Glutathione

“ 点击蓝字 关注我们 胡泽平 清华大学药学院研究员、长聘副教授、生命联合中心 PI，入选国家高层次人才特聘教授。主要研究方向为“基于新型代谢组学 / 多组学技术研发的肿瘤等疾病代谢重塑与转化医学研究”。近年来，以通信作者（含共同）在 Cell Metab, Nat Metab, Nat Cancer, Sci Transl Med, Nat Cardiovasc Res, J Clin Invest, Nat Commun 等期刊发表论文多篇。受邀在 Nat Metab, Trends Analyt Chem 等期刊发表 Viewpoints 或综述。研究成果多次被 Science, Nat Rev Cancer 等期刊作为研究亮点专评。主持国家自然科学基金委重点项目、原创探索项目、重大研究计划重点项目 / 集成项目、国家重点研发计划等多项国家级科研项目，以及国际头部药企资助的新药研发合作项目。受邀担任 Nat Metab, Nat Commun, Sci Adv, Cell Rep 等期刊审稿人。 代谢组学技术在鉴别免疫治疗疗效生物标志物中的应用进展 PPS  张皓玥，胡泽平 * （清华大学药学院，北京 100084） [ 摘要 ] 免疫治疗作为新兴的肿瘤干预方法，通过调节患者自身的免疫系统，取得了显著的治疗效果，对癌症治疗具有重要意义。然而，并非所有患者都能从免疫治疗中获益。有些患者可能会出现不良反应，从而导致病情加重。因此，发现能够预测或监测免疫治疗效果的生物标志物显得尤为重要。代谢组学专注于研究生物体内的低分子量代谢产物；通过分析代谢产物在不同生理和病理条件下的变化规律，可以揭示代谢产物与疾病及其临床治疗之间的关联，因此其在寻找预测免疫治疗效果的小分子生物标志物方面显示出广阔的应用前景。当前，代谢组学被广泛应用于癌症研究领域，并已有多项研究发现了与免疫治疗效果相关的代谢产物。综述总结了近年来发现的糖类、脂类和氨基酸类等生物标志物对免疫治疗效果产生的影响，进一步证明了代谢组学在寻找预测免疫治疗效果小分子生物标志物方面的巨大潜力。 近年来，免疫疗法（immunotherapy）的出现为癌症的治疗领域带来了较大的突破。相较于传统疗法，免疫疗法旨在通过调控患者自身免疫系统干预肿瘤的发展 [1]，并拥有更好的靶向性 [2]。免疫疗法可以被分为几大类：免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor，ICI）、嵌合抗原受体 T 细胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）、 淋巴细胞激活因子（lymphocyte-activating factor）、针对共刺激受体的激动性抗体（agonistic antibodies against co-stimulatory receptors）、肿瘤疫苗（cancer vaccines）、溶瘤病毒（oncolytic viruses）和双特异性抗体（bispecific antibodies） [2]。其中，CAR-T 与针对细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原 4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）、 程序性死亡受体 1（programmed death-1，PD-1）和程序性死亡受体配体 1（programmed death-ligand 1，PD-L1）的 ICI 是目前临床应用最多的几种免疫疗法 [2]。然而，免疫疗法在临床应用上却依然面临安全性和有效性方面的挑战。在一些患者中，免疫疗法产生的自身免疫副作用，会使得患者自身的免疫系统攻击健康组织，并导致细胞因子释放综合征、毛细血管渗漏综合征等病症，进而引起低血压、发热、肾功能障碍、结肠炎、肺炎等症状，严重时甚至可能导致死亡  [2]。此外，只有部分患者对于免疫疗法的响应良好，而导致此现象的原因众说纷纭，尚未有定论  [2]。影响免疫治疗疗效的潜在因素有：免疫细胞状态与种类、肿瘤种类、肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）、微生物群等 [3]。代谢组学能够记录并分析细胞在代谢活动中产生的一系列小分子物质，从而提供不同细胞活动结果的功能参数，为寻找影响患者免疫治疗疗效的生物标志物提供便利。 TME 由癌细胞、免疫细胞、基质细胞组成，是可以维持并帮助肿瘤细胞生长的异常组织环境，具有多样、复杂的特征 [4]。由于各细胞的代谢活动、细胞间的相互作用和患者的代谢特征存在差异，不同的肿瘤、不同的患者，其 TME 都会不一样。即使是在同一患者体内，TME 也会随着病情的改变、治疗的进行、时间的推移等因素产生变化。不过，也正是由于 TME 的复杂性，使得其保存了大量生理活动的信息，成为寻找生物标志物，提供个性化治疗的重要依据。多项研究证实，TME 是产生耐药性的主要场所 [4]。当 TME 中的代谢因缺氧或营养获取途径减少而产生变化时，浸润其中的 T 细胞等免疫细胞便会因无法完成活动所需代谢，进而产生抗肿瘤能力的下降 [5]。因此，维持 TME 中免疫细胞的代谢能力，或是将 TME 调整为抑制肿瘤细胞生长，促进免疫细胞生长，都是提高患者免疫治疗疗效的潜在方法。 代谢组学是对小分子代谢产物的全局分析，它像其他“组学”一样，可以提供癌症状态的重要信息。在应用中，代谢组学主要关注生物体内分子量低于1 500 的代谢物 [6]，并能够根据各物质的化学性质、分子量，同时鉴别并检测出上百，甚至上千种不同的物质；相较于传统的代谢显像技术，使用质谱进行检测的代谢组学方法可以对临床的多种样本进行直接检测，具有更简便、更灵敏的优势 [7]。