Insulin human (rDNA origin, Novo Nordisk)

导读 近年来全球糖尿病患者数量持续上升，对胰岛素的需求不断增加，而经济实惠的胰岛素供应不足，因此开发高效经济的生产工艺至关重要。重组人胰岛素生产主要有大肠杆菌包涵体和酵母表达系统两种途径，大肠杆菌因生长快、成本低等优势成为主要宿主，但包涵体路线需复杂的下游处理。新加坡研究人员曾在Bioresources and Biprocessing上发表了题目为《Downstream processing of recombinant human insulin and its analogues production from E. coli inclusion bodies》的综述。重点阐述了从大肠杆菌包涵体生产重组胰岛素下游加工的各个环节，并对每个环节的方法、条件和影响因素进行了详细讨论。 从大肠杆菌包涵体中纯化重组人胰岛素/类似物的下游工艺很复杂，涉及多个步骤，包括包涵体回收、洗涤、溶解和氧化亚硫酸化、氰化溴裂解、缓冲液交换、色谱纯化、pH沉淀和锌结晶、胰岛素原折叠、酶切和制剂等，且每个步骤中采用的方法对下一步的产品纯度和产量产生重大影响。 图1 重组人胰岛素及其类似物下游加工的一般工作流程 一、包涵体回收与洗涤 由于异源蛋白在大肠杆菌中以不溶性细胞质包涵体形式存在且不分泌到培养基，所以需要特定方法进行回收。破坏细胞包膜的机械方法包括超声处理、在胶体磨中研磨细胞悬浮液或通过Manton-Gaulin高压等方式破碎细胞膜，该方法能有效地破坏细胞，但可能会更严重地损害包涵体中的蛋白质质量[1]。在基于溶菌酶的方法中，添加溶菌酶以消化细胞包膜。溶菌酶可裂解肽聚糖的骨架，使细胞结构被破坏，随后通过膜微滤或离心技术从全细胞裂解物中分离出包涵体。常用的洗涤缓冲液添加剂有尿素、Triton X-100、EDTA、甘油、溶菌酶、NaCl、Tween 20等，其中尿素和Triton X-100最为常见。大肠杆菌细胞壁由磷脂、蛋白质、肽聚糖和脂多糖组成，使用去污剂、低浓度尿素、溶菌酶和EDTA进行选择性萃取有助于去除细菌细胞壁成分。Triton X-100能去除膜磷脂和碎片，促进碎片和可溶性蛋白从包涵体上解离。洗涤优化要确保洗涤缓冲液不会溶解所需的重组蛋白，此外离心次数、速度和洗涤温度等参数也需要优化，以实现时间和成本的有效控制，提高生产效率。 图2 蛋白质-添加剂的相互作用模式 二、包涵体溶解及氧化亚硫酸化 包涵体通常使用高浓度变性剂，如胍盐酸盐和尿素能完全破坏蛋白质结构，对于含多个半胱氨酸残基的蛋白质，可添加二硫苏糖醇（Dithiothreitol ，DTT）或β-巯基乙醇（Mercaptoethanol，BME）防止错误二硫键形成。在正确的构象中，硫解步骤对于保持其展开形式至关重要，防止在溶解过程中和蛋白质复性之前的初始纯化步骤中形成可能不正确的二硫键，此外氧化硫化分解有助于提高后续复性产量。pH值和温度是可能影响反应溶解和硫解速率的因素，为了获得最大产量，监测硫解反应的温度和持续时间以确保反应完成非常重要。 三、溴化氰裂解及缓冲液交换 在大肠杆菌蛋白质翻译过程中，重组蛋白以融合蛋白形式表达，N端起始氨基酸为N-甲酰甲硫氨酸（N-Formylmethionine，fMet）。fMet会被人体免疫系统识别为异物，可能引发不必要的免疫原性反应，因此在纯化前需将其去除，溴化氰裂解就是用于切断胰岛素原的甲硫氨酸连接子，从而去除fMet这一信号序列。该方法的缺点是切割特异性低，溴化氰蒸发时间长，其高毒性和挥发性以及释放产物可能发生化学修饰。另一种方法是使用蛋白质蛋白酶来切割融合蛋白，但必须确保蛋白酶在正确的位点切割以去除N末端融合肽。缓冲液交换能去除影响蛋白功能和稳定性的试剂，使蛋白适应后续操作，主要通过三种方法实现。透析：利用渗透压使溶质透过半透膜，是传统的脱盐和缓冲液交换方法。适合易沉淀的敏感蛋白，但耗时久且需较大的膜表面积。超滤：借助离心力或其他外部压力使小分子溶质透过多孔膜，而大分子溶质被截留，从而实现脱盐和缓冲液交换，同时能浓缩蛋白样品。在工业生产中，超滤常用于包涵体溶解和亚硫酸化反应后，去除高浓度尿素和亚硫酸化试剂；在蛋白复性后，也能将复性样品浓缩并交换缓冲液，为后续的酶促转化提供合适环境。尺寸排阻色谱：基于分子大小差异进行分离，小分子如盐类可与较大的肽段分离，是透析的快速替代方法，稀释因子低。 四、色谱纯化与沉淀 4.1 色谱纯化 亲和色谱（Afnity Chromatography，AC）：基于配体与目标蛋白的特异性结合，需在胰岛素原分子上融合合适的标签。融合标签不仅有助于纯化，还能提升胰岛素原稳定性和表达水平，但基因融合在下游处理时，需考虑标签的去除及对后续分析的影响，且AC树脂成本较高。离子交换色谱（Ion‑Exchange Chromatography，IEX）：根据分子电荷差异分离，可选用阴离子交换色谱或阳离子交换色谱，胰岛素及其前体具有可离子化基团，IEX可用于纯化折叠或磺化的胰岛素原。反相色谱（Reversed‑phase Chromatography，RP）：依据分子与固定相的疏水相互作用分离，通常在胰岛素原酶促转化为胰岛素后使用。RP能有效去除胰岛素原未充分裂解或错切产生的杂质，C8柱因胰岛素的分子量和疏水性成为常用选择，常用乙腈作为洗脱剂[2]。