，显示出减弱但仍然有效的体外靶标抑制活性，同样，RA1也具有时间依赖性、改善的IC50值，表明其参与共价抑制。 上图B-I，类似于Mcl-1精氨酸TCIs的开发，以RA0为起点，展开了针对AURKA精氨酸进行了TCIs研究，也成功设计、合成、证实了精氨酸靶向共价抑制剂RA1，同时其具有细胞活性。 2.5、靶向ALKG1202R精氨酸的TCIs 靶向共价抑制剂的优点之一是它们能够抑制耐药突变体。 受上述早期基于α,β-二酮酰胺靶向KRASG12R突变体的启发，作者也探索了基于乙二醛的化学方法，开发针对溶剂前精氨酸突变的TCIs潜在应用。 ALK多种基因改变与多发性肿瘤的发生有关，超过一半使用了第二代碱性激酶抑制剂（如布加替尼，本文中的RK0）治疗的患者，发现了获得性耐药突变，发生了碱性激酶结构域的突变，其中，最常见的突变体为ALKG1202R,如下图。 晶体结构研究，发现了溶剂前突区域Arg1202靠近RK0的甲氧基苯环基序。因此，本文的精氨酸靶向共价抑制剂设计如下。RK1具有时间依赖性体外靶标抑制活性。 2.6、Pro-TCI设计，提高细胞活性 以上以乙二醛弹头为基础的，针对非激酶类、以及激酶精氨酸靶向共价抑制剂的开发若然都获得了出色的体外靶向抑制，和适度的细胞活性，但与其前提非共价抑制剂相比，它们的细胞活性降低了很多。 这可能是由乙二醛的高亲电性引起的。 比如上述第一个基于精氨酸设计的α,β-二酮酰胺亲电弹头的KRASG12R精氨酸共价靶向抑制剂完全丧失了细胞活性，进一步也支持了以上假设。 此外，乙二醛已知经历各种代谢转化，包括氧化（乙醛）、还原（乙醇醛）、和偶联反应，这些反应会影响其稳定性和药代动力学特征。因此，为了克服乙二醛TCIs固有的高亲电性，以及在参与其自身的靶标之前与其它生物亲核试剂的潜在的非生成性反应，通过pH/酯酶相应的偕二乙酸盐可逆地保护乙二醛弹头，如下图。 作者首先针对RA1开发了pro-TCI，RAAC，如下图A。偕二乙酸盐具有优异的细胞外稳定性，在细胞内会被内源性性酶酯酶迅速解除保护。 如下图B，首先是选择性非共价RAAC/AURKA相互作用，然后是可逆的乙二醛/亲核试剂缩合，“热力学捕获”并最终致使选择性、不可逆地靶向抑制。不同pH条件下的体外稳定性测试证实，RAAC在pH=8.5时被水解，或细胞裂解。 接下来的测试表明，RAAC具有细胞抑制效应，如图C；RAAC对细胞Hek293细胞毒力有轻微改善，而对Hek293细胞毒力在50μM以下无毒性，如图D 03 总结与展望 本文成功开发了一种精氨酸靶向蛋白激酶、和非蛋白激酶不可逆共价抑制剂的研发策略。 1、以靶标已知的带有COOH基序的配体作为起点； 2、结合晶体结构学研究，在溶剂暴露区或者甚至是蛋白质内部，选择与配体COOH紧密接触（晶体结构上靠近）的精氨酸残基作为共价靶向目标； 3、通过COOH原位适度转化为乙二醛，安装上具有精氨酸反应性的亲电弹头，进行小分子药物/候选药物的共价设计。 通过两种类型的靶标（Mcl-1、AURKA，非激酶与激酶类）均在以上策略上获得了更好的验证，成功开发了具有体外出色靶向抑制，适度细胞活性的精氨酸靶向共价抑制剂。 此外，通过突变为精氨酸的ALKG1202R靶标进行同样的验证，也获得了同样的成功！为了提高细胞活性，通过设计偕二酸酯保护的策略，保护乙二醛的前体，使其在细胞外能够保持稳定，细胞内能够被酯酶解除保护，进而发挥亲电弹头的作用，解决了细胞活性低的问题。 总之，本文开发的具有细胞活性的、精氨酸靶向、不可逆共价抑制剂的策略具有普遍的参考意义，值得点赞和借鉴！ 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