使用代谢组学检测免疫治疗有效与免疫治疗无效患者体内的 TME 差异，可以找出大量影响免疫治疗结果的生物标志物。通过监测这些生物标志物的水平，辅助以机器学习技术，便可能在患者接受免疫治疗前或途中预测出其治疗结果，从而节约医疗资源，并实现精准医疗（见图 1）。本文归纳总结了近年来所发现的可能会对 ICI 与 CAR-T 这 2 种最常见的免疫治疗疗法效果产生影响的代谢产物，以及可能直接影响免疫细胞功能的代谢产物，以期明确目前可能的免疫治疗疗效生物标志物，并强调出代谢组学在寻找免疫治疗疗效生物标志物中的巨大潜能。 1 影响 ICI 疗效的生物标志物 ICI 是近年来创新的癌症治疗方法，其主要作用于人体的免疫系统，并旨在通过解除肿瘤细胞对免疫系统的抑制，使得免疫系统得以更有效地识别和攻击癌细胞。在免疫系统中，存在一些诸如 PD-1/PD-L1 和 CTLA-4 的信号通路机制，用于防止免疫系统的过度免疫反应，有时也被癌细胞用于避免被免疫系统发现与摧毁，这些通路机制被称为“检查点”。ICI 便是通过阻断检查点，恢复免疫细胞的细胞毒性功能，使其能够识别并清除肿瘤细胞。 1.1 糖脂代谢相关生物标志物 糖酵解代谢的活跃程度可以对 ICI 疗效产生影响。一项涉及 681 名三阴乳腺癌患者的Ⅱ期临床研究显示，癌细胞中的糖酵解代谢活动会更容易导致其对 ICI 产生抵抗 [8]；作为糖酵解通路的初始底物，葡萄糖具有成为生物标志物的潜力。Ren 等 [9] 发现，在使用葡萄糖转运体 1 抑制剂 BAY-876 后，ICI 疗法在小鼠模型中取得了更好的疗效。Guo 等 [10] 发现在胶质母细胞瘤中，高水平的葡萄糖会影响线粒体中己糖激酶的功能，并导致肿瘤组织中 PD-L1 表达量上升，促进肿瘤免疫逃逸。除葡萄糖外，一项研究显示果糖也可以影响 ICI 疗效：果糖可以增加黑色素瘤上血红素氧合酶 1 的表达量，并帮助肿瘤细胞完成免疫逃逸，抑制 ICI 疗效 [11]。 除糖类以外，还有许多脂类代谢物可以影响ICI 的疗效。Yang 等 [12] 通过抑制小鼠 CD8+T细胞上胆固醇酯化酶 ACAT1，增加质膜上的胆固醇水平，从而增强了CD8+T细胞的肿瘤杀伤能力与扩增能力，帮助 CD8+T 细胞抗原受体簇与免疫突触形成，加强了 T 细胞受体（T cell receptor，TCR）募集能力，并在 PD-1 联合化疗中显示出更好的效应。一项纳入 52 名患者的 PD-L1 临床研究显示，在治疗有效的患者体内，短链脂肪酸，尤其是粪便醋酸、丙酸、丁酸、戊酸和血浆异戊酸的含量高于治疗无效的患者 [13]。该研究还详细探究了丁酸浓度对于免疫的调控作用与 PD-L1 治疗的效果影响，研究发现低浓度的丁酸会倾向于诱导调节性T细胞（regulatory T cell，Treg cell）分化，抑制免疫；高浓度丁酸则会倾向于增加 CD8+T 细胞的效应功能与表型，促进免疫 [13]。在一项关于 CTLA-4 的疗效研究中提到，丁酸会抑制树突状细胞上的 CD80/CD86 与 T 细胞上的诱导性共刺激分子，阻止免疫细胞激活并提升Treg 细胞比例，降低免疫治疗疗效 [14]。 1.2 氨基酸及多肽类生物标志物 2018 年，Gopalakrishnan 等 [15] 在涉及 112 名恶性黑色素瘤患者的 PD-1 免疫疗法临床试验中发现，治疗有效的患者体内氨基酸合成活动相较治疗无效的患者更为频繁。Azuma 等 [16]  更是在针对 53 名非小细胞肺癌患者进行的 Cox 比例风险回归发现，含有丝氨酸、甘氨酸、精氨酸等多种氨基酸的血浆游离氨基酸可以显著提升患者在 PD-1 抑制剂治疗中的总生存率。 Lemos 等 [17]  发现在 Lewis 肺癌模型小鼠的TME 中，树突状细胞拥有更高水平的色氨酸代谢。通过减少色氨酸代谢，可以在一定程度上提升效应T 细胞水平、抑制 Treg 细胞激活、克服肿瘤免疫逃逸，从而改善 ICI 免疫治疗的疗效 [18] 。Rachdi 等  [19] 亦在体外实验中发现色氨酸会促进癌细胞上 PD-L1的表达并抑制 CD8+T 细胞激活过程，协助癌细胞进行免疫逃逸。Jia 等 [20] 则发现色氨酸的代谢产物吲哚-3-丙酸可以提升 CD8+T 细胞的功能并改善 PD-1治疗疗效。Huang 等 [21] 比较了 PD-1 单抗、人参多糖、人参多糖 + PD-1 单抗在非小细胞肺癌同源移植小鼠模型中的疗效，结果显示人参多糖与 PD-1 单抗联用可明显引起特定肠道菌群的增加，这些菌群的代谢活动会抑制体内色氨酸的代谢活动，并导致其下游产物犬尿氨酸在血液中的含量减少，进而产生抑制 Treg 细胞功能并诱导效应 T 细胞的效果，提示犬尿氨酸在血液中的浓度或可作为非小细胞肺癌患者 PD-1 疗法的疗效标志物。Li 等 [22] 通过提高小鼠 S-腺苷甲硫氨酸水平，改善了 PD-L1 疗法的疗效。Pandit 等 [23] 发现减少甲硫氨酸可以提高 CD4+T细胞上的 PD-1 表达量。Zhou 等 [24] 发现甲硫氨酸缺失使黑色素瘤 TME 中 CD8+T 细胞活动增加，改善PD-L1 治疗疗效。这一结论也为甲硫氨酸作为 PD-(L)1 疗法疗效标志物的可能性提供了支持。 Rizvi 等 [25] 发现由苯丙氨酸与酪氨酸代谢产生的芳香族代谢物马尿酸可以抑制自然杀伤（natural killer，NK）细胞上的 PD-1 表达并维持 NK 细胞激活；Badeaux 等 [26] 在小鼠模型中发现，通过促进精氨酸酶 1 的功能，更多精氨酸被转化为鸟氨酸和尿素，并使小鼠在 PD-L1 治疗中获得更好的生存率。