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▎药明康德内容团队编辑（来源：良渚实验室） 肿瘤异质性是癌症的发生、发展以及临床治疗中的关键影响因素。高通量单细胞转录组测序（single cell RNA-seq，scRNA-seq）技术能够精确捕获单个细胞的基因表达信息，为我们深入认识肿瘤内部的异质性和发现稀有细胞类型提供了有力工具。 人工智能在癌症研究和制药创新中发挥着越来越重要的作用。它能够整合庞大的肿瘤数据集，解码肿瘤发生发展背后复杂的生物系统，深化对药物-靶点相互作用的理解，优化治疗策略，并加速新药候选物的识别进程。 图片来源：123RF 然而，目前的抗肿瘤药物筛选主要基于传统的转录组测序数据，往往会忽略肿瘤内部的异质性以及肿瘤细胞与微环境的互作关系。另外，许多研究仅聚焦于单一癌症类型，未能充分利用泛肿瘤数据中蕴含的共性特征。因此，亟需开发基于单细胞泛肿瘤图谱的药物筛选方法，在单细胞水平上实现抗肿瘤药物的高效筛选，并深入揭示药物的作用机制及潜在副作用。 近日，良渚实验室/浙江大学基础医学院郭国骥/韩晓平/夏宏光等团队合作在National Science Review上在线发表了题为A deep learning framework for in silico screening of anticancer drugs at the single-cell level的研究论文，该项工作推出了一个创新的深度学习框架“神农”（Shennong），为在单细胞水平上开展抗肿瘤药物的计算机辅助筛选提供了新途径。正如上古神农氏尝百草以明药性，今天的“神农”框架也在数字世界中“尝试”药物，预测它们对不同类型肿瘤细胞的作用效果。 泛肿瘤细胞图谱是增进对癌症生物学理解以及改善诊断和治疗的重要资源。研究人员首先使用团队自主研发的高通量单细胞测序技术平台Microwell-seq，构建了一个包含303351个细胞的泛肿瘤单细胞图谱，涵盖了中国发病率和死亡率最高的肿瘤类型。 通过该肿瘤细胞图谱，研究人员识别出了恶性细胞和癌前细胞（非恶性上皮细胞）。来源于邻近癌旁组织和肿瘤组织的癌前细胞反映了从正常到肿瘤的过渡中间状态。这些癌前细胞表现出与邻近肿瘤相关的分子改变，提示它们在肿瘤发生中发挥重要作用。癌前细胞和恶性细胞之间共享的调控通路和代谢模式强调了区分这些细胞类型的必要性——它们具有异于正常上皮细胞的特征，而这些特征在传统转录组测序中往往难以发现。 通过泛肿瘤分析，研究人员还全面表征了肿瘤相关成纤维细胞和内皮细胞。表达分析和调控模式揭示了肿瘤组织和邻近癌旁组织的基质或内皮细胞之间的相似性，证实了邻近癌旁组织和正常组织细胞的不同功能。泛肿瘤细胞图谱数据集可在交互式网站http://bis.zju.edu.cn/shennong/landscape.html进行访问。 ▲图1 泛肿瘤单细胞图谱的工作流程和细胞数据集统计（图片来源：原始论文[1]） 传统的药物筛选或药物发现方法通常耗时且成本高昂。人工智能和机器学习方法加速了药物发现和开发的进程。研究人员推出了神农框架，正是这类方法的创新典范。 神农框架以单细胞计数矩阵和预处理的细胞扰动数据为输入。通过基于变分自编码器的深度学习模型，计算每个细胞对特定药物处理的响应强度（潜在得分）和变化趋势（潜在方向）。模型包括含有4个隐藏层的编码器、相同层数但顺序相反的解码器和中间的瓶颈层。考虑到扰动数据的的庞大规模，同时某些细胞可能存在冗余的扰动特征，模型在潜在空间中采用了组套索正则化层，运用类注意力机制为每个细胞富集特征信息丰富的扰动条目。最终输出药物处理对各细胞的影响得分矩阵。 利用贝叶斯检验计算药物处理对不同细胞类型的影响，研究人员获得了富集分数矩阵，以评估不同药物对特定细胞类型的影响。这一方法不仅能预测药物的治疗效果和副作用，指导药物筛选，还能发现针对特定细胞类型的候选药物。通过分析药物处理相关基因在模型解码器中的权重，探究该基因在对应药物处理中的相对重要性，从而识别出特定药物的潜在作用靶点。 10折交叉验证结果表明，神农框架在特征提取和潜在空间的细胞聚类映射方面展现出优异的可重复性。 ▲图2 神农框架的搭建流程和应用方向（图片来源：原始论文[1]） 将神农框架应用于泛肿瘤细胞图谱后，研究人员识别出了一些具有新适应症的FDA批准药物、正在进行临床试验的候选药物以及具有抗肿瘤活性的实验性化合物。例如，FDA批准的乳腺癌治疗药物依西美坦对肺癌细胞表现出显著的抗增殖效果，同时这一发现在一期临床试验中得到证实。候选药物volasertib在多个临床试验中显示出安全性和抗肿瘤活性，能够缓解非小细胞肺癌患者的病情。细胞系实验证实了实验化合物帕苯达唑具有抗肝癌活性，其效果与晚期肝细胞癌的标准疗法（索拉非尼和瑞戈非尼）以及临床试验药物陶扎色替相当。 在药物潜在作用靶点的预测方面，神农框架的分析结果与已知研究高度吻合。