Ulipristal Acetate

声明：因水平有限，错误不可避免，或有些信息非最及时，欢迎留言指出。本文仅作医疗健康相关药物介绍，非治疗方案推荐（若涉及）;本文不构成任何投资建议。近日，印度药企Bharat Biotech 宣布：已在印度建立其首个细胞和基因治疗 (CGT) 工厂，并投资7500万美元。据悉，该公司正在研究两款细胞疗法和3款基因疗法，预计其新疗法将在未来3年内上市。该公司正将把重点从核心疫苗业务扩展到复杂的细胞和基因治疗，据市场研究公司 Precedence Research 的数据，该市场预计从 2024 年的 212.8亿美元增长五倍以上至 2034 年的 1174.6 亿美元。该 50,000 平方英尺的设施专门用于生产高滴度病毒载体，包括 AAV（腺相关病毒）、慢病毒和腺病毒，以支持基因治疗应用。该设施拥有最先进的能力，可在其平台上生产不同的产品，并为血癌、实体器官癌和遗传性疾病提供治疗选择。Bharat Biotech 首席开发官 Raches Ella 表示，其目标是使基因疗法普及化，就像疫苗一样，让所有人都能负担得起这些疗法。细胞疗法和基因疗法比传统疗法更贵，动辄几百万美元。Bharat Biotech 执行主席 Krishna Ella 博士表示：“与全球相比，印度仍处于CGT发展初级阶段，如果在印度市场售卖这些CGT疗法，售价约500万卢比（约57900美元），或许定价比这还低。”作为一家在开发抗病毒疫苗方面拥有数十年经验的公司，Bharat Biotech 具有独特的资质，可以进行大规模生产，从而加快临床产品的商业化。该公司还与威斯康星大学麦迪逊分校的 Krishanu Saha 教授合作开发下一代 CAR-T疗法。Bharat Biotech 是一家印度生物技术公司，在疫苗和生物治疗领域有突出表现，成立于1996 年，截至 2023 年有 1526 名员工，公司致力于开发价格亲民、安全且高质量的疫苗和生物治疗产品。其拥有 145 项全球专利，在生物信息学、分子流行病学、分子生物学、微生物学、细菌学、病毒学、免疫学、生物化学、临床研究、工业生物技术、制剂和产品开发等领域开展前沿研究。Bharat Biotech已开发出多种突破性的疫苗和生物治疗产品，包括世界上第一种伤寒结合疫苗 Typbar TCV、用于治疗糖尿病足溃疡的生长因子凝胶 Regen - D®，以及使 Revac - B mcf® 得以生产的专利技术 Himax®。Revac - B mcf® 是第一种重组乙型肝炎疫苗，与同类疫苗相比，具有最高水平的抗原回收率。其新冠疫苗 Covaxin4是印度本土开发的全病毒灭活新冠疫苗，与印度医学研究理事会（ICMR）和印度国家病毒研究所（NIV）合作研发。2021 年 1 月 3 日获得印度药品管理总局批准紧急使用。研究显示，Covaxin 对儿童具有良好的安全性和免疫原性。其结核病疫苗 MTBVAC与 Biofabri 密切合作进行临床试验。MTBVAC 是第一个从人类身上分离出来的结核分枝杆菌的减毒活疫苗，2024 年已开始在印度成年人中进行安全性和免疫原性试验，计划于 2025 年开始关键的安全性、免疫原性和有效性试验。它还与葛兰素史克公司建立产品转让合作伙伴关系，负责生产葛兰素史克公司开发的疟疾疫苗 RTS，S/AS01E 的 S 抗原成分。根据协议，巴拉特生物技术公司预计在 2029 年成为该疫苗的唯一供应商。研发管线参考资料：https://www.fiercepharma.com/manufacturing/bharat-biotech-enters-cell-and-gene-therapy-market-75m-production-investment

导读：mRNA序列设计是mRNA疫苗/药物开发的第一难关，序列骨架直接影响mRNA的稳定性、翻译效率和免疫原性等，是mRNA成功开发的关键决策之一。mRNA由编码区域（CDS）和非编码区域（5' cap、5' UTR、3' UTR和3' poly A尾）构成。其中编码区决定了经mRNA递送的功能性蛋白的成药潜力。本期文章菌菌将聚焦于CDS编码序列，结合mRNA巨头公司Moderna、BioNTech/辉瑞、Arcturus等实际应用案例解析其设计与优化策略。 01 mRNA序列全解析  5’ Cap的作用是保护mRNA不被外切酶降解、维持其结构稳定性，并与3’端的poly A尾、poly A结合蛋白（PAPB）和翻译起始因子蛋白协同作用，起始蛋白质的翻译。出于真核生物体内表达的考虑，mRNA常用的帽结构为Cap1。IVT mRNA常用的加帽方式包括酶法加帽和共转录加帽。 5’ UTR和3’ UTR的功能为调控mRNA的翻译，影响mRNA的稳定性。