Hibino 等 [27] 使用同系肿瘤小鼠模型，在小鼠的TME 中检测到大量的亚精胺。通过进一步的研究，其团队发现了亚精胺可以抑制 TCR 聚集，进而抑制免疫功能。通过多胺生成抑制剂抑制亚精胺生成后，CD8+T 细胞抗肿瘤能力得到了有效恢复。 1.3 其他生物标志物 Wang 等 [28] 发现效应 T 细胞可以通过嘌呤核苷磷酸化酶将肌苷代谢为次黄嘌呤和 5-磷酸核糖，将代谢肌苷得到的核糖替代葡萄糖作为在 TME 中的能量来源，诱导 CD8+T 细胞激活，增强 ICI 疗法的疗效，帮助缩小肿瘤组织。 2 影响 CAR-T 疗效的生物标志物  CAR-T 是近年创新的免疫疗法，其属于过继细胞输注（adoptive cell transfer，ACT）疗法，利用患者自身的 T 细胞，经过体外基因工程改造与扩增，使 T 细胞表达一种特殊的人工受体，即嵌合抗原受体后，回输到患者体内。拥有嵌合抗原受体的 T 细胞能够识别并结合到肿瘤细胞表面的特定抗原上，特异性地找到并攻击表达目标抗原的肿瘤细胞，同时激活免疫系统，对肿瘤进行攻击，具有高度特异性和作用持久性。 2.1 糖脂代谢相关生物标志物 研究人员分别使用糖酵解代谢通路抑制剂 2-脱氧 -D- 葡萄糖与抗氧化剂抑制活性氧生成，并发现在此 2 种培养条件下的 T 细胞在 ACT 疗法中均显示出更强的抗肿瘤能力和自我更新能力 [29-30]。一项针对使用 ACT 疗法治疗恶性黑色素瘤与肺癌的研究显示，T 细胞浸润程度较差的肿瘤组织中，糖酵解相关的基因皆出现了上调。因此，糖酵解行为产生的代谢物可能会损伤 T 细胞的抗肿瘤毒性，且糖酵解活动活跃的肿瘤细胞或许将更容易产生抗性 [31]。Shi等 [32] 通过在急性淋巴细胞白血病、肾细胞癌、胶质母细胞瘤模型小鼠中表达葡萄糖转运蛋白 1 提高 T 细胞内葡萄糖水平，发现 CAR-T 的糖酵解活动、线粒体呼吸链活动和记忆 T 细胞前体表型水平均有上升，使得 CAR-T 细胞的抗肿瘤功效增加。Raglow等 [33] 在其文章中总结道，肿瘤细胞中存在大量异常糖基化修饰，如岩藻糖基化、唾液酸糖基化、O-聚糖截断、N-聚糖分支增加等。这些异常的糖基化修饰往往会造成更糟糕的 ACT 疗法预后。Gross 等 [34] 在临床试验中提取了急性淋巴细胞白血病患者的 T 细胞，并发现去除 T 细胞培养环境中的葡萄糖，改为增加半乳糖可以促进 CAR-T 细胞中的线粒体活动，并在小鼠模型中增加 CAR-T 细胞的有效性，显著延长白血病模型小鼠的无病生存期。 Yan 等 [35] 发现 TME 中的髓系抑制细胞和肿瘤细胞富含胆固醇，而其中的 T 细胞却缺少胆固醇。因此，低胆固醇水平可能会抑制 T 细胞的增殖功能，并促进 T 细胞产生自噬介导的细胞凋亡。通过调控肝 X 受体提高 T 细胞内胆固醇水平后，CAR-T 细胞获得了更强的抗肿瘤功能。Morotti 等 [36] 发现 TME中的前列腺素 E2 可以抑制肿瘤浸润淋巴细胞对白细胞介素-2 的感应，造成氧化压力与细胞铁死亡；而通过抑制前列腺素 E2，肿瘤浸润淋巴细胞便可以恢复对白细胞介素-2 的感应能力，同时提升增殖能力和抗肿瘤能力，提高 ACT 疗法的疗效。Luu 等 [37] 的恶性黑色素瘤和胰腺癌体外研究证明丁酸和戊酸可以增强 PI3K-Akt 信号通路中的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）功能并抑制Ⅰ类组蛋白去乙酰化酶功能，增强细胞毒性T淋巴细胞和CAR-T细胞的抗肿瘤功能。Wen等 [38] 在小鼠模型中发现丙戊酸可以上调肿瘤细胞上的 NKG2D 分子配体表达量，进而显著提升 CAR-T 细胞在急性髓细胞性白血病中的效果。此外，双唾液酸神经节苷脂 GD2 也是 CAR-T 疗法中常用的靶点。Reppel 等 [39] 发现 14 种肺癌细胞中，有 4 种细胞表面表达有双唾液酸神经节苷脂 GD2。通过使用他泽司他上调细胞表面双唾液酸神经节苷脂 GD2 表达量后，CAR-T 细胞在肺癌中的细胞毒性也得到了上升。 2.2 氨基酸及多肽类生物标志物 研究表明，多种氨基酸都能影响CAR-T的疗效。例如，Yang 等 [40] 发现，在 TME 中补充支链氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸可以提升 CAR-T 细胞对癌细胞的杀伤率；使用促进支链氨基酸的分解代谢或减少支链氨基酸转运体的方法减少支链氨基酸后，CAR-T 细胞对癌细胞的清除效率也会降低。 Yu 等 [41] 发现肺鳞癌细胞可与 T 细胞竞争性抢夺甲硫氨酸，并导致 CAR-T 的细胞杀伤能力被抑制、细胞因子释放减少，且记忆 T 细胞表型减少。Patra 等 [42] 在研究中指出，色氨酸代谢通路与肿瘤免疫逃逸存在关联，其中游产物犬尿氨酸可通过抑制 TCR 表达、抑制 NK 细胞功能、激活芳烃受体并导致 T 细胞激活减少和 Treg 细胞增多，进而影响CAR-T 细胞疗效。通过抑制肝细胞癌患者细胞表面的 Lin28 表达，色氨酸代谢活动也受到抑制，最终导致 CAR-T 细胞抗肿瘤能力提升。Ye 等 [43] 发现脯氨酸代谢通路对于 CAR-T 治疗效果具有影响。通过增强脯氨酸代谢，CAR-T 细胞的效应表型与记忆表型基因表达量都得到提高，且在体外和体内实验中都显示出更强的抗肿瘤能力。Jalota 等 [44] 在使用代谢组学探究代谢物与 CAR-T 疗法副作用的关联时发现，低水平的谷氨酸与更快进程的细胞因子释放综合征相关；低水平的脯氨酸、甘氨酸与更严重的细胞因子释放综合征相关；低水平的羟基脯氨酸则与更快进展且更严重的免疫效应细胞相关神经毒性综合征相关。 