疏水相互作用色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）：与RP类似基于疏水性分离，但HIC吸附剂疏水性较弱，洗脱无需有机溶剂，对敏感蛋白更温和。尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，SEC）：根据分子大小分离，是较温和的技术，常用于胰岛素纯化的抛光步骤，也可在蛋白质折叠液相色谱中与复性过程结合。混合模式色谱（Mixed‑Mode Chromatography，MMC）：利用多种相互作用实现分离，在胰岛素纯化中逐渐受到关注，其混合模式离子交换剂与传统离子交换剂相比具有不同选择性，可在高盐条件下结合蛋白质，减少脱盐或稀释步骤。 表1 胰岛素原（PI）纯化中的亲和色谱法 4.2 沉淀方法 pH沉淀：利用蛋白质在等电点时溶解度最低的特性，通过调节溶液pH使胰岛素/胰岛素类似物沉淀，从而与杂质分离，还能浓缩蛋白。例如可将溶解的融合蛋白pH调至5.0使其沉淀，离心后再溶解于碱性缓冲液提高蛋白纯度；在胰岛素原复性后，也可调节pH沉淀杂质，收集含正确折叠胰岛素原的上清。锌结晶：胰岛素在锌离子存在下可形成六聚体等聚集体，利用这一特性在纯化过程中加入锌离子使胰岛素结晶，可用于胰岛素的浓缩和临时保存，减少其在储存过程中的物理和化学降解[3]。 五、复性 胰岛素由A、B两条多肽链通过二硫键连接而成，胰岛素原在体外复性时，需去除高浓度变性剂，促使二硫键正确形成和蛋白质折叠为天然结构。在复性缓冲液中稀释溶解的蛋白质是胰岛素生产中最常用的复性方法，其他回收胰岛素原的方法包括蛋白质折叠液相色谱法（Protein-Folding Liquid Chromatography，PFLC）和透析。PFLC具有连续复性、生产率高和缓冲液消耗低等优势，但设备成本较高。透析法耗时较长，且在大规模生产中应用存在一定局限性。为了提高胰岛素原复性得率，可以在复性缓冲液中添加离液剂，同时缓冲液成分、氧化还原试剂、蛋白质浓度、温度、时间及融合标签等都会影响复性效率。 表2 通过稀释法进行胰岛素原（PI） 重折叠的优化条件 六、酶促切割及制剂 在生产“胰岛素原”途径中，需通过酶促切割去除重组人胰岛素/类似物前体分子中的C肽，以形成具有活性的胰岛素异二聚体。常使用胰蛋白酶和羧肽酶B（Carboxypeptidase B，CPB）进行切割，胰蛋白酶是丝氨酸内肽酶，能切割内部精氨酸和赖氨酸残基的羧基末端；CPB作为外肽酶可去除胰蛋白酶作用后C末端的精氨酸、赖氨酸和组氨酸等碱性氨基酸。可通过RP-HPLC监测酶促反应确定反应终点。反应终止方法多样，如将反应混合物pH调至2.5-3.5适合直接上阳离子交换色谱；添加蛋白酶抑制剂如抑肽酶，适用于后续为阴离子交换色谱/混合模式色谱的情况。在完成最终的色谱纯化后，胰岛素分子面临脱酰胺和聚集/纤维化的风险。为防止这些情况发生，需通过结晶和冻干去除残留的盐和缓冲液。胰岛素在锌离子存在下可形成晶体，通过离心、倾析或过滤分离胰岛素晶体，并洗涤去除残留锌。锌结晶后进行冷冻干燥，使胰岛素在储存时保持稳定，在使用前再将其溶解。为了抑制细菌生长、防止蛋白质聚集或改变胰岛素的体内吸收动力学，会向制剂中添加特定添加剂。间甲酚可抑制胰岛素淀粉样蛋白形成；胰岛素与锌和/或鱼精蛋白络合，能够制备中效或长效制剂，满足不同的临床需求。 结语 本文全面介绍了大肠杆菌包涵体生产重组人胰岛素的下游加工全过程，该过程步骤繁多，各环节紧密相连且相互影响，并提供了关键生产阶段实例，讨论了多模式纯化方案整合的实际问题，旨在为生产更高效、经济的胰岛素提供指导，以应对全球糖尿病患者对胰岛素的庞大需求。未来需优化整合各步骤，开发更高效、经济的生产工艺，以满足全球对胰岛素的需求，降低患者治疗成本。 参考文献 [1] Singhvi P, Saneja A, Srichandan S, et al. Bacterial Inclusion Bodies: A Treasure Trove of Bioactive Proteins. Trends Biotechnol. 2020 May; 38(5):474-486.  [2] Govender K, Naicker T, Baijnath S, et al. Sub/supercritical fluid chromatography employing water-rich modifier enables the purification of biosynthesized human insulin. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2020 Oct 15;1155:122126. [3] Zieliński M, Romanik-Chruścielewska A, Mikiewicz D, et al. Expression and purification of recombinant human insulin from E. coli 20 strain. Protein Expr Purif. 2019 May;157:63-69. 识别微信二维码，可添加药时空小编 请注明：姓名+研究方向！