例如，对候选药物volasertib的分析显示，其显著影响了多个基因的表达，包括BCL2L1、PLK1、NEK7和HMGB2，这些基因在其对应的解码器中具有极高的权重。 此外，神农框架还能评估药物引起的组织损伤效应，其预测结果与已知的毒性表现和研发停用案例高度一致。例如，框架预测维莫非尼可能损害正常胰腺上皮细胞，这与临床试验中发现的维莫非尼相关胰腺炎病例相符，该不良反应导致欧洲和加拿大更新了药品说明标签。同样，框架预测表面lopinavir可能会对来源于正常组织的肝上皮细胞和基质细胞产生显著影响，这与已报道的lopinavir相关肝损伤病例相吻合。 为了进一步验证神农框架的稳健性，研究人员比较了泛肿瘤细胞图谱和多个第三方数据集的预测结果。训练后的模型成功提取了这些数据集中来自不同组织来源的细胞的独特和共性特征。潜在空间的映射中，相同细胞谱系的细胞簇呈现出明显的聚集趋势。约有30%至45%的化合物与相应第三方数据集中的预测结果重叠。这一比较结果表明神农框架具有良好的稳健性和泛化能力。 ▲图3 第三方数据集比较（图片来源：原始论文[1]） 总的来说，本研究推出的深度学习框架“神农”（Shennong）实现了在单细胞水平上准确预测药物反应，不仅可用于筛选潜在抗肿瘤药物并探究其作用靶点，还能评估药物引起的组织损伤效应。神农框架展现出良好的稳健性和可解释性，有望显著提升药物筛选的效率和准确度，加速新药开发进程。 良渚实验室/浙江大学基础医学院郭国骥教授、浙江大学基础医学院韩晓平教授、良渚实验室/浙江大学基础医学院夏宏光教授和浙江大学医学院附属第一医院梁廷波教授为本文通讯作者。浙江大学基础医学院张霈婧博士后、浙江大学基础医学院王雪怡博士生、良渚实验室岑旭峰特聘研究员和浙江大学医学院附属第一医院章琦副教授为本文共同第一作者。良渚实验室/浙江大学基础医学院欧阳宏伟教授，良渚实验室王晶晶研究员为本研究提供了重要帮助。研究受到了国家自然科学基金委和浙江省自然科学基金委的支持。 原始论文： [1] A deep learning framework for in silico screening of anticancer drugs at the single-cell level. National Science Review, nwae451, https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1093/nsr/nwae451 免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。 更多推荐 点个“在看”再走吧~

蛋白翻译后修饰在细胞信号转导、蛋白稳定性调控、蛋白识别与相互作用以及空间定位等发挥着重要作用，其中的赖氨酸乙酰化修饰报道的最为广泛下修饰之一。深入认识蛋白的乙酰化修饰的机制以及乙酰化修饰对蛋白的功能调控机制对相关药物的开发和设计至关重要。2024年8月20日，新加坡国立大学的Yao Shao Qin 教授团队联合暨南大学药学院张志民团队在J. Am. Chem. Soc.上发表了题为“Small Molecule-Induced Posttranslational Acetylation of Catalytic Lysine of Kinases in Mammalian Cells”的研究论文，首次在哺乳动物细胞中利用小分子对激酶催化中心的赖氨酸实现了选择性乙酰化修饰，为激酶的生物学研究和靶向药物的开发提供了一个新的化学工具。 赖氨酸乙酰化状态失调与心血管疾病、癌症和神经性疾病等均存在密切的联系。生物体中的赖氨酸乙酰化稳态是由众多赖氨酸乙酰化酶（KACs）和去乙酰化酶（KDACs）精确调控的。在哺乳动物细胞中对蛋白进行选择性修饰的化学工具是研究赖氨酸乙酰化生物学功能的利器，但在开发过程中面临着一系列的挑战。一些传统的生物方法操作复杂，如通过工程化改造的pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNACUA系统在表达过程中插入非天然的乙酰化赖氨酸；已报道的可以诱导蛋白乙酰化修饰的小分子缺乏广谱性和修饰位点选择性，如AceTAC 和 BAHA试剂。本文作者以激酶为对象，尝试开发同时具有高选择性和高反应性的乙酰化分子工具。 激酶可以通过水解ATP来磷酸化底物蛋白，从而调控一系列信号通道的开放。在激酶的活性中心，大都存在一个非常保守的催化性赖氨酸，目前人们已经开发了多个可以共价修饰这个赖氨酸的小分子，包括一个可以在体外对PI3Kδ (K779)进行选择性乙酰化修饰的分子。为了实现在哺乳动物细胞中对这个赖氨酸的乙酰化修饰，作者以3-aminopyrazole这个可以跟众多激酶结合的分子作为化学支架，在它的末端芳香环上引入一个活化酯并通过不同的取代基来微调该warhead的反应性与稳定性，成功的合成Ac1-Ac8。