谷氨酰胺可以生成多种多肽，如亚精胺、精胺、腐胺等，这些多肽是 T 细胞激活过程中主要的碳源，并与谷氨酰胺共同调控组织驻留记忆 T 细胞的功能。然而，尽管谷氨酰胺对于 T 细胞激活十分重要，Elmarsafawi 等 [45] 在其研究中指出，抑制谷氨酰胺及其下游多肽的生成，反而可以增强毒性 CD8+T 细胞的功能，这一发现，为在营养物质缺乏的 TME 中进行治疗提供了新的思路，并可能提升 CAR-T 与其他 ACT 疗法的疗效。 2.3 其他生物标志物 在 1.3 节中提到，Wang 等 [28] 发现肌苷可以在能量匮乏的 TME 中替代葡萄糖作为碳源，诱导 T细胞激活，增强免疫治疗中 T 细胞的功能。因此，肌苷也可以改善 ACT 疗法疗效，帮助缩小肿瘤组织。此外，Long 等 [46] 发现维生素 A 的代谢中间产物全反式维 A 酸可以减少软组织肉瘤模型小鼠中的髓系抑制细胞，提升双唾液酸神经节苷脂 GD2-CAR-T 细胞的抗肿瘤功能。 3 其他直接影响免疫细胞的代谢物 综上所述，本文整理了 31 种能够影响不同免疫治疗疗效的候选代谢性生物标志物（见表 1）。此外，还有一部分代谢物在研究中被发现能够直接影响患者的免疫细胞，并可能对免疫疗法的疗效造成相应的影响。 3.1 糖脂代谢相关代谢物 Gubser 等 [47] 通过体外实验证明，记忆 T 细胞需要大量的葡萄糖进行糖酵解活动以应对抗原刺激和执行抗癌功能。不过，在 TME 中，肿瘤细胞往往会表达更多的葡萄糖受体以夺得更多的葡萄糖，形成免疫逃逸 [9]。Brand 等 [48] 在关于恶性黑色素瘤的研究中发现乳酸的存在会抑制 CD4+ /CD8+T 细胞和 NK 细胞的激活以及细胞因子分泌功能，促进肿瘤生长。Husain 等 [49] 使用小鼠模型验证了乳酸可以募集小鼠脾脏中的髓源性抑制细胞且降低 NK 细胞毒性。Angelin 等 [50] 在小鼠模型与体外实验中发现低糖、高乳酸的环境使 Treg 细胞存活率增加。Chen 等 [51] 在他们关于乳腺癌转移的研究中表示，乳酸可以激活 G 蛋白偶联受体 Gpr132，进而促进 M2 型巨噬细胞表型激活，导致癌细胞产生转移和免疫逃逸。 Molnár 等 [52] 在体外使用放射性同位素标记法发现激活的 T 细胞膜上有更高含量的胆固醇，胆固醇与鞘磷脂可以与 TCR 的 β 链进行特异性结合，形成 TCR 二聚体，提高 TCR 对抗原的亲和力。Wang等 [53] 通过体外实验指出硫酸胆固醇——一种带负电的胆固醇类似物，可以抑制 CD3 分子胞内段上的免疫受体酪氨酸激活基序中的酪氨酸发生磷酸化，阻止胆固醇与 TCRβ 的结合，抑制 T 细胞激活过程中TCR 二聚体的形成。丁酸和丙酸还可以直接调控细胞毒性 T 细胞的基因表达，增加 γ-干扰素和颗粒酶的分泌 [54]。Arpaia 等 [55] 发现小鼠模型中，丙酸和丁酸盐可以调控 Treg 细胞的功能，引导外周的 Treg细胞分化。Bachem 等 [56] 发现使用丁酸盐可以引导小鼠效应 T 细胞向记忆 T 细胞转化。 3.2 氨基酸及多肽类代谢物 Wolfson 等 [57] 发现亮氨酸可以通过与 Sestrin2蛋白结合增强 mTOR 复合物 1（mTORC1）功能，加快 T 细胞的激活过程。Sinclair 等 [58] 的研究进一步补充验证了亮氨酸的这一功能，如果选择性地消除亮氨酸或抑制亮氨酸转移酶，则 mTORC1 就会表现出缺乏氨基酸的特征，其功能也会受损，造成CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞分化量减少。Peters 等 [59] 更是以 27 位恶性黑色素瘤患者的临床试验数据证明，高水平 L-异亮氨酸与更长的无进展生存期有关。 Bai 等 [60] 提到，缺少色氨酸的 T 细胞会抑制自身的扩增功能，并更容易产生凋亡。Litzenburger 等 [61] 使用人肿瘤细胞进行免疫蛋白印迹与免疫沉淀实验，发现犬尿氨酸和犬尿喹啉酸可以激活芳烃受体，抑制 T 细胞扩增，并促进 TME 的耐药性。Yan 等 [62] 报道 3-羟基邻氨基苯甲酸会抑制核因子 κB 与白细胞介素-6 的激活，并阻碍 T 细胞进行扩增，促使 T细胞凋亡，提升树突状细胞转化生长因子-β 水平并激活 Treg 细胞。黄尿酸则是 3-羟基犬尿氨酸的下游代谢物，在 Cronin 等 [63] 的研究中，黄尿酸会抑制产生效应 T 细胞所必需的四氢生物蝶呤，亦起到抑制免疫的效果。 Geiger 等 [64] 通过高分辨率质谱发现人体 T 细胞在激活过程中，精氨酸浓度会产生较大变化。在激活的 T 细胞中提升精氨酸水平，会促进 T 细胞的氧化磷酸化，增强 T 细胞的生存能力并帮助生产记忆 T 细胞。Infantino 等 [65] 的研究表示精氨酸可以提升 B 细胞的增殖能力、分化能力、生存能力和对抗原的识别结合能力。Rodriguez 等 [66] 则发现，缺少精氨酸会导致 TCR-CD3 的结构受损，并造成减少细胞因子、抑制效应 T 细胞扩增、增加 Treg 细胞的结果。 Gu 等 [67] 发现，甲硫氨酸及其代谢产物 S-腺苷甲硫氨酸可以调控mTORC1，帮助T细胞激活。然而，Bian 等 [68] 发现肿瘤细胞上亦存有大量甲硫氨酸转运体 SLC43A2，通过不断转移甲硫氨酸，肿瘤细胞可以在 TME 中扰乱 CD8+T 细胞中的甲硫氨酸代谢，减少 T 细胞能够获得的甲硫氨酸并阻碍 S-腺苷甲硫氨酸的合成，以抑制 T 细胞的免疫功能。