在mRNA疫苗/药物的研发过程，UTR的设计原则为：直接选取人高表达基因的mRNA、使用病毒来源UTR、或基于算法全新设计UTR序列。 如前所述，poly A尾与Cap结构、poly A尾结合蛋白（PAPB）协同起始mRNA的翻译程序。已被证明有效的polyA序列包括长度在100~120 nt的纯A序列、或分段式polyA序列（例如辉瑞/BioNTech的30A + 10(GCAUAUGACU) + 70A）。 除以上非编码的元件外，编码区域（CDS）的可翻译率无疑是至关重要的。CDS的设计和优化策略为：首先确定目标蛋白的氨基酸序列（天然蛋白序列或具有增强功能的突变体），其次是针对目标物种进行密码子优化。 下文中菌菌将结合典型案例分析mRNA CDS的设计与优化，主要包括两个步骤：首先是设计目标蛋白氨基酸序列，再基于密码子设计并优化mRNA CDS序列。 图示 mRNA序列设计原则 02 编码蛋白的氨基酸序列设计与优化 mRNA CDS序列的设计基础是确定目标蛋白的氨基酸序列。氨基酸排列顺序是蛋白质一级结构和高级结构的基础，直接决定蛋白质的生物学功能。天然活性蛋白的氨基酸序列是CDS序列设计的可选方案之一。 然而，随着蛋白质工程的成熟发展，筛选或定向改造具有增强功能的突变体能够进一步改善蛋白或多肽分子的成药特性。这一工程化设计思维也逐渐应用于mRNA CDS序列的设计，相关典型案例如下： 案例1：报告基因eGFP 绿色荧光蛋白（GFP, green fluorescent protein）来源于水母Aequorea victoria，能够在原核和真核生物体内表达荧光蛋白。2008年，发现和发展GFP蛋白的三位科学家Osamu Shimomura、Martin Chalfie 和Roger Tsien（钱永健）被授予了诺贝尔化学奖。 然而GFP发光信号较弱，科学家发现了一种GFP突变体，得到了增强型绿色荧光蛋白（eGFP, enhanced green fluorescent protein）。相比天然版本的GFP，eGFP的荧光强度提高了35倍。 目前，eGFP mRNA已成为mRNA研究领域必不可缺的工具，用于细胞转染对照、mRNA序列优化、目标蛋白示踪以及递送系统开发。 图示 耀海RNASci平台eGFP mRNA的细胞转染评估 报告基因mRNA的使用对于LNP递送系统的开发至关重要，例如：绿色荧光蛋白mRNA、红色荧光蛋白mCherry mRNA、荧光素酶mRNA（Luciferase mRNA）等。耀海生物RNASci平台提供多种报告基因mRNA（转染级和高纯度级），在体内外均具备高表达水平，高质量满足mRNA的细胞转染和动物试验需求。欢迎垂询：13380332910。 案例2：Moderna mRNA-3705（hMMUT多态性） 基因/蛋白的多态性也是目标蛋白氨基酸序列选择的考量之一。 mRNA-3704和mRNA-3705是Moderna开发的针对甲基丙二酸血症/酸尿症（MMA）的管线，MMA最常见的致病因素是甲基丙二酰辅酶A变位酶（MMUT）缺陷或缺失。 mRNA-3704和mRNA-3705均编码人MMUT，二者的区别在于，mRNA-3704的第671位氨基酸是缬氨酸（V671），而mRNA-3705的671位氨基酸替换为异亮氨酸（I671）。mRNA-3705的编码序列的来源为健康人群MMUT在671位点的多态性。 图示 Moderna mRNA-3704/3705的序列示意图 案例3：Arcturus ARCT-810（OTC突变体） 参考蛋白/多肽药物的开发，设计一种蛋白突变体以改善其半衰期等性能，也是mRNA上游设计中的重要步骤。 ARCT-810是Arcturus的在研管线，靶点为鸟氨酸氨甲酰转移酶（OTC），针对鸟胺酸氨甲酰基转移酶缺乏症（OTCD）。ARCT-810通过专有脂质纳米颗粒（LNP）将mRNA递送到细胞中，mRNA被翻译成功能性的OTC，使患者自身肝细胞产生具有生物学功能的OCT酶。相比野生型OCT酶，ARCT-810存在3个氨基酸位点的改变，从而提高了OTC的半衰期，且增加了与线粒体的结合。 图示 Arcturus ARCT-810序列示意图 案例4：ReCode RCT2100（CFTR突变体） 囊性纤维化（CF）是由囊性纤维化跨膜传导调节器（CFTR）基因突变引起的疾病，会导致患者进行性气道损伤和呼吸衰竭。ReCode正在开发一款基于mRNA蛋白替代疗法的管线——RCT2100。RCT2100编码CFTR mRNA，利用选择性器官靶向（SORT）LNP通过雾化器吸入给药，将mRNA特异性递送至与疾病有关的器官、组织和细胞。 RCT2100的mRNA编码区经过了优化。野生型CFTR蛋白存在一个特定的水解热点，而ReCode优化后的CFTR mRNA相比野生型的水解热点明显减少，有效维持mRNA的稳定性和翻译效率。  