这些分子在PBS中都具有较高的稳定性(t1/2 > 12 h) 和与氨基的反应活性，而含有两个F作为吸电子取代基的Ac4表现最佳。  Ac4在细胞中也可以很好的修饰激酶SRC和AURKA的催化赖氨酸。XO44是一个非常成熟的激酶赖氨酸共价修饰分子，PD/WB实验显示在细胞提前孵育了Ac4后，XO44与SRC和AURKA的结合能力急剧降低，证明催化性赖氨酸被Ac4乙酰化后阻止了XO44与SRC/AURKA的共价反应。蛋白组学实验证明Ac4可以乙酰化上百个内源性激酶，显示该方法的普适性；而且IP-WB显示Ac4孵育后细胞中SRC和AURKA的乙酰化程度都出现了剂量依赖性的提高，更直接证明Ac4可以在细胞中对SRC和AURKA进行乙酰化；最后竞争条件下的IP-WB研究显示活细胞中的AURKA催化赖氨酸被其它小分子共价占据后，Ac4将不能乙酰化AURKA，显示出乙酰化位点选择性。  作者接下来利用这一策略研究了AURKA的催化赖氨酸K162的乙酰化。目前还没有证据显示AURKA 上的K162可逆乙酰化在细胞中是否真实存在。通过对前期开发了一个AURKA选择性非共价抑制剂VX-680进行改造，在靠近K162的苯环上引入活化酯作为乙酰化基团，并将旁边位置引F取代对该活化酯反应性和稳定性进行微调，合成了Ac9-Ac14等系列分子。其中最优异的Ac13不仅显示出与VX-680类似的对AURKA体外抑制活性和细胞毒性，也保留了对AURKA 激酶的高选择性；并且还可以高效地选择性乙酰化AURKA上的K162。Ac13孵育后，细胞中AURKA（K162）的乙酰化明显提高，相应的AURKA（T288）的自磷酸化水平则显著降低。洗脱实验中Ac13也显示出持续的细胞活性和乙酰化AURKA能力。被Ac13乙酰化的AURKA在SIRT3调控下可以实现去乙酰化，这一点在体外和细胞内都被证明。在HCT116细胞中， AURKA可以通过磷酸化p53蛋白，促进其泛素化进而被降解。Ac13孵育的细胞中p53的稳定性显著提高，而当在细胞中过表达去乙酰化酶SIRT3时则可以发现AURKA的乙酰化水平几乎被完全逆转，p53的稳定性也随之降低。综上所述，本论文首次开发成功了一类可以在活细胞中对激酶催化赖氨酸进行选择性乙酰化修饰的化学分子，并以此为基础证明了AURKA的催化赖氨酸K162的可逆乙酰化，显示该方法在深入研究激酶的赖氨酸乙酰化调控领域的广阔应用空间。 论文第一作者为新加坡国立大学唐光辉博士和中山大学王璇博士（现为暨南大学药学院博士后），通讯作者为新加坡国立大学Shao Q. Yao教授和唐光辉博士以及暨南大学药学院张志民研究员。这项工作得到了新加坡NMRC和教育部相关基金、国家重点研发计划和广东省重大基础与应用研究基金的支持。 导师介绍 Shao Q. Yao教授博士毕业于美国普渡大学，随后分别于加州大学伯克利分校癌症研究院和斯克里普斯研究所从事博士后研究工作。2011年起获聘新加坡国立大学终身正教授，2012年起被聘为首席教授。Shao Q. Yao教授以化学生物学为主要研究方向，长期致力于酶及相关生物分子对生命调控的研究，以小分子荧光探针、蛋白质组学、微阵列芯片、高通量筛选等为手段，积极推进疾病的机理研究及治疗手段的开发，先后在Nature、Acc.Chem. Res.、 J. Am. Chem. Soc.、 Angew. Chem. Int. Ed.、 Nat. Commun.和 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.等国际著名期刊上发表高水平学术论文200余篇。 张志民研究员博士生毕业于中科院上海有机化学研究所，随后再加州大学河滨分校（UCR）从事博士后研究，2017年入职暨南大学药学院生物制药系。入选国家级青年拔尖人才和广东省“珠江人才”计划青年拔尖人才。长期以具有重要生理功能和新颖催化机制的酶为研究对象，致力于酶的结构生物与结构药理学研究。近年来以（共）第一/通讯作者在Nature、Nature Communications、Nature Plants、Nature Structural & Molecular Biology、J. Am. Chem. Soc. 、Angew. Chem. Int. Ed.和J. Med. Chem.等国际知名期刊发表研究论文多篇。 唐光辉博士毕业于北京大学，随后加入新加坡国立大学Yao Shao Qin课题组从事博士后研究。长期致力于新型激酶共价抑制剂的开发和活性化合物的药物靶点鉴定。近年来以（共）第一/通讯作者在J. Am. Chem. Soc. 、Angew. Chem. Int. Ed.和Eur. J. Med. Chem. 等国际知名期刊发表研究论文多篇。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