Fang 等 [69] 发现剥夺肿瘤细胞中的甲硫氨酸可以抑制 SUV39H1甲基转移酶对环鸟苷酸-腺苷合成酶的甲基化修饰，进而提升环鸟苷酸-腺苷合成酶的抗肿瘤能力，有助于提高免疫治疗疗效。  在 TME 中，肿瘤细胞往往会与 T 细胞争夺谷氨酰胺。Nakaya 等 [70] 发现肿瘤细胞能够消耗大量的谷氨酰胺，并使 TME 中的 T 细胞受到抑制。而当谷氨酰胺的浓度足够高时，便可以激活mTORC1，进而激活 T 细胞并帮助 T 细胞扩增 [71]。Leone 等 [72] 在小鼠模型中使用了谷氨酰胺拮抗剂，并观察到肿瘤细胞中的氧化磷酸化与糖酵解活动被抑制，效应 T 细胞中的氧化磷酸化活动则被上调，这也与前文中 Elmarsafawi 等 [45] 的结论相同。Klysz 等 [73] 称谷氨酰胺及其代谢物 α-酮戊二酸参与到 CD4+T 细胞的分化调控过程之中。若是在 CD4+T 细胞激活的过程中缺少谷氨酰胺，则细胞将会分化成为 Treg 细胞。此时若是加入 α-酮戊二酸，则辅助性 T 细胞 Th1 的基因表达量出现上升，免疫功能得到恢复。 Elia 与 Haigis 提到谷氨酸可以被肿瘤细胞用于生产天冬氨酸并帮助其扩增 [74]。Mak 等 [75] 提到谷胱甘肽是小鼠 T 细胞发挥功能必不可少的三肽。缺少谷胱甘肽的 T 细胞可以被激活，但其功能被大大减弱。Bailis 等 [76] 发现，线粒体中的柠檬酸转运与苹果酸-天冬氨酸穿梭过程可以促进组蛋白乙酰化，在 CD4 T 细胞的激活与分化过程中起到帮助辅助性T细胞扩增、细胞因子分泌的重要作用。Olivares等 [77] 和 Sousa 等 [78] 通过研究胰腺导管腺癌中癌细胞周边的基质相关星状细胞发现，丙氨酸和脯氨酸会被用作癌细胞在营养缺失时的能量来源。Hesterberg 等 [79] 发现鸟氨酸可以转变为腐胺、精胺、亚精胺等多胺，这些多胺可能具有抑制 T 细胞扩增、帮助肿瘤生长与免疫逃逸的功能。 3.3 其他代谢物 Ohta 等 [80] 报道 TME 中大量存在的腺苷可以激活腺苷 A2A 受体，抑制细胞毒性淋巴 T 细胞。Thomas 等 [81] 发现，精氨酸经一氧化氮合酶催化生成的一氧化氮自由基可以对色氨酸代谢产生抑制作用，提升免疫治疗疗效。不过，Garciá-Ortiz 与Serrador 发现，一氧化氮在低浓度时促进血管新生，支持肿瘤生长；而在高浓度时，会导致肿瘤细胞凋亡，起到抗肿瘤的作用 [82]。一项体外研究使用二亚乙基三胺/一氧化氮加合物以增加人黑色素瘤中的一氧化氮浓度，最终发现肿瘤细胞上 NK 细胞激活型受体DNAM-1 出现增加，使得 NK 细胞与淋巴 T 细胞更易发挥抗肿瘤功能 [83]。Horrigan 等 [84] 报道咖啡因及其主要代谢产物副黄嘌呤也可以调控免疫反应：通过抑制中性粒细胞与单核细胞趋化性、抑制细胞因子分泌、抑制 T 细胞增殖与抗体生成，咖啡因与副黄嘌呤可以起到抑制免疫系统的作用。 4 展望 通过整理近年来多篇关注免疫治疗疗效和免疫细胞功能的文献，本文归纳总结了包含糖类、脂类、氨基酸类等多种类在内的免疫治疗疗效候选代谢性生物标志物。这些代谢性生物标志物可以通过多种途径，对免疫治疗疗效和免疫细胞功能造成影响（见图 2）。代谢组学在寻找与鉴定这些小分子生物标志物方面具有广阔的应用前景。通过合理的实验设计，代谢组学可以帮助研究者了解 TME 在免疫治疗过程中的代谢变化，结合免疫细胞在免疫治疗过程中的活动、功能变化与使用代谢组学观察到的代谢物水平变化，便能够筛选出可能与免疫治疗效果相关的代谢性标志物。一旦得到可靠的疗效标志物，代谢组学便能够在临床的免疫治疗过程中，快速为患者的治疗效果提供实时的反馈。 然而，目前距离使用代谢组学发现的生物标志物进行临床诊治尚面临许多挑战：1）TME 具有复杂性，包含多种细胞类型和大量的代谢物。因此，代谢组学现有技术识别未知代谢物的能力、处理大样本量的能力、辨别不同化学结构的能力仍需提升，以提高代谢物的检测准确性。2）TME 中的多种细胞间可能产生相互作用，对数据解释提出挑战。因此，需要研发新技术以分离 TME 中不同细胞类型，提升样本纯度，获得更加直观的数据，或是建立和优化预测模型，深化机器学习等技术建立出的模型对 TME 中生物学过程的理解。3）不同患者体内的 TME 以及同一患者体内的 TME 在不同时间点的代谢状态均可能存在显著差异。因此，代谢组学也需结合其他组学如基因组学、转录组学、蛋白质组学等多组学的数据，以更全面、多维的视角进行免疫治疗疗效标志物的分析。4）目前研究发现的生物标志物大多来自体外培养的肿瘤细胞，无法确定位于 TME 的肿瘤细胞是否会产生代谢差异，导致生物标志物失效。因此，代谢组学发现的生物标志物预测价值仍需进一步的验证和临床试验进行证明。这些问题，都是现阶段研究仍需努力解决的。 值得一提的是，随着人工智能技术的发展，已有前沿的研究开始使用人工智能算法，构建多组学的机器学习模型来尝试预测患者的免疫治疗疗效，并取得了一定的结果 [85-86]。通过在临床中加入代谢组学分析，可以帮助医生和研究人员更好地理解病理机制并鉴定最佳干预时机；对于患者而言，则可以接受到更加适合自己的治疗方法。相信在未来，随着免疫治疗疗效生物标志物的丰富与完善，通过患者体内的代谢物预测疗效结果也会成为可能，实现精准个体化医疗。 参考文献 ：  [1] Galon J, Bruni D. 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1973年，一组科学家成功地从发生流产的人类胚胎中的肾脏组织中分离出了一种最的胚胎肾细胞，即293细胞（人类胚胎肾细胞系293，HEK 293细胞）。