图示 ReCode RCT2100序列示意图 03 mRNA CDS序列的设计与优化 基于以上策略确定了目标蛋白的氨基酸序列，下一步是针对氨基酸序列设计优化mRNA序列，常用的策略为密码子优化。据报道，两种密码子优化策略（复合密码子家族优化和家族内密码子优化）已成功用于商业化mRNA疫苗CDS区的优化，包括Moderna新冠疫苗mRNA-1273和BioNTech/辉瑞疫苗BNT-162b2。 当前主要以CAI（密码子适应指数）作为密码子优化的参数。经密码子优化后，mRNA-1273的CAI约为0.98，BNT-162b2的CAI约为0.95，二者均相比天然新冠病毒S蛋白编码基因（CAI＜0.7）大幅提高。 3.1 复合密码子家族优化 对于精氨酸（Arg）编码基因来说，人体内使用CGN的频率高于AGR。然而，在病毒基因组内却恰恰相反。例如，新冠病毒的刺突蛋白包含42个Arg残基，其中30个由 AGR 密码子编码，仅12个由 CGN 密码子编码。 在mRNA疫苗的CDS序列优化方面，辉瑞/BioNTech采用了典型的复合密码子优化策略，在BNT162b2的CDS区域减少了8个AGR密码子，对应增加了CGN密码子的频率。Moderna开发的mRNA-1273也使用了这一策略，将其中28个AGR密码子替换成了CGN。 类似地，高表达的人核糖体蛋白中，81%的亮氨酸通过CUN密码子编码。因此，在mRNA疫苗BNT162b2和mRNA-1273中，多数的UUR被替换为CUN。 3.2 家族内密码子优化 家族内密码子优化的原则是替换为高表达基因优选且被最丰富的tRNA解码的最佳同义密码子。在编码Arg的密码子中，CGG被认为是CGN家族中的最优解。基于这一原则，BNT162b2和mRNA-1273对Arg密码子进行了优化。 同样地，在谷氨酸（Glu）密码子优化方面，mRNA-1273中的GAN家族密码子全部替换成了GAG。 图示 2款商业化mRNA疫苗的密码子优化策略 04 结语 众所周知，mRNA通过表达目标蛋白发挥预防或治疗效应，因此在mRNA CDS序列设计中，目标蛋白分子的设计是重中之重。编码蛋白的一级结构（氨基酸序列）直接影响功能性蛋白在体内的稳定性、半衰期和活性等成药关键特性。这一偏上游的分子设计在公共文章中反而鲜少提及，菌菌在本文通过典型案例进行了详细阐述。 其次，密码子优化能够改善mRNA在目标宿主的翻译效率，对于mRNA-蛋白剂量水平也必不可少。密码子优化是基因合成、分子生物学领域的重要部分，可借助的工具包括多家生物技术公司推出的线上工具、以及百度推出的LinearDesign。 参考文献  [1] Coughlan KA, Eybye M, Henderson N, DeAntonis CM, et al. Improved therapeutic efficacy in two mouse models of methylmalonic acidemia (MMA) using a second-generation mRNA therapy. Mol Genet Metab. 2024 Sep-Oct;143(1-2):108560. [2] Markey McNutt, MD, PhD, FACMG. It Translates: An Update on the ARCT-810 mRNA for OTC Deficiency. SIMD Annual Meeting 2024. [3] Daniella I，Dmitri B， Ella A M， et al. Functional Rescue of CFTR by Aerosolized Delivery of Optimized CFTR mRNA Using ReCode LNPs in Primary Human Bronchial Epithelial Cells Derived From Patients With Cystic Fibrosis. American Thoracic Society (ATS) 2022 International Conference.2022. [4] Xia X. Detailed Dissection and Critical Evaluation of the Pfizer/BioNTech and Moderna mRNA Vaccines. Vaccines (Basel). 2021 Jul 3;9(7):734. doi: 10.3390/vaccines9070734. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观，不代表本站立。