这些细胞来源于一个父母谱系不明的胚胎，经过多次尝试后，科学家将转入变体腺病毒DNA片段进行转化。在最初的几个月里，细胞的转化过程相当困难，但最终科学家获得了一个稳定性较高且快速生长的HEK 293单克隆细胞株。自此，HEK 293细胞被成功培育出来。在细胞生物学和生物技术领域，HEK 293细胞的应用频率仅次于首个人类细胞系HeLa，并衍生出数百种不同的克隆细胞系。 1. HEK 293细胞概述1.1 细胞特性 该细胞系被5型腺病毒DNA片段转染，导致其永生化。HEK 293细胞具有以下特性： 生长特性：HEK 293细胞通常以贴壁生长方式培养，形态扁平，直径在11-15µm之间。它们也可以在悬浮培养条件下生长，此时细胞呈圆形。 遗传特性：HEK 293细胞是亚三倍体，具有64条染色体和三个X染色体拷贝。此外，细胞基因组整合了约4 kbp的腺病毒5型基因组片段，主要位于19号染色体上。 适应性：HEK 293细胞适应于多种培养基，包括Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）和DMEM培养基，通常添加10%胎牛血清（FBS）以及L-谷氨酰胺等营养成分。它们在37℃、5% CO2的条件下生长良好，pH值在6.9-7.1时可顺利贴壁生长。 转染效率：HEK 293细胞容易转染，常用的转染方法包括磷酸钙共沉淀法、脂质体介导转染和电穿孔等，转染效率可达90%以上。这使得它们成为基因功能研究和蛋白表达的理想工具。1.2 应用领域 HEK 293细胞在生物医学研究和工业生产中具有广泛的应用： 基因功能研究：由于HEK 293细胞易于转染，研究人员可以将目标基因导入细胞，研究其功能和调控机制。例如，通过过表达或敲除特定基因，观察细胞表型的变化，从而揭示基因在细胞生长、分化和信号传导中的作用。 蛋白表达与生产：HEK 293细胞能够高效表达外源蛋白，常用于生产重组蛋白，如单克隆抗体、细胞因子和酶等。其人类细胞系的背景使得生产的蛋白在结构和功能上更接近天然人类蛋白，具有较高的生物活性和稳定性。 病毒载体生产：HEK 293细胞广泛用于腺病毒、慢病毒和逆转录病毒等病毒载体的生产。这些病毒载体在基因治疗、疫苗开发和基因功能研究中具有重要应用。例如，在新冠疫苗的开发中，HEK 293细胞被用于生产病毒载体，以实现病毒基因的递送和表达。 药物筛选与毒性测试：HEK 293细胞可用于药物筛选和毒性测试，通过将细胞暴露于不同药物或化合物中，评估其对细胞生长、代谢和基因表达的影响，从而筛选出具有潜在治疗效果的药物或评估药物的安全性。 细胞信号传导研究：HEK 293细胞在细胞信号传导研究中也有广泛应用。研究人员可以利用该细胞系研究细胞表面受体与信号分子的相互作用，以及信号在细胞内的传递途径和调控机制。例如，通过转染特定的受体基因，研究其在细胞信号传导中的作用和信号通路的激活情况。2. 细胞培养方法2.1 培养基与条件 HEK 293细胞的培养基通常为Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM)或DMEM培养基，其中添加10%胎牛血清(FBS)以提供细胞生长所需的营养物质和生长因子。此外，培养基中还需添加2 mM L-谷氨酰胺以满足细胞的氮源需求。在特定情况下，如需要进行无血清培养，可以选择不含血清的培养基，并添加适量的胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸盐等替代成分，以维持细胞的生长和功能。 培养条件对HEK 293细胞的生长和表达具有重要影响。细胞通常在37℃、5% CO2的加湿培养箱中培养，以维持培养基的pH值在6.9-7.1范围内。pH值过高或过低都会影响细胞的生长状态和代谢活动。此外，培养箱中的湿度应保持在95%，以防止培养基的过度蒸发和浓度变化。在培养过程中，应定期观察细胞的生长情况，及时更换新鲜培养基，通常每2-3天换液一次，以保证细胞的营养供应和代谢废物的清除。2.2 细胞传代技术 HEK 293细胞的传代是细胞培养过程中的关键步骤，旨在维持细胞的生长活力和遗传稳定性。传代时，首先需要将细胞从培养瓶中消化下来。常用的消化方法是使用0.25%的胰蛋白酶-EDTA溶液。将消化液加入培养瓶中，轻轻摇晃使消化液均匀覆盖细胞表面，然后将培养瓶放入37℃培养箱中消化2-3分钟。在显微镜下观察细胞消化情况，当细胞大部分变圆并开始脱落时，迅速拿回操作台，加入适量的完全培养基终止消化。轻轻吹打培养瓶，使细胞完全脱落并形成单细胞悬液。 接下来，将细胞悬液转移至离心管中，以1000rpm的转速离心5分钟，弃去上清液。加入适量的新鲜完全培养基重悬细胞，根据传代比例将细胞悬液接种到新的培养瓶中。传代比例一般为1:4-1:8，具体比例可根据细胞的生长状态和实验需求进行调整。接种后，将新的培养瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中继续培养。传代后的细胞需要定期观察其贴壁生长情况，通常在12-24小时内，90%以上的细胞能够重新贴壁生长。传代周期一般为24-48小时，即每1-2天进行一次传代，以保持细胞的旺盛生长和良好的生长状态。3. 细胞培养注意事项3.1 无菌操作 无菌操作是HEK 293细胞培养成功的关键。整个培养过程必须在无菌条件下进行，以防止微生物污染。操作前，需要对所有器具和试剂进行严格的消毒和灭菌处理。例如，培养瓶、移液管等器具应使用高压蒸汽灭菌，培养基和其他液体试剂应通过0.22µm滤膜过滤除菌。操作时应在生物安全柜内进行，避免快速移动和交谈，以减少空气流动和污染风险。 在进行细胞操作时，动作要轻柔、准确，避免产生过多的气溶胶和污染。使用无菌技术打开培养瓶和试剂瓶，瓶口应通过酒精火焰消毒后再进行操作。操作过程中，应定期更换无菌手套，避免手部污染。此外，培养箱和操作台面也应定期清洁和消毒，以保持整个培养环境的无菌状态。3.2 培养条件维持 维持稳定的培养条件对HEK 293细胞的生长和表达至关重要。首先，温度应严格控制在37℃，这是细胞生长的最佳温度。温度过高或过低都会影响细胞的代谢活动和生长状态。其次，CO2浓度应保持在5%，以维持培养基的酸碱平衡，确保细胞在适宜的pH值范围内生长。培养箱中的湿度也应控制在95%左右，以防止培养基的过度蒸发和浓度变化。 此外，培养基的pH值应维持在6.9-7.1之间。pH值过高或过低都会对细胞产生不利影响。定期监测培养基的颜色变化，如培养基变黄，说明pH值下降，需要及时更换新鲜培养基。在培养过程中，还应定期观察细胞的生长情况，及时更换新鲜培养基，通常每2-3天换液一次，以保证细胞的营养供应和代谢废物的清除。 总之，无菌操作和培养条件的维持是HEK 293细胞培养成功的基础。只有在严格的无菌条件下，结合适宜的温度、CO2浓度、湿度和pH值等培养条件，才能确保细胞的健康生长和高效表达。4. 常见问题及解决策略4.1 细胞贴壁问题 HEK 293细胞贴壁能力较弱，容易在操作过程中脱落。以下是一些常见原因及解决策略： 培养基pH值不适宜：HEK 293细胞适应的pH值范围为6.9-7.1，pH值过高或过低都会影响细胞的贴壁能力。解决方法是定期监测培养基的pH值，必要时进行调整。可以使用预调pH值的培养基，或者在培养基中添加适量的碳酸氢钠以维持pH值稳定。 培养瓶表面处理不当：培养瓶表面如果过于光滑或存在污染，会影响细胞的贴壁。解决方法是使用经过包被的培养瓶，如预先涂覆一层多聚赖氨酸、明胶或鼠尾胶原等物质，以增加表面粗糙度和细胞附着力。此外，确保培养瓶在使用前经过严格的消毒和灭菌处理，避免污染。 消化过度：在传代过程中，如果胰蛋白酶-EDTA消化时间过长或浓度过高，会导致细胞消化过度，从而影响细胞的贴壁能力。解决方法是严格控制消化时间和消化液浓度，建议在显微镜下密切观察细胞消化情况，一旦细胞变圆并开始脱落，立即终止消化。 接种密度不当：接种密度过低会导致细胞难以贴壁和生长，而密度过高则会导致细胞聚集和竞争营养。解决方法是根据细胞的生长状态和实验需求，合理调整接种密度。一般建议的接种密度为1×10^4-5×10^4个细胞/cm²。4.2 细胞污染预防 细胞污染是细胞培养过程中常见的问题，会导致细胞生长受阻甚至死亡。以下是一些预防细胞污染的策略： 严格无菌操作：在整个细胞培养过程中，必须严格遵守无菌操作规程。操作前，对所有器具和试剂进行严格的消毒和灭菌处理，如使用高压蒸汽灭菌、过滤除菌等方法。操作时应在生物安全柜内进行，避免快速移动和交谈，以减少空气流动和污染风险。 定期更换培养基：及时更换新鲜培养基可以有效清除培养基中的代谢废物和潜在污染物。通常每2-3天换液一次，换液时要轻柔操作，避免对细胞造成机械损伤。 使用抗生素：在培养基中添加适量的抗生素，如青霉素和链霉素，可以有效抑制细菌和真菌的生长，预防细胞污染。但需注意抗生素的使用浓度不宜过高，以免对细胞产生毒性作用。 定期监测细胞状态：定期观察细胞的生长情况和形态变化，及时发现异常现象。如果发现细胞出现污染迹象，如培养基变浑浊、细胞形态异常、生长缓慢等，应立即采取措施进行处理。可以使用显微镜观察细胞是否有微生物污染，必要时进行细菌、真菌和支原体检测。 培养箱和操作台面清洁：保持培养箱和操作台面的清洁，定期进行消毒处理。培养箱内的水盘要定期更换水，避免细菌滋生。操作台面在使用前后要用70%酒精擦拭消毒。5. 细胞冻存与复苏5.1 冻存步骤 HEK 293细胞的冻存是细胞培养过程中的重要环节，旨在长期保存细胞系，以便未来使用。以下是详细的冻存步骤： 细胞准备：选择处于对数生长期的健康细胞进行冻存，此时细胞生长旺盛，冻存后复苏成功率较高。当细胞融合率达到80%-90%时，进行传代培养，待细胞生长良好后，方可进行冻存操作。 消化收集细胞：使用0.25%的胰蛋白酶-EDTA溶液对细胞进行消化。将消化液加入培养瓶中，轻轻摇晃使消化液均匀覆盖细胞表面，然后将培养瓶放入37℃培养箱中消化2-3分钟。在显微镜下观察细胞消化情况，当细胞大部分变圆并开始脱落时，迅速拿回操作台，加入适量的完全培养基终止消化。轻轻吹打培养瓶，使细胞完全脱落并形成单细胞悬液。 离心收集细胞沉淀：将细胞悬液转移至离心管中，以1000rpm的转速离心5分钟，弃去上清液，收集下层细胞沉淀。离心时注意转速和时间的控制，避免对细胞造成损伤。 制备冻存液：冻存液的配制是关键步骤之一。常用的冻存液配方为70%的完全培养基+20%胎牛血清（FBS）+10%二甲基亚砜（DMSO）。DMSO是一种常用的细胞冻存保护剂，能够有效防止细胞内冰晶的形成，减少冻存过程中对细胞的损伤。配制时需注意DMSO的加入方式，应缓慢滴加，边滴边轻轻摇晃，以确保其均匀混合。 重悬细胞：向离心管中加入适量的冻存液，用枪头反复吹打重悬起细胞。取少量细胞悬液计数细胞浓度及冻前存活率，一般细胞浓度为2-5×10^6 cells/mL较适宜。重悬时动作要轻柔，避免产生气泡，确保细胞均匀分散在冻存液中。 分装冻存：将重悬好的细胞悬液分装到无菌的冻存管中，每管分装1-1.5 mL。分装时要避免气泡的产生，可采用边分装边轻轻摇晃的方式，使细胞悬液均匀分布。在冻存管上做好标记，注明细胞名称、冻存日期、细胞浓度等信息，以便于后续管理和使用。 程序降温：将冻存管放入程序降温仪中进行缓慢降温。降温程序一般为：先在4℃下放置30分钟，然后在-20℃下放置1小时，最后在-80℃下过夜。缓慢降温有助于细胞逐渐适应低温环境，减少冰晶的形成，提高细胞的存活率。 液氮保存：降温完成后，将冻存管从-80℃冰箱中取出，迅速放入液氮罐中长期保存。液氮温度极低，能够长期保持细胞的活性和稳定性。在液氮保存过程中，需定期检查液氮罐的液氮量，确保冻存管始终处于液氮环境中。5.2 复苏操作 细胞复苏是将冻存的细胞恢复到正常生长状态的过程，操作的正确与否直接影响细胞的复苏效果。以下是详细的复苏操作步骤： 准备工作：提前将水浴锅预热至37℃，并准备好无菌的离心管、培养皿、移液管等实验器具。同时，将完全培养基在37℃培养箱中预热，以备后续使用。 快速融化：从液氮罐中取出冻存管，迅速将其投入37℃水浴锅中，轻轻摇动，使冻存管内的细胞悬液快速融化。整个融化过程应在1-2分钟内完成，以避免细胞在融化过程中受到损伤。 稀释细胞：将融化的细胞悬液吸出，加入到含有预热完全培养基的离心管中，轻轻混匀。通常情况下，将1 mL的细胞悬液加入到9 mL的完全培养基中进行稀释，以降低DMSO的浓度，减轻其对细胞的毒性。 离心收集细胞：将稀释后的细胞悬液以1000rpm的转速离心5分钟，弃去上清液，收集细胞沉淀。离心时注意转速和时间的控制，避免对细胞造成损伤。 重悬接种：用适量的完全培养基重悬细胞沉淀，制成均匀的细胞悬液。将细胞悬液接种到预先准备好的培养皿中，轻轻摇晃使细胞均匀分布。接种密度一般为1×10^4-5×10^4个细胞/cm²，根据细胞的生长状态和实验需求进行调整。 培养观察：将接种好的培养皿放入37℃、5% CO2的培养箱中进行培养。在细胞复苏后的24小时内，尽量减少对培养皿的移动和观察，以免影响细胞的贴壁和生长。在随后的培养过程中，定期观察细胞的生长情况，及时更换新鲜培养基，通常每2-3天换液一次。 评估复苏效果：通过显微镜观察细胞的形态、生长状态和密度，评估细胞的复苏效果。健康的复苏细胞应贴壁生长良好，形态正常，无明显的污染迹象。若发现细胞生长异常或污染，需及时采取相应措施进行处理。6. 细胞培养优化技巧6.1 提高细胞活性 提高HEK 293细胞活性是确保实验成功和获得可靠结果的关键。以下是几种有效的方法：优化培养基成分 添加氨基酸和维生素：在培养基中添加非必需氨基酸和维生素，如谷氨酰胺、丙酮酸钠、维生素C和维生素E等，可以促进细胞生长和代谢，提高细胞活性。例如，谷氨酰胺是细胞生长的重要氮源，添加2 mM的L-谷氨酰胺可显著提高细胞活性。 使用胎牛血清替代品：胎牛血清（FBS）是培养基中常用的添加物，但其成分复杂且批次间差异较大。使用经过优化的胎牛血清替代品，如无血清培养基添加剂，可以提供更稳定的生长环境，提高细胞活性。改善培养条件 控制温度和CO2浓度：HEK 293细胞最适宜的生长温度为37℃，CO2浓度为5%。使用精确控制温度和CO2浓度的培养箱，可以维持稳定的培养环境，有利于细胞的生长和活性维持。 调节pH值：培养基的pH值对细胞活性有重要影响。使用缓冲体系，如HEPES缓冲液，可以维持培养基的pH值在6.9-7.1范围内，从而提高细胞活性。采用细胞保护剂 抗氧化剂：在培养基中添加抗氧化剂，如谷胱甘肽、维生素C和维生素E等，可以清除细胞内的活性氧（ROS），减少氧化应激对细胞的损伤，提高细胞活性。 细胞凋亡抑制剂：使用细胞凋亡抑制剂，如Z-VAD-FMK等，可以阻断细胞凋亡途径，减少细胞死亡，提高细胞活性。定期传代和细胞计数 定期传代：细胞在培养过程中会逐渐衰老，定期传代可以去除衰老和死亡的细胞，保持细胞群体的年轻和活力。一般建议每2-3天进行一次传代。 细胞计数：在传代和实验操作前，进行准确的细胞计数，以确保细胞密度适宜，避免细胞过度拥挤或稀疏，从而维持细胞的正常生长和活性。6.2 提升转染效率 转染效率的提升对于基因功能研究和蛋白表达等实验至关重要。以下是几种有效的方法：选择合适的转染方法 脂质体介导转染：使用脂质体介导的转染试剂，如Lipofectamine 2000或Lipofectamine 3000，可以高效地将核酸导入HEK 293细胞。这些试剂通过形成脂质体-核酸复合物，促进细胞内吞作用，提高转染效率。 电穿孔转染：电穿孔转染通过短暂的高电压脉冲在细胞膜上形成瞬时孔洞，使核酸更容易进入细胞。这种方法适用于较难转染的细胞类型，但对细胞有一定的损伤，需优化电穿孔参数。优化转染试剂和核酸的用量 调整转染试剂和核酸的比例：不同的细胞类型和实验需求可能需要不同的转染试剂和核酸用量。通过实验优化，找到最佳的转染试剂和核酸的比例，可以显著提高转染效率。例如，对于HEK 293细胞，常用的转染试剂和质粒DNA的比例为3:1。 核酸的纯度和质量：确保所使用的核酸纯度高、无污染，且具有良好的超螺旋结构。核酸的质量直接影响转染效率，使用高质量的核酸可以提高转染的成功率。优化细胞状态和密度 细胞状态：选择处于对数生长期的健康细胞进行转染，此时细胞生长旺盛，转染效率较高。避免使用处于静止期或衰老期的细胞。 细胞密度：在转染前，将细胞密度控制在50%-80%之间。过低的细胞密度可能导致转染效率低，而过高的细胞密度则可能影响细胞的生长和转染效果。使用细胞转染增强剂 转染增强剂：使用细胞转染增强剂，如聚乙烯亚胺（PEI）等，可以提高转染效率。这些增强剂通过与核酸结合，形成稳定的复合物，促进细胞内吞作用，增加核酸在细胞内的摄取。优化转染操作步骤 转染复合物的制备：在制备转染复合物时，需严格按照试剂说明书进行操作，确保核酸和转染试剂充分混合。混合后需静置一段时间，使复合物充分形成。 转染后培养条件的调整：转染后，适当调整培养条件，如降低培养基中的血清浓度或添加抗生素，可以提高转染效率和细胞的稳定性。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。